CN103374048B - 链霉素半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种链霉素半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于链霉素半抗原建立的快速检测酶联免疫试剂盒产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中链霉素残留的现场监控和大量样本的筛查。

Description

链霉素半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及链霉素半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

链霉素(Streptomycin，SM)是一种重要的氨基糖苷类抗生素，其作为一种抗生素在治疗家畜感染性疾病中发挥着重要作用，但其耐药性强，毒副作用较大，若动物性食品中有过量的链霉素残留，则可能对人造成严重危害。为了保障动物源性食品的安全，农业部第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定链霉素在牛奶中为200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中为600μg/kg，在肾中为1000μg/kg。

目前链霉素残留的检测主要有仪器检测方法、微生物学检测法、免疫学法，如高效液相色谱法、荧光检测法、薄层色谱法、质谱法、杯碟法、纸片法、酶联免疫法、光学免疫传感器等，由于仪器较昂贵，操作繁琐、费用高、不适合进行大规模现场检测等，ELISA法具有灵敏度高、耗时少、成本低、大规模检测等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种链霉素半抗原及其制备方法。

本发明提供的链霉素半抗原分子结构式为：

本发明提供的链霉素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

0.58g链霉素与0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室温下反应5-10小时，蒸除溶剂，定量得到链霉素半抗原。

本发明的另一个目的是上述链霉素半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述链霉素半抗原与载体蛋白偶联得到的链霉素抗原，及由所得链霉素抗原免疫动物制备得到的链霉素抗体，

其中所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，

所述抗体为链霉素单克隆抗体。

本发明还提供由上述链霉素抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测动物源性食品中链霉素残留的应用。

本发明提供的链霉素半抗原既最大程度地保留了链霉素的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的-NH，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中链霉素残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的链霉素半抗原在链霉素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：链霉素半抗原合成路线图

图2：链霉素半抗原核磁共振氢谱图

图3：链霉素ELISA标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1：链霉素半抗原的合成和鉴定

0.58g链霉素与0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室温下反应5-10小时，蒸除溶剂，定量得到链霉素半抗原。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，图谱中1.6，2.3及3.4ppm(mg/L)处新增加的峰为氨乙基片断的信号峰，7.7ppm左右的峰为烯胺双键上的C-H信号峰，说明半抗原合成成功。

实施例2：链霉素抗原

将链霉素半抗原与载体蛋白偶联得到链霉素抗原。

一、免疫原制备——链霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物合成

取链霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I；取3％的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液I中，室温搅拌反应24h，得到溶液II；取牛血清白蛋白(BSA)50mg用4ml水溶解得溶液III；将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH₄30mg还原；用0.02M的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得链霉素免疫原。

二、包被原制备——链霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物合成

取卵清白蛋白(OVA)50mg用4ml水溶解得到溶液I；取碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中，室温搅拌反应30min，得到溶液II；取链霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III；将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应24h，得链霉素包被原。

三、链霉素抗原的鉴定

将载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明链霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。

实施例3：链霉素单克隆抗体

一、链霉素单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将链霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成5×10⁷个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射链霉素的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1∶100000～120000。

间接竞争ELISA方法：用链霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物包被酶标板，加入链霉素标准品溶液和单克隆抗体工作液，37℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入酶标记抗抗体，轻轻振荡混匀，37℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，37℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

三、单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将链霉素、双氢链霉素、硫酸链霉素、卡拉霉素、庆大霉素做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：链霉素100％，双氢链霉素105％，硫酸链霉素94％、卡拉霉素＜1％、庆大霉素＜1％。本发明抗体可以同时检测链霉素、双氢链霉素、硫酸链霉素。

实施例4：由链霉素单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

(1)包被链霉素偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)链霉素单克隆抗体工作液；

(4)标准溶液：浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺溶液；

(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；

(7)浓缩洗涤液为含1％吐温-20的0.1～0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH为7.2～7.8，含有5％～8％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样本的前处理

(1)肌肉前处理方法

除去肌肉中的脂肪部分，用均质器均质样本；称取2g±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml PBST缓冲液(称取5.2g十二水合磷酸氢二钠、0.88g二水合磷酸二氢钠、9g氯化钠和1ml吐温-20加1升去离子水溶解混匀)用振荡器振荡5min，加入正己烷5ml充分上下振荡混合10min后静置1h；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心15min；移取1ml中间层至5ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml正己烷，用振荡器充分振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心15min；除去上层，取下层清液用复溶工作液(用去离子水将10×浓缩复溶液按1∶9体积比进行稀释)按1∶9体积比进行稀释混匀；取50μl用于分析。

(2)肝脏前处理方法

除去肝脏中的脂肪部分，用均质器均质肝脏样本，称取5.0g±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入20ml PBST缓冲液用振荡器振荡30min；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；移取2ml上层清液至10ml玻璃离心管中，加入3ml正己烷用振荡器充分振荡5min；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；除去上层，取下层清液用复溶工作液按1∶9体积比进行稀释混匀；取50μl水相进行分析。

(3)血清前处理方法

用加有肝素钠(20-30单位/ml血)的离心管采集血清样本(建议采血注射器也用肝素钠润洗)，血清样本室温静置1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；取制备好的血浆样本20μl至5ml聚苯乙烯离心管，用复溶工作液按1∶199体积比进行稀释；取50μl用于分析。

(4)牛奶前处理方法

取20μl牛奶样本，加入780μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析。

(5)奶粉前处理方法

称取1.0g±0.05g奶粉样本；加入5ml去离子水，充分振荡至奶粉全部溶解；取出50μl，加入1950μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析。

(6)蜂蜜前处理方法一

称取1.0g±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml提取缓冲液(称取1.5g十二水合磷酸氢二钠和1g庚烷-磺酸钠盐，加100ml去离子水溶解混匀，加入0.75ml浓磷酸调pH至2.0)，用振荡器振荡10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min，直至清亮。用RIDAC18柱(纯化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速为60d/min；用2ml去离子水洗柱子，流速为60d/min；取2ml样本以流速为15d/min过柱；用3ml去离子水洗柱子，45d/min；用氮气或空气吹干柱子；除去柱中水分，用1ml甲醇洗脱样本，流速为15d/min；在40～50℃，水浴氮气流下完全蒸发溶剂；用2ml复溶工作液溶解干燥的残留物；取50μl进行分析。

蜂蜜前处理方法二

称取1.0g±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml复溶工作液，用振荡器振荡10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min，直至清亮；取200μl清亮上清液，加入600μl复溶工作液中，混匀；取50μl进行分析。

(7)蜂王浆前处理方法

称取1.0g±0.05g蜂王浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml去离子水，用振荡器振荡混匀；加入2.0g中性氧化铝，用振荡器充分振荡5min后，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；取100μl清亮上清液，加入900μl复溶工作液，混匀后；取50μl进行分析。

2.用试剂盒进行检测

向包被有包被原的酶标板微孔中加入50μl标准品/样本，再加入50μl单克隆抗体工作液，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，37℃恒温箱中避光反应30min。倒出孔中的液体，用洗涤工作液(用去离子水将20×浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释)250μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干以保证完全除去孔中的液体，加入100μl酶标记抗抗体，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，37℃恒温箱中避光反应30min。倒出孔中的液体，重复洗板步骤，加入底物液A液50μl，再加入底物液B液50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后37℃恒温箱中避光显色15min。加入50μl终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测量每孔的吸光度值。

3.检测结果分析

用所获得的标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即得到标准品或样本的百分吸光率。以链霉素标准品百分吸光率为纵坐标，以链霉素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图3所示。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中链霉素实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本链霉素浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对肝脏、肌肉检测限为2μg/kg，血清检测限为10μg/kg，牛奶检测限为4μg/L，奶粉检测限为20μg/kg，蜂蜜检测限为(方法一0.5μg/kg，方法二2μg/kg)，蜂王浆检测限为2μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白肝脏、肌肉、牛奶、蜂蜜、蜂王浆样本，以10、20、40μg/kg三个浓度的链霉素对其进行添加回收试验，取空白血清、奶粉样本，以50、100、200μg/kg三个浓度的链霉素对其进行添加回收试验，结果得该方法对肌肉、肝脏、血清样本的回收率为70％±10％，对牛奶、奶粉样本的回收率为85％±25％，对蜂蜜、蜂王浆样本的回收率为90％±15％，批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

经测定本发明试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。

Claims (5)

1.一种制备链霉素抗原的方法，其特征在于链霉素抗原包括免疫原或包被原，免疫原或包被原制备方法包括如下步骤：

取链霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I；取3％的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液I中，室温搅拌反应24h，得到溶液II；取载体蛋白50mg用4ml水溶解得溶液III；将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应过夜；加入30mg NaBH4还原；用0.02M的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到免疫原；

取50mg载体蛋白用4ml水溶解得到溶液I；取EDC和NHS各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中，室温搅拌反应30min，得到溶液II；取链霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III；将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应24h，得到包被原；

所述链霉素半抗原的分子结构式为：

所述链霉素半抗原与载体蛋白偶联得到的包被原分子结构式为：

2.如权利要求1所述的一种制备链霉素抗原的方法，其特征在于所述链霉素半抗原的制备方法包括如下步骤：

0.58g链霉素与0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室温下反应5-10小时，蒸除溶剂，定量得到链霉素半抗原。

3.如权利要求1所述的一种制备链霉素抗原的方法，其特征在于所述免疫原免疫动物能够制备得到链霉素单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的一种制备链霉素抗原的方法，其特征在于所述链霉素单克隆抗体能够制备链霉素酶联免疫试剂盒。

5.如权利要求4所述的一种制备链霉素抗原的方法，其特征在于所述链霉素酶联免疫试剂盒能够检测动物源性食品中链霉素残留。