CN101936997A

CN101936997A - 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒

Info

Publication number: CN101936997A
Application number: CN2010102572647A
Authority: CN
Inventors: 刘汉平; 廖园园; 刘洁; 王威; 彭杏; 漆世华; 温文生; 谢红玲
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2030-08-19
Also published as: CN101936997B

Abstract

本发明涉及人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。本发明试剂盒的特异性达100％；灵敏度为1∶640。本试剂盒用于人接种狂犬疫苗后的免疫效果评价。

Description

人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为犬、猫等动物。典型症状为恐水症，又称：恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100％。随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们迫切希望了解宠物犬接种狂犬疫苗后犬只是否获得保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，没有得到广泛的应用。狂犬病毒是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多数的人狂犬病是由与人类密切接触的带毒犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。

目前，用于人狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道，也有一定的产品上市。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括普通ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。普通ELISA试剂盒多用原核表达的重组蛋白或培养的全病毒做包被抗原。重组蛋白存在复性困难，缺乏空间构象表位的缺点，全病毒存在不易纯化的缺点，这些都会导致检测灵敏度低下。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层析法虽然有操作简单的优点，但是灵敏度比较低。宁波天润生物药业有限公司产品“人狂犬病病毒IgG抗体测定试剂盒(酶联免疫法)，国药准字20060008”采用的狂犬病毒全病毒抗原包被微孔板。中国专利公开号为CN101251537的专利申请公开了一种人和动物狂犬病中和抗体竞争ELISA检测试剂盒。上述专利所用检测板包被方法为抗原直接包被法。

发明内容

本发明的目的是提供一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，本发明采用单克隆抗体包被法间接包被抗原制备反应板，进而组成用间接免疫吸附实验检测犬抗狂犬病毒IgG抗体的试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还弥补了由于抗原问题而致的灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案为：

一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有：预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其特征在于：酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。

辣根过氧化物酶标记的是小鼠抗人IgG单克隆抗体。

人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其步骤是：(1)抗狂犬病毒单克隆抗体的制备：用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法和IFA(间接免疫荧光)方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克隆抗体；(2)HRP-小鼠抗人IgG酶结合物的制备：按常规方法提取纯化人1gG；免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗人1gG的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗人1gG的单克隆抗体；用改良的过碘酸氧化法进行标记；最后酶标记物加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；(3)上述各种溶液的配制：①样品稀释液：0.1-10％BSA，0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000ml的0.01M PBS溶液中加0.5ml吐温-20(Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液：i)底物A液：称取TMB100mg加入10ml二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液：称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30％H₂O₂400ul即得；④终止液：取54.3ml浓度为95-98％浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。

所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取和Sepharose 4FF柱过滤纯化，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。

本发明实验结果及分析：

1.特异性检测：用本发明制造的试剂盒分别检测人狂犬病毒免疫血清，人阴性血清，人乙脑疫苗免疫血清，操作和判定按照具体实施方式中人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤进行，结果显示，人狂犬病毒免疫血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，特异性为100％。

2.灵敏度检测：用本发明制造的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清，操作和判定按照具体实施方式中人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤进行，检测结果为：最高检测到阳性参考样品的稀释度为1∶640。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

一.人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法

1.狂犬病毒单克隆抗体的制备：用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法和IFA方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克隆抗体；

2.HRP-小鼠抗人IgG酶结合物的制备：按常规方法提取纯化人1gG；免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗人1gG的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗人1gG的单克隆抗体；用改良的过碘酸氧化法进行标记；最后酶标记物加入1％牛血清白蛋白、1％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；

3.所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取和Sepharose 4FF柱过滤纯化，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原；

4.将狂犬病毒单克隆抗体均匀的包被在酶标板孔上，包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为BSA或脱脂牛奶，浓度是1-10％；封闭完再包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；

5.试剂盒其他溶液配制：①样品稀释液：1％BSA，0.05％NaN₃的0.01mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000ml的0.01M PBS溶液中加0.5ml吐温-20(Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液：i)底物A液：称取TMB100mg加入10ml二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液：称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30％H₂O₂400ul即得；④终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。

二.人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤：

1.将待检样本用样本稀释液10倍稀释，每孔加100ul，同时加入阳性和阴性对照液，设空白对照。置37℃孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加酶标抗体100ul，37℃孵育1小时；洗涤液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100μl，避光显色5-10分钟，加入终止液，每孔50μl。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm.

2.结果判定：Cutoff(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，样品值大于1判为阳性；样品值小于1判为阴性。

Claims

1.一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有：预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其特征在于：酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。

2.根据权利要求1所述的人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取和Sepharose 4FF柱过滤纯化，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。