CN102433397A - 禽白血病病毒的多重pcr检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽白血病病毒的多重PCR检测引物，包括检测禽白血病病毒A亚群、B亚群和J亚群的检测引物，同时，公开了多重PCR的反应体系和反应条件。本发明所提出的检测方法具有快速、准确、廉价的优点。

Description

禽白血病病毒的多重PCR检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种动物疾病检测方法，具体地，涉及禽白血病病毒的多重PCR检测引物及其应用。

背景技术

禽白血病是由禽白血病病毒（avian lekosis virus，ALV）引起的以造血细胞恶性增生为主的一类传染病。包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病和髓细胞样白血病。禽白血病主要通过垂直和水平传播引起临床和亚临床感染，产生非肿瘤综合征，表现为生产指标发生变化，如性成熟推迟、母鸡产蛋率下降、蛋重下降、受精率下降和孵化率下降，由此严重影响鸡的生产性能，最终产生肿瘤，导致鸡的死亡。并且该病能够通过垂直传播危害子代鸡，严重影响雏鸡的质量，造成较大的经济损失。此外，禽白血病一但感染后，可引起鸡群的免疫抑制，会继发诸如马立克氏病、传染性法氏囊、鸡传贫等免疫抑制病，从而造成更严重的损失。自1908年首次报道并分离到ALV以来，禽白血病已分布于世界各地，我国也有该病的流行和发生。近年来，湖北、山东等地鸡白血病疑似病例频发，重庆、广西等省份也有相关报道，鸡群ALV的感染率高达60%，病死率高达50%以上。而我国西北地区尚未见禽白血病流行报告，据此本实验拟通过建立禽白血病的PCR诊断方法，对甘肃省各鸡场进行禽白血病的分子流行病学调查，准确而详细的掌握该病对本地养禽业的危害情况，为制定有效的疾病防制措施提供理论依据和技术支持，并采取相应的措施淘汰带毒病鸡，通过不断地净化达到纯化鸡群的目的。

禽白血病在世界范围内几乎所有鸡群均有发生，严重影响养禽业的可持续发展，因此具有重要的经济意义。我国对于禽白血病的综合防控体系还不够完善，仍需加强对该病毒的分子生物学、分子遗传学研究，加快建立更加快速、敏感及准确的检测方法，并应用于实践，以便对该病更好地进行监控。目前，该病尚无切实可行的防治措施。既无疗效好的抗病毒药物，又无有效的疫苗可使用。预防本病的主要方法是培育具有遗传性抵抗力的新品种，淘汰阳性鸡，净化种群，经过儿代选育净化出无白血病鸡群。要建立一个无白血病鸡群必须从孵化、饲养到维持都必须使鸡群处在无先天性感染的隔离状态。目前国内外相继建立了多种检测ALV 的方法，主要包括传统的病毒分离与鉴定、血清学检测方法和分子生物学检测方法。

自1868年，国外学者报道禽白血病以来，研究工作者就对其进行了许多的研究，并在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了许多进展。国内外已经建立了一些禽白血病检测诊断方法，如琼脂扩散试验、病毒中和试验、补体结合试验、ELISA、放射免疫、免疫荧光技术等。而这些方法大多是用于实验室研究，很少能进入临床应用。国外的ELISA检测方法建立比较早，1979年以来，美、英、澳、日等国家相继报道应用ELISA方法检测禽白血病，如1983年Pyane L.N等应用ELISA方法对鸡群进行检测，随后(1985)美国制成ELISA试剂盒井于市场出售。Smith E J.等建立了PCR法检测ALV-J前病毒DNA，寡核苷酸序列设计基于前病毒E元件序列和3’末端TLR。这种方法具有很高的特异性和敏感性，可代替常规的病毒分离。Smith L M.等所建立的PCR方法，是从pol基因片段选取一段作为下游寡核苷酸序列，这种方法可避免内源性EAV序列发生非特异性反应。Arshda等应用原位杂交技术，以DIG标记的特异性核酸探针检测感染ALV-J(HPRS一103)病鸡组织中的RNA复制，也取得了成功。有人利用感染的CEF的ALV-J的囊膜糖蛋白作为抗原进行了ELISA试验。Venugopal应用重组gp85基因产物作为抗原进行的新型ELISA获得了良好的效果。在我国，八十年代中期哈尔滨兽医研究所首先建立了简便易行，适用于现场大面积应用的从羽髓中检测禽白血病病毒群特异性抗原的琼脂扩散试验，随后国内多家单位相继研制出该方法。但琼扩试验的敏感性较差，并有一定的假阳性出现，因此，人们将目光转向更加敏感、特异、操作方便的ELISA检测方法。国内1991年起哈尔滨兽医研究所开展了从蛋清、泄殖腔拭子等样品中检测禽白血病的双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)技术及其在生产实践中应用的研究工作，并取得了阶段性的进展。国内其他单位也在ELISA方法上作了初步的尝试。任德林等(1992)建立了抗p27、p19蛋白的杂交瘤细胞株。黄进等 (1994)以双抗体夹心酶联免疫吸附试验为基本原理，研制出禽白血病抗原ELISA试剂盒，秦爱建等国应用特异性ALV-J单克隆抗体JE9建立了免疫荧光检测ALV-J抗原和抗体的方法也具有很高的特异性。

上述各种诊断方法都存在各自的不足之处，如操作复杂、检测成本高、敏感性差等。因此在实际生产实践中迫切需要一种快速、准确、廉价的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种禽白血病病毒的多重PCR检测引物，该引物用于检测禽白血病病毒的3个亚群，本发明所提出的检测方法具有快速、准确、廉价的优点。

本发明具有以下有益效果：

传统的各种诊断方法都存在各自的不足之处，如病毒的分离鉴定法很难确保鸡体内不存在潜伏感染的病毒，更不能排除鸡发生再感染的可能；琼脂双向扩散试验法对大型集约化祖代鸡场来讲， 要实现全群净化，实际操作非常困难；荧光抗体实验需要荧光显微镜，所以有一定的局限性；现有的PCR方法成本较高、操作较复杂耗时、对人员素质要求较高,这些都限制其在生产中的实际应用等等，相比之下，本发明所提出的禽白血病病毒的多重PCR检测引物实现了在一次实验中快速检测出三个禽白血病病毒亚群的目的，相当于传统的三次PCR反应，另外，传统方法需要借助大型仪器来完成，这些仪器往往耗资巨大，增加了实验成本，因此，本发明的成本相比之下非常低廉，效率也相当高；在灵敏度方面，本方法灵敏度和特异性都非常高，能够检出的模板最小拷贝数是1000bp。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例2中多重PCR扩增结果示意图；

图2是实施例2中多重PCR敏感性实验结果示意图；

图3是实施例4中多重PCR特异性实验结果示意图。

结合附图，给出以下附图标记：

图1中：M：DNA分子质量标准；1：ALV-A；2：ALV-B；3：ALV-.J；4：ALV-A/B；5：ALV-A/J；6：ALV-B/J；7：ALV-A/B/J；

图2中：M：DNA分子质量标准；1~10：质粒拷贝数（1010，109，108，107，106，105，104，103，102，101）；

图3中：M：DNA分子质量标准；1：ALV-A/B/J；2~8：对照毒株（MDV，HVT，NDV，IBDV，ILTV，IBV，DF-1）。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1（产品实施例）

本发明所提出的一种禽白血病病毒的多重PCR检测引物，包括以下禽白血病病毒3个亚群A、B、J的3对核苷酸序列：

禽白血病病毒亚群A检测引物：

上游引物A3：5'-GGTTGGTCTAGACAGGAAGC-3'

下游引物A4：5'-CATTGCCACAGCGGTAC-3'

禽白血病病毒亚群B检测引物：

上游引物B3：5'-CATACGATAGTCCGGCTG-3'

下游引物B4： 5'-CCCCACACATCCTGACA-3'

禽白血病病毒亚群J检测引物：

上游引物J3： 5'-GGAGTTCATCTATTGCAACAACC-3'

下游引物J4： 5'-GCGCCTGCTACGGTGGT-3'。

其中，禽白血病病毒亚群A（ALV-A）检测引物是在env基因的上游596~615位点，下游775~791位点上设计的，该基因在Genbank中的登录号为M19113；

禽白血病病毒亚群B（ALV-B）检测引物是在env基因的上游569~586位点，下游805~821位点上设计的，该基因在Genbank中的登录号为M14902；

禽白血病病毒亚群J（ALV-J）检测引物是在env基因的上游175~197位点，下游1082~1098位点上设计的，该基因在Genbank中的登录号为Z46390。

实施例2（应用实施例）

本发明所提出的禽白血病病毒的多重PCR检测引物在禽白血病病毒检测中的应用，包括以下步骤：

（1）提取鸡血全基因组DNA，作为多重PCR的模板；

（2）以禽白血病病毒亚群A检测引物、禽白血病病毒亚群B检测引物和禽白血病病毒亚群J检测引物为3对检测引物，进行多重PCR；所述多重PCR的反应条件如表1和表2：

（3）取步骤（2）4μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并记录扩增条带的有无，并判断感染的病毒亚群。

通过以上步骤，琼脂糖凝胶电泳可以检测出三种条带，大小分别为：196bp，253bp，924 bp。

其中，196bp的条带由引物ALV-A扩增出，经测序，该片段为基因env的一个片段SEQ ID NO:1；

253bp的条带由 引物ALV-B扩增出，经测序，该片段为env基因的片段SEQ ID NO:2；

924 bp的条带由引物ALV-J扩增出，经测序，该片段为env基因中的gp85蛋白基因SEQ ID NO:3。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，图1是多重PCR扩增结果示意图，其中，M：DNA分子质量标准；1：ALV-A；2：ALV-B；3：ALV-.J；4：ALV-A/B；5：ALV-A/J；6：ALV-B/J；7：ALV-A/B/J，在确定最佳退火温度为58℃的优化反应条件下，以3对引物进行多重PCR扩增，能够从A、B、J亚群的单一模板和混合模板中有效地扩增出各自特异性的目的片段，且引物间无非特异性片段扩出，1泳道为单一模板A亚群，2泳道为单一模板B亚群，3泳道为单一模板J亚群，4泳道为A、B亚群混合模板，5泳道为A、J亚群混合模板，6泳道为B、J亚群混合模板，7泳道为A、B、J亚群混合模板。

图2 是本实验的敏感性试验电泳图，其中，M：DNA分子质量标准；1~10：质粒拷贝数（10¹⁰，10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹），分别从3个亚群阳性克隆菌液中提取重组质粒，经紫外分光光度计测定质粒浓度后利用公式：拷贝数（copies／μL）=C值×10-9×6.02×1023／碱基数（目的基因＋载体）×分子量，计算每微升中的质粒拷贝数。将各亚群阳性质粒等比例混合，进行适当倍比稀释，确定多重PCR方法的最小检出拷贝数。1-10为模板的质粒拷贝数， A、B、J亚群的倍比稀释混合模板，从图中可以看出其多重PCR扩增产物的电泳条带亮度随着模板浓度递减而减弱，A、B、J亚群能够同时扩出3条清晰的特异性条带的相对最小检出拷贝数为1000。

实施例3（特异性实验）

本实施例为检测本发明所提出六条引物特异性的实施例：

分别提取：鸡马立克病病毒（MDV）感染的细胞基因组、火鸡疱疹病毒（HVT）感染的细胞基因组、新城疫病毒（NDV）感染的细胞基因组、传染性囊病病毒（IBDV）感染的细胞基因组、传染性喉气管炎病毒（ILTV）感染的细胞基因组、传染性支气管炎病毒（IBV）感染的细胞基因组、DF-1细胞基因组，以实施例2的方法进行多重PCR反应，其结果如图3所示。

图3 是本方法的特异性试验电泳图，其中，M：DNA分子质量标准；1：ALV-A/B/J；2~8：对照毒株（MDV，HVT，NDV，IBDV，ILTV，IBV，DF-1），在多重PCR优化条件下，以MDV、HVT、NDV、IBDV、ILTV、IBV、DF-1细胞的基因组为模板进行多重PCR扩增，检测其特异性。图片显示，本发明的引物对MDV、HVT、NDV、IBDV、ILTV、IBV、DF-1细胞的基因组模板均未扩增出任何条带，表明该方法只能检出禽白血病A、B和J亚群病毒，对其他禽常见病毒病不出现交叉反应。

实施例4（与ELISA的对比实验）：

通过酶联免疫（ELISA）方法同样检测禽白血病病毒的三个亚群，以感染禽白血病病毒的鸡血清为检测样本，比较数据如表3下：

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种禽白血病病毒的多重PCR检测引物，包括针对禽白血病病毒A、B、J亚群的3对特异性寡核苷酸引物序列：

禽白血病病毒亚群A检测引物：

上游引物A3：5'-GGTTGGTCTAGACAGGAAGC-3'

下游引物A4：5'-CATTGCCACAGCGGTAC-3'

禽白血病病毒亚群B检测引物：

上游引物B3：5'-CATACGATAGTCCGGCTG-3'

下游引物B4： 5'-CCCCACACATCCTGACA-3'

禽白血病病毒亚群J检测引物：

上游引物J3： 5'-GGAGTTCATCTATTGCAACAACC-3'

下游引物J4： 5'-GCGCCTGCTACGGTGGT-3'。

2.权利要求1所述的禽白血病病毒的多重PCR检测引物在禽白血病病毒检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：

（1）提取家禽全基因组DNA，作为多重PCR的模板；

（2）以禽白血病病毒亚群A检测引物、禽白血病病毒亚群B检测引物和禽白血病病毒亚群J检测引物为3对检测引物，进行多重PCR；

所述多重PCR的反应条件为：

反应体系为25μL：三个亚群A、B、J的上下游每条引物1μL；模板3μL；预混酶12.5μL；水补足至25μL；

预变性：95℃   5 min；

变性：  94℃   45s；

退火：  58℃   45s；

延伸：  72℃   1min；

循环数：35；

循环末延伸：72℃  10 min；

（3）取步骤（2）反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。

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