CN104991061A - 基于ipma的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，包括：含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板；阳性对照血清；阴性对照血清；样品稀释液；盐水洗涤液；HRP标记鼠抗羊McAb；二组分AEC显色液；终止液；血清稀释板和使用说明书。其中，细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM细胞；细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞；阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N 75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和效价在1∶160以上；阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。
Description
技术领域
本发明提供一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒能够高特异性高灵敏度地检测小反刍动物体内是否存在小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)抗体，从而达到疫苗抗体检测或疾病诊断的目的。
背景技术
小反刍兽疫是小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)感染引起的一种严重的烈性、接触性传染病，会造成重大的经济损失。该病为FAO/OIE规定的A类烈性传染病，我国规定的一类动物疫病。
其病原是副粘病毒科麻疹病毒属的成员，基因组为不分节段的单股负链RNA。与牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、Vero细胞上增殖，并产生细胞病变(CPE)，形成合胞体。只有一个血清型，但从遗传演化上，可分为4个系。
该病自1942年在西非象牙海岸首次报道以来，目前主要流行于非洲西部、中东部和亚洲的部分地区。2007年首次由境外传入我国西藏，次年西藏又有传染来源不明的疫情，2013年底新疆再次发生，目前已有20各省市区出现疫情。传染途径主要为直接、间接接触或呼吸道飞沫传播。传染源主要为患病动物和隐性感染动物，处于亚临床型的病羊尤为危险。其中病畜的分泌物和排泄物均能携带病毒。
PPRV主要感染小反刍兽，山羊比绵羊更易感，其它野生动物也可发生。临床上以发热、眼鼻分泌物、口炎、腹泻和肺炎为特征。发病率和死亡率分别可高达100％和90％，其中幼畜一般高于成年家畜。还常伴有继发的呼吸道和胃肠道感染。
对患畜尸体剖检，可见结膜炎、坏死性口炎，严重病例可蔓延到硬腭及咽喉部。皱胃、肠(尤其结直肠结合处)常出现糜烂、出血。淋巴结肿大，脾有坏死性病变。在鼻甲、喉、气管等处有出血斑。
该病的初步诊断，可根据临床症状和病理变化作出判断，而确诊需进行实验室检查。其中，血清学诊断方法仍为常规采用的方法，包括：琼脂扩散试验(AGID)、沉淀抑制试验(CIEP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFA)和病毒中和试验(VNT)、RT-PCR-ELISA等。其中，VNT和ELISA两种方法最为重要，在国际贸易中，前者为指定方法，后者为替代方法。
VNT虽是敏感特异的检测方法，但也存在一些缺点，如(1)费时，一般10～12天才能获得结果。(2)条件严格，涉及细胞培养和试验样品的无菌处理，结果判定要有经验等，在发展中国家，尤其现地基层，没有条件开展。(3)费力，工作量和劳动强度大，不适合大量样品的检测。ELISA目前建立有间接、竞争或阻断ELISA等多种方法，检测用抗原有全病毒抗原或针对核衣壳蛋白(N)、血凝素蛋白(H)的重组表达抗原，它们之间在敏感性和特异性上存在差异。由于羊血清往往存在背景值偏高的问题，因此，基于核衣壳蛋白(N)和血凝素蛋白(H)的单克隆抗体，建立了竞争或阻断ELISA方法。目前英法两国的小反刍兽疫参考实验室虽有商品化的ELISA试剂盒面世，但仍存在敏感性和特异性不足的问题，尚不能取代黄金标准的VNT方法，加之使用价格比较昂贵。
发明内容
本发明人基于免疫组织化学原理，建立了基于免疫过氧化物酶细胞单层试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，可以用于检测病毒蛋白(细胞内抗原)相应的抗体，并且具有敏感特异、简便快速、判读直观，适合大量样品与溯源检测的特点。本发明人建立的基于IPMA检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒和方法，为国内外首次报道；同时，所述试剂盒能够取代国外价格昂贵的ELISA试剂盒，应用于我国对小反刍兽疫的防控实践中。
在第一方面，本发明提供基于IPMA的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：包含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、盐水洗涤液、HRP标记鼠抗羊McAb、二组分AEC显色液、终止液、血清稀释板和使用说明书。其中，所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞。所述阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRVN75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和效价在1∶160以上。所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。优选地，其中所述BHK-gSLAM细胞为保藏号为CGMCCNo.10587的细胞。
更具体地，其中所述样品稀释液为含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2；
所述盐水洗涤液为含0.5％吐温80的0.15M氯化钠溶液；
所述二组分AEC显色液由A液和B液按1∶1的体积比组成，其中A液由下述组成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2.5ml N，N-二甲基甲酰胺和47.5ml醋酸溶液，pH 5.0；B液由50ml纯水和20μl双氧水组成；
所述终止液为0.05M醋酸溶液，pH 5.0。
在一个优选的实施方案中，本发明提供的基于IPMA的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒包括：含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板，96孔/1块/盒；阳性对照血清，100μl/1管/盒；阴性对照血清，100μl/1管/盒；样品稀释液，30ml/1瓶/盒；盐水洗涤液，400ml/1瓶/盒；HRP标记鼠抗羊McAb，12ml/1瓶/盒；二组分AEC显色液(A液：6ml/1瓶/盒和B液：6ml/1瓶/盒)；终止液，6ml/1瓶/盒；血清稀释板，96孔/1块/盒；说明书，1份/盒。其中所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞(保藏号为CGMCC No.10587)。所述阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和效价在1∶160以上。所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。所述样品稀释液为含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2；所述盐水洗涤液为含0.5％吐温80的0.15M氯化钠水溶液；所述二组分AEC显色液由A液和B液按1∶1的体积比组成，其中A液由下述组成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2.5ml N，N-二甲基甲酰胺和47.5ml醋酸溶液，pH 5.0；B液由50ml纯水和20μl双氧水组成；所述终止液为0.05M醋酸溶液，pH 5.0。
本发明所述的试剂盒用于小反刍兽疫病毒抗体检测或小反刍兽疫疾病诊断的目的。
在第二方面，本发明提供基于IPMA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法，所述方法包括下述步骤：
1.细胞系BHK-gSLAM的建立：用构建的重组质粒pIRES3-gSLAM转染BHK-21细胞在选择性培养基上进行细胞克隆，通过克隆后细胞的SLAM蛋白表达检测及病毒rPPRV/GFP感染试验对阳性克隆进行鉴定，最终获得乳仓鼠肾细胞系BHK-gSLAM。该细胞系于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，邮政编码：100101，http：//www.cgmcc.net)。
2.细胞内抗原的制备：BHK-gSLAM细胞在96孔细胞培养板内长成单层后，以接种rPPRV/GFP病毒的细胞作为阳性抗原，同时以未接毒的细胞作为阴性抗原。当接毒孔内受感染细胞达到15～30％时，弃去细胞板内生长培养液，终止细胞培养。0.15M盐水溶液洗涤细胞板后，用预冷的4％多聚甲醛溶液对细胞板室温下固定10分钟，弃去固定液。洗板后，加入3％鱼皮胶溶液对细胞板37℃封闭2小时，弃去封闭液。37℃干燥1～2小时后，将细胞板密封，4℃保存或-20℃冻存备用。
3.用法与判定：
试剂盒所有试剂组分使用前应恢复至室温(18～25℃)，通常室温放置30min即可，使用后放回2～8℃。使用过程中，各组分应避免交叉污染；同时不同批次之间或不同试剂盒之间的组分不可交叉使用。
3.1 样品处理受试血清样品800×g离心5分钟后，用样品稀释液(含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2)在96孔稀释板上按1∶10、1∶40、1∶160和1∶640的浓度对血清样品进行稀释，待用。
3.2 一抗孵育
将稀释好的血清样品或对照血清，按100μl/孔移入上述步骤2中制备好的细胞抗原板上，密封后，37℃孵育1小时。弃去液体，盐水洗涤液(含0.5％吐温80的0.15M氯化钠溶液)洗涤3次。
3.3 二抗孵育
按100μl/孔加入合适浓度的HRP标记鼠抗羊McAb，37℃孵育1小时。弃去液体，盐水洗涤液洗涤3次。
3.4 显色
按50μl/孔加入配制好的二组分AEC显色液(A液∶B液＝1∶1)，常温显色30分钟以上。显色后按50μl/孔加入0.05M醋酸溶液(pH 5.0)终止反应。
3.5 结果判定(判定标准)
(1)定性判定：若受感染的15～30％细胞胞质出现暗或深红色，则判为血清学阳性；否则为血清学阴性。
(2)定量判定(抗体反应效价)：血清抗体反应的效价，以孔内感染细胞出现阳性显色的最高血清稀释度的倒数表示。即血清抗体反应的效价(滴度)，若小于10，判为阴性；若10～40之间，判为弱阳性；若大于等于160，判为强阳性。
4.特异性鉴别
由于血清自身的背景问题，可能会出现非特异性着色，这样会造成假阳性结果，常出现于判为弱阳性的血清样品中。本试验方法所用病毒株自身携带有GFP标签，根据这一荧光示踪细胞内抗原的独特优势，借助普通光学生物倒置显微镜和荧光显微镜对同一视野下观察到的试验结果，能够对非特异性着色结果做出明确的鉴别诊断。
其中步骤3中所用的HRP标记鼠抗羊McAb购自Sigma公司。
所用的二组分AEC显色液由A液和B液按1∶1的体积比组成，其中A液由下述组成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2.5ml N，N-二甲基甲酰胺和47.5ml醋酸溶液，pH 5.0，B液由50ml纯水和20μl双氧水组成。
综上所述，本发明提供下述：
1.基于免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：
包含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板；
阳性对照血清和阴性对照血清；
样品稀释液；
盐水洗涤液；
HRP标记鼠抗羊McAb；
二组分AEC显色液，和终止液；
血清稀释板和使用说明书；
其中，所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞；
所述阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和效价在1∶160以上；
所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。
2.根据第1项所述的试剂盒，其中所述BHK-gSLAM细胞为保藏号为CGMCC No.10587的细胞。
3.根据第1项所述的试剂盒，其中所述含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板通过下述步骤制备：
(1)将BHK-gSLAM细胞在96孔细胞培养板内培养，待其长成单层后，以接种rPPRV/GFP病毒的BHK-gSLAM细胞作为阳性抗原，同时以未接毒的BHK-gSLAM细胞作为阴性抗原；
(2)当接毒孔内受感染的BHK-gSLAM细胞达到15～30％时，弃去细胞板内生长培养液，终止细胞培养；
(3)用0.15M盐水溶液洗涤细胞板后，用预冷的4％多聚甲醛溶液对所述细胞板在室温固定10分钟，弃去多聚甲醛固定液；
(4)洗板后，加入3％鱼皮胶溶液对所述细胞板在37℃封闭2小时，弃去封闭液；在37℃干燥1～2小时后，将所述细胞板密封，4℃保存或-20℃冻存备用。
4.根据第1项所述的试剂盒，其中所述样品稀释液为含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2；
所述盐水洗涤液为含0.5％吐温80的0.15M氯化钠溶液；
所述二组分AEC显色液由A液和B液按1∶1的体积比组成，其中A液由下述组成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2.5ml N，N-二甲基甲酰胺和47.5ml醋酸溶液，pH 5.0；B液由50ml纯水和20μl双氧水组成；
所述终止液为0.05M醋酸溶液，pH 5.0。
5.稳定表达山羊SLAM蛋白的BHK-21细胞系BHK-gSLAM，其保藏号为CGMCC No.10587。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示重组质粒pIRES3-SLAM的酶切鉴定。M：DNA分子量标记；泳道1：pIRES3-SLAM用EcoRI/NotI双酶切；泳道2：pIRESpuro3用EcoRI/NotI双酶切。
图2显示接毒筛选阳性细胞系，A：BHK-gSLAM细胞感染rPPRV/GFP；B：BHK-21细胞感染rPPRV/GFP。
图3显示免疫印迹检测SLAM蛋白在BHK-gSLAM细胞系中的表达，M为蛋白标准分子量标记，Mock为BHK-21细胞，BHK-gSLAM为BHK-gSLAM细胞。
图4显示IPMA试验中阴性、阳性血清的定性与定量判定。①抗原：除5R、6T为Mock对照抗原外，其余均为BHK-gSLAM细胞内rPPRV/GFP抗原。其中第1、3和5排为视野中AEC染色结果；第2、4和6排为对应的相同视野中荧光示踪抗原情况。②血清：第1、2排和5R、6T为阳性血清，第3、4排和5Q、6S为阴性血清；其中1∶10、1∶40、1∶160和1∶640为血清稀释浓度。③结果：A、B、C和D为IPMA试验抗体阳性，效价为640；I、J、K和L为IPMA试验抗体阴性；Q为非特异染色；R为Mock对照抗原阴性染色。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
1.材料方法
1.1 细胞与病毒细胞为稳定表达山羊SLAM蛋白(gSLAM)的BHK-21细胞(BHK-gSLAM)。病毒为携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的PPRV N75/1疫苗株(rPPRV/GFP)。均由哈尔滨兽医研究所重要人兽共患与烈性外来病创新团队保存并提供(Yin，Chen et al.2014；还可参见专利申请号：201010559545.8)。
1.2 血清已知病毒中和试验(VNT)效价的小反刍兽疫病毒阳性血清19份，用于IPMA方法的敏感性试验。小反刍兽疫病毒阴性血清60份(来自小反刍兽疫阴性羊群，经过VNT和N-cELISA验证)和其它已知病原(口蹄疫病毒、羊痘病毒、蓝舌病病毒16型、布鲁氏菌等)阳性血清各1份，用于IPMA方法的特异性试验。其余血清，来自现地的送检样品，用于IPMA与VNT的比较试验。均由哈尔滨兽医研究所提供或保存。
1.3 细胞系的构建
1.3.1 羊SLAM基因的扩增
根据GenBank中山羊的SLAM基因序列(GenBank：DQ228869.1，SEQID No.1，其编码的山羊SLAM的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)进行了特殊优化，以提高其在真核细胞中的表达量，并在上海捷瑞公司进行了基因合成，合成的序列如SEQ ID No.2所示。根据优化后的基因序列，设计上下游引物，上游引物中引入EcoRI酶切位点，下游引物引入NotI酶切位点及Flag标签(goat-slam-F：TTTGAATTCGCCGCCACCATGGACC，goat-slam-R：TTGCGGCCGCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGACTCGGGCACGGTCAC，加粗部分为酶切位点，斜体部分为Kozak序列，下划线部分为flag标签序列)。以合成的SLAM优化基因为模版进行PCR扩增。
小反刍兽疫病毒的易感动物为小反刍动物的山羊和绵羊，且山羊更为易感，是因为它们均携带有编码该病毒受体蛋白的SLAM基因，同时，它们的SLAM基因(SLAM蛋白)序列保守。因此，选择山羊SLAM基因。
1.3.2 pIRESpuro3重组质粒的构建
PCR产物通过1％琼脂糖胶回收后，经EcoRI和NotI双酶切后与同样酶切的pIRESpuro3载体(购自Clontech公司)连接，构建重组质粒命名为pIRES3-SLAM。重组质粒经双酶切鉴定后，进行测序验证。
1.3.3 表达SLAM蛋白的细胞系筛选
参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书，将重组质粒pIRES3-SLAM转染到6孔板中的单层BHK-21细胞中，4h后更换含5％FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养液(购自Gibco公司)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养，48h后按1∶30、1∶40、1∶50传至直径10cm的细胞培养皿中，培养液更换为含3ug/ml嘌呤霉素(购自Sigma公司)的10％FBS的选择性培养基(购自Gibco公司)，每隔3d进行换液。待培养皿底部出现明显的细胞群落后，挑取单克隆至96孔细胞培养板中进行细胞系的鉴定。
因PPRV不能感染正常的BHK-21细胞，因此接种单克隆细胞至96孔板中，用病毒rPPRV/GFP以MOI等于1感染细胞，48h后观察荧光，同时设BHK-21细胞对照。
1.3.4 Western blot鉴定SLAM基因的表达
将挑取的单克隆细胞接种至6孔板，48h后收集细胞裂解，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转印后的硝酸纤维素膜用5％脱脂乳4℃封闭过夜，一抗为鼠抗Flag标签的单克隆抗体(购自Sigma公司)，1∶1000倍稀释。二抗为红外标记的山羊抗鼠IgG(购自Invitrogen公司)，1∶3000倍稀释。利用Odyssey红外荧光扫描仪检测结果。
1.4 细胞内抗原的制备先用含5％FBS，100IU青霉素(购自Sigma公司)和100μg/ml链霉素(购自Sigma公司)的DMEM生长液(购自Gibco公司)，将BHK-gSLAM细胞配成浓度为2×106/ml左右的细胞悬液；接着按100μl/孔将细胞悬浮液加入到96孔细胞培养板各孔中，使每孔的细胞浓度为105个。加湿条件下，37℃、5％CO2孵育培养18～24小时。细胞长成单层后，每孔加入50微升含105TCID50/ml的rPPRV/GFP病毒悬液，在相同培养条件下孵育培养48～72小时，使受感染的细胞达到15～30％。同时未感染病毒的培养细胞作为阴性抗原对照。弃去生长培养液，用0.15M氯化钠溶液洗板1次，同时在毛巾上轻拍，去除多余液体。用预冷过的经PBS配制的4％多聚甲醛，室温固定细胞10分钟。弃去固定液，0.15M盐水溶液洗细胞板2～3次。按200μl/孔加入3％鱼皮胶溶液对细胞板进行37℃2小时的封闭。弃去封闭液，37℃干燥1～2小时。将板密封后，4℃保存或-20℃冻存备用。
1.5 免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)方法的建立
1.5.1 样品处理受试血清样品800×g离心5分钟后，用样品稀释液(含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2)在96孔稀释板上按1∶10、1∶40、1∶160和1∶640的浓度对血清样品进行稀释，待用。
1.5.2 一抗孵育
将稀释好的血清样品或对照血清，按100μl/孔移入1.4中制备好的细胞抗原板上，密封后，37℃孵育1小时。弃去液体，0.5％吐温80的0.15M氯化钠水溶液洗涤3次。
1.5.3 二抗孵育
按100μl/孔加入合适浓度的HRP标记鼠抗羊McAb(作为二抗，购自Sigma公司)，37℃孵育1小时。弃去液体，0.5％吐温80的0.15M氯化钠溶液洗涤3次。
1.5.4 显色
按50μl/孔加入配制好的AEC显色液(A液：50mg AEC(3-amino-9-ethylcarbazole，即3-氨基-9-乙基咔唑)、2.5ml DMF(N，N-dimethylformamide，即N，N-二甲基甲酰胺)和47.5ml醋酸溶液(pH5.0)，B液：50ml纯水和20μl双氧水；A液与B液按1∶1的体积比混合)，常温显色30分钟以上。显色后按50μl/孔加入0.05M醋酸溶液(pH 5.0)终止反应。
1.5.5 结果判定
(1)定性判定：若受感染的15-30％细胞胞质出现暗或深红色，则判为血清学阳性；否则为血清学阴性。
(2)定量判定(抗体反应效价)：血清抗体反应的效价，以孔内感染细胞出现阳性显色的最高血清稀释度的倒数表示。即血清抗体反应的效价(滴度)，若小于10，判为阴性；若10-40之间，判为弱阳性；若大于等于160，判为强阳性。
1.6 敏感性试验用样品稀释液将受试血清样品(已知中和效价的阳性血清)以1∶2的稀释倍数从1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280至1∶2560的10个递度进行稀释，同时设阴性、阳性血清为对照。试验按照建立的IPMA方法进行，在阴性、阳性血清试验结果成立的条件下，按照定量判定标准，计算血清抗体反应的效价，从而确定该方法的敏感性。
1.7 特异性试验将阴性血清60份、其它已知病原(口蹄疫病毒、羊痘病毒、蓝舌病病毒16型、布鲁氏菌等)的阳性血清各1份进行IPMA抗体检测。按照定性标准，判定试验结果。
1.8 血清中和试验按照OIE规定的小反刍兽疫血清学中和试验进行(参见OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册，2.1.5小反刍兽疫，第五版，2004年，世界动物卫生组织著，农业部兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译，具体参见第133页)。
2.结果
2.1 细胞系BHK-gSLAM的建立
2.1.1 pIRESpuro3重组质粒的构建鉴定
将重组质粒用EcoRI和NotI双酶切，得到预期大小的DNA片段，分别约为5200bp和1100bp(图1)。进一步测序证明扩增所得片段与设计要求相符，片段的上下游分别引入了相应的酶切位点，下游引入了Flag标签。
2.1.2 转染细胞的克隆筛选
挑取细胞培养皿中的单克隆细胞(即，经过pIRES3-SLAM质粒转染的BHK-21细胞)至96孔板中，接种病毒rPPRV/GFP进行筛选，将筛选得到GFP表达较多的细胞克隆，进一步通过有限稀释法进行单克隆纯化，经纯化的单细胞克隆，即为我们建立的乳仓鼠肾细胞系株，命名为BHK-gSLAM(图2A)。该细胞系于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，邮政编码：100101，http：//www.cgmcc.net)，保藏编号为CGMCC No.10587。
经过克隆筛选、病毒rPPRV/GFP接种筛选和western blotting鉴定，说明我们构建获得的细胞具有稳定表达山羊SLAM蛋自(gSLAM)的特性，即存在小反刍兽疫病毒受体，适用于小反刍兽疫病毒分离与培养的细胞系株(命名为BHK-gSLAM)。细胞克隆和再克隆，是为了获得性能均一、表达稳定的纯净细胞株；接种病毒rPPRV/GFP，是通过GFP荧光观察结果示踪细胞内小反刍兽疫病毒增殖复制情况，说明一方面受感染的细胞存在小反刍兽疫病毒受体，另一方面GFP表达较多的细胞，其gSLAM表达也较高。
2.1.3 阳性克隆的western blotting鉴定
为验证所筛选的阳性克隆中SLAM基因是否表达，在6孔细胞培养板中培养BHK-gSLAM细胞至100％汇合度，收集并裂解细胞，通过westernblot进行检测。结果显示BHK-gSLAM细胞有约45KD条带出现，与预期的大小相符，而mock对照无此条带(图3)，说明所筛选得到的阳性克隆中SLAM基因得到了表达。
2.2 结果判定与特异性鉴别IPMA在阴性、阳性对照血清成立的条件下，其结果的判定可分为定性和定量两种。即根据其判定标准，对受试血清样品的试验结果，既可以作出阴性或者阳性的定性判定；又可以对判为阳性结果的血清样品，根据其抗体反应的具体效价，进一步进行定量判定。另外，在1∶10～1∶40区间稀释的血清，判为弱阳性的血清样品中，由于血清自身的背景问题，可能会出现非特异性着色，这样会造成假阳性结果。但是本试验方法所用病毒株自身携带有GFP标签，根据这一荧光示踪细胞内抗原的独特优势，利用普通光学生物倒置显微镜和荧光显微镜对同一视野下观察到的试验结果，能够对非特异性着色结果做出明确的鉴别诊断(图4)。
2.3 敏感性通过对PPRV阳性血清19份进行IPMA抗体效价检测，其IPMA抗体反应效价范围在10～1280之间；与VNT相比，具有相同的检测敏感性。即其检测的灵敏度能对含有10中和效价的血清样品进行判定，符合OIE规定的阳性判定标准(表1)。
表1：IPMA方法的敏感性试验
2.4 特异性通过IPMA试验，对PPRV阴性羊血清60份和口蹄疫病毒、羊痘病毒、蓝舌病病毒16型、布鲁氏菌等病原的阳性羊血清各1份进行检测，结果均为阴性。表明该方法具有良好的特异性。
2.5 与VNT方法的比较根据IPMA与VNT方法对受试血清样品的检测结果比较，表明其与VNT方法的相对敏感性、相对特异性和符合率分别为91％、99％和97％(表2)。同时，IPMA方法具有简便、快速、直观、费用低，并适合大量样品检测的特点。即其敏感性和特异性，与VNT相当，但耗时短、试验条件要求低，尤其适合发展中国家的基层应用。
表2：IPMA与VNT的比较
注：1：相对敏感性(％)＝a/(a+c)×100％；2：相对特异性(％)＝d/(b+d)×100％；
3：符合率(％)＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％。
3讨论
3.1 IPMA方法中所用细胞系的选择。
PPRV N75/1弱毒疫苗株是在Vero细胞上进行扩增和生产的，但是由于该病毒在Vero细胞上形成的合胞体较少，不容易观察；同时，由于Vero细胞较大，生长不是很紧密，在IPMA试验中容易脱落。这两种因素导致最终IPMA试验中阳性结果的噬斑染色不容易观察。
BHK-21细胞无PPRV感染的相关受体，不能用于该病毒的分离与培养。因此本研究构建了稳定表达山羊SLAM蛋白的BHK-21细胞系(BHK-gSLAM)，该细胞不但适用于PPRV的分离与培养，又因其形态上要比Vero细胞小，可形成更致密的细胞单层，在受到PPRV感染后，更容易观察到数量较多、形态较大的合胞体，其在IPMA试验中，肉眼更容易观察，因此用来替代Vero细胞。
在细胞系的构建中，目的基因被整合到细胞基因组后，其表达效率受众多因素影响，并且表达水平也会影响到表达产物能否发挥其正常功能。其中，基因序列是一个重要的因素，为此，我们将该基因序列专门优化成独一无二的序列(SEQ ID No.2)，以增强表达效率。从rPPRV/GFP感染试验和western blotting试验结果中的表达水平，验证了我们的优化效果。
3.2 IPMA方法中所用病毒株的选择。
病毒株PPRV-GFP N75/1感染BHK-gSLAM细胞后，能够表达GFP。在荧光显微镜下，通过对GFP荧光的观察，不仅有利于制备高质量的细胞内抗原，而且结合利用普通光学生物倒置显微镜对同一视野进行观察，有助于对非特异性着色结果作出明确的鉴别诊断。
3.3 IPMA方法。
与VNT、N-cELISA方法相比，IPMA方法具有许多优点。细胞内抗原制备无需提取纯化、成本低廉，且可事先进行，封闭处理后，还能长时间保存。一般情况下，利用普通光学倒置显微镜，即可对IPMA结果进行检查并作出判定，非常适合现地样品的检测。染色结果，虽保存数月，仍然稳定，有利于结果的溯源和比对。IPMA方法在反应步骤及试验操作上基本与iELISA一样，因此，利用96孔细胞板制备的细胞内抗原，同样可以对大量样品进行PPRV抗体检测，且检测费用远比国外的N-cELISA试剂盒低；同时，从IPMA方法的敏感性、特异性试验结果，以及与VNT的相对特异性、相对敏感性和符合率可知，表明该法同样具有特异敏感的特点，而且省工省时、操作简单，不需要特殊的试验条件。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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Claims (5)
1.基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：
包含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板；
阳性对照血清和阴性对照血清；
样品稀释液；
盐水洗涤液；
HRP标记鼠抗羊McAb；
二组分AEC显色液，和终止液；
血清稀释板和使用说明书；
其中，所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞；
所述阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和效价在1∶160以上；
所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述BHK-gSLAM细胞为保藏号为CGMCC No.10587的细胞。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板通过下述步骤制备：
(1)将BHK-gSLAM细胞在96孔细胞培养板内培养，待其长成单层后，以接种rPPRV/GFP病毒的BHK-gSLAM细胞作为阳性抗原，同时以未接毒的BHK-gSLAM细胞作为阴性抗原；
(2)当接毒孔内受感染的BHK-gSLAM细胞达到15～30％时，弃去细胞板内生长培养液，终止细胞培养；
(3)用0.15M盐水溶液洗涤细胞板后，用预冷的4％多聚甲醛溶液对所述细胞板在室温固定10分钟，弃去多聚甲醛固定液；
(4)洗板后，加入3％鱼皮胶溶液对所述细胞板在37℃封闭2小时，弃去封闭液；在37℃干燥1～2小时后，将所述细胞板密封，4℃保存或-20℃冻存备用。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品稀释液为含4％马血清和0.5％吐温80的0.5M氯化钠溶液，pH 7.2；
所述盐水洗涤液为含0.5％吐温80的0.15M氯化钠溶液；
所述二组分AEC显色液由A液和B液按1∶1的体积比组成，其中A液由下述组成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2.5ml N，N-二甲基甲酰胺和47.5ml醋酸溶液，pH 5.0；B液由50ml纯水和20μl双氧水组成；
所述终止液为0.05M醋酸溶液，pH 5.0。
5.稳定表达山羊SLAM蛋白的BHK-21细胞系BHK-gSLAM，其保藏号为CGMCC No.10587。
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