CN105527442B - 一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法，所述检测系统的包被原含猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白。其中所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白均为真核表达的重组蛋白，保证了正确的空间构象和翻译后修饰过程，使抗原尽可能有效地与血清中抗体结合，提高了检测的特异性、灵敏度和重复性。该发明可应用于猪瘟预防控制中猪瘟病毒抗体的诊断及猪瘟疫苗的免疫评价。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和家畜疫病诊断领域，具体涉及一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性病毒传染病，传播快、流行广、发病率和死亡率高，对我国养猪业危害极大。根据临床症状和病程长短可将猪瘟分为急性型、慢性型、温和型。病猪和带毒母猪是猪瘟病毒的主要传染源。世界动物卫生组织将其列为A类疾病，中国《动物防疫法》将其列为一类疫病。
猪瘟病毒属黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.3Kb，含有一个大的开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞的酶作用，形成4个成熟的结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。
酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)因为其操作简便，快速敏感的优点，广泛应用于市场上的猪瘟抗体监测方法。目前，市场上的猪瘟抗体诊断ELISA试剂盒大多数是检测猪血清中的E2蛋白抗体，而Erns蛋白作为包被原，仅用于鉴别诊断亚单位疫苗免疫后疫苗产生的抗体和野毒感染产生的抗体，且特异性和灵敏度均不理想。此类E2蛋白抗体检测ELISA试剂盒针对猪瘟大规模的群体诊断中，能够发挥有效的作用。
但是对于一些早期感染或者猪瘟抗体水平低下的临床样本，单纯检测E2蛋白抗体，有出现假阴性的可能。因此，建立一种准确可靠的新型ELISA检测手段，用来弥补现有技术中单纯检测E2蛋白抗体的不足，对疾病的预防和控制有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪瘟抗体检测ELISA试剂盒，以及该试剂盒的制备与使用方法。
本发明的第一方面是一种猪瘟抗体检测系统，所述系统包被抗原为猪瘟病毒E2蛋白、Erns蛋白。
术语“猪瘟病毒E2蛋白”位于病毒囊膜表面，由373个氨基酸组成，是猪瘟病毒主要保护性抗原，是抗猪瘟病毒感染的主要保护性抗原(李淼，王宇飞，王煜等.表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析.生物化学与生物物理进展,2009,36(7):916-922)。
术语“猪瘟病毒Erns蛋白”为病毒的囊膜糖蛋白，由227个氨基酸组成，无跨膜区(高华峰，李富祥，张念祖等.猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达.动物医学进展,2007,28(2):22-24)。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQ IDNo.4编码的蛋白。
术语“实质上编码”意指通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸后仍然保持原有蛋白相同或相近功能。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为100-400ng，Erns蛋白含量为25-100ng。
作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng，Erns蛋白含量为50ng。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白为真核表达体系表达的重组蛋白。
作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白为重组杆状病毒表达体系表达的重组蛋白。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统中，所述的检测系统包括ELISA检测试剂盒、试纸。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒中，试剂盒包括包被所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白的酶标板、样品稀释液、洗涤液、封闭液、带标记的二抗、显色液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒中，所述样品稀释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种；
所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；
所述终止液为2M的H2SO4。
术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
本发明的另一方面是一种所述猪瘟抗体检测系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)克隆表达所述猪瘟病毒抗原性蛋白E2蛋白、Erns蛋白，使用所述E2蛋白和Erns蛋白包被酶标板；(2)制备或配制样品稀释液、洗涤液、封闭液、HRP标记的兔抗猪IgG、显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照；以及(3)将步骤(1)与(2)所制备的各成分组装成试剂盒。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统的制备方法中，所述步骤(1)中克隆表达E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.4编码的蛋白；所述E2蛋白含量为100-400ng/孔，Erns蛋白含量为25-100ng/孔；优选地，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng/孔，Erns蛋白含量为50ng/孔。作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统的制备方法中，所述步骤(1)使用真核表达体系表达猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白；优选地，所述真核表达体系为重组杆状病毒表达体系。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的猪瘟抗体检测系统的制备方法中，所述样品稀释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种；
所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；
所述终止液为2M的H2SO4。
本发明的另一方面是所述试剂盒的使用方法，作为使用方法的一种优选实施方式，所述使用方法包括以下步骤：
(1)将待检血清和阴阳性猪血清用稀释液做100倍稀释。
(2)将稀释后的样品100μl加入至ELISA反应板，37℃反应1h。每孔加入200μl洗涤液洗3次，每次1min，洗完后用吸水纸拍干。
(3)每孔加入100μl的1:10000倍稀释(V/V)的HRP标记的兔抗猪IgG，37℃反应40min，每孔加入200μl洗涤液洗5次，每次1min，洗完后用吸水纸拍干。
(4)每孔加入显色液A液和B液各50μl，室温放置10min。
(5)加入50μl终止液终止反应。
(6)在酶标仪上读取OD450、OD630的值，对其进行计算，并参照判定标准进行判定。
本发明的另一方面是提供一种猪瘟抗体ELISA检测试剂盒在猪瘟预防控制中的应用。
基于此，本发明的突出优点在于：
(1)提供一种ELISA试剂盒，该试剂盒的包被原含猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白。因为检测结果是两种蛋白抗体的叠加，所以从理论上和实践上对阳性样品的检出率灵敏度均高于单独检测E2和Erns蛋白的效果。
(2)所述包被原中猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白的混合比例经过优化，使抗原对血清中抗体的捕捉效率最高，提高了检测的灵敏度。
(3)所述包被原为纯化后的真核表达的重组蛋白，与蛋白真实结构接近，具备翻译后的糖基化与磷酸化修饰，是优质的抗原，能有效降低检测的背景值。
(4)所述包被原可通过基因工程手段进行大量表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，其1L体积配方为：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实例中所用的样品保存液为磷酸盐缓冲液，pH值为7.4，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
本实例中所用的猪瘟抗体检测试剂盒检测方法的判定标准为：
(其中，OD表示OD450-630，即OD450-OD630的值)当OD参考阳性血清≥1.0，OD阴性血清≤0.2时结果成立；当血清样品的S/P值≥0.5时为阳性，当S/P值＜0.5时为阴性。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪瘟E2蛋白的制备
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪瘟病毒C株(登录号为AF531433)中E2蛋白的基因序列(见序列表SEQ ID No.1)制备猪瘟病毒E2蛋白。
1.1构建pFastBac HBM-E2
设计一对引物运用PCR扩增E2蛋白：
CE2-F：5'-CGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3'
CE2-R：5'-TCTTTCATCTGATGCATGCACCT-3'
PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min。将扩增产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物使用DNA凝胶回收试剂盒回收后，将目的基因片段连接至pFastBac HBM载体，连接条件为：载体1μl、载体buffer1μl和胶回收产物4μl室温连接30min。连接产物加入到一支DH5α感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热激90s，然后冰上孵育30min，然后加入400μl的SOC培养基37℃，以200rpm离心1h，离心去掉300μl培养基，剩余的涂LB平板。培养过夜挑取菌落于抗性液体LB培养。用质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。
1.2构建Bacmid-E2
将pFastBac HBM-E2转化DH10Bac感受态，挑取白色菌落鉴定后提取Bacmid。
1.3获得重组E2蛋白
提前将sf21细胞铺至6孔板，直到融合度达到80％以上。将8μl转染试剂Cellfectin II与100μl培养液混合均匀。将1μl Bacmid-E2与100μl培养液混合均匀。将上述两种溶液混匀，室温15-30min。将液体加入6孔板。3-5h后更换新鲜培养液。培养72h收获P0代重组杆状病毒。通过将重组杆状病毒传代培养，扩增至P3代。
用Western blot对表达后的蛋白进行鉴定。将蛋白样品做SDS-PAGE分离，120V1.5h。300mA恒流湿转转1h，将蛋白转移至PVDF膜上，室温封闭2h，然后HRP-His单抗室温孵育1h，最后用DAB显色试剂盒显色(康为世纪生物科技有限公司)。
1.4蛋白纯化及含量的测定
收集感染杆状病毒48h后的sf21细胞上清，使用GE公司的HisGravitrap亲和层析。纯化后透析除去咪唑，用BCA法对蛋白浓度进行定量，蛋白浓度为2.5mg/ml。
实施例2猪瘟Erns蛋白的制备
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪瘟病毒C株(登录号为AF531433)中Erns蛋白的基因序列(见序列表SEQ ID No.3)制备猪瘟病毒Erns蛋白。
2.1构建pFastBac HBM-Erns
设计的引物序列如下
CErns-F：5'-GAAAATATAACTCAATGGAACCTGA-3'
CErns-R：5'-GGCATAAGCGCCAAACCAGGT-3'
参照实施例1.1部分构建pFastBac HBM-E2。
2.2构建Bacmid-Erns、获取Erns蛋白及其纯化定量
参照实施例1.2-1.4部分依次构建Bacmid-E2、获取重组E2蛋白、对重组后的E2蛋白进行纯化、定量，蛋白浓度为2.1mg/ml。
实施例3猪瘟抗体ELISA试剂盒的制备
3.1酶标板制备
(1)酶标板包被抗原：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将实施例1-2所制备的猪瘟病毒E2和Erns蛋白按表1所示各包被原编号所对应的成分进行配制。
表1各试剂盒所对应的包被原组分及其含量
(2)封闭：封闭液为PBST稀释的10％脱脂奶，每孔100μl，37℃封闭1h。封闭后PBST洗3次。
3.2试剂的配制
稀释液：含0.05％(V/V)Tween-20和10％(V/V)脱脂奶的PBS溶液；
洗涤液：含0.05％(V/V)Tween-20的PBS溶液；
显色液A液：TMB20mg加入10ml无水乙醇，再用ddH2O定容至100ml；
显色液B液：柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml，ddH2O定容至100ml；
终止液：2M H2SO4。
将实施例3.1～3.2部分制备的试剂及材料组装成猪瘟抗体试剂盒，按包被原的不同组装成不同的试剂盒，编号依次为试剂盒1-4(见表1)。
实施例4建立间接ELISA方法
猪瘟抗体检测试剂盒的使用方法包括：
(1)样品稀释：将猪血清用稀释液50倍(V/V)稀释，用洗液器混匀。
(2)一抗孵育：稀释后的血清每孔加入100μl，37℃孵育1h。每孔加入200μl PBST洗3次，每次1min，洗完后用吸水纸拍干。
(3)二抗孵育：HRP标记的兔抗猪二抗，用PBST按体积比1:10000稀释，然后每孔加入100μl，37℃反应40min。每孔加入200μl PBST洗5次，每次1min，洗完后用吸水纸拍干。
(4)显色：显色液A液和显色液B液按体积比1:1混合，100μl/孔室温孵育10min。
(5)加入50μl的2M H2SO4终止反应。
(6)读数：用酶标仪读取OD450-630，根据判定标准进行判定。
实施例5猪瘟抗体检测试剂盒的鉴定
5.1特异性试验
将实施例3制备的猪瘟抗体检测试剂盒按1-4，即分别有包被原1-4的酶标板分别对猪圆环病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪伪狂犬阳性血清、猪口蹄疫阳性血清进行ELISA检测，每个样品做3个重复，并同时设置阴阳性对照。
检测结果表明：除猪瘟阳性对照血清OD值为0.56到2.04外，试剂盒1-4检测的OD均小于0.1，说明试剂盒1-4与其它主要猪病无交叉反应，特异性好。
5.2灵敏度试验
将猪瘟病毒高免血清做1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240倍(V/V)稀释。用试剂盒1-4进行ELISA检测。结果见表2。
表2猪瘟病毒抗体检测试剂盒灵敏度试验结果
*：OD值表示OD450-OD630。
由表2可知：当阳性猪血清稀释到1:1280(V/V)时，各试剂盒通过ELISA检测显色后虽然靠肉眼观察难以判断结果，但在酶标仪上读数时试剂盒1-4仍然可以读出且检出结果均为阳性，而试剂盒1-2在1:2560的血清稀释度检出结果仍为阳性。表明各试剂盒的灵敏度较高。
5.3重复性试验
5.3.1批内重复性试验。
选取实施例5中10份阳性样品，实施例3中的用试剂盒1按照实施例4建立的方法进行检测，每个样品做10次重复。用统计学分析OD值发现批内重复变异系数在2.3％至9.4％之间，均小于10％，说明该方法重复性好。
同样试剂盒2-4检测阳性样本，变异系数小于10％，重复性好。
5.3.2批间重复性试验
用3个批次的试剂盒1对10个样品进行测定，经统计学进行分析后发现：3次批次的试验结果差异不显著，变异系数均在3.52％-11.37％之间，均小于12％，说明该检测方法重复性好。
同样，分别用3个批次的试剂盒2-4对10个样品做测定，测定结果表明：该检测方法重复性好。
5.4保存期试验
将分别用包被原1-4包被好的酶标板一式四份用封闭液封闭后洗涤吸干水分，再用包封袋封好后置于4℃分别保存6个月、9个月、12个月、15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件下的酶标板用5份被检样品进行检测。
经统计学分析，结果表明：各酶标板对每一样品进行检测时，6个月、9个月、12个月的结果均无显著差异，而与15个月的结果有显著差异，说明试剂盒在4℃条件下可保存12个月。
实施例6与现有试剂盒临床检测结果比对试验
将经猪瘟抗体检测金标准-荧光抗体病毒中和试验鉴定为阳性的240份临床感染猪瘟病毒的猪血清样品，分别用试剂盒1～4(即实施例3)以及构建的检测方法(即实施例4)，E2-ELISA试剂盒(购自IDEXX公司)，以及Erns-ELISA试剂盒(购自Prionics公司)进行对比检测，检测结果为：试剂盒1的阳性检出率为95.8％(230/240)，试剂盒2的阳性检出率为96.7％(232/240)，试剂盒3的阳性检出率为92.9％(223/240)，试剂盒4的阳性检出率为91.7％(220/240)；而E2-ELISA的阳性检出率为89.2％(214/240)，Erns-ELISA的阳性检出率为77.1％(185/240)。
因而，本实施例所制备的试剂盒检测时阳性检测率高于E2-ELISA试剂盒、Erns-ELISA试剂盒的阳性检测率，具有较好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种猪瘟抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括各孔中包被有猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白的酶标板；所述猪瘟病毒E2蛋白含量为100-400ng/孔，Erns蛋白含量为25-100ng/孔，其中，所述猪瘟病毒E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.4编码的蛋白；所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白为真核表达体系表达的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng/孔，Erns蛋白含量为50ng/孔。
3.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述真核表达体系为重组杆状病毒表达体系。
4.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、封闭液、带标记的二抗、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。
5.根据权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种；
所述显色液包括显色液A液和显色液B液，所述显色液A液含TMB 20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO4 2.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；
所述终止液为2M的H2SO4。
6.一种如权利要求1所述的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤(1)克隆表达所述猪瘟病毒抗原性蛋白E2蛋白、Erns蛋白，使用所述E2蛋白和Erns蛋白包被酶标板；
步骤(2)制备或配制样品稀释液、洗涤液、封闭液、HRP标记的兔抗猪IgG、显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照；以及
步骤(3)将步骤(1)与(2)所制备的各成分组装成试剂盒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中克隆表达E2蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQ ID No.4编码的蛋白。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述E2蛋白含量为100-400ng/孔，Erns蛋白含量为25-100ng/孔。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng/孔，Erns蛋白含量为50ng/孔。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)使用真核表达体系表达猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达体系为重组杆状病毒表达体系。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种；
所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB 20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO4 2.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；
所述终止液为2M的H2SO4。
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| CN201410526025.5A CN105527442B (zh) | 2014-09-30 | 2014-09-30 | 一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法 |
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