CN106896224A - 一种猪瘟新型抗体elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。本发明以杆状病毒表达系统获得的CSFV‑E2蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV‑E2蛋白进行标记，获得酶标抗原，具有无毒性等优点，抗原的产生和纯化，相对于全病毒来说重组蛋白较容易获得。本试剂盒采用双抗原夹心法，具有较高的特异性和敏感性，并且大大缩短了检测时间。对解决大批量样品猪血清中的猪瘟病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对猪群抗体水平的检测，可以实时监控猪群的整体免疫效果，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

Description

一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体是涉及一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒。

背景技术

猪瘟(CSFV)是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而目前我国CSF ELISA抗体检测试剂盒主要依赖进口，成本极高。

CSF ELISA抗体检测试剂盒在国内市场多以进口产品为主，成本极高。近年来虽然有多家公司开发或转化生产了一些诊断试剂盒，但其稳定性，可重复性和敏感性仍无法与进口产品相媲美，而且多未获得管理部门的正式批文。目前进口试剂盒多属于竞争ELISA，是采用全病毒作为抗原和HRP标记的单克隆抗体作为二抗，相比于本发明，全病毒和单克隆抗体的制备与获得工艺更加复杂，耗时更久，成本更高，并且在检测的过程中，其抗原抗体的孵育时间至少需要两个时间或者过夜孵育，检测时间较长，不利于进行大批量的样品检测。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，以杆状病毒系统表达的CSFV抗原为基础，灵敏度高、特异性和稳定性好，可用于猪瘟抗体的快速检测。

本发明的技术方案是：一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。

进一步地，在上述方案中，所述包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。有前期研究结果表明，在CSFV的结构蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击，因此E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本发明将CSFV-E2蛋白克隆入杆状病毒表达载体系统中，转染昆虫细胞，获得体外表达的外源蛋白，并将该蛋白作为诊断抗原建立ELISA抗体检测方法，与原核表达的蛋白作为包被抗原相比，杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，利用该系统表达的蛋白与猪血清中抗体的结合更加具有特异性和敏感性，可作为理想的包被抗原蛋白。

进一步地，在上述方案中，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记。

进一步地，在上述方案中，所述阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。

进一步地，在上述方案中，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20mL。

进一步地，在上述方案中，所述底物缓冲液A配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2 HPO4·12 H2O，吐温-20 100μL，蒸馏水1000mL，pH5。

进一步地，在上述方案中，所述底物液B配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4。

进一步地，在上述方案中，所述终止液配方：2M浓硫酸。

本发明还提供了一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的使用方法：

S1：待测血清经前处理后备用；

取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；

20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1:100 1X浓缩洗液稀释的待检血清，37℃孵育1h；

倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；

倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；

S2：结果计算，用建立的双抗原夹心ELISA方法检测40份阴性血清，血清不稀释，100μL/孔，每份血清重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算40份血清的D450平均值和标准差；

S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。

进一步地，所述猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的的检测原理是：

酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标抗原，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。

本发明的有益效果是：本发明以杆状病毒表达系统获得的CSFV-E2蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记，获得酶标抗原。以此作为开发的新型CSF ELISA抗体检测试剂盒能够替代国外同类产品。相比完整的CSFV，重组的结构蛋白具有无毒性等优点，因此，实验无须在专门的实验室中进行。更重要的是，抗原的产生和纯化，相对于全病毒来说重组蛋白较容易获得。囊膜E2蛋白作为CSFV主要抗原蛋白，包含许多在CSFV毒株中高度保守的抗原区域。而在ELISA检测中，针对BVDV和BDV的抗体检测中存在交叉反应。但这一情况，在使用重组E2蛋白代替全病毒后降低。本试剂盒采用双抗原夹心法，具有较高的特异性和敏感性，并且大大缩短了检测时间。本发明对解决大批量样品猪血清中的猪瘟病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对猪群抗体水平的检测，可以实时监控猪群的整体免疫效果，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

附图说明

图1是本发明试剂盒的制备工艺流程图；

图2是抗原包被ELISA板的保存期测定结果；

图3是酶标抗原的保存期测定结果。

具体实施方式

一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFVE2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。有前期研究结果表明，在CSFV的结构蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击，因此E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本发明将CSFV-E2蛋白克隆入杆状病毒表达载体系统中，转染昆虫细胞，获得体外表达的外源蛋白，并将该蛋白作为诊断抗原建立ELISA抗体检测方法，与原核表达的蛋白作为包被抗原相比，杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，利用该系统表达的蛋白与猪血清中抗体的结合更加具有特异性和敏感性，可作为理想的包被抗原蛋白。

酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记。阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。

20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20mL。

底物缓冲液A配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2HPO4·12 H2O，吐温-20100μL，蒸馏水1000mL，pH5。

底物液B配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4。

终止液配方：2M浓硫酸。

本实施例的猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的使用方法为：

S1：待测血清经前处理后备用；

取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；

20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1:100 1X浓缩洗液稀释的待检血清，37℃孵育1h；

倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；

倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；

S2：结果计算，用建立的双抗原夹心ELISA方法检测40份阴性血清，血清不稀释，100μL/孔，每份血清重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算40份血清的D450平均值和标准差；

S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。

该猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的的检测原理是：

酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标抗原，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。

本发明的工艺流程图如图1所示。

保存期稳定性实验

将猪瘟新型抗体检测试剂盒中的抗原包被ELISA板，置37℃恒温箱中加速老化，将其余成分仍放于4℃。抗原包被ELISA板于37℃恒温箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d后，依次取出继续保存于4℃。当抗原包被ELISA板于37℃恒温箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的抗原包被ELISA板，对背景已知的6份被检血清(4份阳性血清P1、P2、P3、P4，2份阴性血清N1、N2)进行检测，以判断抗原包被ELISA板的保存情况。保存期测定结果如图2所示。

将试剂盒中的抗原包被ELISA板，置37℃放置7d后，检测背景已知的6份血清，结果见上图，从结果可知抗原包被ELISA板在37℃恒温箱中放置7d，其检测结果数值仍较稳定，说明试剂盒中的抗原包被ELISA板在37℃恒温箱中可保存一周，即相对于4℃能保存一年。

将猪瘟新型抗体检测试剂盒中的酶标抗原分装成7管后，置37℃恒温箱中加速老化，将其余成分仍放于4℃。酶标抗原于37℃恒温箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d后，依次取出继续保存于4℃。当酶标抗原于37℃恒温箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的酶标抗原，对背景已知的6份被检血清(4份阳性血清P1、P2、P3、P4，2份阴性血清N1、N2)进行检测，以判断酶标抗原的保存情况。保存期测定结果如图3所示。

将试剂盒中的酶标抗原，置37℃放置7d后，检测背景已知的6份血清，结果见上图，从结果可知酶标抗原在37℃恒温箱中放置7d，其检测结果数值仍较稳定，说明试剂盒中的酶标抗原在37℃恒温箱中可保存一周，即相对于4℃能保存一年。

试剂盒特异性实验

用E2蛋白以10倍的反应浓度与CSFV阳性血清混合，进行阻断试验。E2蛋白吸附阳性血清后，所测抗体的OD值显著降低，(N-P)/N的值均大于0.5，阻断阳性。阻断试验的结果表明，以E2蛋白为抗原建立的双抗原夹心法ELISA具有较好的特异性。

(N-P)/N＝(未阻断孔OD值一阻断孔OD值)/未阻断孔OD值(此比值大于0.5即判为阻断阳性)

用表达蛋白包被酶标板，分别取猪链球菌阳性血清(MRP)、大肠杆菌阳性血清(ED)和猪细小阳性血清(APP)，猪胸膜肺炎放线菌阳性血清(PPV)等，进行交叉试验。CSFV阳性血清ELISA试验P/N值较高，在4.0以上，而与猪链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清和口蹄疫阳性血清反应的P/N值则比较低，均在2.0以下，结果说明建立的夹心ELISA具有较好的特异性(见表1)。

根据阻断试验和交叉试验结果可知该试剂盒其特异性较好，可用于CSFV的血清学诊断。

表1

血清样品1:100稀释

试剂盒敏感性实验

选择保存的1份强阳性血清(S1)、1份阳性血清(S2)、2份弱阳性血清(S3、S4)，一份阴性血清S5，分别进行倍比稀释(25～6400)，设置重复孔，按优化的ELISA方法进行检测，读取其OD值，由表2可见，强阳性血清经6400倍稀释，阳性血清经800倍稀释，弱阳性血清经200倍稀释，OD值均大于0.4，而阴性样品经25～6400倍稀释，OD值均小于0.4，表明该方法具有良好的敏感性。

表2

与猪瘟IDEXX抗体检测ELISA试剂盒检测结果符合率的比较

将建立的E2-1 ELISA方法对140份临床血清的检测结果与猪瘟IDEXX抗体检测试剂盒进行比较。用猪瘟DEXX抗体检测ELISA试剂盒检测出的120份阳性血清中，E2重组蛋白建立的夹心ELISA检测出113份阳性，而用猪瘟IDEXX抗体检测ELISA试剂盒检测出20份阴性血清，用E2重组蛋白建立的夹心ELISA检测出14份阴性，6份阳性；二者符合符合率为90.7％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。

2.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。

3.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记。

4.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20mL。

5.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物缓冲液A配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，吐温-20 100μL，蒸馏水1000mL，pH5。

6.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物液B配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4。

7.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述终止液配方：2M浓硫酸。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，使用方法为：

S1：待测血清经前处理后备用；

取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；

20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1:100 1X浓缩洗液稀释的待检血清，37℃孵育1h；

倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；

倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；

S2：结果计算，用建立的双抗原夹心ELISA方法检测40份阴性血清，血清不稀释，100μL/孔，每份血清重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算40份血清的D450平均值和标准差；

S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。