CN109295257A - 一种一步法pcr检测禽白血病病毒a/b/j/k亚群引物组及试剂盒 - Google Patents

一种一步法pcr检测禽白血病病毒a/b/j/k亚群引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及试剂盒，其特征在于包括禽白血病病毒A/B/J/K亚群的检测引物组和由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出核苷酸序列制备的ALV‑A、ALV‑B、ALV‑J、ALV‑K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照，能够快速、特异、敏感、高效的检测禽白血病，并区分禽白血病A/B/J/K亚群，适用于禽白血病流行病学调查，有助于禽白血病的净化。

Description

一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术
禽白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒（Avian leukosisvirus，ALV）引起的造血细胞增生为主的一类肿瘤性疾病。可以通过水平和垂直两种方式传染易感鸡群。根据病毒干扰模式、宿主范围和囊膜糖蛋白的不同，将ALV分为A-J 10个亚群，其中鸡源禽白血病病毒包含A、B、C、D、E和J 6个亚群。E亚群为内源性禽白血病病毒，没有致瘤性。A、B、C、D、J亚群为外源性禽白血病病毒，能诱发机体产生肿瘤引起死亡和生产性能下降。C、D亚群相对罕见且临床症状不明显，而A、B和J亚群是目前流行最广，是导致鸡群ALV发病的优势亚群，在许多禽类养殖场中十分常见。另外，2012年我国又分离鉴定到了新的亚群，即K亚群。近几年来ALV- K在我国的检出率呈上升趋势，且可能在我国多个地方鸡种中长期存在。
近几年禽白血病的流行和爆发给我国养禽业带来了严重的经济损失，目前临床上尚无可用的ALV疫苗及有效的药物。控制ALV传播的唯一手段是检测阳性鸡，并严格淘汰，最终得到纯净的种群。因而，准确、快速、实用的检测方法对禽白血病的防控至关重要。多重PCR检测方法快速、特异性好、敏感性高，适用于禽白血病流行病学调查，有利于临床监测以及禽白血病的净化工作。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组核苷酸序列，包括引物Pl、P2、P3、P4和P5；其中P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物；P5为检测ALV-K亚型病毒的下游引物；由所述的引物组进行扩增出的目的核苷酸序列，为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：
（1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4中所示的目的核苷酸序列；
（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；可在一个PCR反应中即可快速、准确地检测禽白血病病毒并区分亚群。
本发明另一个目的是提供一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群试剂盒，包括引物组、由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出的目的核苷酸序列克隆至pMD-18-T载体所得的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照；所述试剂盒反应体系包括：PCR-Mix 25 μl；dd H2O 6 μl；浓度10 pmol/μl的上游引物6μl、下游引物各2 μl; cDNA 5 μl；所述试剂盒反应条件包括：预变性95 ℃，4 min；再经95 ℃变性45 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。其灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化种鸡场禽白血病病毒进行分型检测，大大降低了禽白血病的检测时间及成本。
本发明的技术方案是这样实现的：一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组核苷酸序列，其特征在于包括引物Pl、P2、P3、P4和P5；其中P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物；P5为检测ALV-K亚型病毒的下游引物；
所述核苷酸序列为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：
（1）如下所示的核苷酸序列
Pl:5’-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3’;
P2:5’-AACCCAGATACCAAGGAACC-3’;
P3:5’-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3’;
P4:5’-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3’;
P5:5’-CCCATTCCCCTATTCCCTCG-3’；
（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
应用PCR检测引物组进行扩增的条件为:
采用50μl的反应体系，包括：PCR-Mix 25 μl；dd H2O 6 μl；浓度10 pmol/μl的上游引物6μl、浓度10 pmol/μl的下游引物各2 μl; cDNA 5 μl。
设置如下条件进行反应：预变性95 ℃，4 min；再经95 ℃变性45 s，56 ℃退火35s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
由所述的引物组进行扩增出的目的核苷酸序列，为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：
（1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4中所示的目的核苷酸序列；
（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
ALV-A亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-A亚型病毒cDNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到375 bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-18-T载体，即得；
ALV-B亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-B亚型病毒cDNA为模板，以Pl和P3为引物进行PCR扩增，得到581 bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-18-T载体，即得；
ALV-J亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-J亚型病毒cDN A为模板，以Pl和P4为引物进行PCR扩增，得到683 bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-18-T载体，即得；
ALV-K亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-K亚型病毒cDN A为模板，以Pl和P4为引物进行PCR扩增，得到1377 bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-18-T载体，即得。
一种一步法PCR检测禽白血病A/B/J/K亚群病毒引物组的诊断试剂盒，其特征在于包括：检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组和由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出的目的核苷酸序列克隆至pMD-18-T载体制备的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照。
相比现有技术本发明的积极效果是：
1. 本发明的引物组，涵盖了禽白血病病毒广泛流行的A/B/J/K四个亚群，可在一个PCR反应中即可快速、准确地检测禽白血病病毒并区分亚群。
2. 本发明的试剂盒所包含的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K亚型病毒阳性对照质粒，是通过禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出的目的核苷酸序列克隆至pMD-18-T载体所得，目的片段大小分别为375 bp、581 bp、683 bp和1377 bp，可通过一个PCR反应后目的片段大小进行禽白血病病毒亚群区分，简便快捷，省时省力。
3. 本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化种鸡场禽白血病病毒进行分型检测，大大降低了禽白血病的检测时间及成本，为禽白血病的流行病学调查、临床监测以及禽白血病的净化提供了有效工具。
附图说明
图1 pMD-A、pMD-B、pMD-J、pMD-K 质粒PCR扩增结果。
图2 引物浓度筛选结果。
图3 退火温度筛选结果。
图4 特异性试验结果。
图5 灵敏度试验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1 PCR引物的设计
从GenBank数据库中下载表1中ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K基因序列全长，用DNA star软件进行序列比对，在四个亚群共同的最保守pol基因区设计一条共用的上游引物P1，在亚群特异性env基因区设计四条不同的下游引物P2、P3、P4和P5。 其中，P1与P2可以扩增出375bp的片段用以检测ALV-A，P1与P3可以扩增出581 bp的片段用以检侧ALV-B，P1与P4可以扩增出683 bp的片段用以检测ALV-J，P1与P5可以扩增出1377 bp的片段用以检测ALV-K。引物序列下表1。
表1
引物 亚型 5’-3’序列 产物大小
P1 GCCAAACGGATTTCTGCCTT
P2 ALV-A AACCCAGATACCAAGGAACC 375 bp
P3 ALV-B ACAGATGGACCAATTCTGTCTC 581 bp
P4 ALV-J ATTGTTCCACAACACCTCTG 683 bp
P5 ALV-K CCCATTCCCCTATTCCCTCG 1377 bp
实施例2 标准阳性质粒构建
将从ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K前病毒DNA中扩增到的特异条带用DNA凝胶回收试剂盒回收，分别克隆到 pMD-18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取单克隆后提质粒送测序鉴定。结果如图1所示，M：DNA分子标准DL2000；1：pMD-A；2：pMD-B；3：pMD-J；4：pMD-K，其中，克隆ALV-A 375 bp片段的质粒命名为 pMD-A，为ALV-A亚型病毒标准阳性对照质粒；克隆ALV-B 581 bp片段的质粒命名为 pMD-B，ALV-B亚型病毒标准阳性对照质粒；克隆ALV-J683 bp片段的质粒命名为 pMD-J，ALV-J亚型病毒标准阳性对照质粒；克隆ALV-K 1377 bp片段的质粒命名为 pMD-K，ALV-K亚型病毒标准阳性对照质粒。
实施例3 PCR方法建立及条件优化
将提取的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K前病毒DNA分别稀释到100 ng/μl，等浓度混合后为模板，在50 μl反应体系中从10 pmol/L引物浓度 (上游引物P1分别是2 μl、4 μl、6 μl和8 μl；下游引物P2、P3、P4和P5各2 μl（结果如图2所示M：DNA分子标准DL2000；1：上游引物2μL；2：上游引物4μL；3：上游引物6 μL；4：上游引物8 μL）)，退火温度(53 ℃，56 ℃，59 ℃（结果如图3所示M：DL 2000标准分子量；1-3：退火温度分别为53℃、56℃、59℃时的扩增结果）)等条件进行优化，筛选获得多重PCR反应的最佳条件见下表2：
表2
50 μl体系
Premix DNA聚合酶 25 μl
P1 6 μl
P2 2 μl
P3 2 μl
P4 2 μl
P5 2 μl
灭菌水 6 μl
模板 5 μl
程序如下：95 ℃，4 min；再经95 ℃变性45 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
实施例4 PCR方法的特异性实验
提取A、B、J、K型ALV的前病毒DNA以及GPV和DF1细胞的DNA。同时提取NDV、IBDV和IBV的RNA并反转录成cDNA。用已经建立好的多重PCR检测方法分别扩增上述模板，结果如图4所示M：DL 2000标准分子量；1：ALV-A；2：ALV-B；3：ALV-J；4：ALV-K；5：GPV；6：IBDV；7：IBV；8：NDV；9：DF1，该多重PCR只能够从阳性对照(ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的等浓度混合的前病毒DNA)中扩增出四条特异性的目的条带，而对于其他禽类常见病毒（GPV、IBDV、IBV和NDV)和DF1细胞中均未扩增出特异条带。
实施例5 PCR方法的敏感性实验
将建构建好的4个质粒( pMD-A、pMD-B、pMD-J和pMD-K)用微量分光光度计测定质粒浓度C值，根据公式拷贝数(copies/μl)=C值×10－9×6.02×1023/碱基数(目的片段＋载体)×分子量，将浓度换算成DNA拷贝数。把每个质粒稀释成1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100和1.0× 10-1 copies/μl。同时，将这四个质粒等浓度混合后也做上述倍比稀释，用已经建立好的多重PCR检测方法分别扩增，结果如图5 所示M：DL 2000标准分子量；1-6：以1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100、1.0×10-1拷贝/μL为模板的PCR结果，该PCR方法对于单个亚群的敏感性可以检测到1.0×101和1.0×100copies/μl。
实施例6 PCR方法的检测实例
在临床采集禽白血病A、B、J 亚型阳性病料100份（标准ELISA检测方法只能将ALV分为J型和AB型两类，K亚型目前尚无商品化检测方法），应用本研究建立的多重PCR方法，对比其检测结果见表3。
表3
J亚型 A、B亚型 阴性
ELISA方法 40 36 24
多重PCR方法 38 34 28
符合率 95% 94.4% N/A
结果分析可知，本多重PCR方法与常规ALV鉴定方法的阳性符合率为94.4%~95%。与常规鉴定方法相比，本方法在保证阳性检出率的同时，还可以将A/B/J/K亚型进行区分。
序列表
<110> 吉林省畜牧兽医科学研究院
<120> 一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(ALV-A sequence)
<400> 1
gccaaacgga tttctgcctt tctacacagt cagccacctc cccttttcaa acatgtttga 60
taggtatccc gtcccctatt tctgagggtg attttaaggg atatgcttct gatacaaatt 120
gcgccacctc ggaaactgac cggttagtct cgtcagctga ctttactggc ggtcctgaca 180
acagcaccac cctcacttat cggaaggtct catgcttatt attaaagctc aatgtttcta 240
tgtgggatga gccacctgaa ctacagctgt taggttccca gtctctccct aacattacta 300
atattactca gatctccggt gtaaccgggg gatgcgtagg cttcaggcca aaaggggttc 360
cttggtatct gggtt 375
<210> 2
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列(ALV-B sequence)
<400> 2
gccaaacgga tttctgcctt tctacacagt cagccacctc cccttttcaa acatgtttga 60
taggtatccc gtcccctatt tctgagggtg attttaaggg atatgtctct gataattgca 120
ccactttgga acctcaccgg ttagtctcga gaggcattcc tggcggccct gagaacagca 180
caaccctcac ctatcagaag gtttcatgct tgttgttaaa gctgaatgtt tctctgttgg 240
acgagccatc agaactacaa ctgctaggtt cccagtctct ccccaatata actaatatta 300
ctcggatccc cagtgtggct gggggatgca taggctttac cccatacgat agtccggctg 360
gtgtctacgg atgggaccgg agagaggtta cacacatcct tctgaccgac ccagggaaca 420
atcctttctt tgataaggcc tctaactcct cgaaaccgtt tacagtagtg acagcggaca 480
ggcacaatct ctttatgggg agtgagtact gtggtgcata tggctacagg ttctgggaaa 540
tgtacaattg ctcccaaatg agacagaatt ggtccatctg t 581
<210> 3
<211> 683
<212> DNA
<213> 人工序列(ALV-J sequence)
<400> 3
gccgaacaga tttttgcctt agtctacagt cagcgacctc accattccgc acctgcttga 60
taggcattcc acagtatcct ctgaacacct ttaagggata tgtcactaat gttactgctt 120
gcgataacaa caccgattta gccagccaaa cagcatgctt gataaaggct ctaaatacaa 180
ccctcccttg ggacccccaa gaattggata ttttagggtc ccagatgatc aagaacggaa 240
caacacgtac gtgtgttacc tttggttcgg tgtgctataa agagaacaat cgcagtagag 300
tctgtcacaa ttttgatggg aatgttaatg ggactggtgg ggcggaacga gagttgcgtg 360
acttcatagc aaaatggaaa agtgatgacc ttcttataag gccctatgtc aaccaatcat 420
ggacgatggt aagtccaata aacgtagaga gtttttcaat aagtcgtaga tattgtggat 480
tcaccagtaa cgagactcgt tactatagag gggacctttc taattggtgt agttcaaaaa 540
ggggagaatg gtcagcgggg tacagcaacg ggacaaaatg ttccagcaac acgacgggtt 600
gtggtggtaa ttgcacaacg gaatggaatt attatgcata tgggtttacc ttcggggaac 660
agccagaggt gttgtggaac aat 683
<210> 4
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列(ALV-K sequence)
<400> 4
gccaaacgga tttctgcctc tctacacagt cagccacctc cccttttcaa acatgtttga 60
taggtatccc gtcccctatt tccgaaggtg attttaaggg atacgtctct gataattgca 120
ccaccttggg aactgaccgg ttagtctcgt cagccagcat taccggcggc cctgacaaca 180
gcaccaccct cacttatcga aaggtttcat gcttgctgtt aaagctgaat gtctctctgt 240
tggatgagcc accggaacta cagttgctag gttcccagtc tctccctaac attactaaca 300
ttactcagat ctctggcgta gccgggggat gcgtagcttt cggcccccgg agcattgaca 360
cgctttcaga ttggtccagg ccgcaactca cgaggtggct cctcctccgc cgcaactaca 420
cagaaccgtt tacggtggtg acagcggata gacacaatct ttttaggggg attgagtact 480
gcggtacata tggttacaga ttttggaagc tatacaattg tgcacagaca ggttctcgct 540
tccgctgtgg gcgcgtgcct gtcgggggcc tccctgagac cgggtgcaca cgcacaggag 600
gtatatgggt taatcaatca aaggaagtta acgagacaaa gccgttcagt tttactgcga 660
actgtacagc tagtaatttg ggtaatgtca gcggatgttg tgggaaaaca cccacgactc 720
tcccaccagg ggcgtggatc gacagcacac aaggtagttt cactaaacca aaagcgctac 780
cacccgcaat tttcctcatt tgtggggatc gcgcatggca aggaattccc agtcgtccgg 840
tagggggccc ctgctattta ggcaagctta ccatgttagc acccaaccac acagaaattc 900
tcaaggtgct tgccaactca tcgcggacag gtatgagacg taaacgaagc atctcacacc 960
tggatgatac atgctcagat gaagtgcagc tttggggtcc tacggcaaga atctttgcat 1020
ctatcttagc cccgggggta gcagctgcgc aagccttaag agaaatcgag agactagcct 1080
gttggtccgt taaacaggct aacttgacaa catcactcct cggggactta ttggatgatg 1140
tcacgagtat tcgacacgcg gccctgcaga accgagcggc tattgacttc ttgcttctag 1200
ctcacggcca tggctgtgag gacgttgccg gaatgtgttg tttcaatctg agtgatcaca 1260
gtgagtctat acagaagaag ttccagctaa tgaaggaaca tgtcaataag atcggcgtgg 1320
acagcgaccc aatcggaagt tggctgcgag gattattcga gggaataggg gaatggg 1377

Claims (4)

1.一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组，其特征在于包括：引物Pl、P2、P3、P4和P5；其中Pl为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物；P5为检测ALV-K亚型病毒的下游引物；
所述引物组核苷酸序列为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：
（1）如下所示的核苷酸序列
Pl:5’-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3’;
P2:5’-AACCCAGATACCAAGGAACC-3’;
P3:5’-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3’;
P4:5’-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3’;
P5:5’-CCCATTCCCCTATTCCCTCG-3’；
（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组，其特征在于所述的引物组进行扩增的条件为：采用50μl的反应体系，包括：2×PCR-Mix 25 μl;ddH2O 6 μl；浓度10 pmol/μl的上游引物6 μl、浓度10 pmol/μl的下游引物各2 μl；cDNA 5μl；设置如下条件进行反应：预变性95 ℃，4 min；再经95 ℃变性45 s，56 ℃退火35 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
3.根据权利要求1所述的一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组，其特征在于，利用所述的引物组进行PCR扩增出的目的核苷酸序列为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：
（1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4中所示的目的核苷酸序列；
（2）与（1）中所示的目的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
（3）与上述（1）或（2）所述目的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
4.一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群试剂盒，其特征在于包括：检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组和由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出的目的核苷酸序列克隆至pMD-18-T载体制备的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照。
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