CN103420879B - 氨苯砜半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种氨苯砜半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于氨苯砜半抗原建立的试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于动物源性食品中氨苯砜残留的现场监控和大量样本的筛查。

Description

氨苯砜半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及氨苯砜半抗原及其制备方法和应用。

技术背景

氨苯砜（dapsone，DDS）属砜类化合物，N-乙酰氨苯砜（mono-N-acetyldapsone，MADDS）是氨苯砜的主要代谢产物。氨苯砜对麻风杆菌有较强的抑菌作用，是治疗各类麻风病的首选药，大剂量使用时显示杀菌作用。由于其与磺胺类药物具有协同增效作用，在动物和水产养殖中曾作为磺胺增效剂使用。然而氨苯砜毒性较大，易发生溶血性贫血与发绀，并可出现高铁血红蛋白血症、肝肾功能损害和精神障碍，我国农业部235号公告明确规定禁止以任何用途将氨苯砜用于食品动物，在动物性食品中不得检出；欧盟2377/90也明确规定氨苯砜为禁用药物。

目前国内外关于氨苯砜药物残留的检测报道较少，多与磺胺类药物同时检测，方法包括高效液相色谱法和液质联用法，这些方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种氨苯砜半抗原及其制备方法。

本发明提供的氨苯砜半抗原，分子结构式为：

。

本发明提供的氨苯砜半抗原的制备方法，包括如下步骤：

0.50g氨苯砜、0.40g琥珀酸酐和2ml吡啶在10ml二甲基亚砜中混合，在60℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到氨苯砜单琥珀酸酰胺，即为氨苯砜半抗原。

本发明的另一个目的是上述氨苯砜半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述氨苯砜半抗原与载体蛋白偶联得到的氨苯砜抗原，及由所得氨苯砜抗原免疫动物制备得到的氨苯砜抗体。

其中所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述抗体为氨苯砜单克隆抗体，是由氨苯砜单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3-4CGMCCNo.6066分泌获得。

本发明还提供由上述氨苯砜抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测动物源性食品中氨苯砜残留的应用。

本发明提供的氨苯砜半抗原既最大程度地保留了氨苯砜母核的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的—COOH，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中氨苯砜残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的氨苯砜半抗原在氨苯砜的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：氨苯砜半抗原合成路线图

图2：氨苯砜半抗原核磁共振氢谱图

图3：氨苯砜酶联免疫试剂盒标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1氨苯砜半抗原的合成和鉴定

一、氨苯砜半抗原的合成（合成路线如图1）

0.50g氨苯砜、0.40g琥珀酸酐和2ml吡啶在10ml二甲基亚砜中混合，在60℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到氨苯砜单琥珀酸酰胺，即为氨苯砜半抗原。

二、氨苯砜半抗原的鉴定

取合成的氨苯砜半抗原经核磁共振氢谱测定，如图2所示，图谱中12.0ppm左右的羧基信号峰以及2~3ppm之间的烷烃信号峰，说明半抗原合成成功。

实施例2氨苯砜抗原

将氨苯砜半抗原与载体蛋白进行偶联得到氨苯砜抗原。

一、免疫原的制备——氨苯砜半抗原-牛血清白蛋白偶联物合成

取氨苯砜半抗原12mg用1.5mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液I；取50%的戊二醛10μl加入溶液I中，室温下搅拌反应18h，得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白60mg用4.5ml水稀释后加入溶液Ⅱ中，反应过夜后加入24mgNaBH₄反应3h，用三蒸水透析48h，即得氨苯砜免疫原。

二、包被原的制备——氨苯砜半抗原-卵清蛋白偶联物合成

取碳化二亚胺50mg用2ml水使之充分溶解，得到溶液A；取氨苯砜半抗原13mg用1mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液B；取载体蛋白30mg溶于2ml0.01mol/LPBS（pH=8.0）溶液中，得到溶液C；将B液与C液混合，在磁力搅拌下逐滴加入A液中，室温下搅拌反应24h，用三蒸水透析48h，即得氨苯砜包被原。

三、氨苯砜抗原的鉴定

将载体蛋白、氨苯砜半抗原、氨苯砜半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到载体蛋白、氨苯砜半抗原、氨苯砜半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明氨苯砜半抗原与载体蛋白偶联成功，半抗原与牛血清白蛋白的结合比为(18~22):1，与卵清蛋白的结合比为(16~21):1。

实施例3氨苯砜单克隆抗体

一、氨苯砜单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并意外发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该氨苯砜单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为D-3-4，该细胞株已于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCCNo.6066。

细胞冻存和复苏：将氨苯砜单克隆抗体杂交瘤细胞株用冻存液制成3×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射氨苯砜单克隆抗体杂交瘤细胞株6×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(80000~130000)。

间接竞争ELISA方法：用氨苯砜半抗原-卵清蛋白偶联物包被酶标板，加入氨苯砜标准品溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液和单克隆抗体工作液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

实施例4由氨苯砜单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

（1）包被氨苯砜半抗原-载体蛋白偶联物的酶标板；

（2）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（3）氨苯砜单克隆抗体工作液；

（4）氨苯砜标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；

（5）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2mol/L硫酸；

（7）浓缩洗涤液为pH7.2，含0.8%~1.2%吐温-20、0.01‰~0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1~0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（8）浓缩复溶液为pH7.6，含8%~12%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，同时采用一步法，节省了检测时间。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样品前处理

（1）鸡肉、猪肉前处理方法

称取2.0g±0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入7.5ml乙腈和0.5ml水，振荡2min，3000g以上室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；取出2ml上层有机相至10ml干净的玻璃试管中，50℃下氮气吹干或旋转蒸发仪蒸干；加入1ml正己烷，涡动30s，再加入1ml复溶工作液（用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释），涡动30s，3000g以上室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；除去上层有机相，取50μl下层用于分析。

（2）鸡蛋、蜂蜜前处理方法

称取1.0g±0.05g样本至10ml离心管中；加入4ml去离子水，振荡30s，取上层清液200μl加入600μl复溶工作液（用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释）混匀；取50μl用于分析。

（3）牛奶前处理方法

取100μl样本至2ml离心管，加入500μl复溶工作液（用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释），混匀；取50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有氨苯砜半抗原-载体蛋白偶联物的酶标板微孔中加入氨苯砜标准品溶液或样品溶液50μl，随即加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体50μl/孔，再加入氨苯砜单克隆抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃恒温箱中避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤工作液（用去离子水将浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释），30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺（TMB）50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃恒温箱中避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值。以氨苯砜标准品浓度（μg/L）的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即为样本中氨苯砜的实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本氨苯砜浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对鸡肉、猪肉样本的最低检测限为0.2μg/kg，对鸡蛋、蜂蜜样本的最低检测限为2μg/kg，对牛奶样本的最低检测限为0.6μg/L。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白鸡肉、猪肉样本，以0.2、0.4、0.8μg/kg三个浓度的氨苯砜对其进行添加回收试验；取空白鸡蛋、蜂蜜样本，以2、4、8μg/kg三个浓度的氨苯砜对其进行添加回收试验；取空白牛奶样本，以0.6、1.2、2.4μg/L三个浓度的氨苯砜对其进行添加回收试验，结果得该方法对鸡肉、猪肉样本的回收率为85%±15%，对鸡蛋、蜂蜜样本的回收率为95%±15%，对牛奶样本的回收率为90%±15%，批内变异系数＜15%，批间变异系数＜25%。

经测定本发明试剂盒在2~8℃至少可以保存12个月。

Claims (7)

1.一种氨苯砜抗原，其特征在于由氨苯砜半抗原与载体蛋白偶联得到，分子结构式为：

其中，所述氨苯砜半抗原的制备方法为：0.50g氨苯砜、0.40g琥珀酸酐和2ml吡啶在10ml二甲基亚砜中混合，在60℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到氨苯砜单琥珀酸酰胺，即为氨苯砜半抗原，其分子结构式为：

2.一种制备权利要求1所述的氨苯砜抗原的方法，其包括如下步骤：

取氨苯砜半抗原12mg用1.5mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液I；取50％的戊二醛10μl加入溶液I中，室温下搅拌反应18h，得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白60mg用4.5ml水稀释后加入溶液Ⅱ中，反应过夜后加入24mgNaBH₄反应3h，用三蒸水透析48h，即得氨苯砜免疫原；

取碳化二亚胺50mg用2ml水使之充分溶解，得到溶液A；取氨苯砜半抗原13mg用1mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液B；取卵清蛋白30mg溶于2mlpH＝8.0的0.01mol/LPBS溶液中，得到溶液C；将B液与C液混合，在磁力搅拌下逐滴加入A液中，室温下搅拌反应24h，用三蒸水透析48h，即得氨苯砜包被原。

3.一种氨苯砜抗体，其特征在于由权利要求2所述的氨苯砜免疫原免疫动物制备得到。

4.如权利要求3所述的氨苯砜抗体，其特征在于所述抗体为氨苯砜单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的氨苯砜抗体，其特征在于所述氨苯砜单克隆抗体是由氨苯砜单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3-4CGMCCNo.6066分泌获得。

6.由权利要求5所述的抗体制备的氨苯砜酶联免疫试剂盒。

7.权利要求6所述的氨苯砜酶联免疫试剂盒在检测动物源性食品中氨苯砜残留的应用。