CN106755596A - K亚群禽白血病病毒荧光定量rt‑pcr检测引物组及试剂盒 - Google Patents
K亚群禽白血病病毒荧光定量rt‑pcr检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测引物组及试剂盒。本发明所采用的引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。其能够特异性的扩增出ALV‑K,种内和种间的特异性均非常好;最低能够检测到8.4×10 copies/μL的病毒,灵敏度是普通PCR的100倍;批内变异系数和批间变异系数均小于5%,证明此方法特异性强,灵敏度高,重复稳定性好,扩增效率高,可以用于临床ALV‑K的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体涉及一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALVs)是反转录病毒科、肿瘤病毒亚科的一员,该病毒群引起的所有良性和恶性肿瘤统称为禽白血病(avian leukosis,AL)。(殷震,1997)。禽白血病被列为2012-2020年国家优先防治的动物疫病之一(高鸿宾,2012)。禽白血病病毒诱发的肿瘤主要包括白血病、结缔组织肿瘤、上皮性肿瘤、内皮性肿瘤及其他相关肿瘤,其中白血病又可分为淋巴细胞性白血病(Lymphoid Leucosis,LL)、成红细胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓细胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓细胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchase et al.,1984;霍夫斯塔,1980)。
目前,病毒分离鉴定是检测禽白血病病毒最常规基础的方法,主要是测定病毒或病毒抗原,准确性较高、易操作。其缺点在于耗时长,从采样到检出结果至少需要10天时间;存在假阳性或病毒隐性未检出的可能性;花费高;操作流程繁琐。因此,该方法不适用于大范围、多样品的检测,难以在临床中推广和应用。病毒中和试验是检测禽白血病病毒最灵敏的方法之一。但存在操作步骤繁琐,耗时耗力,花费高等缺点,临床实际检测中很少用到。琼脂扩散试验是哈尔滨兽研所在20世纪80年代建立的方法。该方法需要拔羽取髓,会引起鸡群较大的应激反应,同时特异性也较低,会受内源性病毒的干扰,出现一定的假阳性。(关云涛等,2002)。IFA的基本原理是根据抗原-抗体反应,将荧光色素标记在已知抗体(或抗原)上,当其与对应的抗原(或抗体)结合后,就能够在荧光显微镜下观察到特异性的荧光信号。IFA的主要特点是特异性强,反应速度快,结果易观察,但是,操作步骤繁琐,专业要求高,耗时长,敏感度低,会因非特异染色而出现假阳性,在临床上推广范围较窄。
近几年来,禽白血病发生频繁,给我国农业经济的发展带来很大冲击。经典外源性的禽白血病病毒亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J在检测、净化等方面已经相对成熟,而对于在2008年才发现命名的ALV-K亚群,在相关方面的研究非常滞后。因此,建立一种快速有效的针对ALV-K的检测方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、简单快速的K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针,其是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。
作为优选的,所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。
所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示:
ALV-F:5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’(SEQ ID NO.1),
ALV-R:5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’(SEQ ID NO.2),
ALV-Pb:5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’(SEQ ID NO.3)。
一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒,其含有如上所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针。
一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法,包括如下步骤:
(1)提取样品中病毒RNA;
(2)利用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;
(3)收集荧光信号,对比标准曲线,计算得到病毒拷贝数。
RT-PCR扩增反应的条件为:42℃5min,95℃0.1min,95℃0.05min,60℃0.34min,共40个循环。
本发明的有益效果是:
本发明设计的引物和探针,能够特异性的扩增出ALV-K,种内和种间的特异性均非常好;构建阳性重组质粒,制作标准曲线,阳性质粒在8.4×1010copies/μL~8.4×101copies/μL之间呈现良好的线性关系,y=-3.402x+48.355,斜率为-3.402,相关系数为R2为0.998,扩增效率Eff%为96.768;最低能够检测到8.4×10copies/μL的病毒,灵敏度是普通PCR的100倍;批内变异系数和批间变异系数均小于5%,证明此方法特异性强,灵敏度高,重复稳定性好,扩增效率高,可以用于临床ALV-K的检测。
附图说明
图1为阳性重组质粒PCR扩增产物的凝胶电泳图(M.DNA Marker 4500;1.RT-PCR产物;2.重组质粒PCR产物;3.阴性对照);
图2为ALV-K实时荧光定量RT-PCR的标准曲线。
图3荧光定量RT-PCR的种内特异性实验结果图;
图4荧光定量RT-PCR的种间特异性实验结果图;
图5荧光定量RT-PCR的灵敏度实验结果图(1-10模板含量分别为(单位copies/μL):8.4×1010;8.4×109;8.4×108;8.4×107;8.4×106;8.4×105;8.4×104;8.4×103;8.4×102;8.4×101);
图6普通PCR的灵敏度实验结果图(1-9模板含量分别为(单位copies/μL):8.4×1010;8.4×109;8.4×108;8.4×107;8.4×106;8.4×105;8.4×104;8.4×103;10为阴性对照);
图7为ALV-K对机体生长发育的影响柱形图;
图8不同脏器中基因拷贝数的比较。
具体实施方式
下面结合实施了对本发明做进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1 K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1实验材料
毒株、细胞
美国ATCC鸡胚成纤维细胞系(DF-1)、A亚群禽白血病RAV-1株(GenBank登录号:M19113)、B亚群禽白血病RAV-2株(GenBank登录号:M14902)、J亚群禽白血病HPRS-103株(GenBank登录号:Z46390)、E亚群禽白血病RAV-0株(GenBank登录号:M12172)、K亚群禽白血病GDFX0601株(GenBank登录号:KP686142.1)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。
2实验方法与结果
2.1阳性重组质粒的构建
参考GDFX0601株前病毒全基因组,设计了一对引物用于质粒标准品的构建:env-F:5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC-3’(SEQ ID NO.4);env-R:5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG-3’(SEQ ID NO.5)。利用该引物对特异性的扩增ALV-K,目的基因1850bp,琼脂凝胶电泳结果显示在1850bp附近有一条特异性的目的条带;再以构建的阳性质粒为模板,得到预期大小的目的条带(图1),测序结果显示插入的基因序列与目的基因一致,结果表明阳性重组质粒构建成功。
质粒标准品的定量:DNA拷贝数={[X(g/μL)DNA/DNA长度bp×660]×6.02×1023}=Y(拷贝/μL)。用蛋白核酸定量仪测定阳性重组质粒DNA浓度,质粒浓度为170ng/μL=170×10-9g/μL;质粒的分子量=1850(碱基总数)×660(碱基对的平均分子量);DNA拷贝数=(170×10-9×6.02×1023)/(1850×660)=8.4×1010copies/μL。
2.2 RT-PCR引物和探针的设计与合成.
选取K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行TaqMan探针法荧光定量RT-PCR引物的设计。如表1所示。将探针的5’端以荧光报告基团FAM标记;3’端以荧光淬灭基团Eclips标记,引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成。
表1荧光定量RT-PCR引物及探针
2.3 RT-PCR反应体系与条件的优化
按TaKaRa荧光定量试剂盒One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime)说明书进行荧光定量RT-PCR,20μL反应体系:
反应条件:42℃5min,95℃0.1min,95℃0.05min,60℃0.34min,共40个循环。
2.4标准曲线的建立
将阳性标准品(阳性重组质粒)10倍梯度稀释(8.4×1010copies/μL~8.4×101copies/μL),每个稀释度做3个重复,用优化的实时荧光定量RT-PCR进行目的基因的扩增,软件分析系统将自动生成以模板DNA拷贝数为横坐标,以CT值为纵坐标的标准曲线。结果显示阳性标准品在8.4×1010copies/μL~8.4×101copies/μL之间呈现良好的线性关系,拟合得到的标准曲线为y=-3.402x+48.355,斜率为-3.402,相关系数R2为0.998,扩增效率Eff%为96.768。(图2)。
2.5荧光定量RT-PCR方法的稳定性检测
用优化的荧光定量RT-PCR条件对8.4×107copies/μL、8.4×105copies/μL、8.4×103copies/μL 3个稀释度的阳性标准品进行3次重复,每个稀释度设3个重复,计算其批内变异系数(intra-assay CV%)。此外,设置3个不同时间重复试验,每次间隔1周,计算其批间变异系数(inter-assay CV%)。结果如表2所示。批内标准差在0.017~0.105之间,变异系数在0.055%~0.565%之间;批间标准差在0.496~0.754之间,变异系数在2.229%~3.321%之间,变异系数均小于5%,证明该方法重复稳定性高,可在临床应用中推广。
表2(a)ALV-K荧光定量RT-PCR批内稳定性
表2(b)ALV-K荧光定量RT-PCR批间稳定性
实施例2特异性实验
以ALV-K、ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-E为模板,进行荧光定量RT-PCR,检测其种内特异性。再以ALV-K、NDV、REV、AIV、MDV、IBV、DF-1为模板,检测其种间特异性。结果表明只有ALV-K呈现“S”型的扩增曲线,ALV的其他亚群以及其他病毒均未出现扩增曲线,证明该方法具有高度的特异性,能有效的检出ALV-K,并能够与其他病毒区分开(见图3和图4)。
实施例3灵敏度实验
将阳性重组质粒从8.4×1010copies/μL开始10倍梯度稀释,以每个稀释度为模板,进行荧光定量RT-PCR反应。设计一对引物(F:5’-ACGCTTTCAGATTGGTCC-3’(SEQ ID NO.6);R:5’-AAGCGAGAACCTGTCTGTGC-3’(SEQ ID NO.7)),目的基因182bp,以同样稀释的阳性重组质粒为模板,进行常规PCR反应,比较两种检测方法的灵敏度。结果显示荧光定量RT-PCR最低能够检测8.4×101copies/μL的核酸,普通PCR最低只能检测到8.4×103copies/μL,证明TaqMan探针荧光定量RT-PCR的灵敏度是普通PCR的100倍,该方法适用于临床对ALV-K的检测和鸡场净化(图5和图6)。
实施例4 ALV-K荧光定量RT-PCR的临床应用
1、实验动物攻毒
1日龄SPF鸡110只,分为两组,一组接种4×104TCID50的ALV-K,另一组作为空白对照,严格隔离饲养,在性成熟时期,无菌操作取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,带回实验室提取组织病料的DNA。随机抽取五周龄(35d)攻毒组和对照组的鸡各5只,剖检称重,对比ALV-K对鸡群生长发育的影响。剖检性成熟时期的两组鸡,观察病鸡各组织脏器的病理变化。
观察性成熟时期攻毒组的病鸡,临床上无典型症状,未出现肉眼可见的肿瘤。病鸡消瘦,精神萎靡,部分病鸡出现跛行,腿根部有隆起的肿块。剖检病鸡,病鸡脚掌心、胸腺、肝脏、心脏、脾脏等处均有点状出血,盲肠扁桃体出现灰白色坏死灶。剖检四周龄(35d)病鸡,分别对病鸡的脾脏、法氏囊和胸腺称重,如图7所示,病鸡体重消瘦明显,法氏囊重量也有所减轻,脾脏和胸腺的重量变化不大,结果表明ALV-K对机体的生长发育会产生明显的抑制作用。
2、ALV-K在不同脏器中mRNA的表达水平
检测ALV-K在不同组织脏器中mRNA的表达水平采用绝对定量法计算。实验中设置无模板对照(双蒸水)、阴性对照(健康鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)和8.4×108copies/μL~8.4×10copies/μL 8个不同稀释度的重组质粒作为阳性对照,每个稀释度设3个重复。待检样品为攻毒SPF鸡的组织病料,进行TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应,反应结束后,系统会自动通过与标准品扩增曲线进行比较,得到待检鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的拷贝数,以确定ALV-K在不同脏器中mRNA的表达水平。结果显示ALV-K在鸡体内各脏器中均有所分布和表达。如图8所示,通过对比5只攻毒鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的病毒拷贝数,发现在每只鸡体内肝脏、脾脏和肾脏的病毒含量均显著高于心脏和肺脏的。
以上实施例表明,本发明设计的引物和探针,能够特异性的扩增出ALV-K,种内和种间的特异性均非常好;最低能够检测到8.4×10copies/μL的病毒,灵敏度是普通PCR的100倍;批内变异系数和批间变异系数均小于5%,证明此方法特异性强,灵敏度高,重复稳定性好,扩增效率高,可以用于临床ALV-K的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccctgctat ttaggcaagc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agttggcaag caccttgaga a 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccatgttagc acccaaccac acagaa 26
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatccg ccaccatgga agccgtcata aaggcatttc tgactggata c 51
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaggaaaaaa gcggccgctt acactgctcc attttcg 37
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgctttcag attggtcc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagcgagaac ctgtctgtgc 20
Claims (6)
1.种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针,其特征在于,所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。
2.根据权利要求1所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针,其特征在于,所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。
3.根据权利要求2所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针,其特征在于,所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示:
ALV-F:5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’,
ALV-R:5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’,
ALV-Pb:5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’。
4.一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒,其含有权利要求1-3任一项所述的引物对及探针。
5.一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法,包括如下步骤:
(1)提取样品中病毒RNA;
(2)利用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;
(3)收集荧光信号,对比标准曲线,计算得到病毒拷贝数。
6.根据权利要求5所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法,其特征在于,RT-PCR扩增反应的条件为:42℃ 5min,95℃ 0.1min,95℃ 0.05min,60℃ 0.34min,共40个循环。
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