CN113092392A - 一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法。方法如下：将通用型包被抗体工作液加入酶标板中，封板，孵育过夜；将封闭液加入酶标板中，封板，孵育，用洗液洗板后将稀释后的校正标样、空白猴混合血清、质控品和待测猴血清样品加入酶标板中，封板，孵育；用洗液洗板后将通用型酶标检测抗体工作液加入酶标板中，封板，孵育；用洗液洗板后将酶的底物加入酶标板中，将酶标板置于室温孵育进行显色；将硫酸加入酶标板终止显色后，用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，计算浓度值。本发明的检测方法，可以准确可靠地测定猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体总药物浓度，反映实际的血药浓度。
Description
技术领域
本发明涉及药物临床前生物分析领域，特别涉及单克隆抗体药物的临床前药代动力学和毒代动力学样品分析领域，具体涉及一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法。
背景技术
单克隆抗体药物因其选择性高、特异性强以及毒副作用小的特点，现已成为国内外生物制药领域中的研发重点，可用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病、眼科疾病等严重威胁人类生命和健康的疾病，具有非常广阔的商业价值和应用前景。目前单克隆抗体药物均是基于IgG框架进行开发的，根据抗体的亚型，单克隆抗体药物可分为IgG1型单克隆抗体药物、IgG2单克隆抗体药物和IgG4型单克隆抗体药物（IgG3因与FcRn的亲和力较弱导致其半衰期较短故一般不用来开发抗体药物）；根据靶点的类型，单克隆抗体药物又可分为靶向膜蛋白的单克隆抗体药物和靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物。
由于食蟹猴或恒河猴能表达预期的抗原表位，故适合用于单克隆抗体药物的临床前药代动力学和毒代动力学研究，而获得准确可靠的血药浓度数据是评价药代动力学和毒代动力学特征的前提，对于靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物，目前主要通过特异性的Ligand binding assay（配体结合试验）方法来检测血药浓度，具体包括特异性间接法和特异性双抗体夹心法。
特异性间接法采用单克隆抗体药物所靶向的可溶性蛋白包被酶标板，封闭后制成固相抗原，加入校正标样、空白基质样品、质控品和待测血清样品温育后，再加入酶标二抗，当待测样品中含有单克隆抗体药物时，可形成“可溶性蛋白-单克隆抗体药物-酶标二抗”复合物，酶可催化底物产生显色反应，生成蓝色产物，加入硫酸终止反应后变为黄色，颜色的深浅与样品中单克隆抗体药物的浓度呈正相关，用酶标仪测定酶标板各孔吸光度值，用4参数或5参数Logistic方程拟合标准曲线，然后可计算出样品中单克隆抗体药物的浓度。
特异性双抗体夹心法采用抗单克隆抗体药物独特型抗体包被酶标板，封闭后制成固相抗体，加入校正标样、空白基质样品、质控品和待测血清样品温育后，再加入酶标二抗，当待测样品中含有单克隆抗体药物时，可形成“抗单克隆抗体药物独特型抗体-单克隆抗体药物-酶标二抗”复合物，酶可催化底物产生显色反应，生成蓝色产物，加入硫酸终止反应后变为黄色，颜色的深浅与样品中单克隆抗体药物的浓度呈正相关，用酶标仪测定酶标板各孔吸光度值，用4参数或5参数Logistic拟合标准曲线，然后可计算出样品中单克隆抗体药物的浓度。
因靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物具有两个相同的抗原结合位点，给药后在动物体内可能有三种存在形式：两个抗原结合位点均未结合可溶性蛋白的完全游离型、单个抗原结合位点结合了可溶性蛋白的部分结合型和两个抗原结合位点均结合了可溶性蛋白的完全结合型。无论是特异性间接法还是特异性双抗体夹心法，均只能检测完全游离型和部分结合型单克隆抗体药物而不能检测完全结合型单克隆抗体药物，故获得的检测数据并不能反映实际的血药浓度，特别是当体内存在较高浓度水平的靶向可溶性蛋白时这种情况尤其严重，从而不能完整观察和评价这类单克隆抗体药物的药代动力学和毒代动力学特征；另外当采用特异性间接法或特异性双抗体夹心法来检测靶向不同可溶性蛋白的单克隆抗体药物血药浓度时，需要分别进行方法学开发工作，在此过程中也会耗费大量的时间成本和试剂成本，且存在方法开发失败或所开发方法性能不达标的风险。
鉴于现行检测靶向不同可溶性蛋白的单克隆抗体药物血药浓度的方法学所存在的不足和缺点，需要开发一种可准确可靠地检测靶向不同可溶性蛋白的单克隆抗体药物总血药浓度的、经济便利的通用型方法。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种可准确可靠地检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，可应用于检测猴血清中靶向不同可溶性蛋白的不同亚型单克隆抗体总药物浓度，包括完全游离型、部分结合型和完全结合型三种单克隆抗体药物存在形式。
技术方案：一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，方法步骤如下：
S1：将通用型包被抗体工作液加入酶标板中，用封板膜封板后，置于2-8℃下孵育14-20h；
S2：用洗液洗板3次后将封闭液加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min，再用洗液洗板3次后将稀释后的校正标样、空白猴混合血清、质控品和待测猴血清样品加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min；
S3：用洗液洗板5次后将通用型酶标检测抗体工作液加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min；
S4：用洗液洗板5次后将酶的底物加入酶标板中，将酶标板置于室温孵育进行显色5-15min；将硫酸加入酶标板终止显色后，用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，并拟合标准曲线和计算质控品和待测猴血清样品的浓度值。
进一步的，所述S1中通用型包被抗体工作液的配制方法为：将小鼠抗人IgG单克隆抗体用pH9.4-pH9.8的碳酸盐缓冲液稀释为2μg/mL浓度作为包被抗体工作液，所使用的小鼠抗人IgG单克隆抗体可特异性结合人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种IgG亚型，而与人IgA、IgE和IgM不存在交叉反应。
进一步的，所述S1中酶标板为对免疫球蛋白具有高吸附能力的无色、透明、平底的聚苯乙烯96孔板，可容纳最大反应体积为400μL/每孔。
进一步的，所述S1中通用型包被抗体工作液加入酶标板的体积为100μL/孔。
进一步的，所述洗液为0.05%PBST，即含有0.05%Tween 20的1×PBS缓冲液，洗液加入酶标板的体积均为300 μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，均需将酶标板在吸水纸上拍干。
进一步的，所述S2中封闭液为含有0.2%I-Block的0.05%PBST，加入酶标板中的体积为250μL/孔。
进一步的，所述S2中稀释后的校正标样、空白猴混合血清、质控品和待测猴血清样品的稀释度为100倍稀释，使用的稀释液均为封闭液（对于浓度高于标准曲线定量上限的待测猴血清样品，先用空白猴混合血清对其进行适度稀释，再用稀释液进行100倍稀释），加入酶标板的体积为100μL/孔。
进一步的，所述S3中通用型酶标检测抗体工作液的配制方法为：将辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG重链和轻链的多克隆抗体用封闭液稀释为0.1μg/mL浓度作为检测抗体工作液，所使用的山羊抗人IgG重链和轻链的多克隆抗体为使用人IgG免疫山羊后获得的抗血清，经食蟹猴和恒河猴免疫吸附剂交叉吸附后，再经抗原亲和层析所获得的多克隆抗体，该多克隆抗体与猴IgG的交叉反应性低于0.1%。
进一步的，所述步骤S4中底物为四甲基联苯胺，加入酶标板的体积为100μL/孔。
进一步的，所述步骤S4中硫酸的浓度为1M，加入酶标板的体积为50μL/孔；终止显色后30min内使用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，检测波长为450nm，校正波长为630nm，空白猴混合血清的吸光度值将作为板空白进行扣除，再采用4参数Logistic拟合标准曲线，计算质控品和待测猴血清样品的浓度值。
有益效果：
1. 本发明设计了一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，可以准确可靠地测定猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体总药物浓度，包括完全游离型、部分结合型和完全结合型三种单克隆抗体药物存在形式，故可以反映实际的血药浓度；而目前通行的不管是特异性间接法还是特异性双抗体夹心法，均只能检测完全游离型和部分结合型单克隆抗体药物而不能检测完全结合型单克隆抗体药物，因而不能反映实际的血药浓度。
2. 本发明方法可应用于检测猴血清中靶向不同可溶性蛋白的不同亚型单克隆抗体药物的总浓度，并具有广泛的通用性。
3. 本发明方法作为一种通用型分析方法，亦可替代目前通行的检测猴血清中靶向不同膜蛋白的不同亚型单克隆抗体药物的完全游离型单克隆抗体药物浓度的特异性间接法或特异性双抗体夹心法，并能保证检测结果的准确性和可靠性。
4. 本发明方法作为一种通用型分析方法，采用本发明方法可以极大降低目前通行的用于检测猴血清中靶向可溶性蛋白或膜蛋白的单克隆抗体药物浓度的特异性分析方法开发过程中所花费的时间成本和试剂成本，具有显著的经济效益。
附图说明
图1为靶向膜蛋白的单克隆抗体药物及其在体内的存在形式示意图。
图2为靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物及其在体内的存在形式示意图。
图3为现有技术中应用于检测靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物的血药浓度的特异性间接法示意图。
图4为现有技术中应用于检测靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物的血药浓度的特异性双抗体夹心法示意图。
图5为本发明提供的技术方案中应用于检测靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法示意图。
具体实施方式
实施例一
用于检测食蟹猴血清中靶向补体C5蛋白的IgG4型单克隆抗体药物总浓度的通用型酶联免疫分析方法：
一、主要试验步骤
包被：将可特异性结合人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型的小鼠抗人IgG单克隆抗体用pH9.4-pH9.8的碳酸盐缓冲液配制成2μg/mL的包被抗体工作液，每孔加入100μL，用封板膜封板后，置于2-8℃孵育14-20h；
洗板：用0.05%PBST（含有0.05%Tween 20的1×PBS缓冲液）洗涤酶标板3次，300μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，将酶标板在吸水纸上拍干；
封闭：每孔加入250μL含有0.2%I-Block的0.05%PBST，用封板膜封板后，置于37±1℃，400转/min孵育lh±5min；
洗板：用0.05%PBST洗涤酶标板3次，300μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，将酶标板在吸水纸上拍干；
加样：将校正标样、空白食蟹猴混合血清、质控品和待测食蟹猴血清样品用含有0.2%I-Block的0.05%PBST进行100倍稀释（对于浓度高于标准曲线定量上限的待测食蟹猴血清样品，先用空白食蟹猴混合血清对其进行额外适度稀释，再用含有0.2%I-Block的0.05%PBST进行100倍稀释），每孔加入100μL，质控品分布于待测食蟹猴血清样品前后各一套，用封板膜封板后，置于37±1℃，400转/min孵育lh±5min；
洗板：用0.05%PBST洗涤酶标板5次，300 μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，将酶标板在吸水纸上拍干；
加酶标抗体：将辣根过氧化物酶标记的经食蟹猴和恒河猴免疫吸附剂交叉吸附后的羊抗人IgG重链和轻链的多克隆抗体用含有0.2%I-Block的0.05%PBST配制成0.1μg/mL的检测抗体工作液，每孔加入100μL，用封板膜封板后，置于37±1℃，400转/min孵育lh±5min；
洗板：用0.05%PBST洗涤酶标板5次，300 μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，将酶标板在吸水纸上拍干；
显色：每孔加入100 μL四甲基联苯胺，室温孵育10min±5min；
终止显色：每孔加入50μL的1M硫酸；
读板：终止显色后30min内使用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，检测波长为450nm，校正波长为630nm，空白食蟹猴混合血清的吸光度值将作为板空白进行扣除；
计算：采用4参数Logistic拟合标准曲线且不加权重因子，计算质控品和待测食蟹猴血清样品的浓度值。
二、实验结果
1）标准曲线结果
本实施例中，标准曲线包含9个浓度水平的校正标样：100000.000ng/mL，80000.000ng/mL，40000.000ng/mL，20000.000ng/mL，10000.000ng/mL，6000.000ng/mL，3000.000ng/mL，1500.000ng/mL，750.000ng/mL；100000.000ng/mL为定量上限（ULOQ），1500.000ng/mL为定量下限（LLOQ），750.000ng/mL为锚定点。校正标样采用药物用空白食蟹猴混合血清配制而成。各校正标样的回算浓度与理论浓度的相对偏差在-5.7%~5.0%之间（不包括锚定点），完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中标准曲线的技术要求，即至少75%且至少6个校正标样应满足接受标准：回算浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内（LLOQ和ULOQ应在±25%范围内）。具体结果见表1。
表1标准曲线校正标样回算浓度
注：空白食蟹猴混合血清的吸光度值为0.197，作为板空白进行了扣除
2）质控品检测结果
本实施例中，质控品包含3个浓度水平：75000.000ng/mL（HQC）、25000.000ng/mL（MQC）、4500.000ng/mL（LQC），采用药物用空白食蟹猴混合血清独立于校正标样之外配制而成。质控品的检测结果与理论浓度的相对偏差在-7.6%~3.5%之间，完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中质控品检测结果的技术要求，即至少67%且每个浓度至少50%的质控品的测定浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内。具体结果见表2。
表2质控品测定浓度
3）食蟹猴血清样品测定结果
2只体重为3公斤左右的雄性食蟹猴单次静脉注射15mg/kg的靶向补体C5蛋白的IgG4型单克隆抗体，分别于给药前（0h）和给药后4h、D2、D4、D7、D10、D14、D18、D23、D28采集药代动力学血样并分离血清以检测血药浓度，除给药前样品未检测到药物，其余采血时间点样品均可检测出药物。实际检出的血药浓度符合预期的药代动力学特征。具体结果见表3。
表3食蟹猴血清药物总浓度
注：IV=静脉注射，h=小时，D=天，NA=不适用，BQL=低于定量下限
实施例二
用于检测食蟹猴血清中靶向补体C5蛋白的IgG2型单克隆抗体药物总浓度的通用型酶联免疫分析方法：
一、主要试验步骤
除标准曲线校正标样和质控品的配制浓度有所差别之外，均与实施例一中的主要试验步骤相同。
二、实验结果
1）标准曲线结果
本实施例中，标准曲线包含9个浓度水平的校正标样：200000.000ng/mL，160000.000ng/mL，80000.000ng/mL，40000.000ng/mL，20000.000ng/mL，10000.000ng/mL，5000.000ng/mL，2500.000ng/mL，1250.000ng/mL；200000.000ng/mL为定量上限（ULOQ），2500.000ng/mL为定量下限（LLOQ），1250.000ng/mL为锚定点。校正标样采用药物用空白食蟹猴混合血清配制而成。各校正标样的回算浓度与理论浓度的相对偏差在-14.4%~13.6%之间（不包括锚定点），完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中标准曲线的技术要求，即至少75%且至少6个校正标样应满足接受标准：回算浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内（LLOQ和ULOQ应在±25%范围内）。具体结果见表4。
表4标准曲线校正标样回算浓度
注：空白食蟹猴混合血清的吸光度值为0.132，作为板空白进行了扣除
2）质控品检测结果
本实施例中，质控品包含3个浓度水平：150000.000ng/mL（HQC）、30000.000ng/mL（MQC）、7500.000 ng/mL（LQC），采用药物用空白食蟹猴混合血清独立于校正标样之外配制而成。质控品的测定浓度与理论浓度的相对偏差在-17.7% ~ -0.4%之间，完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中质控品的技术要求，即至少67%且每个浓度至少50%的质控品的测定浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内。具体结果见表5。
表5质控品测定浓度
3）食蟹猴血清样品测定结果
2只体重为3公斤左右的雄性食蟹猴单次静脉注射15mg/kg的靶向补体C5蛋白的IgG2型单克隆抗体，分别于给药前（0h）和给药后4h、D2、D4、D7、D10、D14、D18、D23、D28采集药代动力学血样并分离血清以检测血药浓度，除给药前样品未检测到药物，其余采血时间点样品均可检测出药物。实际检出的血药浓度符合预期的药代动力学特征。具体结果见表6。
表6食蟹猴血清药物总浓度
注：IV=静脉注射，h=小时，D=天，NA=不适用，BQL=低于定量下限
实施例三
用于检测食蟹猴血清中靶向某种未知膜蛋白的IgG1型单克隆抗体药物的完全游离型单克隆抗体药物浓度的通用型酶联免疫分析方法：
一、主要试验步骤
除标准曲线校正标样数量、配制浓度以及质控品的配制浓度有所差别之外，均与实施例一中的主要试验步骤相同。
二、实验结果
1)标准曲线结果
本实施例中，标准曲线包含8个浓度水平的校正标样：50000.000ng/mL，40000.000ng/mL，20000.000ng/mL，10000.000ng/mL，6000.000ng/mL，3000.000ng/mL，1500.000ng/mL，750.000ng/mL；50000.000ng/mL为定量上限（ULOQ），1500.000ng/mL为定量下限（LLOQ），750.000ng/mL为锚定点。校正标样采用药物用空白食蟹猴混合血清配制而成。各校正标样的回算浓度与理论浓度的相对偏差在-6.3%~2.4%之间（不包括锚定点），完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中标准曲线的技术要求，即至少75%且至少6个校正标样应满足接受标准：回算浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内（LLOQ和ULOQ应在±25%范围内）。具体结果见表7。
表7标准曲线校正标样回算浓度
注：空白食蟹猴混合血清的吸光度值为0.098，作为板空白进行了扣除
2)质控品检测结果
本实施例中，质控品包含3个浓度水平：37500.000ng/mL（HQC）、12500.000ng/mL（MQC）、4500.000ng/mL（LQC），采用药物用空白食蟹猴混合血清独立于校正标样之外配制而成。质控品的测定浓度与理论浓度的相对偏差在-4.9%~3.9%之间，完全符合《中华人民共和国药典》（2020版）：9012生物样品定量分析验证指导原则和美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指导原则（2018版）对配体结合分析实验中质控品检测结果的技术要求，即至少67%且每个浓度至少50%的质控品的测定浓度与理论浓度的相对偏差应在±20%范围内。具体结果见表8。
表8质控品测定浓度
3)食蟹猴血清样品测定结果
2只体重为3公斤左右的食蟹猴（1雌1雄）单次静脉注射3mg/kg的靶向某种未知膜蛋白的IgG1型单克隆抗体，于给药前（0h）和给药后0.25h、2h、8h、D2、D3、D5、D8、D11、D15、D22、D29采集药代动力学血样并分离血清以检测血药浓度，除给药前样品未检测到药物，其余采血时间点样品均可检测出药物。实际检出的血药浓度符合预期的药代动力学特征。具体结果见表9。
表9食蟹猴血清完全游离型药物浓度
注：IV=静脉注射，h=小时，D=天，NA=不适用，BQL=低于定量下限
从以上实施例的结果可以看出，本发明方法可以准确可靠地检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物的总浓度，另外也可以准确可靠地检测猴血清中靶向膜蛋白的单克隆抗体药物的完全游离型单克隆抗体药物浓度；本发明方法不受单克隆抗体药物的靶点类型和抗体亚型限制，且具有非特异性反应信号低、线性范围宽的优点，可以满足各类型单克隆抗体药物的常规临床前药代动力学和毒代动力学研究中血清药物浓度的检测要求，具有广泛的应用前景。
以上实施例仅为本发明的示例，并不用于限制本发明的使用范围，本发明的保护范围由权利要求书限定。
Claims (10)
1.一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：将通用型包被抗体工作液加入酶标板中，用封板膜封板后，置于2-8℃下孵育14-20h；
S2：用洗液洗板3次后将封闭液加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min，再用洗液洗板3次后将稀释后的校正标样、空白猴混合血清、质控品和待测猴血清样品加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min；
S3：用洗液洗板5次后将通用型酶标检测抗体工作液加入酶标板中，用封板膜封板后，将酶标板置于37±1℃，400转/min孵育55-65min；
S4：用洗液洗板5次后将酶的底物加入酶标板中，将酶标板置于室温孵育进行显色5-15min；将硫酸加入酶标板终止显色后，用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，并拟合标准曲线和计算质控品和待测猴血清样品的浓度值。
2.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S1中通用型包被抗体工作液的配制方法为：将小鼠抗人IgG单克隆抗体用pH9.4-pH9.8的碳酸盐缓冲液稀释为2μg/mL浓度作为包被抗体工作液，所使用的小鼠抗人IgG单克隆抗体可特异性结合人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种IgG亚型，而与人IgA、IgE和IgM不存在交叉反应。
3.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S1中酶标板为对免疫球蛋白具有高吸附能力的无色、透明、平底的聚苯乙烯96孔板，可容纳最大反应体积为400μL/每孔。
4.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S1中通用型包被抗体工作液加入酶标板的体积为100μL/孔。
5.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述洗液为0.05%PBST，即含有0.05%Tween 20的1×PBS缓冲液，洗液加入酶标板的体积均为300μL/孔，不浸泡，最后1次洗板后，均需将酶标板在吸水纸上拍干。
6.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S2中封闭液为含有0.2% I-Block的0.05%PBST，加入酶标板中的体积为250μL/孔。
7.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S2中稀释后的校正标样、空白猴混合血清、质控品和待测猴血清样品的稀释度为100倍稀释，使用的稀释液均为封闭液，加入酶标板的体积为100μL/孔。
8.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述S3中通用型酶标检测抗体工作液的配制方法为：将辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG重链和轻链的多克隆抗体用封闭液稀释为0.1μg/mL浓度作为检测抗体工作液，所使用的山羊抗人IgG重链和轻链的多克隆抗体为使用人IgG免疫山羊后获得的抗血清，经食蟹猴和恒河猴免疫吸附剂交叉吸附后，再经抗原亲和层析所获得的多克隆抗体，该多克隆抗体与猴IgG的交叉反应性低于0.1%。
9.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述步骤S4中底物为四甲基联苯胺，加入酶标板的体积为100μL/孔。
10.根据权利要求1所述的一种检测猴血清中靶向可溶性蛋白的单克隆抗体药物总浓度的通用型方法，其特征在于，所述步骤S4中硫酸的浓度为1M，加入酶标板的体积为50μL/孔；终止显色后30min内使用酶标仪读取酶标板各孔吸光度值，检测波长为450nm，校正波长为630nm，空白猴混合血清的吸光度值将作为板空白进行扣除，再采用4参数Logistic拟合标准曲线，计算质控品和待测猴血清样品的浓度值。
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