CN105675861A - 一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的gcrv病毒ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的GCRV病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法，所述试剂盒含有固定在细胞培养板上的细胞内阳性抗原，其制备方法为将草鱼呼肠孤病毒株接种到GSB细胞悬液中，加入到细胞板中，培养成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用固定液固定，干燥后即可。该试剂盒可以对无明显CPE的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒进行定量分析，测定病毒的浓度和滴度；同时可以检测草鱼多份血清样品并达到早期诊断的目的，对草鱼出血病的诊断、流行病学调查和病原监测具有较高的临床使用及推广价值；通过该试剂盒的应用，将为我国控制并最终消灭草鱼出血病提供技术保障，从而降低水产养殖过程中因草鱼出血病所带来的巨大经济损失。

Description

一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的GCRV病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法及试剂盒。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率一般为30%-50%，最高可达60%-90%，而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条鱼等，并能使这几种鱼发生出血病症状而死亡，该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重影响了广大养殖者的积极性和我国淡水养殖业的健康发展。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了20多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、GCHV-854、GCRVHZ08、JX09-01、GCRV-104、GD10、HuNan1307、GZ1208等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。草鱼呼肠孤病毒至今还没在血清学或者基因型上对其进行系统分类。根据现有的分离株序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因型，即GCRVⅠ型（代表株为GCRV-873与GCRV-JX09-01）、GCRVⅡ型（代表株为GCRV-HZ08与GCRV-GD10）和GCRVⅢ型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。通过我们2011年至2015年这5年的草鱼出血病监测和流行病学调查分析表明，目前导致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRVⅡ型。因此，对GCRVⅡ型病毒引起的草鱼出血病的特异性诊断具有重要意义。

草鱼呼肠孤病毒的检测方法有多种，各具优势和缺陷，病毒分离、电镜观察、核酸带型分析至今仍是检测草鱼呼肠孤病毒普遍采用的方法，但这些方法法费时费力、操作比较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于草鱼出血病的流行病学调查工作。全病毒诊断涉及病毒培养、纯化及浓缩等过程，不仅制作过程复杂，耗时，成本较高，而且还潜在散毒危险，因此不利于推广使用。当前，对于草鱼呼肠孤病毒的检测，最为常用的方法是基于PCR扩增技术的各种分子生物学检测方法，包括常规的RT-PCR和荧光定量PCR等，具有较高的敏感性和特异性。但这些分子生物学方法都是检测病毒的核酸存在与否，方法单一，经常导致假阳性和假阴性结果，难于对该病做到确诊。因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法的不足，如各种免疫学（血清学）检测方法。

目前，针对草鱼出血病的疫苗，无论是法规许可的细胞弱毒疫苗还是市场上流行的土法疫苗，甚至一些细胞灭活疫，绝大部分都是针对GCRVⅡ型的疫苗。而对这些疫苗免疫效果的评价，只是根据免疫草鱼的死亡率来初步估计，一旦其它疫病的爆发导致免疫草鱼死亡，就无法弄清是由于疫苗效果不好，草鱼出血病依然爆发导致而的死亡，还是由于其它疫病的爆发而导致的死亡，更无法对疫苗免疫效果进行评价。因此，也急需要一种检测GCRV特异性抗体的免疫学检测方法。临床和实验室试验证实草鱼出血病弱毒疫苗是预防控制草鱼出血病的有效生物制剂，而对草鱼呼肠孤病毒特异性抗体的监测是评价鱼出血病疫苗免疫效果及合理制定免疫程序的关键。对于草鱼呼肠孤病毒抗体的检测，目前还没有有效可靠的方法，ELISA方法特异性好、灵敏度高、快速易行，可进行大量样品的检测，但存在病毒抗原或重组蛋白抗原纯化条件苛刻、试剂保存条件要求高、检测需要酶标测定仪，只能在具有一定条件的实验室使用等缺点。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明建立的GCRVⅡ免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidasemonolayerassay，IPMA）采用病毒感染细胞后固定作为检测抗原，试验过程所需时间短、特异性好、敏感性高、操作方便、性能稳定、易于临床推广，并且观察时只需普通的光学显微镜，适用于基层流行病学调查、临床检测和疫苗免疫后血清抗体的监测。

本发明的目的是提供一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒，该试剂盒含有细胞内阳性抗原。

进一步的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上。

进一步的，所述细胞内阳性抗原为感染了Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的细胞。

进一步的，所述细胞为草鱼鳔细胞系GSB。

进一步的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上的具体操作为：将草鱼呼肠孤病毒HZ08株接种到新消化的GSB细胞悬液中，混匀，加入到细胞板中，于27.5℃~28.5℃条件下培养至形成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用PBS清洗后，用固定液固定12～17min，干燥后即可。

进一步的，该试剂盒还含有抗草鱼IgM单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG。

进一步的，该试剂盒还含有细胞内阴性抗原，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，磷酸盐缓冲液洗涤液，AEC显色液和血清稀释板。

进一步的，所述细胞内阴性抗原为未感染草鱼呼肠孤病毒的细胞，固定在细胞板中；

所述阳性对照血清为经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗体效价在1:400以上；

所述阴性对照血清为未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清；

所述样品稀释液由25mMDTT、100mMpH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA和200mMNaCl组成。

进一步的，所述细胞为草鱼脑细胞系GSB。

一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法，包括如下步骤：

1）将固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板，于室温预热25～35min，PBS洗1～2次；

2）加入一抗：用PBS将待检血清进行系列稀释后，分别加入固定有细胞内阳性抗原或细胞内阴性抗原的细胞板孔中，每孔80～130μL；另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别作为阳性对照和阴性对照；

3）温育和洗涤：36.5~37.5℃湿盒孵育45~75min，PBS洗涤；

4）加入二抗：加入稀释如的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔80～130μL；

5）温育和洗涤：同步骤3）；

6）显色：加入底物ACE，每孔80～120μL，室温显色15～45min；

7）去除底物液，每孔加入PBS，用光学显微镜观察，判定结果。

本发明的有益效果是：

1、本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒可以对无明显CPE（细胞病变）的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒进行定量分析，测定病毒的浓度和滴度；

2、本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒可以对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性抗体的进行定性检测，同时可以检测草鱼多份血清样品并达到早期诊断的目的，对草鱼出血病的诊断、流行病学调查和病原监测具有较高的临床使用及推广价值；

3、本发明的基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒能用于疫苗免疫注射后抗体的检测，进行疫苗免疫效果的评价，为草鱼出血病的预防控制和免疫监测等提供科学的技术手段。通过该试剂盒的应用，将为我国控制并最终消灭草鱼出血病提供技术保障，从而降低水产养殖过程中因草鱼出血病所带来的巨大经济损失。

附图说明

图1为草鱼血清中抗GCRVⅡ抗体的IPMA检测图（A为阳性反应，B为阴性反应）。

具体实施方式

一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒，该试剂盒含有细胞内阳性抗原。

优选的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上。

优选的，所述细胞内阳性抗原为感染了Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的细胞。

优选的，所述Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒为草鱼呼肠孤病毒HZ08株。

优选的，所述细胞为草鱼鳔细胞系GSB。

优选的，所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上的具体操作为：将Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒接种到新消化的GSB细胞悬液中，混匀，加入到细胞板中，于27.5℃~28.5℃条件下培养至形成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用PBS清洗后，用固定液固定12～17min，干燥后即可。

优选的，所述Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒为草鱼呼肠孤病毒HZ08株。

优选的，所述固定液为丙酮与甲醇按1：（0.8～1.2）体积比混合的混合液。

优选的，草鱼呼肠孤病毒HZ08株接种到新消化的GSB细胞悬液中的终浓度为0.5×10³~1.5×10³拷贝/μL。

优选的，所述新消化的GSB细胞悬液中GSB细胞浓度为1×10⁶~2×10⁶个/mL。

优选的，所述27.5~28.5℃条件下培养至形成单层细胞的时间为70~74小时。

优选的，该试剂盒还含有抗草鱼IgM单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG

优选的，所述抗草鱼IgM单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2013193的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

优选的，该试剂盒还含有细胞内阴性抗原，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤液，AEC显色液和血清稀释板。

优选的，所述细胞内阴性抗原为未感染草鱼呼肠孤病毒的细胞，固定在细胞板中.

优选的，所述阳性对照血清为经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗体效价在1:400以上.

优选的，所述阴性对照血清为未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清。

优选的，所述样品稀释液由25mMDTT、100mMpH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA和200mMNaCl组成。

优选的，所述细胞为草鱼脑细胞系GSB。

一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法，包括如下步骤：

1）将固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板，于室温预热25～35min，PBS洗1～2次；

2）加入一抗：用PBS将待检血清进行系列稀释后，分别加入固定有细胞内阳性抗原或细胞内阴性抗原的细胞板孔中，每孔80～130μL；另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别作为阳性对照和阴性对照；

3）温育和洗涤：36.5~37.5℃湿盒孵育45~75min，PBS洗涤；

4）加入二抗：加入稀释如的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔80～130μL；

5）温育和洗涤：同步骤3）；

6）显色：加入底物ACE，每孔80～120μL，室温显色15～45min；

7）去除底物液，每孔加入PBS，用光学显微镜观察，判定结果。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子细胞学和免疫学实验技术包括血清制备、细胞培养、病毒感染、细胞固定、抗原抗体反应等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《精编免疫学实验指南》(第一版)(JohnE.Coligan，JanssenK,ArgentineJ.曹雪涛等译，2009，北京：科学出版社)和参见《精编细胞生物学实验指南》(第一版)(JuanS.Bonifacino,MaryDasso.章静波等译，2007，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、血清制备

阴性血清制备，采集健康无发病的且草鱼呼肠孤病毒抗原抗体检测为阴性的草鱼血清（即未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清），其中病原用RT-PCR方法检测，抗体用ELISA方法检测，然后按常规方法制备阴性血清；

阳性血清由本实验室通过弱毒疫苗株GCRV892株病毒感染上述制备阴性血清同一批草鱼制备而得（经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒感免疫后的血清），经检测该血清ELISA抗体效价在1:400以上；

抗GCRV-JX0901、GCRV104、致病性嗜水气单胞菌、荧光极毛杆菌和肠炎型点状气单胞菌阳性血清为分别用相应病原菌感染健康、没有发病史且没有注射疫苗的草鱼，然后分别采集感染后发病并出现明显症状的草鱼血清制备而得。

二、病毒的增殖与毒价测定

用GCRVHZ08株种毒接种GSB细胞，病毒培养液为M199培养基，含10%灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素各，当感染病毒5天以后，取细胞上清液参照文献中的方法（刘宝芹，曾伟伟，王庆，张乐生，王英英，石存斌，吴淑勤。草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及初步应用。中国水产科学，2012,19(2):329-335）进行荧光定量检测，当每毫升上清液的病毒拷贝数达到10⁶以上时，收集病毒液，反复冻融3次，4℃、3000rpm/min离心15min，取上清液，分装后置于-80℃保存备用。

三、抗原板的制备

将M199稀释至1×10³拷贝/μL的GCRVHZ08株接种新消化的浓度为1.2×10⁶个/mLGSB细胞悬液中，于96板中每孔加100μL，同时设未接种病毒的GSB细胞作对照。置于28℃条件下培养48h形成单层后取出，弃去细胞培养液，用PBS洗3次后，固定液（丙酮与甲醇按1:1体积比混合）固定15min，干燥后置于-20℃保存备用，即得抗原板（固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板）。

四、一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法

1）取抗原板于室温预热30min，PBS洗1次。

2）用PBS在血清稀释板中将GCRV待检血清从1:25起进行2倍系列稀释，分别加入到抗原孔和对照孔，每孔100μL；另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别作为阳性对照和阴性对照；

3）28℃湿盒孵育1h，PBS洗3次；

4）加入1:5000倍稀释的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔200μL；

5）28℃湿盒孵育1h，PBS洗3次；

6）加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（HRP-IgG)，每孔100μL，37℃湿盒孵育1h，PBS洗3次，加入底物（ACE），每孔100μL，室温显色15～45min；

7）甩去底物液后用PBS洗涤1次，每孔加入150μLPBS，用光学显微镜观察，判定结果。

为了获得更好的细胞内阳性抗原，以提高检测灵敏性、特异性、准确性和重复性，在研究过程中进一步将上述“二”中GCRVHZ08株分别稀释为5、10和15mL/L，接种到GSB细胞后分别培养12、24、36、48和60h后逐一取出固定；后续检测时HRP-IgG分别按1：500、1：1000、1：1500和1：3000进行稀释，运用方阵法确定最佳的IPMA反应条件。

筛选结果表明，种毒按照1×10³拷贝/μL的终浓度接种GCRVHZ08株后第72小时后固定效果最佳，HRP-IgG最适稀释度为1:1000。GCRVHZ08株阳性血清与病毒感染细胞反应显示细胞胞浆内有特异性棕色反应（见图1A），而阴性组与空白对照组无特异着色反应（见图1B）。

五、特异性试验

用抗GCRV-JX0901、GCRV-104、致病性嗜水气单胞菌、荧光极毛杆菌和肠炎型点状气单胞菌的阳性血清进行交叉反应试验，以检验该方法的特异性。

交叉反应试验结果表明，除GCRVⅡ阳性血清呈阳性外，其他几种草鱼血清均呈阴性，证明该IPMA方法与这几种常见草鱼病原无血清学交叉反应。

六、敏感性试验

将阳性血清从1：25开始2倍系列稀释，即将血清依次稀释25倍、25×2倍、25×22倍、25×2³倍、25×2⁴倍、25×2⁵倍，分别进行IPMA的敏感性试验。

敏感性试验结果表明，当GCRVⅡ阳性血清稀释至800倍（25×2⁵倍）时，仍能观察到很特异的着色反应，表明本方法具有较好的敏感性。

七、重复性试验

制备3批IPMA反应板，选用GCRVⅡ型阳性和阴性血清各5份，用相同批次和不同批次的3个IPMA反应板进行批内和批间重复性试验。

重复性试验结果表明，该IPMA方法的批内和批间检测结果一致，表明本方法具有良好的重复性。

八、IPMA与ELISA的符合试验

挑选30份草鱼血清，分别用IPMA和ELISA进行平行检测，比较检测情况。ELISA按照文献报道的操作步骤进行(YongxingHe,YoushengJiang,LiqunLuerodiagnosisofgrasscarpreovirusinfectioningrasscarpCtenopharyngodonidellabyanovelWesternblottechnique,JournalofVirologicalMethods194(2013)14–20)。

分别用IPMA和ELISA对30份临床血清样本进行平行试验，结果如表1所示，从中可以看出IPMA法检出23份阳性，7份阴性；ELISA法检出22份阳性，8份阴性。IPMA与ELISA检测结果阳性符合率为95.7%，阴性符合率为87.5%。对上述存在检测差异的血清样品进一步进行western-blot、间接免疫荧光及中和试验验证，验证结果与本发明IPMA法检测的结果相同，为GCRVⅡ型阳性，说明本发明IPMA检测方法具有更好的准确性。

表1本发明IPMA方法与现有ELISA方法的符合性试验结果

九、人工免疫草鱼血清中抗体效价的检测

选取GCRVⅡ型抗体阴性草鱼100尾巴，免疫草鱼出血病Ⅱ型弱毒疫苗（中国水产科学研究院珠江水产研究所商品化草鱼出血病弱毒疫苗），200μL/尾。分别于免疫前、免疫后第1～5周采集试验鱼血清，每次采集10尾，用本发明IPMA方法和ELISA检测血清抗体水平，将10个样品的结果去除异常数据之后求平均值，得到不同时间阶段免疫鱼的抗体效价。

结果如表2所示，从中可以看出，病毒接种后第1周，本发明IPMA法和ELISA法检测的抗体效价均为1：400，免疫第2周后就达到1：1600最高水平，第4周下降至1：800，第5周抗体效价均为1：400(见表2)。说明ELISA检测结果与本发明IPMA法的结果基本一致，但其敏感性相对较低，操作繁琐，耗时长。

表2接种GCRVⅡ后不同时间的血清抗体效价的检测

十、临床送检血清样品的检测

收集江西、广东、广西、湖南、湖北、山东、山西等地养殖场的疑似草鱼出血病血清样本126份，用本发明IPMA方法检测GCRVⅡ型抗体水平。结果显示，各地检出的阳性率从63.6％～79.4％不等，平均阳性率为72.2％（见表3）。

表3本发明IPMA法检测不同地区疑似草鱼出血病血清样品结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有细胞内阳性抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原为感染了Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的细胞。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞为草鱼鳔细胞系GSB。

5.根据权利要求2或4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上的具体操作为：将Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒接种到新消化的GSB细胞悬液中，混匀，加入到细胞板中，于27.5℃~28.5℃条件下培养至形成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用PBS清洗后，用固定液固定12～17min，干燥后即可。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有抗草鱼IgM单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG。

7.根据权利要求1或6所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有细胞内阴性抗原，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，磷酸盐缓冲液洗涤液，AEC显色液和血清稀释板。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阴性抗原为未感染草鱼呼肠孤病毒的细胞，固定在细胞板中；

所述阳性对照血清为经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗体效价在1:400以上；

所述阴性对照血清为未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清；

所述样品稀释液由25mMDTT、100mMpH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA和200mMNaCl组成。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞为草鱼脑细胞系GSB。

10.一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板，于室温预热25～35min，PBS洗1～2次；

2）加入一抗：用PBS将待检血清进行系列稀释后，分别加入固定有细胞内阳性抗原或细胞内阴性抗原的细胞板孔中，每孔80～130μL；另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别作为阳性对照和阴性对照；

3）温育和洗涤：36.5~37.5℃湿盒孵育45~75min，PBS洗涤；

4）加入二抗：加入稀释如的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔80～130μL；

5）温育和洗涤：同步骤3）；

6）显色：加入底物ACE，每孔80～120μL，室温显色15～45min；

7）去除底物液后，每孔加入PBS，用光学显微镜观察，判定结果。