CN102680677A

CN102680677A - 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法

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Publication number: CN102680677A
Application number: CN2012101415332A
Authority: CN
Inventors: 胡卫江; 欧文斌; 李海龙; 孟凡国; 蒋哲; 顾兰兰; 马凤花
Original assignee: Botai Biological Science & Technology Development Co Ltd Jiaxing; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Current assignee: Botai Biological Science & Technology Development Co Ltd Jiaxing; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-08
Also published as: CN102680677B

Abstract

一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，所述的试剂盒是由带微孔包被板，氧氟沙星标准品，抗氧氟沙星的抗体，氧氟沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；所述包被板上的封闭液为1％明胶，抗氧氟沙星的抗体稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗体是通过先合成氧氟沙星半抗原，在将氧氟沙星半抗原与载体蛋白通过碳化二亚胺法得到的偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对氧氟沙星特异性的抗体。

Description

一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种快速高效检测食品中抗生素氧氟沙星残留的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于食品中残留氧氟沙星含量的检测。

背景技术

食品安全检测作为保障食品安全的重要手段，发挥着越来越重要的作用，食品安全检测技术的发展方向呈现两个趋势：一是向设备日趋完善、痕量分析方向发展；另一个是向仪器便携化和现场检测方向发展。食品安全检测中备受关注的检测物包括农兽药残留等项目，研发高通量、快速、灵敏的农兽药检测试剂可谓当务之急。

农兽药残留的检测手段主要有：理化分析法、微生物法、免疫法。其中免疫学检测是农兽药残留检测的发展方向，它可以做到快速和特异性。酶联免疫吸附方法(ELISA法)已经逐步成为食品中农兽药残留检测的一种重要方法。国家兽药安全评价中心的初步调查，国内使用ELISA试剂盒作为兽药残留筛选的检测样本数量远远超过微生物方法和理化分析方法。

免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性、测定方法的简单、快速及高灵敏度、低费用和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。免疫学技术进行分析是特异性很好、检测时间较短的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种高效快速检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及其检测方法，用于食品检测行业中氧氟沙星含量的检测。

本发明的目的通过如下技术方案来完成的：本发明所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，它是由微孔包被板，氧氟沙星标准品，抗氧氟沙星的抗体，氧氟沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；所述包被板上的封闭液为1％明胶，抗氧氟沙星的抗体稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗体通过合成的氧氟沙星半抗原，并将半抗原与载体蛋白(匙孔蓝蛋白)通过碳化二亚胺法得到偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对氧氟沙星特异性的抗体。

所述的氧氟沙星酶标抗原是以辣根过氧化物酶(HRP)用EDC法合成酶标抗原OFL-HRP。

所述的氧氟沙星标准品是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，氧氟沙星浓度分别为：0μg/L，0.1μg/L，1.0μg/L，5μg/L，25μg/L，100μg/L。

所述抗氧氟沙星的抗体为多克隆抗体，它们均是用氧氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的氧氟沙星半抗原是将氧氟沙星和EDC法作用得到。

一种利用如上所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒进行氧氟沙星的检测方法，该检测方法是：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入50μl氧氟沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50μl酶标氧氟沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

所述的检测方法包括如下步骤：

(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟；

(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液；

(3)取出需要数量的微孔板，每个标准品和样本做2个平行，并记录标准孔和样本孔的位置；

(4)每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤1次；

(5)每孔依次加入标准品和样品各50μl，每孔再加入配制好的酶标抗原工作液各50μl，充分混匀1min，37℃反应30min；

(6)取出反应板，每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤3次；

(7)每孔加入显色液A液和B液各50μl，避光37℃显色15min；

(8)每孔加入终止液各50μl，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值；

本发明所述处理好的样品是根据前处理方法确定，具体是：用匀浆机搅匀样本，取1g匀质样本，加入样本处理液2mL，充分混匀10min，用离心机5000rpm离心15min，取上层液，用PBS稀释2倍左右后可以进行测定，本前处理的方法可以用于猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉中氧氟沙星的检测。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，组成成分少、使用方便、廉价、灵敏度高，其中前处理时间为0.5小时；检测时间为0.5小时，优于质谱等方法的处理时间。

酶联免疫检测试剂盒的全面评估：本方法可以用0.5小时结束试验。其中前处理时间为0.5小时。

酶联免疫检测试剂盒的结果：

1.标准曲线绘制：

(1)竞争法测不同浓度氧氟沙星标准品溶液(0～1000μg/L)，初步确定线性范围0.1～100μg/L，见附图1所示；

(2)分别对0，0.1，1，5，25，100μg/L的OFL标准品进行检测，每个浓度做3个平行，取平均值，计算其标准偏差和变异系数，结果见表1：

表1

浓度(μg/L)	OD值(平均)	标准偏差(SV)	变异系数(CV％)
				0	1.843	0.135	7.31
0.1	1.4163	0.077	5.43
				1	1.047	0.053	5.06
5	0.769	0.062	8.06
				25	0.582	0.050	8.52
100	0.434	0.015	3.49

并以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴，做标准曲线，见图2所示。

附图说明

图1是本发明以标准品浓度为X轴、吸光值为Y轴制作而成的标准曲线图；

图2是本发明另一以标准品浓度为X轴，吸光值为Y轴制作而成的标准曲线图；

图3是本发明OFL-KLH全抗原光谱扫描图；

图4是本发明OFL-HRP全抗原紫外扫描图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，它是由微孔包被板，氧氟沙星标准品，抗氧氟沙星抗体，氧氟沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；所述包被板上的封闭液为1％明胶，抗氧氟沙星的抗体稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星抗体是通过先合成氧氟沙星半抗原，再将氧氟沙星半抗原与载体KLH通过碳化二亚胺法得到的偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对氧氟沙星特异性的抗体。

一种利用如上所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒进行氧氟沙星的检测方法，该检测方法是：取包被抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入氧氟沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的氧氟沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

本发明优选的检测方法是：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入50μl氧氟沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50μl酶标氧氟沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

所述的检测方法包括如下步骤：

(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟；

(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液；

(7)每孔加入显色液A液和B液各50μl，避光37℃显色15min；

本发明所述处理好的样品是根据前处理方法确定，具体是：用匀浆机搅匀样本，取1g匀质样本，加入处理液2mL，充分混匀10min，用离心机5000rpm离心15min，取上层液，用PBS稀释2倍左右后可以进行测定，且本前处理的方法可以用于猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉中氧氟沙星的检测。

实施例1、制备试剂盒所需的包被抗体和酶标抗原

1.免疫抗原和酶标抗原的合成

分别合成OFL-KLH及OFL-HRP全抗原，且OFL-KLH作为免疫原免疫新西兰兔，得到特异性抗体。

1.1氧氟沙星分子结构分析和抗原合成

氧氟沙星分子式为C₁₈H₂₀FN₃O₄，由于氧氟沙星带有羧基，可以用EDC法合成全抗原，现举例氧氟沙星(OFL)反应步骤如下：

1.2OFL-KLH全抗原的鉴定：见图3所示。图中的曲线1为OFL的扫描图，峰值在302.5nm；曲线2为KLH扫描图，峰值在279nm；曲线3为OFL-KLH扫描图，峰值在283.5nm。

从光谱扫描图中可见，载体蛋白和全抗原扫描峰发生变化，初步证实此OFL-KLH全抗原偶联成功。FeCl₃显色反应试验也表明，偶联合成成功。

1.3氧氟沙星酶标抗原的制备：

氧氟沙星(OFL)分子量为361。以辣根过氧化物酶(HRP)用EDC法合成酶标抗原OFL-HRP。利用紫外分光光度计进行鉴定，见图4。

(1)将1.6mg氧氟沙星、2.6mgEDC和4.3mgNHS分别溶于1ml、0.5ml和0.5ml DMF，然后将EDC溶液和NHS溶液逐滴加入OFL溶液并混匀，室温避光下轻微震荡24小时，得到A液；

(2)10mg HRP溶解于5ml PBS得到B液；

(3)将A液缓慢滴加于B液，避光震荡反应6小时；

(4)待反应完成后，将反应液装入透析袋，用磷酸缓冲液(10mM pH7.4)透析5次，得到氧氟沙星全抗原；

(5)最后将酶标抗原进行冷冻干燥，置于-20℃保存。

1.4对合成的酶标抗原性质进行分析

通过光谱扫描法对合成的OFL-HRP全抗原进行性质鉴定(见图4)，曲线1为OFL-HRP的扫描图，峰位在278.5nm；曲线2为OFL扫描图，峰位在302.5nm；曲线3为HRP扫描图，峰位在280.5nm。表明OFL与HRP已经偶联成功。

2.兔源性OFL多克隆抗体的制备

2.1准备两只成年兔，体重1.5-2.0公斤，免疫前取3-5ml血清作为对照。按每只兔子0.5mgOFL-KLH的量溶于0.5ml磷酸缓冲液，然后与等体积弗氏完全佐剂混合，震荡使之充分乳化。在兔背部脊柱两侧不同部位进行皮下注射抗原溶液。

2.2按照0周、2周、4周、8周、10周的间隔进行免疫，在注射后的7天～10天进行血液收集。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。

2.3收集血液：在兔颈动脉处插管进行血液收集，将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，再在4℃放置过夜。将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，-20℃保存。

2.4抗体的纯化

OFL的抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化。硫酸铵沉淀法法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

实施例2氧氟沙星检测试剂盒前处理方法确定

最佳的前处理方法如下：用匀浆机搅匀样本，取1g匀质样本，加入处理液2mL，充分混匀10min，用离心机5000rpm离心15min，取上层液，用PBS稀释2倍左右。此处理方法可以用于猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋等样本的前处理。

以下在确保是阴性的条件下，猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋样品的不同前处理方法结果。

表2不同阴性样本的检测结果

样本	猪肝	猪肉	虾	鱼	甲鱼	鸡肉	鸡蛋
									0.075	0.032	0.044	0.093	0.032	0.045	0.099

实施例3氧氟沙星酶联免疫检测试剂盒的设计与及评估

1.OFL试剂盒测定原理

本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被OFL-KLH的抗体。检测时，样本中的残留物氧氟沙星与加入的酶标抗原OFL-HRP竞争氧氟沙星抗体，通过洗涤除去游离的抗体、酶标抗原及抗原抗体复合物，用TMB底物显色，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。样本吸光度值与其所含氧氟沙星的含量成负相关，根据标准曲线，可计算出残留物氧氟沙星的含量。

2.组成成分

(1)包被液：0.1M的PH9.6的碳酸氢钠。

(2)PBS缓冲液：氯化钠8.5g，12水磷酸氢二钠5.54g，2水磷酸二氢钠0.39g，PH7.2，定容到1L。

(3)洗液：0.05％PBS-TWEEN20。

(4)封闭液：1％的明胶或1％的BSA。

(5)显色液A：配PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，在5mL缓冲液10μL30％的H₂O₂。

(6)显色液B：先将10mgTMB溶于2mLDMSO，在加PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液5mL+3mgTMB。

(7)终止液：2M硫酸

3.具体操作

(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟。

(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液。

(3)取出需要数量的微孔板，每个标准品和样本做2个平行，并记录标准孔和样本孔的位置。

(4)每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤1次。

(5)每孔依次加入标准品和样品各50μl，每孔再加入配制好的酶标抗原工作液各50μl，充分混匀1min，37℃反应30min。

(6)取出反应板，每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤3次。

(7)每孔加入显色液A液和B液各50μl，避光37℃显色15min。

(8)每孔加入终止液各50μl，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值。

(9)15min内用酶标仪在450nm/630nm下读取OD值。

(10)根据标准曲线计算样品中OFL浓度。

4.OFL酶联免疫检测试剂盒的结果：

4.1标准曲线绘制：

竞争法测不同浓度氧氟沙星标准品溶液(0～1000μg/L)，初步确定线性范围0.1～100μg/L，见附图1。

分别对0，0.1，1，5，25，100μg/L的OFL标准品进行检测，每个浓度做3个平行，取平均值，计算其标准偏差和变异系数，并得到其标准曲线见附图2。

4.2精密度实验：

选取IC₅₀附近的浓度1μg/L和5μg/L分别进行20孔平行测定，进行精密度计算，结果如下：

表3氧氟沙星检测试剂盒的精密度评估

浓度(μg/L)	OD值(20次平均)	标准偏差(SV)	变异系数(CV％)
				1	1.103	0.107	9.7
5	0.782	0.069	8.82

4.3特异性实验：

采用竞争法检测氧氟沙星及其它氟喹诺酮类的IC50，计算方法为：氧氟沙星的IC50除以其它氟喹诺酮类的IC50，交叉反应率(见表4)，说明氧氟沙星抗体对氧氟沙星检测的特异性较高，与其他氟喹诺酮类交叉反应率都比较低，可以忽略。

表4氧氟沙星与其他氟喹诺酮类的交叉反应率

项目	IC50	交叉反应率(％)
			氧氟沙星	2.36	100
诺氟沙星	300	0.78
			恩诺沙星	60	3.93

环丙沙星	250	0.94
			洛美沙星	150	1.57
氯霉素	200	1.18

4.4添加回收实验：

4.4.1猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋的添加回收实验

样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，分别进行OFL终浓度为1μg/L，10μg/L，40μg/L，80μg/L不同浓度进行添加，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用，进行检测。

(1)猪肉的添加回收实验：

表5

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.078	-
1	0.896	89.6％
			10	10.325	103.3％
40	38.726	96.8％
			80	83.735	104.7％

(2)猪肝的添加回收实验：

表6

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.062	-
1	1.042	104.2％
			10	11.325	113.3％
40	39.526	98.8％
			80	88.765	110.9％

(3)虾的添加回收实验：

表7

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.075	-
1	0.968	96.8％
			10	9.825	98.3％
40	42.746	106.9％
			80	85.235	106.5％

(4)鱼的添加回收实验：

表8

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.048	-
1	0.972	97.2％
			10	9.385	93.9％
40	41.726	104.3％
			80	81.535	101.9％

(5)甲鱼的添加回收实验：

表9

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.031	-
1	0.826	82.6％
			10	9.315	93.2％
40	37.926	94.8％
			80	75.835	94.8％

(6)鸡肉的添加回收实验：

表10

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.051	-
1	0.952	95.2％

10	10.925	109.3％
			40	42.226	105.6％
80	83.735	104.7％

(7)鸡蛋的添加回收实验：

表11

添加浓度(μg/L)	测定值(μg/L)	回收率(％)
			0	0.078	-
1	0.917	91.7％
			10	11.861	118.6％
40	42.746	106.9％
			80	73.735	92.2％

4.4.2结果分析

对猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这7种样本进行了OFL不同浓度的添加，各浓度的回收率均在80～120％之间，具有较好的回收率，能广泛用于实际工作中。

Claims

1.一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于它是由带微孔包被板，氧氟沙星标准品，抗氧氟沙星的抗体，氧氟沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；所述包被板上的封闭液为1％明胶，抗氧氟沙星的抗体稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗体是通过先合成氧氟沙星半抗原，在将氧氟沙星半抗原与载体蛋白通过碳化二亚胺法得到的偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对氧氟沙星特异性的抗体。

2.根据权利要求1所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于其中的氧氟沙星酶标抗原是以辣根过氧化物酶用EDC法合成酶标抗原OFL-HRP，并利用紫外分光光度计进行鉴定。

3.根据权利要求1所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于其中的氧氟沙星标准品是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，氧氟沙星浓度分别为：0ug/L，0.1ug/L，1.0ug/L，5ug/L，25ug/L，100ug/L。

4.根据权利要求1所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于其中的抗氧氟沙星的抗体为多克隆抗体，它们均是用氧氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的氧氟沙星半抗原是将氧氟沙星和EDC法作用得到；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。

5.一种利用如权利要求1或2或3或4所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒进行氧氟沙星的检测方法，其特征在于：取包被抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入氧氟沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的氧氟沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

6.根据权利要求5所述的氧氟沙星的检测方法，其特征在于：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入100ul氧氟沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标氧氟沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

7.根据权利要求5所述的氧氟沙星的检测方法，其特征在于所述的检测方法包括如下步骤：

(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟；

(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液；

(7)每孔加入显色液A液和B液各50uL，避光37℃显色15min；

(8)每孔加入终止液各50uL，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值。

8.根据权利要求6或7所述的氧氟沙星的检测方法，其特征在于：处理好的样品是根据前处理方法确定，具体是：用匀浆机搅匀样本，取1g匀质样本，加入处理液2mL，充分混匀10min，用离心机5000rpm离心15min，取上层液，用PBS稀释2倍左右后可以进行测定，且本前处理的方法可以用于猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉中氧氟沙星的检测。