CN103509068B - 丁胺卡那霉素半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种丁胺卡那霉素半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于丁胺卡那霉素半抗原建立的快速检测试剂盒产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时进行丁胺卡那霉素残留的现场监控和大量样本的筛查。

Description

丁胺卡那霉素半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及丁胺卡那霉素半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

氨基糖苷类抗生素(AGs)是由氨基糖与氨基环醇形成的苷，AGs的结构和理化性质相似。由于结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高。AGs的抗菌作用强，属常用的抗生素。常用的氨基糖苷类药物含有1个l，3或1，4二氨基环多醇和l或2个氨基糖。根据氨基环多醇的结构，可将AGs划分为两大类：链霉胺类和2-脱氧链霉胺类。按其来源，AGs又可分为：由链霉菌产生的抗生素，包括链霉素族、卡那霉素族和新霉素族；有小单孢菌产生的抗生素，主要包括庆大霉素族。

丁胺卡那霉素(Amikin)又名阿米卡星，是卡那青霉素a的半合成衍生物的硫酸盐。临床主要用于对庆大霉素、卡那霉素耐药的革兰阴性杆菌如大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌引起的各种感染。长期或反复大量摄入丁胺卡那霉素可导致前庭神经和听神经损害，肾脏出现轻度损害，严重者可出现肾功能衰竭。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，被广泛用于治疗猪、牛、鸡等由金黄色葡萄球菌及结核杆菌所致的各种感染。为保证我国出口禽肉的卫生质量和食用安全，促进禽肉出口，国家质量监督检验检疫局2002年第37号文件中规定了禁用药物和允许使用药物。其中，丁胺卡那霉素最大残留限量为：肌肉100μg/kg；肝300μg/kg。日本肯定列表制度将其列为使用一律标准物质，即最大残留为10μg/kg。目前对氨基糖苷类抗生素残留的检测方法主要有高效液相法、微生物法、免疫分析法，此外还有一些其他方法用于氨基糖苷类药物的分析，例如电化学法、薄层色谱法、质谱法等。采用微生物法，不适于快速检测。色谱法需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种丁胺卡那霉素半抗原及其制备方法。

本发明提供的丁胺卡那霉素半抗原分子结构式为：

。

本发明提供的丁胺卡那霉素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

0.59 g丁胺卡那霉素、0.18 g对羧基苯甲醛和1 ml吡啶在20 ml 二甲基亚砜（DMSO）中的混合液，在60℃搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到丁胺卡那霉素与对羧基苯甲醛的缩合产物，得率70%。

本发明的另一个目的是上述丁胺卡那霉素半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述丁胺卡那霉素半抗原与载体蛋白偶联得到的丁胺卡那霉素抗原，及由所得丁胺卡那霉素抗原免疫动物制备得到的丁胺卡那霉素抗体。

其中所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、人血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、鼠血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述抗体为丁胺卡那霉素单克隆抗体，该单克隆抗体是由丁胺卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株D-4-3 CGMCC No.6141分泌获得。

本发明还提供由上述丁胺卡那霉素抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测鸡蛋中丁胺卡那霉素残留的应用。

本发明提供的丁胺卡那霉素半抗原既最大程度地保留了丁胺卡那霉素的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的—COOH，用该半抗原作为原料，制备适于进行动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，试剂盒检测成本低，使用方便，检测方法准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于鸡蛋中丁胺卡那霉素残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的丁胺卡那霉素半抗原在丁胺卡那霉素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：丁胺卡那霉素半抗原合成路线图

图2：丁胺卡那霉素半抗原核磁共振氢谱图

图3：丁胺卡那霉素ELISA标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1：丁胺卡那霉素半抗原的合成和鉴定（合成路线如图1）

0.59 g丁胺卡那霉素、0.18 g对羧基苯甲醛和1 ml吡啶在20 ml DMSO中的混合液，在60℃搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到丁胺卡那霉素与对羧基苯甲醛的缩合产物，得率70%。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，核磁图谱说明：图谱中新增加的12.7ppm左右的羧基信号峰以及8-9ppm之间的芳环信号峰说明半抗原合成成功。

实施例2：丁胺卡那霉素抗原

将丁胺卡那霉素半抗原与载体蛋白偶联得到丁胺卡那霉素抗原。

一、免疫原制备——丁胺卡那霉素半抗原-牛血清白蛋白（BSA）偶联物合成

取丁胺卡那霉素半抗原15mg用1.5ml水溶解，得到溶液Ⅰ；取50%的戊二醛（GA）10μl加入溶液Ⅰ中，室温下搅拌反应18h得到溶液Ⅱ；取BSA60mg用4.5ml水稀释后加入溶液Ⅱ中；反应过夜后加入24mg NaBH₄反应3h；用三蒸水透析48小时得到免疫原。

二、包被原制备——丁胺卡那霉素半抗原-卵清白蛋白（OVA）偶联物合成

取碳化二亚胺（EDC）50mg用2ml水使之充分溶解得到溶液Ⅲ；取丁胺卡那霉素半抗原18mg用2ml水溶解得到溶液Ⅳ；取OVA30mg溶于1ml 0.01mol/L PBS（pH=8.0）溶液中得到溶液Ⅴ；将溶液Ⅳ与溶液Ⅴ混合，在磁力搅拌下逐滴加入溶液Ⅲ；室温下搅拌反应24小时；用三蒸水透析48小时得到包被原。

三、丁胺卡那霉素抗原的鉴定

将载体蛋白、丁胺卡那霉素半抗原、丁胺卡那霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到载体蛋白、丁胺卡那霉素半抗原、丁胺卡那霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明丁胺卡那霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。

实施例3：丁胺卡那霉素单克隆抗体

一、丁胺卡那霉素单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，发现其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该丁胺卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为D-4-3，该细胞株已于2012年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.6141。

细胞冻存和复苏：将丁胺卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成2×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射丁胺卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:100000~150000。

间接竞争ELISA方法：用丁胺卡那霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物包被酶标板，加入丁胺卡那霉素标准品溶液、酶标二抗、单克隆抗体工作液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干；加入底物液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

三、单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将丁胺卡那霉素按下式计算交叉反应率：

结果显示交叉反应率为：丁胺卡那霉素100%，卡那霉素＜1%。本发明抗体可以检测丁胺卡那霉素。

实施例4：由丁胺卡那霉素单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

（1）包被丁胺卡那霉素偶联抗原的酶标板；

（2）酶标二抗：用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（3）丁胺卡那霉素单克隆抗体工作液；

（4） 标准溶液：浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；

（5）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺溶液；

（6）终止液为2mol/L的硫酸溶液；

（7）浓缩洗涤液为含1%吐温-20、0.5%的叠氮化钠的0.1~0.3mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（8）浓缩复溶液为pH为7.2~7.8的0.1~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1. 样本的前处理

先将蛋清和蛋黄充分震荡或涡动，使其混合均匀；称取1.0g±0.05g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中；分别加入 1ml 3%三氯乙酸溶液（称取3.00g三氯乙酸加入去离子水100ml 使其完全溶解），1ml 三氯甲烷和2 ml乙酸乙酯，用涡旋仪涡动3min；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；移取400µl上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，再加入600µl复溶工作液（用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释）涡动混匀；取50µl用于分析。

2. 用试剂盒进行检测

向包被有包被原的酶标板微孔中加入50μl标准品/样本，再加入50μl酶标二抗，最后加入50μl单克隆抗体工作液，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，25℃恒温箱中避光反应30min。倒出孔中的液体，用洗涤工作液（用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释）250μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干以保证完全除去孔中的液体。加入底物液A液50μl，再加入底物液B液50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后25℃恒温箱中避光显色15min。加入50μl终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm 处测量每孔的吸光度值。

3. 检测结果分析

用所获得的标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即得到标准品或样本的百分吸光率。以丁胺卡那霉素标准品百分吸光率为纵坐标，丁胺卡那霉素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图3所示。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中丁胺卡那霉素实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本丁胺卡那霉素浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对鸡蛋检测限为5μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白鸡蛋样本，以10、20、40μg/kg三个浓度的丁胺卡那霉素对其进行添加回收试验，结果得该方法对鸡蛋样本的回收率为90%±15%，批内变异系数＜15%，批间变异系数＜25%。

经测定本发明试剂盒在2~8℃至少可以保存12个月。

Claims (5)

1.一种丁胺卡那霉素单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏编号为CGMCC No.6141的丁胺卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株D-4-3分泌获得的。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，它是由丁胺卡那霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的丁胺卡那霉素免疫原免疫动物制备得到，所述丁胺卡那霉素半抗原的制备方法包括如下步骤：

0.59g丁胺卡那霉素、0.18g对羧基苯甲醛和1ml吡啶在20ml DMSO中的混合液，在60℃搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到丁胺卡那霉素与对羧基苯甲醛的缩合产物，得率70％，所述丁胺卡那霉毒半抗原的分子结构式为：

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述丁胺卡那霉毒免疫原的制备方法包括如下步骤：

取丁胺卡那霉素半抗原15mg用1.5ml水溶解，得到溶液Ⅰ；取50％的GA 10μl加入溶液Ⅰ中，室温下搅拌反应18h得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白60mg用4.5ml水稀释后加入溶液Ⅱ中；反应过夜后加入24mg NaBH₄反应3h，用三蒸水透析48小时，即得免疫原。

4.由权利要求1所述的单克隆抗体制备的丁胺卡那霉素酶联免疫试剂盒。

5.权利要求4所述的丁胺卡那霉素酶联免疫试剂盒检测鸡蛋中丁胺卡那霉素残留的应用。