CN109055615A - 一种检测a、b、j和k亚群禽白血病病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测a、b、j和k亚群禽白血病病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组，包括检测禽白血病病毒的通用上游引物SEQ ID NO.1，A亚群禽白血病病毒的下游引物SEQ ID NO.2，B亚群禽白血病病毒的下游引物SEQ ID NO.3，J亚群禽白血病病毒的下游引物SEQ ID NO.4，K亚群禽白血病病毒的下游引物SEQ ID NO.5。本发明还公开了一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR试剂盒，包括本发明所述的多重PCR引物组、Premix Ex Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、阴阳性对照质粒DNA模板。此外，本发明还公开了一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR方法。实验证明，应用本发明可以同时从样品中检测出A、B、J和K亚群禽白血病病毒，特异性强，灵敏度高，操作和结果判定简便，适合进行批量样品的检测及外源性ALV的初步鉴定。

Description

一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组、试剂 盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR 引物组、试剂盒及方法。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属于反转录病毒科α反转录病毒属成员，感染禽类能 够引起多种肿瘤性疾病。根据病毒囊膜蛋白抗原性差异、病毒干扰实验及宿主范围，ALV可分为A～K 11 个亚群(ALV-A～K)。自然感染鸡的有A～E和J亚群，近年来又从我国地方品种鸡中分离并鉴定了K亚群 禽白血病病毒(ALV-K)。其中，ALV-E为内源性病毒，对鸡不致病或致病性很弱。除ALV-E外，其它均 为外源性病毒。ALV-A和ALV-B在我国不同类型鸡群中普遍存在；ALV-C和ALV-D自然感染病例很少见 到；ALV-J与其它亚群病毒抗原性差异最大，且致病性和传染性最强，是发病鸡群中分离率最高的亚群。 前六个亚群ALV是欧美国家学者从该国饲养的主要类型鸡群中分离鉴定的；而ALV-K是2012年我国学者 从国内特有的地方品种鸡群首次分离鉴定的。经调查，ALV-K在我国黄羽肉鸡和地方品种鸡中具有较高分 离率，可能是我国或东亚地区地方品种鸡群中固有的亚群。
ALV感染鸡群后，可诱发多种多样的肿瘤。ALV-J感染时最常见肝脏的骨髓细胞样瘤和皮肤血管 瘤引起的死亡；其它亚群ALV感染时，最常见内脏的淋巴细胞瘤及纤维肉瘤；ALV-K复制能力相对弱， 往往被其它亚群ALV感染所掩盖而被忽视。这些肿瘤发生通常有较长的潜伏期，4～6个月甚至更长，是逐 渐发展的慢性肿瘤。临床也会出现急性肿瘤，但比较少见。感染鸡可因肿瘤而导致死亡，死亡率一般为 1％～2％，有的甚至更高。但大多数感染鸡仅表现亚临床症状，包括免疫抑制、生长迟缓、产蛋下降等。实 际上，由ALV感染后的亚临床病理作用带来的经济损失，可能大于临床上显示肿瘤性死亡带来的损失， 严重危害了我国养鸡业的健康发展。
禽白血病是垂直传播性疾病，控制该病最有效的措施是对鸡群进行种源净化，建立无外源性ALV 感染的种鸡核心群。其主要手段是通过对种鸡核心群定期进行外源性ALV检测，及时淘汰阳性鸡，以净 化和消除鸡群中的外源性ALV。因此，高效、快速、便捷的检测方法有利于控制ALV的传播。国内外对 ALV的检测和鉴定方法主要有病毒分离、ELISA、间接免疫荧光试验、PCR等。病毒分离方法最可靠，但 检测周期长，需要与其它方法配合才能鉴定亚群。群特异性抗原ELISA检测方法在我国临床上应用最广， 操作相对简便，有商品化试剂盒可以使用，但不能区分内源性和外源性ALV。间接免疫荧光试验比较直观， 但需要用到特异性单抗。针对ALV的PCR方法已有报道，但多为鉴定一种亚群的单一PCR。多重PCR 可在同一体系中同时扩增多个目的基因，节省时间和成本，检测效率显著高于单一PCR。已有报道建立了 针对ALV-A、ALV-B和ALV-J的多重PCR方法，但对于目前新鉴定且在黄羽肉鸡和地方品种鸡中广泛流 行的ALV-K并未涉及。
发明内容
本发明的目的是针对现有禽白血病病毒检测技术的不足，提供一种检测A、B、J和K亚群禽白血 病病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法。采用本发明的引物组、试剂盒及方法检测ALV，灵敏度高、 特异性强、操作简便。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明设计了一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组，包括一条针对ALV 的通用上游引物PF，由SEQ ID NO.1所示；一条针对ALV-A的下游引物AR，由SEQ IDNO.2所示；一 条针对ALV-B的下游引物BR，由SEQ ID NO.3所示；一条针对ALV-J的下游引物JR，由SEQ ID NO.4 所示；一条针对ALV-K的下游引物KR，由SEQ ID NO.5所示。
本发明构建了ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J和pMD19K， 混合后作为多重PCR阳性对照DNA模板。利用本发明设计的引物组，通过多重PCR确定最适模板浓度 和最佳引物浓度。
本发明组装了一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR检测试剂盒，内容包括检测 A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组、Premix Ex Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水及阴阳性对 照质粒DNA模板。其中，多重PCR引物组，PF、AR、BR、JR和KR引物浓度为5μmol/L，在PCR反应 体系中，PF引物终浓度为0.2μmol/L，AR、BR、JR和KR引物终浓度为0.1μmol/L；Premix Ex Taq DNA 聚合酶浓度为0.05U/μL，在PCR反应体系中，其终浓度为0.025U/μL；阴、阳性对照质粒DNA模板浓度 2.5×106拷贝/μL，在PCR反应体系中，其终浓度为1×105拷贝/μL。
使用本发明组装的试剂盒，对多重PCR退火温度、循环数等反应条件进行了优化，并对其特异性、 敏感性及重复性进行了验证，最终建立了检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR方法，包括如 下步骤：
(1)病毒分离及基因组提取：无菌采集抗凝血，推入1.5mL灭菌离心管，1500r/min离心3min， 取上清血浆接种DF-1细胞；病料样品用含青链霉素的灭菌PBS研磨后，4℃、10000r/min离心10min，取 上清接种DF-1细胞；精液、蛋清样品用含青链霉素的灭菌PBS/DMEM培养基做1:4～1:8倍稀释后，4℃、 10000r/min离心10min，取上清接种DF-1细胞；上述样品接种DF-1细胞后，37℃、5％二氧化碳培养箱反 应2h；PBS润洗一遍，加入1％胎牛血清DMEM培养基维持培养7～9d；收集DF-1细胞，采用DNAiso试 剂提取前病毒DNA作为PCR待检测模板。
(2)多重PCR反应：25μL反应体系中，Premix Ex Taq DNA聚合酶12.5μL，PF引物1μL，AR、 BR、JR和KR引物各0.5μL，待检测DNA模板1μL，无菌双蒸水8.5μL。同时各取1μL阴、阳性质粒DNA 作为模板，设置阴、阳性对照。PCR仪进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃ 退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min，降温至4℃结束。
(3)结果判断：取PCR扩增产物5μL，用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观 察。阴性对照未有特异性扩增条带，而阳性对照分别在195bp、417bp、567bp及742bp位置出现四条特异 性扩增条带，实验有效。检测样品如果在567bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在A亚群禽白血病 病毒感染；如果在417bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在B亚群禽白血病病毒感染；如果在195bp 位置出现单一扩增条带，则说明样品存在J亚群禽白血病病毒感染；如果在742bp位置出现单一扩增条带， 则说明样品存在K亚群禽白血病病毒感染；如果在195bp、417bp、567bp及742bp位置出现两条、三条或 四条扩增条带，则说明样品存在相对应的二重、三重或四重混合感染。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明设计的多重PCR引物组，通过共用一条ALV通用上游引物，减少了多重PCR反应 体系中引物数量，降低了反应中引物间互相干扰，提高了多重PCR的特异性。
(2)本发明的多重PCR检测试剂盒设置了阴、阳性对照质粒模板，既可以用于验证因操作失误 或PCR反应体系污染而引起的假阴性或假阳性结果，又可以作为参考Marker用于结果判断，保证了试剂 盒的可靠性。
(3)本发明的多重PCR检测试剂盒，通过一个PCR反应，就能从样品中同时检测出目前国内养 禽场主要流行、也是危害最为严重的外源性ALV，包括ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K。具有操作简便、 特异性强、敏感性高等优点，可节约时间、人力和物力成本，适合批量样品的检测，也适用于外源性ALV 的初步鉴定。
附图说明
图1为多重PCR对不同亚群ALV标准质粒模板扩增的电泳结果图。
图2为多重PCR对不同病毒DNA或cDNA模板扩增的特异性试验电泳结果图。
图3为多重PCR对不同拷贝ALV标准质粒混合模板扩增的敏感性试验电泳结果图。
图4为多重PCR对不同浓度ALV前病毒DNA混合模板扩增的敏感性试验电泳结果图。
图5为多重PCR对临床血浆样品前病毒DNA检测的电泳结果图。
图6为多重PCR对临床病料样品前病毒DNA检测的电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。但这些实施例仅用于解释本发明，而非用于限制本发 明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于 本发明范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂耗材等，如无 特殊说明，均可从商业途径购买获得。
实施例1一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组设计、试剂盒组装及方法 建立
1、引物的设计与合成
根据GenBank已发表的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K参考株基因序列设计多重PCR引物组： 在各亚群间均相对保守的pol基因序列设计一条通用上游引物PF；在亚群内相对保守，但在各亚群间差异 较大的gp85基因序列，分别设计4条下游引物，ALV-A下游引物AR，ALV-B下游引物BR，ALV-J下游 引物JR及ALV-K下游引物KR，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
SEQ ID NO. 引物名称 引物序列(5’→3’) 扩增片段大小(bp) 扩增病毒
1 PF GGAGAAGACACCCTTGCTG
2 AR GAAAGGGAGGATTGTCTAAGGAG 567 ALV-A
3 BR GAACCCAACAGTTGTAGTTCTGAT 417 ALV-B
4 JR GGTGAGGTCGCTGACTGTAGACT 195 ALV-J
5 KR TGTGCGTGTGCACCCGGTCT 742 ALV-K
2、标准质粒样品的构建
以临床分离并经测序鉴定的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K分离株JS15AJH03、JS15BJ01、 JS15YXB01和JS17LK01前病毒DNA为模板，分别使用通用上游引物和各亚群特异性下游引物进行PCR 扩增，胶回收PCR产物，连接pMD19-T载体并转染JM109感受态细胞，同时设置阴性对照，划线接种含 氨苄的LB固体培养皿，挑选菌落增菌培养，菌液经PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒提取质粒，阳性样品 分别命名为pMD19A、pMD19B、pMD19J和pMD19K，阴性对照亦提取质粒，测定质粒浓度。
3、引物浓度和标准质粒样品浓度的确定
用30％TE缓冲液分别稀释引物PF、AR、BR、JR及KR至10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、 0.625μmol/L、0.3125μmol/L，使用0.5～2.0μL引物量，以构建的标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K混合物作为模板，进行多重PCR反应，摸索引物最适配比及浓度。结果，PF、AR、BR、JR 和KR引物浓度5μmol/L；在25μL反应体系中，PF引物取1μL，终浓度为0.2μmol/L；AR、BR、JR和 KR引物各取0.5μL，终浓度为0.1μmol/L，PCR反应后各扩增条带最为清晰明亮。
用30％TE缓冲液分别稀释标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J和pMD19K至1×109拷贝/μL， 等比例混合后，再做梯度稀释至单模板浓度2.5×108～2.5×104拷贝/μL，各取1μL，以最适引物浓度进行多 重PCR反应，确定阳性对照质粒样品的最佳浓度。结果，当阳性对照质粒样品浓度为2.5×106拷贝/μL， 终浓度为1×105拷贝/μL时，各扩增条带清晰度最高。
4、退火温度和循环数的确定
多重PCR反应体系确定后，对其反应条件进行了优化，包括退火温度和循环数。退火温度设置 50.0℃、50.7℃、51.8℃、53.6℃、55.7℃、57.8℃、59.9℃、61.9℃、64.1℃、65.8℃、67.1℃、68.0℃共12 个梯度，循环数设置为20、25、30、35、40共5个梯度。结果，多重PCR反应退火温度55.7℃～61.9℃， 30个循环以上，扩增效果较好。则确定本发明的多重PCR反应退火温度为56℃，30个循环。
5、多重PCR检测试剂盒的组装
该试剂盒由引物组、DNA聚合酶、阴阳性对照质粒模板、无菌双蒸水构成，其具体组分如下： 5μmol/L PF、AR、BR、JR和KR引物，0.05U/μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，2.5×106拷贝/μL阴、阳性 对照质粒DNA模板。
6、多重PCR检测方法的建立
(1)病毒分离及基因组提取：无菌采集抗凝血，推入1.5mL灭菌离心管，1500r/min离心3min， 取上清血浆接种DF-1细胞；病料样品用含青链霉素的灭菌PBS研磨后，4℃、10000r/min离心10min，取 上清接种DF-1细胞；精液、蛋清样品用含青链霉素的灭菌PBS/DMEM培养基做1:4～1:8倍稀释后，4℃、 10000r/min离心10min，取上清接种DF-1细胞；上述样品接种DF-1细胞后，37℃、5％二氧化碳培养箱反 应2h；PBS润洗一遍，加入1％胎牛血清DMEM培养基维持培养7～9d；收集DF-1细胞，采用DNAiso试 剂提取前病毒DNA作为PCR待检测模板。
(2)多重PCR反应：25μL反应体系中，Premix Ex Taq DNA聚合酶12.5μL，PF引物1μL，AR、 BR、JR和KR引物各0.5μL，待检测DNA模板1μL，无菌双蒸水8.5μL。同时各取1μL阴、阳性质粒DNA 作为模板，设置阴、阳性对照。PCR仪进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃ 退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min，降温至4℃结束。
(3)结果判断：取PCR扩增产物5μL，用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观 察。如图1所示，泳道16阴性对照未有特异性扩增条带，而泳道17阳性对照分别在195bp、417bp、567bp 及742bp位置出现四条特异性扩增条带，实验有效。检测样品如果在567bp位置出现单一扩增条带，则说 明样品存在ALV-A感染(泳道1)；如果在417bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在ALV-B感染(泳 道2)；如果在195bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在ALV-J感染(泳道3)；如果在742bp位置 出现单一扩增条带，则说明样品存在ALV-K感染(泳道4)；如果在195bp、417bp、567bp及742bp位置 出现两条、三条或四条扩增条带，则说明样品存在相对应的ALV二重、三重或四重混合感染(泳道5～15)。
实施例2一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR试剂盒特异性试验
使用实施例1构建的多重PCR试剂盒及方法，提取ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K分离株前病 毒DNA，同时以实验室保存的H9亚型禽流感病毒(AIV)cDNA、新城疫病毒(NDV)cDNA、马立克氏 病病毒(MDV)DNA、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)cDNA、传染性支气管炎病毒(IBV)cDNA 及禽呼肠孤病毒(ARV)cDNA作为模板，进行多重PCR特异性试验。
结果如图2所示，泳道12阴性对照无特异性扩增条带，泳道13阳性对照在195bp、417bp、567bp 及742bp位置有四条特异性扩增条带，实验有效。泳道1～5分别为ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K前病 毒DNA及四个亚群ALV前病毒DNA混合物多重PCR扩增产物，均能扩增出与目的片段相符的条带。而 泳道6～11分别为AIV、NDV、MDV、REV、IBV及ARV cDNA或DNA多重PCR产物，均未扩增出特 异性条带。以上结果说明本发明的一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组、试剂盒 及方法可以特异性地检测出ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K。
实施例3一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR试剂盒敏感性试验
使用实施例1构建的多重PCR试剂盒及方法，将阳性标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J和 pMD19K混合后，做10倍梯度稀释，1×109～1×100拷贝/μL；同时将ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K 分离株前病毒DNA混合后，亦做10倍梯度稀释，100ng/μL～0.1fg/μL，以此作为模板，进行多重PCR敏 感性试验。
结果如图3和图4所示，对于图3质粒模板，泳道1～10分别对应了1×109、1×108、1×107、1 ×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL阳性标准质粒，当质粒模板浓度为1× 103拷贝/μL时，多重PCR仍能扩增出ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K四条特异性条带；对于图4前病 毒DNA模板，泳道1～10分别对应了100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、 10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL前病毒DNA，当前病毒DNA模板浓度为100pg/μL时，多重PCR仍能扩增出 ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K四条特异性条带。以上结果说明本发明的一种检测A、B、J和K亚群 禽白血病病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法具有较高的敏感性，能对1×103拷贝/μL质粒混合模板和 100pg/μL前病毒DNA混合模板做出检测。
实施例4多重PCR试剂盒对临床样品的检测
按照实施例1构建的多重PCR试剂盒及方法，对从地方品种鸡采集的99份血浆样品及18份肝、 脾、肾等肿瘤样品进行病毒分离及前病毒DNA提取，以此作为模板进行多重PCR检测。
结果如图5和图6所示，图5为血浆样品前病毒DNA多重PCR检测结果，图6为病料样品前病 毒DNA多重PCR检测结果。图5中，泳道16为阴性对照，泳道17为阳性对照，泳道1～15为血浆样品。 图6中，泳道16为阴性对照，泳道17为阳性对照，泳道1～15为病料样品。可以看到，血浆样品禽白血 病感染类型比较多样，既有ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的单一感染，又存在ALV-J与ALV-K、ALV-B 与ALV-J的二重感染，以及ALV-A、ALV-B与ALV-J/ALV-K等的三重感染。相对来说，病料样品禽白血 病感染类型更为简单。但无论血浆还是病料，ALV-J单一感染最为普遍，阳性率45.3％(53/117)；其次为 ALV-J与ALV-K的二重感染，阳性率20.5％(24/117)；再次为ALV-K的单一感染，阳性率16.2％(19/117)。 实验结果进一步证实了ALV-K在地方品种鸡中流行的普遍性。对其中48个分离株分别进行ALV-A、ALV-B、 ALV-J和ALV-K单一PCR，多重PCR与其符合率97.9％。由此可见，本发明的一种检测A、B、J和K亚 群禽白血病病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法在外源性ALV检测及初步鉴定中，具有良好的应用效 果和显著优势。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 禽白血病病毒(Avian leukosis virus)
<400> 1
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<212> DNA
<213> 禽白血病病毒(Avian leukosis virus)
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<212> DNA
<213> 禽白血病病毒(Avian leukosis virus)
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<212> DNA
<213> 禽白血病病毒(Avian leukosis virus)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 禽白血病病毒(Avian leukosis virus)
<400> 5
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Claims (7)

1.一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组，所述引物组包括：SEQ IDNO.1所示的禽白血病病毒通用上游引物PF，SEQ ID NO.2所示的A亚群禽白血病病毒下游引物AR，SEQ ID NO.3所示的B亚群禽白血病病毒下游引物BR，SEQ ID NO.4所示的J亚群禽白血病病毒下游引物JR，SEQ ID NO.5所示的K亚群禽白血病病毒下游引物KR。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于所述引物组不包括其它上游引物。
3.一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求书1所述的检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR引物组，与Premix Ex Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水及阴阳性对照质粒DNA模板组合而成。
4.根据权利要求书3所述的检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求书1所述的多重PCR引物组，PF、AR、BR、JR和KR引物浓度为5μmol/L，在PCR反应体系中，PF引物终浓度为0.2μmol/L，AR、BR、JR和KR引物终浓度为0.1μmol/L；Premix Ex Taq DNA聚合酶浓度为0.05U/μL，在PCR反应体系中，其终浓度为0.025U/μL；阴、阳性对照质粒DNA模板浓度2.5×106拷贝/μL，在PCR反应体系中，其终浓度为1×105拷贝/μL。
5.一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR方法，其特征在于该方法采用权利要求3或4所述的检测试剂盒，包括以下步骤：
(1)病毒分离及基因组提取；
(2)多重PCR反应；
(3)结果判断；
优选的，所述多重PCR方法是非诊断目的的。
6.根据权利要求5所述的多重PCR方法，其特征在于PCR仪进行扩增反应的反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min，降温至4℃结束。
7.一种检测A、B、J和K亚群禽白血病病毒的多重PCR方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)病毒分离及基因组提取：无菌采集抗凝血，推入1.5mL灭菌离心管，1500r/min离心3min，取上清血浆接种DF-1细胞；病料样品用含青链霉素的灭菌PBS研磨后，4℃、10000r/min离心10min，取上清接种DF-1细胞；精液、蛋清样品用含青链霉素的灭菌PBS/DMEM培养基做1:4～1:8倍稀释后，4℃、10000r/min离心10min，取上清接种DF-1细胞；上述样品接种DF-1细胞后，37℃、5％二氧化碳培养箱反应2h；PBS润洗一遍，加入1％胎牛血清DMEM培养基维持培养7～9d；收集DF-1细胞，采用DNAiso试剂提取前病毒DNA作为PCR待检测模板；
(2)多重PCR反应：25μL反应体系中，Premix Ex Taq DNA聚合酶12.5μL，PF引物1μL，AR、BR、JR和KR引物各0.5μL，待检测DNA模板1μL，无菌双蒸水8.5μL；同时各取1μL阴、阳性质粒DNA作为模板，设置阴、阳性对照；PCR仪进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min，降温至4℃结束；
(3)结果判断：取PCR扩增产物5μL，用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察；阴性对照未有特异性扩增条带，而阳性对照分别在195bp、417bp、567bp及742bp位置出现四条特异性扩增条带，实验有效；检测样品如果在567bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在A亚群禽白血病病毒感染；如果在417bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在B亚群禽白血病病毒感染；如果在195bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在J亚群禽白血病病毒感染；如果在742bp位置出现单一扩增条带，则说明样品存在K亚群禽白血病病毒感染；如果在195bp、417bp、567bp及742bp位置出现两条、三条或四条扩增条带，则说明样品存在相对应的二重、三重或四重混合感染。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943537A (zh) * 2019-04-12 2019-06-28 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液及制备方法
CN112695138A (zh) * 2021-01-27 2021-04-23 贵州大学 一种禽白血病病毒a/b/j亚群三重pcr检测引物及其应用
CN113416796A (zh) * 2021-07-08 2021-09-21 贵州省畜牧兽医研究所 一种家禽白血病病毒检测方法
CN113481199A (zh) * 2021-08-19 2021-10-08 青岛易邦生物工程有限公司 一种鉴定水禽圆环病毒两种基因型的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI GAO: "Development and Application of a Multiplex PCR Method for Rapid Differential Detection of Subgroup A, B, and J Avian Leukosis Viruses", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
QI SU: "Molecular characteristics of avian leukosis viruses isolated from indigenous chicken breeds in China", 《POULTRY SCIENCE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943537A (zh) * 2019-04-12 2019-06-28 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于公鸡精液中禽白血病病毒分离的处理液及制备方法
CN112695138A (zh) * 2021-01-27 2021-04-23 贵州大学 一种禽白血病病毒a/b/j亚群三重pcr检测引物及其应用
CN113416796A (zh) * 2021-07-08 2021-09-21 贵州省畜牧兽医研究所 一种家禽白血病病毒检测方法
CN113481199A (zh) * 2021-08-19 2021-10-08 青岛易邦生物工程有限公司 一种鉴定水禽圆环病毒两种基因型的方法

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