CN101240023A - 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 - Google Patents
重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101240023A CN101240023A CNA2008100197809A CN200810019780A CN101240023A CN 101240023 A CN101240023 A CN 101240023A CN A2008100197809 A CNA2008100197809 A CN A2008100197809A CN 200810019780 A CN200810019780 A CN 200810019780A CN 101240023 A CN101240023 A CN 101240023A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- heavy metal
- preparation
- cadmium
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 44
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 43
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 title claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 39
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- -1 salt ion Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000000207 volumetry Methods 0.000 claims description 3
- QUFKKKKSFIWGNQ-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.N(=C=S)C1=CC=C(CC(CN)N)C=C1 Chemical compound C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.N(=C=S)C1=CC=C(CC(CN)N)C=C1 QUFKKKKSFIWGNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 claims description 2
- 238000003321 atomic absorption spectrophotometry Methods 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 abstract 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000258920 Chilopoda Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001479 atomic absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001636 atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000013332 literature search Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法。其中重金属镉多克隆抗体的制备方法，步骤包括(A)完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗体制备的关键；(B)抗体的制备。酶联免疫吸附测定方法步骤包括：(1)采用方阵滴定法确定包被原Cd－ITCBE－OVA与抗体最佳反应浓度，以最佳浓度的包被原Cd－ITCBE－OVA包被96孔酶标板；(2)间接竞争酶联免疫吸附测定试验；(3)考察各种条件对CI－ELISA的影响，优化反应条件；(4)在已优化的反应条件下，建立CI－ELISA，绘制标准抑制曲线。本发明的检测限为0.04μg/L，线性范围为10－1～103μg/L，对镉具有特异性，适合环境水样中痕量镉的测定。同时为重金属污染突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染事故进行补救和恢复工作。
Description
技术领域
本发明涉及重金属镉多克隆抗体的制备以及基于抗体的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。
背景技术
由重金属造成的污染称为重金属污染，目前对环境污染最严重的重金属为铅、镉、汞、铬和砷，简称为“五毒”。重金属进入人体后，不易排泄，逐渐蓄积，当超过人体的生理负荷时，就会引起生理功能改变，导致急、慢性疾病或产生远期危害。近年来随着我国经济的迅猛发展，越来越多的环境突发事故频繁发生，其中主要的一类污染物即为重金属污染物，尤其是食物中毒、饮水中毒、水体突发污染事故等。因此，建立快速便捷的重金属检测方法，对重金属污染进行长期监测，对控制污染，保护环境和人类生命安全与健康具有十分重要的意义。
当前，国际上对重金属检测的发展方向是灵敏、准确、实时、快速、选择性好和适用范围广等。而传统的重金属检测技术大多需要大型或专门仪器(原子吸收光谱法、原子发射光谱法等)才能完成，且前处理过程复杂，耗时较多，分析工作只能在室内进行，难以满足高通量快速和在线检测的需要。免疫学检测方法是利用抗原与抗体的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物。它是免疫学长期发展的一个重要分支，具有检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点。已广泛应用于临床医学、生命科学以及环境中有机有毒物质的检测。同时，也为重金属的检测提供了新的思路，对传统的重金属检测方法进行了有效的补充。
自从1985年Reardan等人在Nature上发表文章，首次通过金属-螯合剂制备单克隆抗体以来，国外对于重金属免疫学检测方法的研究越来越多，至目前为止，Cd2+、Co2+、U6+、Pb2+、Gu2+、Hg2+、Zn2+和In3+金属-螯合剂复合物抗体被研制出来，并建立了相应的酶联免疫检测方法。专利CN1769893公开了一种重金属Pb2+完全抗原的制备方法，朱晓霞等制备了镉，铅的单克隆抗体，并建立了相应的酶联免疫检测方法。上述方法均是基于重金属单克隆抗体进行的研究。目前，对重金属免疫检测的研究大多集中在单克隆抗体及相应酶联免疫检测方法方面，对多克隆抗体研究相对较少。单克隆抗体的制备相对多克隆抗体而言制备成本高，周期更长，风险大。虽然在特异性方面较多克隆抗体稍高，但就建立的检测方法来说，多克隆抗体亦能达到检测的要求，且方法的检测限与灵敏度与基于单克隆抗体的检测方法接近。
文献检索表明，国外只有David K.Johnson在1999年以四乙二胺五乙酸酸酐为螯合剂制备了镉多克隆抗体，采用荧光偏振免疫法对镉进行检测(Johnson，D.K.，A fluorescence polarization immunoassay for cadmium(II).AnalyticaChimica Acta，1999.399：p.161-172)。
发明内容
1.发明要解决的技术问题：
针对现有的重金属镉免疫学检测方法存在的问题，本发明提供了重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法，制备一种重金属镉的多克隆抗体，并通过抗体抗原反应，建立一种用于重金属镉检测的酶联免疫吸附测定方法，用于环境水样的快速检测。
2.技术方案：
本发明的原理：制备重金属镉的多克隆抗体，并建立了一种间接竞争酶联免疫吸附测定方法(CI-ELISA)。重金属的免疫学检测方法的关键在于抗重金属抗体的制备，包括多克隆抗体和单克隆抗体，而抗体制备的关键又在于重金属免疫原的制备。重金属镉多克隆抗体制备与间接竞争酶联免疫吸附测定方法的基本原理是：通过选择性双功能螯合剂的一端与重金属螯合生成重金属-螯合剂复合物，作为半抗原，半抗原再通过螯合剂的另一端与载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等偶联后形成重金属-螯合剂-蛋白完全抗原(免疫原和包被原)。以免疫原免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。CI-ELISA的基础是抗原的固相化及抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，酶标记的抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，可溶性抗原包被酶标板，加入系列浓度的待测物的标准溶液与抗体等体积混合孵育后的混合溶液，混合溶液中的待测抗原与固相载体表面的抗原竞争抗体表面的结合位点。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与混合溶液中待测物标准溶液的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与混合溶液中待测物标准溶液的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。抗原制备反应方程式为：
本发明的具体技术方案如下：
重金属镉多克隆抗体的制备方法，其步骤包括
(A)完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗体制备的关键，以1-(4-异硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)作为双功能螯合剂，采用异硫氰酯法和重金属与载体蛋白偶联，获得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被原Cd-ITCBE-OVA；
(B)抗体的制备，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，选取三只1.5-2.0kg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清，常规免疫方法对大白兔进行免疫，免疫约3个月后心脏采血，制备血清，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，间接竞争ELISA法鉴定其对金属镉的特异性，血清添加终浓度为0.01％的硫柳汞，分装后于-20℃冻存，即得到重金属镉的多克隆抗体。
步骤(A)中采用紫外吸收法对完全抗原进行全波扫描，以确定抗原是否合成功。对完全抗原中蛋白含量与重金属镉的含量进行测定，分别采用考马斯靓蓝法和火焰原子吸收分光光度法。
酶联免疫吸附测定方法，其步骤包括：
(1)采用方阵滴定法确定包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体最佳反应浓度，以最佳浓度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶标板；
(2)用含EDTA的PBS溶液配制镉标准溶液，与等体积的1/2最佳工作浓度的抗体混合，作为反应液加入酶标板中进行间接竞争酶联免疫吸附测定试验；
(3)考察螯合剂EDTA及其浓度、盐离子强度、pH值、封闭液和预混时间对CI-ELISA的影响，优化反应条件；
(4)在已优化的反应条件下，建立CI-ELISA，绘制标准抑制曲线。
对方法的检测限，检测范围，精密度和准确度、与其他金属如Pb2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cr3+、Hg2+和Fe3+的交叉反应率等进行分析；以建立的方法对自来水、长江水进行加标回收实验。
3.有益效果：
本发明提供了重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法，在制备了重金属镉多克隆抗体的基础上，建立了测定环境水样中镉含量的间接竞争酶联免疫吸附测定方法。本发明的检测限为0.04μg/L，线性范围为10-1～103μg/L，对镉具有特异性，与Pb2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cr3+、和Fe3+的交叉反应率低于1％，与Hg2+交叉反应率为7.4％；加标回收率在85.5％～116.3％之间。本方法适合环境水样中痕量镉的测定。同时为重金属污染突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染事故进行补救和恢复工作，且可以发展成为环境中其他样品和农产品食品安全检测的重要检测手段，具有重大的现实意义。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明。
实施例1
抗体的制备
步骤1：完全抗原的合成
称取10mg ITCBE溶于10mL pH 9.5的磷酸钠缓冲溶液中形成2.275mM的金属螯合剂溶液。称取40mg BSA蛋白溶于pH 7.4 PBS(137mM NaCl，3mMKCl，8mM Na2HPO4，1mM KH2PO4)缓冲溶液中形成40mg/mL的蛋白溶液。镉(99.999％)溶于热的硝酸中，稀释成4.7mM的使用液。
取2.5mL ITCBE与1.5mL 4.7mM镉使用液反应，得到Cd-ITCBE复合物。复合物逐滴滴加至1mL 40mg/mL BSA蛋白溶液中。反应液在缓慢搅拌下室温反应24小时后装入EDTA预处理过的透析袋中，PBS缓冲液透析三次，纯水透析二次，4℃下透析三天，以去除未反应的Cd，ITCBE以及Cd-ITCBE复合物。准确量取透析液，透析液即为免疫原Cd-ITCBE-BSA，低温下保存。相同方法制备包被原Cd-ITCBE-OVA。
紫外分光光度计检测结合物中蛋白的含量。原子吸收法测定其中镉含量。紫外分光光度计扫描透析液，对偶联物进行分析鉴定。结果表明成功合成了完全抗原。
紫外分光光度计检测结合物中蛋白的含量。取0.5mL抗原于比色管中，加入3.5mL的蒸馏水。采用标准曲线法进行测定。样品的。原子吸收光度法测抗原中Cd离子含量。免疫原Cd-ITCBE-BSA中蛋白浓度浓度为7.024mg/mL，镉浓度为62.49ppm；包被原Cd-ITCBE-OVA中蛋白浓度浓度为5.27mg/mL，镉浓度为8.866ppm。
步骤2：抗体的制备与鉴定
Cd-ITCBE-BSA作为免疫原，选取三只1.5-2.0kg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清。具体免疫程序如下：首免采用每只1mg免疫原与等体积弗氏完全佐剂混和，乳化成油包水结构后进行背部皮下多点注射(20点左右)。三周后用同样剂量的免疫原与等体积不完全弗氏佐剂进行加强。此后每隔两周加强一次，加强后一周耳缘静脉采血测效价。最后一次用等体积的生理盐水稀释免疫原，直接耳缘静脉注射。8天后心脏采血，制备血清，添加重量百分比浓度为0.01％的硫柳汞，分装后于-20℃冻存。
通过间接ELISA(I-ELISA)法测抗体效价，以此确定是否有针对金属离子的抗体生成。比较三只大白兔的效价，最后选择抗体效价较高的白兔血清用于建立CI-ELISA检测方法。
间接非竞争ELISA(I-ELISA)法操作步骤：
(1)包被，100μL/孔，4℃过夜，洗涤3次，拍干；(2)封闭，200μL/孔，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；(3)加入抗血清(分别稀释成4000、8000、12000、20000、30000、40000倍)100μL/孔，37℃孵育2h，洗涤3次，拍干；(4)加入羊抗兔酶标二抗(1∶10000稀释)37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；(5)加显色液37℃作用15min。(6)50μL/孔浓度为2M的硫酸溶液终止显色反应；(7)酶标仪测OD450值，以空白对照调零，以阴性血清作为对照，以待测孔OD450值大于或等于阴性孔的2.1倍定为阳性。
经测定后，抗体效价达到了1∶128×104，能进行酶联免疫吸附测定实验。
实施例2：
酶联免疫吸附测定方法
步骤一：效价的测定
采用方阵滴定法来确定抗原抗体最佳工作浓度：包被抗原(Cd-ITCBE-OVA)系列稀释为1500倍、2500倍、5000倍、10000倍包被酶标板的AB，CD，EF，GH行；用1％OVA作为封闭液；抗血清分别稀释为20000倍、40000倍、80000倍、160000、320000倍和640000倍，加入酶标板的1 2，3 4，5 6，7 8，9 10，11 12列；加羊抗兔-辣根过氧化物酶酶标二抗(1∶10000，1％OVA稀释)；TMB显色，2M硫酸终止，测OD450值。以OD450值为0.8～1.2的抗原抗体浓度作为最佳工作浓度。最后确定最佳包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体浓度分别为1.05μg/mL和1∶30×104。
步骤二：ELISA方法的建立
在包被原与抗体的最佳工作浓度条件下，用间接竞争ELISA法(CI-ELISA)建立抗体对重金属镉的检测方法。用1.0mMEDTA的PBS溶液配制浓度为0.00，0.10，1.00，10.00，100.00，1000.00μg/mL的镉标准溶液，与抗体混合过夜进行前抑制。绘制标准抑制曲线，并计算敏感度(IC50)及最低检测限(IC20)。
间接竞争ELISA法的步骤如下：
(1)抗体与标样(待测样)预混：用PBS稀释抗体到两倍工作浓度(如工作浓度1∶10000，应稀释为1∶5000)后与等体积标样(待测样品)室温预混。
(2)包被：CBS包被缓冲液将包被原稀释到工作浓度，分别加入96孔酶标板的AB、CD、EF、GH八行，100μL/孔，4℃过夜。
(3)封闭：每孔加封闭液200μL，37℃温浴1h。
(4)加样品：将预混液体加入酶标板，100μL/孔，于37℃温浴2h。
(5)加酶标二抗：用封闭液将酶标二抗稀释到工作浓度，100μL/孔加入酶标板，37℃温浴1h。
(以上每一步结束都用洗涤液洗3次)
(6)显色：底物溶液100μL/孔加到酶标板，显色15min。
(7)终止反应：50μL/孔2M H2SO4快速加到酶标板，450nm下读取吸光值。
步骤三：条件优化
改变金属标液稀释缓冲液中EDTA浓度，使反应体系中EDTA浓度分别为0.1mM，0.5mM，1.0mM，5.0Mm，20mM，20.0mM，50.0mM，比较不同EDTA浓度对阳性血清的抑制作用。
竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳工作浓度的条件下，改变基质中盐离子强度，使反应体系中NaCl的浓度依次为0M、0.05M、0.15M、0.5M、1.0M比较不同离子强度对ELISA检测曲线的影响。
封闭液的作用是消除非特异性吸附。竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳工作浓度及最适盐离子强度的条件下，本发明分别采用了1％明胶、1％OVA、及3％脱脂奶粉作为封闭液(200μL/孔)，比较其对检测曲线的影响。
竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳工作浓度、最适盐离子强度及最佳封闭物封闭的条件下，通过改变反应基质中的pH值来反映对竞争ELISA结果的影响。反应体系中pH值分别取5.7、6.5、7.4、8.5，比较不同pH值对ELISA检测曲线的影响。
在间接竞争ELISA反应中，设定金属标液与阳性血清的预混时间为室温过夜和室温1小时，比较其对抑制曲线的影响。
步骤四：方法评价
通过对对间接竞争ELISA方法最佳条件的确定，本发明以1∶5000(蛋白浓度为1.05μg/mL)的包被原包被96孔酶标板，以1％明胶作为封闭液。抗体浓度为1∶300000。抗原抗体反应体系中螯合剂EDTA浓度选择为1.0mM，pH值为7.4，离子强度为0.15M NaCl。抗体与标液的预混时间为1小时。作为最佳反应条件。在最佳工作条件下，得到了抑制曲线，抑制中浓度IC50为33.0ppb，IC20为2.7ppb，R2为0.9976。以Logit(B/B0)为纵坐标(Y)，才Cd2+浓度(ppb)的负对数值为横坐标(X)，做标准曲线。Cd2+在0.1ppb-1000ppb范围内，Logit(B/B0)与Cd2+浓度(ppb)的对数值呈显著的线性关系，得到回归方程Y＝0.6834X+0.4107，相关系数达0.998。
在以上最佳反应条件下，进行方法特异性实验。配制其他金属如Pb2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cr3+、Hg2+和Fe3+的标准溶液，实验操作同步骤二。与Pb2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cr3+、Fe3+的交叉反应率低于1％，与Hg2+交叉反应率为7.4％。抗体对金属镉具有很有的特异性。
取自来水和长江水进行加标回收率实验，根据步骤三中确定的最佳条件下进行试验，操作过程同步骤二。自来水和长江水的加标回收率分别为103.5％～116.3％和85.5％～112.5％。
Claims (5)
1.一种重金属镉多克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：
(A)抗原的合成，以1-(4-异硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸作为双功能螯合剂，采用异硫氰酯法和重金属镉与载体蛋白偶联，获得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被原Cd-ITCBE-OVA；
(B)抗体的制备与鉴定，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，选取三只1.5-2.0kg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清，常规免疫方法对大白兔进行免疫，免疫3个月后心脏采血，制备血清，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，间接竞争ELISA法鉴定其对金属镉的特异性，血清添加浓度为0.01％的硫柳汞，分装后于-20℃冻存，即得到重金属镉的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的重金属镉多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(A)抗原的合成中采用紫外吸收法对完全抗原进行全波扫描，以确定抗原是否合成功。
3.根据权利要求1所述的重金属镉多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(A)抗原的合成中分别采用考马斯靓蓝法和火焰原子吸收分光光度法对完全抗原中蛋白含量与重金属镉的含量进行测定。
4.一种酶联免疫吸附测定方法，其步骤包括：
(1)采用方阵滴定法确定包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体的最佳反应浓度，以最佳浓度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶标板；
(2)用含EDTA的PBS溶液配制镉标准溶液，与等体积的1/2最佳工作浓度的抗体混合，作为反应液加入酶标板中进行间接竞争酶联免疫吸附测定试验；
(3)考察螯合剂EDTA及其浓度、盐离子强度、pH值、封闭液、预混时间对CI-ELISA的影响，优化反应条件；
(4)在已优化的反应条件下，建立CI-ELISA，绘制标准抑制曲线。
5.根据权利要求4所述的酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在抗原抗体反应体系中螯合剂EDTA浓度为1.0mM，离子强度为0.15M NaCl，基质及待测液pH值为7.4，以1％明胶为封闭液、抗体与标液的预混时间为1小时的最佳反应条件下进行，获得竞争抑制标准曲线。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100197809A CN101240023A (zh) | 2008-03-14 | 2008-03-14 | 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100197809A CN101240023A (zh) | 2008-03-14 | 2008-03-14 | 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101240023A true CN101240023A (zh) | 2008-08-13 |
Family
ID=39931881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100197809A Pending CN101240023A (zh) | 2008-03-14 | 2008-03-14 | 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101240023A (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101885775A (zh) * | 2010-07-16 | 2010-11-17 | 上海交通大学 | 重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法 |
| CN101968481A (zh) * | 2010-08-13 | 2011-02-09 | 中国农业大学 | 一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒 |
| CN103076446A (zh) * | 2011-10-25 | 2013-05-01 | 天津科技大学 | 重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用 |
| CN104090110A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-10-08 | 江苏省检验检疫科学技术研究院 | 一种用于测定重金属镉的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN104155424A (zh) * | 2014-08-19 | 2014-11-19 | 河南华牧生物科技有限公司 | 一种水样中镉离子污染阻断elisa检测法 |
| CN104151431A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-11-19 | 南京农业大学 | 杂交瘤细胞株FQ-Aa6及其产生的抗重金属镉单克隆抗体 |
| CN105486822A (zh) * | 2014-10-11 | 2016-04-13 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒 |
| CN108088804A (zh) * | 2017-12-04 | 2018-05-29 | 武汉大学 | 一种水中痕量镉的测定方法 |
| CN108409853A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-17 | 浙江工商大学 | 一种重金属镉人工抗原的制备方法及nota在制备重金属镉人工抗原试剂中的应用 |
| CN112710852A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-04-27 | 上海美迪西生物医药股份有限公司 | 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 |
-
2008
- 2008-03-14 CN CNA2008100197809A patent/CN101240023A/zh active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101885775B (zh) * | 2010-07-16 | 2013-07-10 | 上海交通大学 | 重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法 |
| CN101885775A (zh) * | 2010-07-16 | 2010-11-17 | 上海交通大学 | 重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法 |
| CN101968481A (zh) * | 2010-08-13 | 2011-02-09 | 中国农业大学 | 一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒 |
| CN101968481B (zh) * | 2010-08-13 | 2013-12-11 | 中国农业大学 | 一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒 |
| CN103076446A (zh) * | 2011-10-25 | 2013-05-01 | 天津科技大学 | 重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用 |
| CN104090110A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-10-08 | 江苏省检验检疫科学技术研究院 | 一种用于测定重金属镉的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN104151431A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-11-19 | 南京农业大学 | 杂交瘤细胞株FQ-Aa6及其产生的抗重金属镉单克隆抗体 |
| CN104155424A (zh) * | 2014-08-19 | 2014-11-19 | 河南华牧生物科技有限公司 | 一种水样中镉离子污染阻断elisa检测法 |
| CN105486822A (zh) * | 2014-10-11 | 2016-04-13 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒 |
| CN108088804A (zh) * | 2017-12-04 | 2018-05-29 | 武汉大学 | 一种水中痕量镉的测定方法 |
| CN108409853A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-17 | 浙江工商大学 | 一种重金属镉人工抗原的制备方法及nota在制备重金属镉人工抗原试剂中的应用 |
| CN112710852A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-04-27 | 上海美迪西生物医药股份有限公司 | 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 |
| CN112710852B (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-03 | 上海美迪西生物医药股份有限公司 | 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101240023A (zh) | 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法 | |
| US10281465B2 (en) | Signal amplification in lateral flow and related immunoassays | |
| Liu et al. | Colloidal gold nanoparticle probe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromium ions in water and serum samples | |
| EP0399184A3 (en) | Reagents, methods and kits for an amphetamine-class fluorescence polarization immunoassay | |
| CN102944679A (zh) | 一种胶乳比浊法进行视黄醇结合蛋白检测的试剂盒 | |
| CN101655499A (zh) | 一种重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法 | |
| CN103529210B (zh) | 一种用于检测样品中重金属离子锌离子含量的酶联免疫试剂盒 | |
| CN103076446B (zh) | 重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用 | |
| CN103439508B (zh) | 用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法 | |
| Xing et al. | A highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for copper (II) determination in drinking water | |
| CN107356743B (zh) | 一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒 | |
| CN105486822A (zh) | 一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒 | |
| CN109298178A (zh) | 基于免疫磁珠的心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）时间分辨荧光免疫分析试剂盒 | |
| Dankwardt et al. | Immunoassays: Applications for the aquatic environment | |
| CN113030466A (zh) | 检测土壤中重金属镉的胶体金免疫层析试纸条及制备方法 | |
| Zhuang et al. | Determination of anthracene by real-time immuno-polymerase chain reaction assay | |
| Zhu et al. | Production of highly sensitive monoclonal antibody and development of lateral flow assays for phallotoxin detection in urine | |
| CN116008524A (zh) | 一种无蛋白通用型保护液及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用 | |
| CN102680677A (zh) | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 | |
| CN113588960A (zh) | 一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法 | |
| Quarino et al. | Development of a radioimmunoassay technique for the detection of human hemoglobin in dried bloodstains | |
| US5015586A (en) | Method and apparatus useful in geochemical exploration for petroleum oils | |
| CN112142756A (zh) | 黄曲霉毒素m1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用 | |
| CN112710842A (zh) | hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法 | |
| JPH02500133A (ja) | ハプテンについての改良濁り測定抑制検定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20080813 |