WO2014005298A1 - 检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒及其应用 Download PDF

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WO2014005298A1
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antibody
solution
hapten
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何方洋
冯才伟
万宇平
徐念琴
罗晓琴
冯静
陶光灿
余厚美
李勇
扶胜
吴鹏
崔海峰
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北京勤邦生物技术有限公司
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes

Definitions

  • Enzyme-linked immunosorbent kit for detecting dinitramine and application thereof
  • the present invention relates to an enzyme-linked immunoassay technique, and in particular to an enzyme-linked immunoassay kit for detecting dinitramine and an application thereof. Background technique
  • Dinitramine is a nifediamide anticoccidial drug developed by Dow Company of France in 1960. It was approved for production in China in 1989. Dinitramine is widely used because of its good effect on the control of coccidia, but in use, If the dosage is too large or continues to be used in laying hens and in the withdrawal period, it will cause residual drug residues in animal products, which may cause potential harm to human health.
  • the Ministry of Agriculture's Bulletin No. 235 stipulates the maximum residue limit of dinitramine, chicken. And chicken liver were 3000 g/kg and 6000 g/kg, respectively. There is currently no corresponding standard method for residual analytes, so it is necessary to carry out an analytical method for the determination of dinitramine residues.
  • the enzyme-linked immunosorbent kit for detecting dinitramine comprises: a dinitramine specific antibody, a coating original and an enzyme label; wherein preferably the dinitramine-specific antibody is dinitrazole An amine monoclonal antibody or a dinitramine polyclonal antibody, preferably the coating is a conjugate of a dinitramine hapten and a carrier protein, or a dinitramine-specific antibody or an anti-antibody, and preferably
  • the enzyme label is an enzyme-labeled goat anti-mouse anti-antibody or a goat anti-rabbit anti-antibody, an enzyme-labeled anti-dinitramine monoclonal or polyclonal antibody or an enzyme-labeled dinitramine hapten.
  • the enzyme label is an enzyme-labeled goat anti-mouse anti-antibody or a goat anti-rabbit anti-antibody or an enzyme-labeled anti-dinitroto An amine monoclonal or polyclonal antibody; when the coating is originally a dinitramine-specific antibody or an anti-antibody, the enzyme label is an enzyme-labeled dinitramine hapten.
  • the carrier protein used in the present invention is any protein capable of forming an immunogen after coupling with a dinitramine hapten, preferably thyroprotein, bovine serum albumin, murine serum albumin, rabbit serum albumin, human serum albumin, blood blue Protein, fibrinogen or ovalbumin.
  • the kit may also include dinitramine standard solution, color developing solution, concentrated washing solution, stop solution, and/or concentrated complex solution.
  • the concentrated washing liquid may be a pH 7.1-7.6, 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide;
  • the solution may be a pH 7.2-7.8, 0.1-0.2 mol/L phosphate buffer;
  • the coloring liquid is composed of a coloring liquid A liquid and a color developing liquid liquid B, the color developing liquid A liquid may be hydrogen peroxide or urea peroxide, and the color developing liquid liquid B may be o-phenylenediamine or tetramethyl combined.
  • Aniline; the stop solution may be a 0.5 to 2 mol/L sulfuric acid or hydrochloric acid solution.
  • Tween-20 in the buffer will reduce the non-specific adsorption of the antibody, and also protect the protein from azide.
  • sodium azide inhibits the growth of bacteria in solution and provides a protective effect on the stability of the solution.
  • the dinitramine hapten can be obtained by catalytic hydrogenation of dinitramine (eg Pd/C) to obtain a monoamino derivative, and then reacting with succinic anhydride to obtain a dinitramine hapten (5-amino nitrate). Tolamine monosuccinic acid amide).
  • the dinitramine specific antibody is obtained by using a conjugate of the dinitramine hapten and a carrier protein as an immunogen;
  • the carrier protein is thyroprotein, bovine serum albumin, murine serum albumin, rabbit serum Protein, human serum albumin, hemocyanin, fibrinogen or ovalbumin.
  • Dinitramine is a small molecule substance that is immunoreactive, non-immunogenic, and does not induce an immune response in the body. It must be coupled to a macromolecular carrier protein to be immunogenic.
  • the present invention couples the dinitramine hapten to the carrier protein by the carbodiimide method, highlights the characteristic structure of the dinitramine, and also increases the immunogenicity and specificity of the dinitramine hapten.
  • the dinitramine monoclonal antibody and/or polyclonal antibody may be a murine, equine, sheep, rabbit or guinea pig antibody.
  • the dinitramine monoclonal antibody is an antibody secreted by a monoclonal hybridoma cell line E-2-4 of dinitramine having a deposit number of CGMCC No. 6143.
  • the enzyme-labeled anti-antibody is obtained by coupling the labeling enzyme with the anti-antibody by a sodium periodate method; in the sodium periodate method, the molar concentration of the labeling enzyme and the anti-antibody Ratio is 2: 1 ;
  • the enzyme is alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, preferably horseradish peroxidase.
  • the improved sodium periodate method omits the step of blocking the amino group on the enzyme, which saves time and reduces the ratio of horseradish peroxidase (HRP) to anti-antibody concentration, saving raw materials.
  • Another object of the present invention is to provide a method of detecting dinitramine.
  • the method for detecting dinitramine comprises the following steps:
  • sample preparation Weigh the sample into a centrifuge tube, extract with acetonitrile, centrifuge to precipitate, take the supernatant and dry it in a water bath, add n-hexane to dissolve impurities, extract with working complex solution, centrifuge Thereafter, the lower layer solution is taken for analysis, wherein the sample is an animal feed or animal tissue sample, preferably chicken feed, chicken or chicken liver;
  • the mouse monoclonal hybridoma cell line E-2-4 having the accession number CGMCC No. 6143 is also within the scope of the present invention.
  • the enzyme-linked immunosorbent kit for detecting dinitramine mainly uses a competitive ELISA method to qualitatively or quantitatively detect the residual amount of dinitramine in the sample; the kit has low requirements for pretreatment of the sample, and the sample preparation process is simple and capable. At the same time, rapid detection of large quantities of samples; the main reagents of this kit are provided in the form of working fluids, the test method is convenient and easy, and has the characteristics of high specificity, high sensitivity, high precision and high accuracy.
  • the enzyme-linked immunoassay kit of the invention has the advantages of simple structure, convenient use, low price, convenient carrying, high and accurate detection method, convenient and on-site monitoring, and suitable for qualitative and quantitative screening of a large number of samples, which will be used in dinitramine Play an important role in the detection.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the synthesis of dinitramine hapten
  • Fig. 2 is a standard curve of a kit in which a conjugate of a dinitramine hapten and a carrier protein is used as a coating. detailed description
  • the enzyme-linked immunosorbent kit for the coating of dinitramine hapten and carrier protein conjugates generally includes:
  • Enzyme-labeled anti-antibody working solution goat anti-mouse anti-antibody labeled with horseradish peroxidase or goat anti-rabbit anti-antibody labeled with horseradish peroxidase;
  • the substrate coloring solution is composed of liquid A and liquid B.
  • the substrate coloring liquid A is urea peroxide or hydrogen peroxide
  • the substrate coloring liquid B is tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine.
  • the stop solution is 0.5-2 mol/L hydrochloric acid or sulfuric acid;
  • the concentrated washing solution is a 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer solution having a pH of 7.1-7.6, containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide;
  • the concentrated solution is a phosphate buffer solution of pH 7.2-7.8 and 0.1-0.2 mol/L.
  • the enzyme-linked immunosorbent kit for the coating of the dinitramine hapten and carrier protein conjugate of the present invention comprises:
  • Enzyme-labeled anti-antibody working solution goat anti-mouse anti-antibody labeled with horseradish peroxidase;
  • the concentration is 0 g / L, 1 g / L, 3 g / L, 9 g / L, 27 g / L, 81 g / L;
  • the substrate color developing solution is composed of liquid A and liquid B, the substrate coloring liquid A liquid is urea peroxide, and the substrate color developing liquid liquid B is tetramethylbenzidine;
  • the stop solution is 0.5-2 mol/L sulfuric acid
  • the concentrated washing solution is a 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer solution having a pH of 7.1-7.6, containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide.
  • the concentrated solution is a phosphate buffer solution having a pH of 7.2-7.8 and 0.1-0.2 mol/L.
  • the dinitramine hapten and bovine serum albumin (BSA) obtained above were subjected to the carbodiimide method (see Nanjing University Press, Yang Liguo, Hu Shaozhen, Wei Pinghua, etc., "Enzyme Immunoassay Technology” P254-255) Coupling was carried out to obtain an immunogen.
  • the dinitramine hapten and the ovalbumin (purchased from Shanghai Xibao Biotechnology Co., Ltd.) were coupled by a carbodiimide method to obtain a coating original.
  • the spleen cells were taken and fused with SP2/0 myeloma cells (purchased from the Institute of Genetics and Developmental Biology, China) in a ratio of 9:1 (quantitative ratio), and cells were determined by indirect competition ELISA. The supernatant was screened for positive wells. The positive wells were cloned by limiting dilution until a hybridoma cell line secreting the monoclonal antibody was obtained.
  • the mouse hybridoma cell line E-2-4 of dinitramine was screened.
  • the hybridoma cell line was deposited on May 21, 2012 at the General Microbiology Center of the China Microbial Culture Collection Management Committee (CGMCC, Beijing, China) with the accession number CGMCC No. 6143.
  • the antibody secreted by the hybridoma cell line has good specificity for dinitramine, and the sensitivity can reach lg/L.
  • the affinity constant of the monoclonal antibody is determined by ELISA.
  • the dinitramine monoclonal hybridoma cell line ⁇ -2-4 was prepared into a cell suspension of 6 cells/mL with a cryopreservation solution, and stored for a long time in liquid nitrogen. When resuscitation, remove the cryotube and immediately put it into a 37 °C water bath for rapid fusion. After centrifugation to remove the frozen solution, transfer it to a culture flask for cultivation.
  • the concentrated washing solution diluted 20 times was washed twice, the liquid in the well was removed, and the residual water was absorbed by the absorbent paper, then 150-200 ⁇ blocking solution was added to each well, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours, and the liquid in the well was decanted. After drying, vacuum-sealed with aluminum film and stored at 4 °C in a dry place.
  • the coating solution was a carbonate buffer having a pH of 9.1-9.6 and 0.1-0.2 mol/L.
  • the blocking solution contained 5-10 wt% calf serum and 0.05 wt%.
  • the anti-antibody was coupled to horseradish peroxidase (HRP) using a modified sodium periodate method.
  • the traditional sodium periodate method requires a molar ratio of enzyme to anti-antibody in the reaction system of 4:1; since horseradish peroxidase produces many sites that bind to anti-antibodies under the action of strong oxidation, thus activated
  • the horseradish peroxidase molecule acts as a bridge connecting the molecules, reducing the enzymatic activity of the enzyme label, and mixing the prepared conjugate with many polymers. To solve this problem, we have improved the traditional method. , which is:
  • the blocking process of the amino group is omitted because the amino group capable of producing a self-amino group is practically few.
  • the horseradish peroxidase:antibody molar ratio was reduced to 2:1. Improved method is more traditional The method is simple and the loss of enzyme activity is reduced. 4. Using the above kit to detect residual dinitramine in the sample
  • a microplate reader purchased from Thermo Scientific, model MK3
  • the absorbance average value (B) of the obtained standard solution of each concentration was divided by the absorbance value (B Q ) of the first standard solution (0 standard) and multiplied by 100% to obtain a percent absorbance value.
  • Percent absorbance value (%) x ioo%
  • B is the average absorbance value of the standard solution or the sample solution
  • B Q is the average absorbance value of the standard solution of 0 g/L.
  • the concentration of the dinitramine standard (g/L) is the X-axis and the percent absorbance is the Y-axis.
  • the standard curve is drawn (Fig. 2).
  • the analysis of the detection results in the present invention can also be carried out by using the regression equation method to calculate the concentration of the sample solution.
  • the detection sensitivity of the kit for the preparation of the monoclonal antibody is determined by the precision, the accuracy, the detection limit and the stability index of the kit of the present invention.
  • the detection sensitivity of the kit for the dinitramine is O. lg / L, the accuracy is 80% - 100%, precision The degree is less than 15%.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay can qualitatively and quantitatively detect trace residual harmful substances, and has low requirements on instruments, low cost, quick and easy operation, simple sample preparation process, low professional requirements for detectors, high sensitivity, and can be applied to a large number of sites. Rapid sample testing.
  • a batch of enzyme-labeled plates were taken from the enzyme-labeled plates prepared in three different time periods, and 10 kits were taken from each batch. 20 microwells were extracted from each plate, and the absorbance of the 9 g/L standard solution was determined. , calculate the coefficient of variation.
  • the precision is less than or equal to 25%.
  • the average recovery range of the concentration of 40 mg/kg and 80 g/kg dinitramine in the feed sample ranged from 86.9% to 92.5%
  • the intra-assay coefficient of variation ranged from 8.6 to 8%.
  • the inter-assay coefficient of variation is between 11.5% and 13.4%.
  • the average recovery of the two concentrations of dinitramine in 10 g/kg and 20 g/kg in chicken and chicken liver samples ranged from 80.1% to 89.7%, and the intra-assay coefficient of variation ranged from 9.6 to 12.3. Between %, the inter-assay coefficient of variation is between 10.5% and 14.5%.
  • a negative sample containing no dinitramine was taken and 20 times were tested with the kit. The average value of the results plus 3 standard deviations was used as the minimum detection limit of the kit.
  • the kit is stored at 2 to 8 ° C. After 12 months of measurement, the maximum absorbance of the kit (zero Standard), 50% inhibitory concentration, and actual measured values of dinitramine addition are within the normal range. It is considered that during the transportation and use, abnormal storage conditions will occur.
  • the kit is placed under the storage condition of 37 ° C for 6 days to carry out accelerated aging test. The results show that the indicators of the kit fully meet the requirements. Taking into account the freezing of the kit, the kit was frozen in a -20 ° C refrigerator for 5 days, and the results also showed that the kit parameters were completely normal. From the above results, it can be concluded that the kit can be stored at 2 to 8 ° C for more than 12 months.
  • Kit for the preparation of polyclonal antibodies Determination of the precision, accuracy, limit of detection and stability of the kits prepared with monoclonal antibodies, determined by the method described above
  • the polyclonal antibody kit has a precision of 6.9%-14.2%, an accuracy of 60%-100%, a kit sensitivity of 3.67 g/kg, and a kit that can hold 12 at 2 ⁇ 8 °C. More than a month.
  • the concentration is 0 g / L, 1 g / L, 3 g / L, 9 g / L, 27 g / L, 81 g / L;
  • the substrate color developing solution is composed of liquid A and liquid B.
  • the substrate coloring liquid A is urea peroxide or hydrogen peroxide
  • the substrate coloring liquid liquid B is tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine.
  • the stop solution is 0.5-2 mol/L hydrochloric acid or sulfuric acid;
  • the concentrated washing solution is a 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer solution having a pH of 7.1-7.6, containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide;
  • the concentrated solution is a phosphate buffer having a pH of 7.2-7.8 and 0.1-0.2 mol/L.
  • the substrate coloring solution is composed of liquid A and liquid B.
  • the substrate coloring liquid A is urea peroxide or hydrogen peroxide
  • the substrate coloring liquid B is tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine.
  • the stop solution is 0.5-2 mol/L hydrochloric acid or sulfuric acid;
  • the concentrated washing solution is a 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer solution having a pH of 7.1-7.6, containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide;
  • the concentrated solution is a phosphate buffer having a pH of 7.2-7.8 and 0.1-0.2 mol/L.
  • Example 4 A kit containing a dinitramine hapten and a carrier protein conjugate as a coating
  • Enzyme-labeled antibody working solution a monoclonal antibody of dinitramine labeled with horseradish peroxidase or a polyclonal antibody of dinitramine labeled with horseradish peroxidase;
  • the concentration is 0 g / L, 1 g / L, 3 g / L, 9 g / L, 27 g / L, 81 g / L;
  • the substrate color developing solution is composed of liquid A and liquid B.
  • the substrate coloring liquid A is urea peroxide or hydrogen peroxide
  • the substrate coloring liquid liquid B is tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine.
  • the stop solution is 0.5-2 mol/L hydrochloric acid or sulfuric acid;
  • the concentrated washing solution is a 0.2-0.4 mol/L phosphate buffer solution having a pH of 7.1-7.6, containing 0.2-1.0 wt% Tween-20 and 0.01-0.06 wt% sodium azide;
  • the concentrated solution is a phosphate buffer having a pH of 7.2-7.8 and 0.1-0.2 mol/L.

Abstract

本发明提供了一种检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒及其应用。该酶联免疫试剂盒包括二硝托胺特异性抗体、包被原和酶标记物，其中，二硝托胺特异性抗体为二硝托胺单克隆抗体或二硝托胺多克隆抗体；当包被原为二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物时，酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记特异性抗二硝托胺单克隆或多克隆抗体；当包被原为二硝托胺特异性抗体或抗抗体时，酶标记物为酶标记二硝托胺半抗原。

Description

检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及酶联免疫检测技术， 具体涉及一种用于检测二硝托胺的酶联免疫试 剂盒及其应用。 背景技术
二硝托胺是 1960年由法国 Dow公司开发的硝苯酰胺类抗球虫药，我国于 1989 年批准生产使用， 二硝托胺因防治球虫效果好而得到普遍应用， 但在使用中， 如果 用量过大或在产蛋鸡及停药期继续使用， 将造成畜产品中药物的残留， 对人体健康 造成潜在危害， 我国农业部 235号公告中规定二硝托胺的最大残留限量， 鸡肉和鸡 肝中分别为 3000 g/kg和 6000 g/kg。 目前尚缺乏相应的残留分析物标准方法， 因 此有必要开展测定二硝托胺残留量的分析方法研究。
目前， 对于饲料中和动物组织二硝托胺残留量分析的方法主要为薄层色谱法、 分光光度法和高效液相色谱法。 由于复杂的仪器设备、 繁琐的过程、 较高的检测成 本以及对检验人员的高技能要求， 所以这些现有技术的方法不适合现场监控和大量 样本的筛査。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒， 包括： 二硝托胺特异性抗 体、 包被原和酶标记物； 其中优选所述二硝托胺特异性抗体为二硝托胺单克隆抗体 或二硝托胺多克隆抗体， 优选所述包被原是二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物、 或二硝托胺特异性抗体或抗抗体， 并且优选所述酶标记物为酶标记羊抗鼠抗抗体或 羊抗兔抗抗体、 酶标记特异性抗二硝托胺单克隆或多克隆抗体或酶标记二硝托胺半 抗原。
当所述包被原为二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物时， 所述酶标记物为酶 标记羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体或酶标记特异性抗二硝托胺单克隆或多克隆抗 体； 当所述包被原为二硝托胺特异性抗体或抗抗体时， 所述酶标记物为酶标记二硝 托胺半抗原。 在本发明中所用的载体蛋白是能够与二硝托胺半抗原偶联后形成免疫原的任 何蛋白， 优选为甲状腺蛋白、 牛血清蛋白、 鼠血清蛋白、兔血清蛋白、 人血清蛋白、 血蓝蛋白、 纤维蛋白原或卵清蛋白。
为了更方便现场监控和大量样本筛査， 所述试剂盒还可包括二硝托胺标准溶 液、 显色液、 浓缩洗涤液、 终止液和 /或浓缩复溶液。
所述浓缩洗漆液可以为 pH 7.1-7.6、 含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt% 叠氮化钠的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液可以为 pH 7.2-7.8,0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液；
所述显色液由显色液 A液和显色液 B液组成， 显色液 A液可以为过氧化氢或过 氧化脲， 显色液 B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯胺； 所述终止液可以为 0.5〜2 mol/L硫酸或盐酸溶液。
在洗涤液中加入一定量吐温 -20和叠氮化钠的作用在于： 缓冲液中吐温 -20会 减少抗体的非特异性吸附， 还能对蛋白起到一定的保护作用， 加入叠氮化钠后， 则 叠氮钠在溶液中抑制细菌的生长， 对溶液的稳定性起到一个保护作用。
所述二硝托胺半抗原可以按照如下方法得到：将二硝托胺催化氢化（e.g. Pd/C) 得到单氨基衍生物， 再与琥珀酸酐反应得到二硝托胺半抗原 （5-氨基硝托胺单琥珀 酸酰胺） 。
所述二硝托胺特异性抗体是用所述二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物作为 免疫原得到的； 所述载体蛋白为甲状腺蛋白、 牛血清蛋白、 鼠血清蛋白、 兔血清蛋 白、 人血清蛋白、 血蓝蛋白、 纤维蛋白原或卵清蛋白。
二硝托胺是小分子物质， 只有免疫反应性， 没有免疫原性， 不能诱发机体产 生免疫应答， 必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。 本发明采用碳二亚胺 法将二硝托胺半抗原与载体蛋白偶联， 突出了二硝托胺的特征结构， 同时也增加了 二硝托胺半抗原的免疫原性和特异性。
所述二硝托胺单克隆抗体和 /或多克隆抗体可为鼠源、 马源、 羊源、 兔源或豚 鼠源抗体。
优选所述二硝托胺单克隆抗体为由保藏号为 CGMCC No. 6143的二硝托胺的 单克隆杂交瘤细胞株 E-2-4分泌的抗体。
所述酶标抗抗体是采用过碘酸钠法将所述标记酶与所述抗抗体进行偶联得到 的； 所述过碘酸钠方法中， 所述标记酶与所述抗抗体的摩尔浓度比为 2: 1 ; 所述标 记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶， 优选为辣根过氧化物酶。 该改良的过碘酸钠 法省略了封闭酶上氨基的步骤， 节省了时间， 又降低了辣根过氧化物酶 （HRP) 与 抗抗体的浓度比率， 节省了原材料。
本发明的另一个目的是提供一种检测二硝托胺的方法。
本发明所提供的检测二硝托胺的方法， 包括以下步骤：
1 ) 样品前处理： 称取样品的均质样本至离心管中， 用乙腈提取， 离心沉淀， 取上清液在水浴下吹干， 加入正己烷溶解以去除杂质， 用工作复溶液提取， 离心后 取下层溶液用于分析， 其中所述样品为动物饲料或动物组织样品， 优选为鸡饲料、 鸡肉或鸡肝；
2)用上述任一种酶联免疫试剂盒定量和 /或定性检测 1 ) 中所述下层溶液； 和 任选地
3 ) 分析检测结果。
保藏号为 CGMCC No. 6143的小鼠单克隆杂交瘤细胞株 E-2-4也属于本发明 的保护范围内。
本发明检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒主要采用竞争 ELISA方法定性或定量 检测样品中二硝托胺的残留量； 本试剂盒对样品的前处理要求低， 样品前处理过程 简单， 能同时快速检测大批量样品； 本试剂盒主要试剂以工作液的形式提供， 检验 方法方便易行， 具有特异性高、 灵敏度高、 精确度高、 准确度高等特点。 本发明的 酶联免疫试剂盒， 结构简单、 使用方便、 价格便宜、 携带便利、 检测方法高效、 准 确、 简便， 能够进行现场监控且适合大量样本的定性和定量筛査， 将在二硝托胺的 检测中发挥重要作用。 附图说明
图 1为二硝托胺半抗原的合成示意图；
图 2为以二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原的试剂盒的标准曲线 图。 具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法， 所用各类化学 试剂如无另外特别说明， 都属于可商购的化学纯试剂。 实施例一 以二硝托胺半抗原与载体蛋白偶联物为包被原的试剂盒及其检测 方法
一、 以二硝托胺半抗原与载体蛋白偶联物为包被原的酶联免疫试剂盒一般包 括：
(1) 包被包被原 （包被原为二硝托胺半抗原和载体蛋白偶联物） 的酶标板；
(2) 酶标记抗抗体工作液： 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体或用辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔抗抗体；
(3) 二硝托胺单克隆抗体工作液或二硝托胺多克隆抗体工作液；
(4) 二硝托胺标准品 （上海安普科学仪器有限公司， 货号： 148-01-6) 溶液 6瓶， 浓度分别为 0 g/L、 l g/L、 3 g/L、 9 g/L、 27 g/L、 81 g/L;
(5) 底物显色液由 A液和 B液组成，底物显色液 A液为过氧化脲或过氧化氢， 底 物显色液 B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；
(6) 终止液为 0.5-2 mol/L盐酸或硫酸；
(7) 浓缩洗涤液为 pH 7.1-7.6、含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt%叠氮化钠 的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液；
(8) 浓缩复溶液为 pH 7.2-7.8、 0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。 二、 本发明二硝托胺半抗原与载体蛋白偶联物为包被原的酶联免疫试剂盒具 体包括：
(1) 包被包被原 （包被原为二硝托胺半抗原和载体蛋白偶联物） 的酶标板；
(2) 酶标记抗抗体工作液： 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
(3) 二硝托胺单克隆抗体工作液；
(4) 二硝托胺标准品溶液 6瓶，浓度分别为 0 g/L、 1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、 81 g/L;
(5) 底物显色液由 A液和 B液组成， 底物显色液 A液为过氧化脲， 底物显色液 B 液为四甲基联苯胺；
(6) 终止液为 0.5-2mol/L硫酸；
(7) 浓缩洗涤液为 pH 7.1-7.6、含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt%叠氮化钠 的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液。 (8) 浓缩复溶液为 pH 7.2-7.8、 0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。
三、 试剂盒组分制备
1. 抗原的合成
a. 半抗原的合成 （图 1 )
半抗原的具体步骤：
称取 1.4〜3.0 g二硝托胺 （上海安普科学仪器有限公司， 货号： 148-01-6) 溶 于 200 500 ml无水乙醇， 加入 3.5 5.0 g 10%披钯碳 （Pd/C) 催化氢化， 20~60°C 反应 12〜30 h， 过滤， 除去溶剂， 柱层析 （120〜200目硅胶） （洗脱液： 二氯甲烷 / 甲醇， 体积比 20: 1 ) 分离得到 5-氨基硝托胺；
取 0.4-1.0 g 5-氨基硝托胺， 0.3~0.5g琥珀酸酐和 1 ml吡啶， 溶入 10-20 ml DMSO中， 20~60°C下搅拌反应 10~24 h， 蒸发除去溶剂， 柱层析（120 200目硅胶） (洗脱液： 二氯甲烷 /甲醇， 体积比 20: 1 ) 后在乙醇-水体系中重结晶得到 5-氨基硝 托胺单琥珀酸酰胺 （二硝托胺半抗原） 。 b . 免疫原合成
将以上获得的二硝托胺半抗原与牛血清白蛋白 （BSA) 采用碳二亚胺法 （参 见南京大学出版社， 杨利国,胡少昶，魏平华等编著的 《酶免疫测定技术》 P254-255 页） 进行偶联得到免疫原。
具体操如下：
取 8 mg二硝托胺半抗原用 l mL N,N-二甲基甲酰胺 （DMF) 溶解， 加入 6 mg 用 0.2 mL 0.1 mol/L 2-吗啉乙磺酸 （MES) 溶解的碳二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺
(EDC/NHS) ， 室温反应 15 min， 再加入 30 mg用 1.8 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 溶解的牛血清白蛋白， 反应 16小时， 用 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液透析三天， 每天 换液 3次， 得到免疫原。 c 包被原的合成
将二硝托胺半抗原与卵清蛋白 （购自上海西宝生物科技有限公司） 采用碳二 亚胺法进行偶联得到包被原。
具体操作如下：
取 5 mg二硝托胺半抗原用 1 mL DMF溶解，加入 6 mg用 0.2 mL 0.1 mol/LMES 溶解的 EDC/NHS,室温反应 15 min， 再加入 30 mg用 1.8 mL 0.1 mol/L PBS溶解的 卵清蛋白， 反应 16小时， 用 0.01 mol/L PBS透析三天， 每天换液 3次， 得到包被 原。
2. 单克隆抗体的制备
a. 动物免疫
选取 6-8周龄健康 Balb/c小鼠 （购自中国人民解放军军事医学科学院） ， 按 照免疫剂量为 150 g/只进行皮下多点注射免疫。 首次免疫时取等量弗氏完全佐剂 (购自 Sigma公司， 货号 F5881 ) 与免疫原均匀混合， 后续免疫时与等量弗氏不完 全佐剂 （购自 Sigma公司， 货号 F5506) 混合。
b. 细胞融合和克隆化
小鼠血清测定结果较高后， 取其脾细胞， 按 9: 1比例 （数量比） 与 SP2/0骨髓 瘤细胞（购自中国遗传与发育生物学研究所）融合， 采用间接竞争 ELISA测定细胞 上清液， 筛选阳性孔。 利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化， 直到得到分泌单克隆 抗体的杂交瘤细胞株。
经筛选得到二硝托胺的小鼠杂交瘤细胞株 E-2-4。该杂交瘤细胞株于 2012年 5 月 21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC, 中国， 北京） ， 保藏号为 CGMCC No. 6143。 该杂交瘤细胞株分泌的抗体针对二硝托胺特 异性良好， 灵敏度能达到 l g/L， 经 ELISA测定， 单克隆抗体的亲和常数为大约
Figure imgf000007_0001
c. 细胞冻存和复苏
将二硝托胺单克隆杂交瘤细胞株 Ε-2-4用冻存液制成 Ιχ ΙΟ6个 /mL的细胞悬 液， 在液氮中长期保存。 复苏时取出冻存管， 立即放入 37°C水浴中速融， 离心去除 冻存液后， 移入培养瓶内培养。
d. 单克隆抗体的生产与纯化
取 6-8周龄 Balb/c小鼠若干只， 腹腔注入灭菌石蜡油 0.5 mL/只， 7天后腹腔 注射二硝托胺的单克隆杂交瘤细胞株 E-2-4达 5χ 107个 /只， 7天后采集腹水。 用辛 酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化， -20°C保存。
3. 多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔（购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂） 作为免疫动物， 以二硝托胺半抗原与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原， 免疫剂量为 1.5 mg/kg， 首免 时将免疫原与等量的弗氏完全佐 （来源同上） 混合制成乳化剂， 颈背部皮下多点注 射， 间隔 3〜4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂 （来源同上） 混合乳化， 加强免疫一次， 共免疫 5次， 最后一次不加佐剂。 最后一次免疫 10天后采血， 测 定血清抗体效价， 心脏采血， 用辛酸-饱和硫酸铵法（陈丹， 孙广瑞， 柳增善， 辛酸 -硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用 [J]， 安徽农业科学， 2007,35 (26) ： 8105-8108) 纯化得到多克隆抗体。
4. 羊抗鼠抗抗体的制备过程： 以羊 （购自北京市兴隆实验动物养殖厂） 作为 免疫动物， 以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫， 得到羊抗鼠抗抗体； 羊抗 兔抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫， 得到羊抗兔抗抗体。
5. 酶标板的制备
用包被缓冲液将二硝托胺偶联抗原稀释成 0.05-0.2 g/ml， 每孔加入 100 μ1， 37°C温育 2h或 4°C过夜， 倾去包被液， 用去离子水稀释 20倍的浓缩洗涤液洗涤 2 次， 甩掉孔中液体， 以吸水纸吸除残余水分后， 向每孔中加入 150-200 μΐ封闭液， 37°C温育 2h， 倾去孔内液体， 干燥后用铝膜真空密封， 4°C干燥处保存备用。
所述包被液为 pH 9.1-9.6、 0.1-0.2 mol/L的碳酸缓冲液。 所述封闭液为含 5-10 wt%小牛血清和 0.05 wt%。的叠氮化钠， pH 7.1-7.4、 0.02-0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液。
6. 酶标记羊抗鼠抗抗体的制备
将抗抗体与辣根过氧化物酶 （HRP) 采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。 传 统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为 4: 1 ; 由于辣根过氧化 物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点， 这样活化的辣根过氧化物酶 分子充当了连接各分子的桥梁， 降低了酶标记物的酶活性， 使制备的偶联物中混有 许多聚合体， 为了解决这个问题， 我们将传统的方法进行了改良， 即：
省去了氨基的封闭过程， 因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。
将辣根过氧化物酶： 抗抗体的摩尔浓度比率降低至 2: 1。 改良后的方法比传统 的方法简便， 对酶的活性的损失减少。 四、 用上述试剂盒检测样品中残留的二硝托胺
1、 样本前处理
a) 鸡组织 （鸡肉、 鸡肝）
称取 1.0 ± 0.05 g上述组织的均质物至 50 mL聚苯乙烯离心管中， 加入 8 mL 乙腈， 振荡 10 min; 3000 g以上， 室温离心 5 min; 移取 2 mL上层液至 10 mL干净 玻璃试管中， 于 50〜60°C水浴氮气流下吹干； 加入 l mL正己烷涡旋 30s， 溶解干 燥的残留物， 再加入 l mL工作复溶液， 涡旋 30s， 3000 g以上， 室温离心 5 min; 取 50 μΐ下层液用于分析。
b) 饲料样本
称取 1.0 ± 0.05 g上述饲料样本的均质物至 50 mL聚苯乙烯离心管中， 加入 8 mL乙腈， 振荡 10 min; 3000 g以上， 室温离心 5 min; 移取 1 mL上层液至 10 mL 干净玻璃试管中， 于 50〜60°C水浴氮气流下吹干； 加入 l mL正己烷涡旋 30s， 再加 入 l mL工作复溶液 30s; 3000 g以上， 室温离心 5 min; 取 50 μΐ下层液用于分析。
2、 检测
向包被有二硝托胺偶联抗原的酶标板微孔中加入二硝托胺标准品溶液或样品 溶液 50 μ1， 再加入效价为 1:2χ 105的二硝托胺单克隆抗体工作液 50 μ1， 用盖板模封 板， 25°C恒温箱中反应 30 min， 倒出孔内液体， 每孔加入 250 μΐ 0.01〜0.02 mol/L 洗涤液， 30s后倒出孔内液体， 如此重复操作共洗板 5次， 最后用吸水纸除去残余 水分。加入效价为 1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液 100 μ1， 25 °C 恒温箱中反应 30 min， 倒出孔内液体， 重复洗板步骤， 每孔加入底物显色液 A液过 氧化脲 50 μ1， 底物显色液 Β液四甲基联苯胺 （ΤΜΒ ) 50 μ1， 轻轻振荡混匀， 25°C 恒温箱避光显色 15 min, 每孔加入 2 mol/L盐酸终止液 50 μ1， 轻轻振荡混匀， 用酶 标仪（购自 Thermo Scientific, 型号 MK3 )波长设定在 450 nm处， 测定每孔吸光度 值 （OD450值） 。
3、 检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B )除以第一个标准品溶 液 （0标准） 的吸光度值 （BQ) 再乘以 100%， 得到百分吸光度值。 百分吸光度值 （％) = x ioo%
Bo 公式中 B为标准品溶液或样本溶液的平均吸光度值， BQ为 0 g/L标准品溶液 的平均吸光度值。
以二硝托胺标准品浓度 （ g/L) 值为 X轴， 百分吸光度值为 Y轴， 绘制得到 标准曲线图 （图 2) 。 用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值， 相对应每一个 样品的浓度， 则可从标准曲线上读出样本中二硝托胺的残留量。 本发明中检测结果 的分析也可以采用回归方程法， 计算出样品溶液浓度。 单克隆抗体制备的试剂盒精密度、 准确度、 检测限和稳定性指标测定 本发明试剂盒的对二硝托胺的检测灵敏度为 O. l g/L, 准确度为 80%-100%， 精密度为小于 15%。
与色谱法相比的优势在于： 仪器设备昂贵， 技术水平要求较高， 样品还需要 进行纯化处理， 不利于现场筛査。 酶联免疫分析技术可定性定量检测微量残留有害 物质， 且对仪器要求低， 成本低， 操作快速简便， 对样本前处理过程简单， 对检测 人员专业要求低， 灵敏度较高， 可适用于现场大量样本快速检测。
1.标准品精密度试验
分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板， 每批各抽取 10 个试剂盒， 每板各抽出 20个微孔， 测定 9 g/L标准溶液的吸光度值， 计算变异系 数。
表 1 标准可重复性试验 （cv%)
1 2 3 4 6 8 9 10
01批 4.5 6.4 5.8 7.9 4.5 6.3 9.2 4.3 5.0 6.5
02批 7.2 2.3 4.2
03批 5.3 4.8 6.5 5.5 8.3 4.9 6.0 7.4 通过上述试验结果可以得出， 每批试剂盒各 10次标准品变异系数在
2.3%-9.2%之间， 符合精密度小于或等于 25%的规定。
2.样本精密度和准确度试验
准确度是指测得值与真值的符合程度， 在 ELSIA中， 试剂盒的准确度常以回 收率表示， 而精密度常以变异系数来表示。 按照试剂盒提取方法， 以 40 g/kg、 80 g/kg两个浓度的二硝托胺对空白饲料样本进行添加回收， 以 10 g/kg、 20 g/kg两 个浓度的二硝托胺对空白鸡肉、 鸡肝样本进行添加回收， 每种样本每个浓度各做 4 个平行， 并计算出变异系数。 实验结果见表 2和表 3。 表 2 添加二硝托胺的饲料样本的准确度和精密度 （ g/kg)
Figure imgf000011_0001
20 80.1 9.6 10.5
10 80.3 12.3 13.7
鸡肝
20 89.7 11.4 14.5 从表 2可知， 饲料样本中 40 g/kg、 80 g/kg两个浓度的二硝托胺添加的平均 回收率范围为 86.9%〜92.5%， 批内变异系数范围为 8.6〜10.2%之间， 批间变异系 数在 11.5%〜13.4%。
从表 3可知， 鸡肉、 鸡肝样本中 10 g/kg、 20 g/kg两个浓度的二硝托胺添加 的平均回收率范围为 80.1%〜89.7%， 批内变异系数范围为 9.6〜 12.3%之间， 批间 变异系数在 10.5%〜14.5%。
符合农业部文件 [2005] 17号附件 2试剂盒备案参考评判标准中精密度和准确 度标准。
3. 试剂盒的检测灵敏度
取不含二硝托胺的阴性样品， 用试剂盒分别进行 20次检测， 测定结果的平均 值加上 3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。
结果如表所示， 表明试剂盒的最低检测限为 0.95 g/kg。 表 4 阴性样品测定结果统计表 （ g/kg)
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 测定值 0.30 0.00 0.00 0.34 0.48 0.40 0.25 0.00 样品号 9 10 11 12 13 14 15 16 测定值 0.35 0.38 0.20 0.61 0.00 0.61 0.00 0.33 最低检测 样品号 17 18 19 20 平均值 标准差
限 测定值 0.00 0.42 0.63 0.00 0.27 0.23 0.95
4. 试剂盒的稳定性试验
试剂盒保存条件为 2〜8°C， 经过 12个月的测定， 试剂盒的最大吸光度值 （零 标准） 、 50%抑制浓度、 二硝托胺添加实际测定值均在正常范围之内。 考虑在运输 和使用过程中， 会有非正常保存条件出现， 将试剂盒在 37°C保存条件下放置 6天， 进行加速老化实验， 结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。 考虑到试剂盒冷冻 情况发生，将试剂盒放入 -20°C冰箱冷冻 5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全 正常。 从以上结果可得出试剂盒可以在 2〜8°C可以保存 12个月以上。 多克隆抗体制备的试剂盒精密度、 准确度、 检测限和稳定性指标测定 同单克隆抗体制备的试剂盒精密度、 准确度、 检测限和稳定性指标测定方法， 经测定， 使用上述方法制备的多克隆抗体的试剂盒的精密度为 6.9%-14.2%， 准确度 为 60%-100%， 试剂盒的检测灵敏度为 3.67 g/kg， 试剂盒可以在 2〜8°C可以保存 12 个月以上。 实施例二 以二硝托胺特异性抗体为包被原的试剂盒
(1) 包被包被原 （包被原为二硝托胺特异性抗体） 的酶标板；
(2) 酶标记二硝托胺半抗原： 用辣根过氧化物酶标记的二硝托胺半抗原；
(3) 二硝托胺标准品溶液 6瓶，浓度分别为 0 g/L、 1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、 81 g/L;
(4) 底物显色液由 A液和 B液组成，底物显色液 A液为过氧化脲或过氧化氢， 底 物显色液 B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；
(5) 终止液为 0.5-2 mol/L盐酸或硫酸；
(6) 浓缩洗涤液为 pH 7.1-7.6、含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt%叠氮化钠 的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液；
(7) 浓缩复溶液为 pH值为 7.2-7.8、 0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。 实施例三 以抗抗体为包被原的试剂盒
(1) 包被包被原 （包被原为抗抗体） 的酶标板；
(2) 二硝托胺单克隆抗体工作液或二硝托胺多克隆抗体工作液；
(3) 酶标记二硝托胺半抗原： 用辣根过氧化物酶标记的二硝托胺半抗原；
(4) 二硝托胺标准品溶液 6瓶，浓度分别为 0 g/L、 1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、 81 g/L; (5) 底物显色液由 A液和 B液组成，底物显色液 A液为过氧化脲或过氧化氢， 底 物显色液 B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；
(6) 终止液为 0.5-2 mol/L盐酸或硫酸；
(7) 浓缩洗涤液为 pH 7.1-7.6、含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt%叠氮化钠 的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液；
(8) 浓缩复溶液为 pH值为 7.2-7.8、 0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。 实施例四 以二硝托胺半抗原和载体蛋白偶联物为包被原的试剂盒
(1) 包被包被原 （包被原为二硝托胺半抗原和载体蛋白偶联物） 的酶标板；
(2) 酶标记抗体工作液： 用辣根过氧化物酶标记的二硝托胺单克隆抗体或用辣根 过氧化物酶标记的二硝托胺多克隆抗体；
(3) 二硝托胺标准品溶液 6瓶，浓度分别为 0 g/L、 1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、 81 g/L;
(4) 底物显色液由 A液和 B液组成，底物显色液 A液为过氧化脲或过氧化氢， 底 物显色液 B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；
(5) 终止液为 0.5-2 mol/L盐酸或硫酸；
(6) 浓缩洗涤液为 pH 7.1-7.6、含有 0.2-1.0 wt%吐温 -20和 0.01-0.06 wt%叠氮化钠 的 0.2-0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液；
(7) 浓缩复溶液为 pH值为 7.2-7.8、 0.1-0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。
N2012/078164
物菌种保藏管理委员会
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Claims

权 利 要 求
1.一种用于检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒， 包括： 二硝托胺特异性抗体； 包 被原； 和酶标记物， 其中优选所述二硝托胺特异性抗体为二硝托胺单克隆抗体或二 硝托胺多克隆抗体， 优选所述包被原是二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物、 或二 硝托胺特异性抗体或抗抗体， 并且优选所述酶标记物为酶标记抗抗体、 酶标记特异 性抗二硝托胺单克隆或多克隆抗体或酶标记二硝托胺半抗原， 优选所述抗抗体为羊 抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
2. 如权利要求 1所述的酶联免疫试剂盒，其中当所述包被原为二硝托胺半抗原 与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标记羊抗鼠 抗抗体或羊抗兔抗抗体或酶 标记特异性抗二硝托胺单克隆或多克隆抗体，其中优选所述载体蛋白为甲状腺蛋白、 牛血清蛋白、 鼠血清蛋白、 兔血清蛋白、 人血清蛋白、 血蓝蛋白、 纤维蛋白原或卵 清蛋白； 和当所述包被原为二硝托胺特异性抗体或抗抗体时， 所述酶标记物为酶标 记二硝托胺半抗原。
3. 如权利要求 1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述试剂盒还包括二硝托胺标准 溶液、 显色液、 浓缩洗涤液、 终止液和 /或浓缩复溶液； 所述浓缩洗涤液为 pH 7.1至 7.6、含有 0.2至 1.0 wt%吐温 -20和 0.01至 0.06 wt%叠氮化钠的 0.2至 0.4 mol/L的磷 酸盐缓冲液； 所述浓缩复溶液为 pH值为 7.2至 7.8、 0.1至 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲 液； 所述显色液由显色液 A液和显色液 B液组成， 显色液 A液为过氧化氢或过氧化 脲， 显色液 B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺； 并且所述终止液为 0.5至 2 mol/L硫酸 或盐酸溶液。
4. 根据权利要求 1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述二硝托胺半抗原可通过包 括以下步骤的方法获得： 将二硝托胺催化氢化（e.g. Pd/C)得到单氨基衍生物， 该单 氨基衍生物再与琥珀酸酐反应得到二硝托胺半抗原。
5. 根据权利要求 1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述二硝托胺特异性抗体是可 以用所述二硝托胺半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的， 其中优选通过碳 二亚胺法将二硝托胺半抗原与载体蛋白偶联形成所述偶联物； 优选所述载体蛋白为 甲状腺蛋白、 牛血清蛋白、 鼠血清蛋白、 兔血清蛋白、 人血清蛋白、 血蓝蛋白、 纤 维蛋白原或卵清蛋白。
6. 根据权利要求 1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述酶标记抗抗体是采用过碘 酸钠法将所述标记酶与所述抗抗体进行偶联得到的。
7. 根据权利要求 1-6中任一项所述的酶联免疫试剂盒，其中所述二硝托胺单克 隆抗体为由保藏号为 CGMCC No. 6143的小鼠杂交瘤细胞株 E-2-4分泌的单克隆抗 体抗体。
8.一种检测样品中的二硝托胺的方法， 包括以下步骤：
1 )样品前处理： 称取样品的均质样本至离心管中， 用乙腈提取， 离心， 取上清 液在水浴下吹干， 加入正己烷溶解去除杂质， 用工作复溶液提取， 离心后取下层溶 液用于分析， 其中所述工作复溶液是 pH值为 7.2至 7.8、 浓度为 0.025至 0.05 mol/L 的磷酸盐缓冲液；
2) 利用根据权利要求 1-7中任一项所述的酶联免疫试剂盒， 定性或定量检测步 骤 1 ) 中获得的下层溶液中二硝托胺。
9. 根据权利要求 8所述的方法， 其中所述样品为动物饲料或动物组织样品， 优 选为鸡饲料、 鸡肉或鸡肝。
10. 保藏号为 CGMCC No. 6143的小鼠杂交瘤细胞株 E-2-4。
PCT/CN2012/078164 2012-07-04 2012-07-04 检测二硝托胺的酶联免疫试剂盒及其应用 WO2014005298A1 (zh)

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