CN112710852B - 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112710852B
CN112710852B CN202110323911.8A CN202110323911A CN112710852B CN 112710852 B CN112710852 B CN 112710852B CN 202110323911 A CN202110323911 A CN 202110323911A CN 112710852 B CN112710852 B CN 112710852B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gnp
polypeptide
component
monoclonal antibody
biotin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110323911.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112710852A (zh
Inventor
章登吉
陈春麟
任朋亮
周舟扬
张路路
章春燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medic Sipson Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Shanghai Medicilon Inc
Original Assignee
Medic Sipson Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Shanghai Medicilon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medic Sipson Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd, Shanghai Medicilon Inc filed Critical Medic Sipson Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Priority to CN202110323911.8A priority Critical patent/CN112710852B/zh
Publication of CN112710852A publication Critical patent/CN112710852A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112710852B publication Critical patent/CN112710852B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin

Abstract

本发明公开一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂盒包括：组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；组分C：生物素偶联的GNP多肽；组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；组分F：GNP标准品；组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；组分G：TMB底物；组分I：终止液。本发明基于有限的抗原表位构建竞争性的分析方法，成功构建了GNP多肽的检测试剂盒。

Description

一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及GNP多肽的药代动力学和毒代动力学研究领域，具体涉及一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
GNP多肽，也可以称为“G型利钠肽”或者“GNP”，最初在非洲东部地区的一种窄头树眼镜蛇毒液中发现，是与BNP相似的天然类似物，也是利钠肽家族的新成员，具有极高药用价值。GNP多肽的一级结构中含有38个氨基酸序列，分子量约为3689Da。GNP比BNP相差6个氨基酸，且同源性差异很大，仅48.3%的同源性，但是可以发挥类似于BNP的作用，例如增加靶细胞环鸟苷酸的水平，促进平滑肌细胞舒张，促使静脉和动脉血管扩张，发挥利尿钠、利尿、血管扩张、平滑肌松弛的作用。目前国内外许多药物公司开发GNP多肽，且主要通过合成途径制作GNP多肽。但是当前尚未有相关报道涉及GNP多肽的检测方法，市场上也没有提供对应的GNP多肽检测试剂盒。基于GNP多肽药物分子的研发需求，构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法迫在眉睫。
如上所述，GNP是新发现的外源性多肽分子，GNP与内源的BNP相比不仅相差了6个氨基酸数目，而且序列上同源性很小，仅48.3%的同源性，无表位重叠性可言，GNP和BNP在来源和结构上的差异都决定BNP的检测对GNP完全无可参照性。另有脑利钠肽前体是BNP的前体物质，与GNP也属于不一样的功能物质，其氨基酸数目是76个，远远大于GNP，分子量大，潜在表位相对多，因此对脑利钠肽前体而言容易制备纯化抗体，更可以构建双抗体夹心的检测模式。但是本发明针对的GNP多肽是小肽，氨基酸数目相较GNP前体肽而言少一半，GNP多肽和脑利钠肽前体无论是来源、结构大小、检测试剂开发难易均也不具备可比拟性和参照性。总之，本发明是要针对一个新的非内源性来源的多肽构建检测试剂盒和检测方法。
发明内容
GNP检测试剂盒的开发完全是针对一个不同的新的肽类分子。无论是抗体制备纯化、分子标记，还是检测缓冲液（Assay Format）的构建都是所要面临的全新技术性问题和实施过程中必须克服的技术性挑战。总体而言，当前构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法主要存在以下技术问题：
（1）GNP主要用于治疗心脑血管类疾病，给药剂量很低，通常是ug/kg级别，因此GNP多肽的检测试剂盒对灵敏度要求极高，需要达到纳克级以下，且检测方法在药物分析实践中需要涵盖多个半衰期，还要兼顾小动物实验中样品量少的特点。
（2）GNP作为小肽物质，不稳定性突出，尤其是未经任何修饰的GNP裸肽在血液和缓冲液（例如分析缓冲液）中极不稳定，故在检测试剂盒的构建过程中需要克服其不稳定性。
（3）GNP仅含38个氨基酸，属于很短的小肽，表位非常有限，对其标记存在极高难度，相应的抗体也难以制备，这使得双抗体夹心法难以用于GNP检测试剂盒的构建，这无疑进一步增加了使得该检测试剂盒实现良好检测效果的难度。
针对上述问题，本发明提供一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法，既可以达到很高的灵敏度，提高信号，还可以在样品用量少于常规用量（50~100μL）的情况下，获得良好的检测效果。
第一方面，本发明提供一种GNP多肽的检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：
组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；
组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；
组分C：生物素偶联的GNP多肽；
组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；
组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；
组分F：GNP标准品；
组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；
组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；
组分G：TMB底物；
组分I：终止液。
本发明基于有限的抗原表位构建竞争性的分析方法，区别于常规使用抗原直接包被酶标板，而是预先使用链霉亲和素（Streptavidin）包被微孔板，然后利用生物素（例如biotin）标记的GNP抗原实现间接包被。这样促使GNP反应不受空间位阻的限制，有利于抗原-抗体的结合反应。而且在没有充分可利用的纯化单克隆抗体的情况下，本发明还可以采用直接构建腹水的方法，腹水中单克隆抗体浓度高，不经纯化其抗体活性也不易受到损失，有利于提高反应的信号窗口，进一步也利于促进灵敏度。
此外，值得说明的是，本发明所述试剂盒针对的是GNP多肽。如背景技术中所述，GNP多肽为眼镜蛇毒液中提取物，纯外源性物质，并非人体本身所含物质。因此该试剂盒所检测的物质非人体自身可分泌的内源性物质。
较佳地，所述样品稀释液每升中包括：酪蛋白 4.5~5.5g，两性表面活性剂 2~3g，MgCl2 9~10g，γ-球蛋白 2~2.5g，NaCl20.5~29g，0.5M 的EDTA溶液8~15mL，动物血清 8~15mL，吐温-20 450~550μL。
较佳地，所述分析缓冲液为牛血清蛋白-海藻糖-PBST溶液。例如，所述分析缓冲液每升中包括：0.001~0.005g/mL的牛血清蛋白，0.001~0.005g/mL的海藻糖，0.001~0.005mL/mL的吐温-20，余量为磷酸盐缓冲溶液。
较佳地，所述抗体稀释液为酪蛋白-PBS溶液。例如抗体稀释液每升中包括：0.01~0.05g/mL的酪蛋白，余量为磷酸盐缓冲溶液。
本发明成功构建了GNP多肽的药代动力学检测试剂盒，并取得非常好的实施效果，在药物分析领域尤其是在GNP药物开发的药代动力学和毒代动力学研究领域具有很好的实用价值。不仅如此，本发明的检测试剂盒还可以兼顾不同种属，特别是采集量有限的大鼠、小鼠血清样品，本发明的检测方法可以在样品用量少于常规用量的情况下仍然实现高精度检测。值得一提的是，本发明在构建检测试剂盒的过程中，调制出多种新型缓冲液（Buffer）配方，有利于消除基质干扰、非特异性信号，同时兼顾GNP和标记的GNP多肽的稳定性。这也是本发明首次提出并实现。
分子标记时，标记物要通过一定的基团和被标记物结合。太小的小肽上可与标记物结合的基团很少。GNP上仅两个赖氨酸，生物素标记主要依赖于赖氨酸，且分子量太小使得很难将标记分子和标记物分离开来。较佳地，所述生物素偶联的GNP多肽为N端起10号位及30号位氨基酸。这解决了GNP多肽（属于小肽）难以标记的问题。
第二方面，本发明还提供了一种GNP多肽的检测方法。可将上述任一项所述的GNP多肽的检测试剂盒用于该GNP多肽的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：
步骤（1）、在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体；
步骤（2）、将生物素偶联的GNP多肽结合在固相载体上形成固相化抗原；
步骤（3）、将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物；
步骤（4）、向步骤（3）的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，通过孵育使得羊抗小鼠IgG与固相载体上的抗原抗体复合物进一步结合，然后除去未结合的物质；
步骤（5）、向步骤（4）的酶标板中加入酶促反应TMB底物，底物被酶催化成为有色产物，随后加入终止液以终止颜色的发展；
步骤（6）、根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及受试血清样本中的GNP浓度值。
较佳地，步骤（1）中，用碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至0.5~2µg/mL，然后以50~150 µL/孔加入酶标板，于2-8℃孵育至少15 h；孵育结束后，以100~300µL/孔加入封闭液并在室温孵育2 h ± 15 min以获得固相载体。
较佳地，步骤（2）中，使用分析缓冲液稀释生物素偶联的GNP多肽至5~10 ng/ml，以50~150 µL/孔加入酶标板，室温孵育1 h ± 5 min以获得固相化抗原。
较佳地，步骤（3）中，以25~30µL/孔将标准品、质控品和受试血清样本加入酶标板；使用样品稀释液以1:10000~20000稀释GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水，然后以25~30 µL/孔加入酶标板并在室温孵育1 h ± 5 min。
较佳地，步骤（4）中，使用抗体稀释液以1:10000~1:15000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，然后以50~150µL/孔加入酶标板并在室温孵育1 h ± 5 min。
较佳地，所述受试血清样本为动物血清和/或人血清。
第三方面，本发明公开了包含GNP单克隆抗体的腹水在GNP多肽的检测试剂盒中的应用。具体为：包被链霉亲和素后再结合生物素标记的GNP多肽与游离的GNP多肽竞争性结合含单克隆抗体的腹水或纯化的单克隆抗体的Assay Format在GNP多肽的检测试剂盒中的应用。
通过直接利用腹水构建相应的分析方法，可以避免通过腹水纯化得到抗体后，抗体的效价、活性或量上的损失，可以维持更好的免疫反应强调，有利于Assay灵敏度的促进；也避免了腹水纯化后抗体可能还需要浓缩进一步造成效价或量的损失等情况，而且反而腹水中的其它成分有时也可以起到封闭防止非特异性信号的产生。
附图说明
图1是三个不同给药剂量组的测试曲线，其中由上至下各曲线依次为实验检测的动物个体编号G8-1、G8-2、G7-2、G7-1、G6-1、G6-2；“predose”指的是“给药前”。
具体实施方式
通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各千分含量指的是质量体积比中的千分含量。在本发明未作具体说明的情况下，“室温”指的是“20-26℃”，“rpm”指的是“转/分钟”。
仪器与耗材
（1）Molecular Device全波长酶标仪或其它可测450nm波长的酶标仪；
（2）MaxiSorp型微孔酶标板，不限于96孔酶标板或384孔酶标板。
试剂盒缓冲液
（1）纯化GNP多肽，其具体来源不受限制，例如可购于圣诺生物公司；
（2）辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，也可以称为“HRP-羊抗小鼠IgG”，购于艾博抗(上海)贸易有限公司，牌号Cat# ab97265；
（3）GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水”，也可以称为“GNP单克隆抗体杂交瘤细胞株腹腔注射小鼠之后取得的腹水”；制备过程为：GNP偶联载体蛋白免疫小鼠后,将被免疫的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合后制备的杂交瘤细胞中，挑取的阳性单克隆细胞株培养后再行小鼠腹腔注射而抽取的腹水；
（4）生物素偶联的GNP多肽，也可以称为“Biotin-GNP”，制备过程为：将GNP冻干粉溶解在PBS中浓度达10mg/mL，取0.5mL加入到2.8mL超纯水溶解的生物素溶液中，室温避光过夜孵育，次日将反应液加入到附有15mL收集管的脱盐柱中，以1000转/分钟离心2分钟所得到液体即为生物素偶联的GNP；
（5）链霉亲和素（Sigma，Cat#85878或其它可替代品）；
（6）pH9.6的碳酸盐缓冲液，例如购于Sigma公司；
（7）pH7.4的磷酸盐缓冲液 ，例如购于Sigma公司；
（8）TMB底物，例如购于R$D公司；
（9）2M H2SO4终止液，例如购于Sigma公司；
（10）封闭液(5%牛血清蛋白在PBS中)，制备过程为：将5g牛血清蛋白溶于100mL的1×PBS溶液中，混匀分装；
（11）分析缓冲液，例如组成为0.1‰牛血清蛋白（BSA）+0.1‰L海藻糖 in 0.1‰吐温的 PBS，具体制备过程为：取100 mL 10×PBS溶液和1 mL的吐温-20（Tween-20）溶于900mL 的去离子水中，再加入1 g BSA和1g海藻糖，混匀备用；或取袋装1×PBS粉末溶于1 L去离子水中，再加入1 mL 的Tween-20，再加入1 g BSA和1g海藻糖，混匀分装备用；
（12）0.5M EDTA溶液通过如下方式配制：称取14.612g乙二胺四乙酸 (EDTA)加入到80 mL去离子水中，然后调节pH至8.0±0.1；
（13）抗体稀释液(2%酪蛋白在PBS中)：取2 g 酪蛋白溶于100 mL 的1×PBS溶液中，混匀分装；
（14）样品稀释液：用去离子水将下述物质溶解于800 mL 的1×PBS溶液中，调节pH至7.4±0.1，定容至1L，混匀分装。
一些情况下，在样品稀释液的制备过程中可以根据需要加入0.5mL的防腐剂（例如Proclin 300）。样品稀释液的配方组成详见下表：
Figure 687995DEST_PATH_IMAGE001
以下示例性说明本发明所述GNP多肽的检测方法。在此说明的是，该检测步骤中的数值仅用于对检测方法作出示例性描述，而并非对本发明的限定。任何本领域技术人员根据本发明的检测方法所作的变形，在不脱离本发明本质的情况下，仍然属于本发明的保护范围。
包被。用碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至1µg/mL，混匀后以100 µL/孔加入96孔MaxiSorp酶标板，2-8℃ 过夜孵育。该孵育时间至少为15 h。
封闭。甩掉包被的液体，用洗涤液洗板3次（300 µL/孔），拍干。以200µL/孔加入封闭液，置于数显型酶标板振荡器700 ± 50 rpm，室温孵育2 h ± 15 min。甩掉封闭液，用洗涤液洗板3次（300 µL/孔）后，拍干即用，或放在2~8℃冰箱内保存备用。放置时间不宜超过1周。
使用分析缓冲液稀释生物素偶联的GNP多肽至8 ng/ml，混匀，以100 µL/孔加入已封闭的96孔MaxiSorp酶标板中，置于数显酶标板振荡器700 ± 50 rpm，室温孵育1 h ± 5min。
上述过程中，将生物素偶联的GNP多肽结合在预先包被有链霉亲和素的96孔或384孔MaxiSorp型的酶标板上，在固相载体上形成固相化抗原。该抗原仍保持其免疫反应活性和良好的空间构象。
在空白的血清（例如大鼠、小鼠或人、猴子等）中加入纯化的GNP多肽，配制浓度为50.000 ng/mL，25.000 ng/mL，12.500 ng/mL，6.250 ng/mL，3.125 ng/mL，1.563 ng/mL，0.781 ng/mL和0.391 ng/mL的样品，以作为标准曲线的标准品。另在空白血清中加入不同浓度的GNP多肽，配制成不同浓度水平的质控样品（质控品），ULOQ（50.000 ng/mL），HQC（40.000 ng/mL），MQC（8.000 ng/mL），LQC（2.000 ng/mL），LLOQ（0.781ng/mL）。受试血清样本（也可以称为“待测血清样品”）根据需要进行稀释或不稀释。
加样。甩掉板中液体，用洗涤液洗板3次（300 µL/孔），拍干。以25~30µL/孔将标准品、质控样品和待测血清样品加入96孔MaxiSorp酶标板。
加一抗。使用样品稀释液以1:15000倍稀释GNP免疫小鼠腹水，以25~30 µL/孔加入96孔MaxiSorp酶标板中，置于数显酶标板振荡器700 ± 50 rpm，室温孵育1 h ± 5 min。
本发明向配制的标准品、QC样品（质控样品）及待测血清中的GNP中同步加入GNP单克隆抗体杂交瘤细胞株腹腔注射小鼠之后取得的腹水（或纯化GNP单克隆抗体）并上96孔MaxiSorp酶标板进行孵育，此过程中游离态GNP与固相化Biotin偶联的GNP竞争结合小鼠腹水中或纯化的GNP单克隆抗体上的位点，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与反应液中的其他物质分开。腹水可以避免纯化过程中抗体的效价和活性损失，与抗原的反应性更强，实施过程中可以更好地增加信号窗口。
加二抗。甩掉板中液体，洗涤液洗板4次（300 µL/孔），拍干，再加入用抗体稀释液以1:10000~1:15000倍稀释的HRP-羊抗小鼠IgG（100 µL/孔），置于数显酶标板振荡器700± 50 rpm，室温孵育1 h ± 5 min。通过加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，通过孵育反应并与固相载体上的复合物进一步结合，洗涤去除未结合物质。
显色。甩掉板中液体，用洗涤液洗板4次（300 µL/孔），拍干，加入TMB（100 µL/孔），室温孵育30 ± 10 min。
终止与读数。加入终止液（100 µL/孔），30 min内置于酶标仪上终点法模式于450nm读取OD值。
加入酶促反应的底物TMB后，底物被酶催化成为有色产物，加入终止液可以终止颜色的发展。反应产物颜色的深浅与标本中目标分析物的含量呈反向关系。质控样品及受试血清样本中的GNP浓度值可以根据以标准品回归拟合的标准曲线进行计算。
数据处理。用SoftMax Pro软件进行数据的采集和处理。以五参数方程及固定权重因子对标曲各浓度点仪器响应值及理论浓度的关系进行回归从而确定标准曲线。选择五参数方程的原因是，五参数方程比四参数方程更有利于低浓度标曲点的拟合，提高检测灵敏度。质控样品和/或待测样品的测量值可以由标准曲线计算得出。若QC和/或待测样品被稀释过，可以将测量值乘以相应的稀释倍数得到最终的测量浓度。
综上，本发明采用生物素标记的抗原，本质上是利用固相抗原和游离抗原竞争抗体从而构建一种完全不同于夹心模式的检测试剂盒。另外，在该检测试剂盒中包括多种特别的即用型缓冲液，方便使用，而且缓冲液的成分中由于特别配比了各种防止聚集物质、载体蛋白、表面活性剂等，有利于促进分析过程中保护检测物的稳定性和消除基质中各种成分引起相互作用的干扰。
为了更好地理解本发明的关键技术参数确定过程和实际实施效果，以下将从方法的Assay Format（分析模式）确定、方法学验证、实际药代动力学应用效果方面利用发明创造过程中里程碑意义的典型实施例来说明和展现相关发明的实施效果。应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。在实施例的部分表格中出现大于或小于100%的数据，这是测量值相对于理论值正向偏差或负向偏差的体现，是原始实验数据的呈现，皆由软件对标准曲线自动拟合产生，目前行业要求在75%~125%即可。在整个说明书中，以系列的实施例递进式说明本发明的方法和试剂盒条件优化的过程，以全面体现本发明的创造过程，实用性价值和实施效果。目前行业对准确度（或称回收率）的要求也是 75%~125%，部分实施例的试验数据超出该范围，这进一步说明若不进行后续的改造优化，而是按照该试验条件直接执行，是很难达到最终有益效果的。
在下述表格中，“NA”指的是“不适用本部分”，或理解为无需参考值。
实施例1
采用双抗夹心的方法，分别采用纯化GNP单克隆抗体和GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水碳酸盐缓冲液作1:100倍稀释后直接以100μL/孔包被微孔板，封闭后再添加系列稀释的GNP（包括标准品、质控品、受试血清样本）进行孵育反应1h± 5 min。然后洗涤，并再添加用前述抗体稀释液作1:1000倍稀释的GNP免疫制备的兔多抗孵育，洗涤后继续加入抗体稀释液1:10000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG进一步孵育。这样包被酶标板形成的固相化抗体与GNP免疫制备的兔多抗形成双抗体对GNP夹心检测方式。封闭具体使用5%脱脂奶粉的封闭液（将5g脱脂奶粉溶于100mL的1×PBS的溶液中，混匀分装）。标准品、质控品、受试血清样本的上样量为100μL。其它步骤和参数（包括如孵育、上样、反应时间，显色和终止等）与前述具体实施方式部分提及的测试步骤相同。测试信号结果请详见下表（Plate1为纯化的抗体包被，Plate 2为腹水直接包被）：
Figure 508184DEST_PATH_IMAGE002
可以看出，利用纯化单克隆抗体时，在同一条件下，纯化单克隆抗体的信号较低，腹水信号较高，但不同浓度点间的信号无明显差距，即信号无梯度，不能构建标准曲线。该数据证实双抗夹心的方式不适合GNP多肽的检测。另外，抗体纯化时可能导致活性受损，这也会导致信号非常低。然而腹水可以提高信号，因此使用腹水用于后续的方法优化。
实施例2
直接利用腹水包被构建竞争性的检测方法，即腹水直接包被微孔板，生物素标记和非生物素标记的GNP相互竞争性结合包被的腹水。具体为用碳酸盐缓冲液作1：100倍稀释的腹水包被微孔板，封闭后同步加入系列稀释的GNP标准品及生物素标记的GNP（Bio-GNP，8ng/mL）反应，再加入链霉亲和素-HRP反应后显色读数。其他步骤和参数同与前述具体实施方式部分提及的测试步骤相同。可以看出，检测结果明显得以改善，标准曲线的拟合趋好，但是很难克服腹水直接包被带来的高本底问题，数据说明这种竞争性的Assay Format（分析模式）不可行。实施例2的标准曲线拟合结果详见下表：
Figure 860668DEST_PATH_IMAGE003
实施例3
采用直接包被GNP，直接用固相的GNP与样品中游离的GNP竞争结合腹水尝试优化检测方法。具体操作为：包被2μg/mL的GNP于微孔板中，封闭后同步加入系列稀释的GNP标准品反应和腹水抗体，孵育反应后再加入HRP标记羊抗鼠抗体反应后显色读数。其他步骤和参数同与前述具体实施方式部分提及的测试步骤相同。然而标准曲线拟合较差，质控样品测试结果同样也较差。实施例3的标准曲线拟合结果详见下表：
Figure 803216DEST_PATH_IMAGE004
此竞争性Assay Format对实验结果有所改观，但可以看出，在两组质控样品中，样品回收率偏高，甚至达到200%左右，不能符合PK生物分析方法相关接收标准。两组质控样品的测试结果详见下表：
Figure 241151DEST_PATH_IMAGE005
实施例4
基于前期实施例探索，改造采用链霉亲和素包被微孔板，利用链霉亲和素和生物素结合，拽取生物素标记的GNP抗原，即利用Biotin-GNP与游离的GNP竞争腹水的模式进行检测过程中抗原抗体的反应。这种Assay Format的反应模式和原理，有利于减小空间位阻，GNP不直接固定于板孔上，给予GNP多肽抗原以柔性的反应空间，尽可能避免表位的遮盖，有利于反应体系中反应的进行。测试结果完全符合PK生物分析的方法学接收范围要求，充分性良好，方法稳定。而且标准曲线取点拟合后的准确度在80-120%的范围内，QC的回收率也在80-120%的范围，满足PK的检测需求。因此实施例4的Assay Format经过系列验证后确立为本发明的检测方法及构建相应的检测试剂盒。实施例4中，设计两个平行的反应，每个反应中分别独立配制两套标准曲线，即标准曲线1和标准曲线2，对两套标准曲线也分别独立配制两套质控样品（QC样品），即QC1和QC2。其中，标准曲线2和对应的QC1及QC2，是标准曲线1及QC1、QC2的反应的重复。两个平行反应中的标准曲线精确度及QC的回收率证明了本发明的方法可行性。两个平行反应反应中标准曲线1和标准曲线2的拟合结果，及对应的QC1和QC2检测结果详见下表：
Figure 848718DEST_PATH_IMAGE006
Figure 321288DEST_PATH_IMAGE007
Figure 434738DEST_PATH_IMAGE008
Figure 297651DEST_PATH_IMAGE009
Figure 521959DEST_PATH_IMAGE010
Figure 583456DEST_PATH_IMAGE011
实施例5
基于实施例4的检测方法，结合医药研发工业界的规范要求，对检测方法的各主要参数进行验证。
标准曲线的稳健性：经过测试表明，不同批次运行的标准曲线拟合出的浓度非常接近且稳定。标准曲线的稳健性测试结果详见下表：
Figure 54758DEST_PATH_IMAGE012
批间变异性：结果表明批间无差异。详情请参见下表：
Figure 467285DEST_PATH_IMAGE013
基质效应：在九个随机选取的单个血清中添加已知浓度的GNP，经测试表明回收率均在80-120%。这说本发明构建的检测方法可以排除基质效应的干扰。基质效应测试结果详见下表：
Figure 495283DEST_PATH_IMAGE014
稀释线性：将本发明的样品稀释液添加到随机选择的五个空白血清样品中（GNP的浓度为0.5mg/mL），分别稀释25000、50000、100000倍并进行测量，以测定本发明的Buffer配方对GNP稳定性的影响以及高浓度GNP样品稀释准确度的影响。测定值与理论值偏差不宜超过15%。稀释线性测试结果详见下表：
Figure 801500DEST_PATH_IMAGE015
结果证明本发明的缓冲液配方有利于高浓度GNP的准确测量，而且本发明的样品稀释液配方对GNP样品有稳定作用。这是因为样品稀释液中含有模仿血清和其它生理成分的物质，以及防止分子相互作用的物质，利于多肽的保护和稳定，同时还能起到防止干扰性分子相互作用而致非特异性信号的物质的配方组合。
实施例6
测试该检测方法用于实际的PK 动物实验中的实际效果。如图1所示，在动物实验中，三个不同的给药剂量组（400μg/只,1200μg/只,3960μg/只，每标准体重），每组每性别16只动物，即大鼠，4个采血序列交叉采血，每个采血序列四只动物，采血时间点见图1。大鼠同一剂量组个体平均值得不同性别间检测结果几乎无差异。随着给药剂量增加，组间也呈现很好的相关性，证实本发明的分析方法取得了很好的实施效果，而且克服了给药剂量较低，样本量小，交叉采血对本发明方法实施效果的干扰。

Claims (9)

1.一种外源性GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，采用链霉亲和素包被的微孔酶标板，通过链霉亲和素和生物素结合拽取生物素偶联的GNP抗原，固相化生物素偶联的GNP抗原与游离的GNP竞争抗体，利于减小空间位阻以使得GNP不直接固定于微孔酶标板上，给予GNP抗原以柔性的反应空间并避免表位的遮盖；所述检测试剂盒包括：
组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；
组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；
组分C：生物素偶联的GNP多肽；
组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；
组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；
组分F：GNP标准品；
组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；
组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；
组分G：TMB底物；
组分I：终止液；
使用所述检测试剂盒的GNP多肽的检测方法包括：将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与固相化生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液每升中包括：酪蛋白 4.5~5.5g，两性表面活性剂 2~3g，MgCl2 9~10g，γ-球蛋白 2~2.5g，NaCl2 0.5~29g，0.5M 的EDTA溶液8~15mL，动物血清 8~15mL，吐温-20 450~550μL。
3.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为牛血清蛋白-海藻糖-PBST溶液。
4.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为酪蛋白-PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素偶联的GNP多肽为N端起10号位及30号位氨基酸。
6.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：
步骤（1）、在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体；
步骤（2）、将生物素偶联的GNP多肽结合在固相载体上形成固相化抗原；
步骤（3）、将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物；
步骤（4）、向步骤（3）的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，通过孵育使得羊抗小鼠IgG与固相载体上的抗原抗体复合物进一步结合，然后除去未结合的物质；
步骤（5）、向步骤（4）的酶标板中加入酶促反应TMB底物，底物被酶催化成为有色产物，随后加入终止液以终止颜色的发展；
步骤（6）、根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及受试血清样本中的GNP浓度值。
7.根据权利要求6所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，步骤（1）中，用碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至0.5~2µg/mL，然后以50~150 µL/孔加入酶标板，于2-8℃孵育至少15 h；孵育结束后，以100~300µL/孔加入封闭液并在室温孵育2 h ± 15 min以获得固相载体。
8.根据权利要求6所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）中，使用分析缓冲液稀释生物素偶联的GNP多肽至5~10 ng/ml，以50~150 µL/孔加入酶标板，室温孵育1 h± 5 min以获得固相化抗原；
步骤（3）中，以25~30µL/孔将标准品、质控品和受试血清样本加入酶标板；使用样品稀释液以1:10000~20000稀释GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水，然后以25~30 µL/孔加入酶标板并在室温孵育1 h ± 5 min；
步骤（4）中，使用抗体稀释液以1:10000~1:15000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，然后以50~150µL/孔加入酶标板并在室温孵育1 h ± 5 min。
9.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述受试血清样本为动物血清和/或人血清。
CN202110323911.8A 2021-03-26 2021-03-26 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法 Active CN112710852B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110323911.8A CN112710852B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110323911.8A CN112710852B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112710852A CN112710852A (zh) 2021-04-27
CN112710852B true CN112710852B (zh) 2021-08-03

Family

ID=75550346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110323911.8A Active CN112710852B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112710852B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117606896B (zh) * 2023-11-30 2024-04-30 广东省华微检测股份有限公司 一种人血清样品中gnp浓度的检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240023A (zh) * 2008-03-14 2008-08-13 南京大学 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法
JP2010091398A (ja) * 2008-10-08 2010-04-22 Tosoh Corp 安定なナトリウム利尿ペプチド組成物
CN101819205A (zh) * 2010-06-03 2010-09-01 中国人民解放军第三军医大学 人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法
CN102207501A (zh) * 2011-03-22 2011-10-05 沃克(天津)生物科技有限公司 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法
CN103159847A (zh) * 2013-04-12 2013-06-19 叶亮 一种利钠肽及其基因与用途
JP2014091719A (ja) * 2012-11-05 2014-05-19 Tosoh Corp ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドに対する特異抗体およびそれを用いた測定法
CN106706924A (zh) * 2016-12-08 2017-05-24 申联生物医药（上海）股份有限公司 一种油佐剂疫苗的竞争elisa定性定量检测方法
CN111007266A (zh) * 2019-11-20 2020-04-14 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种检测血浆中b型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2304263C (en) * 1997-09-11 2008-07-29 Shionogi & Co., Ltd. Immunoassay method for bnp
AT407580B (de) * 1999-08-20 2001-04-25 Biomedica Gmbh Indikatorpeptid zur diagnose und/oder vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen erkrankungen, antikörperzusammensetzung und immunoassay
US20030219734A1 (en) * 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
US7632647B2 (en) * 2001-04-13 2009-12-15 Biosite Incorporated Use of B-type natriuretic peptide as a prognostic indicator in acute coronary syndromes
EP1562990B1 (en) * 2002-11-18 2010-07-21 Syn X Pharma, Inc. Polyclonal-monoclonal elisa assay for detecting n-terminus probnp
CN101611318B (zh) * 2006-09-07 2015-03-04 奥塔哥创新有限公司 生物标记物
US20080280377A1 (en) * 2007-05-08 2008-11-13 Abbott Laboratories Human b-type natriuretic peptide assay having reduced cross-reactivity with other peptide forms

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240023A (zh) * 2008-03-14 2008-08-13 南京大学 重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法
JP2010091398A (ja) * 2008-10-08 2010-04-22 Tosoh Corp 安定なナトリウム利尿ペプチド組成物
CN101819205A (zh) * 2010-06-03 2010-09-01 中国人民解放军第三军医大学 人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法
CN102207501A (zh) * 2011-03-22 2011-10-05 沃克(天津)生物科技有限公司 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法
JP2014091719A (ja) * 2012-11-05 2014-05-19 Tosoh Corp ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドに対する特異抗体およびそれを用いた測定法
CN103159847A (zh) * 2013-04-12 2013-06-19 叶亮 一种利钠肽及其基因与用途
CN106706924A (zh) * 2016-12-08 2017-05-24 申联生物医药（上海）股份有限公司 一种油佐剂疫苗的竞争elisa定性定量检测方法
CN111007266A (zh) * 2019-11-20 2020-04-14 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种检测血浆中b型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A fast and sensitive enzyme immunoassay for brain natriuretic peptide based on micro-magnetic probes strategy;Ruping Liu等;《Talanta》;20100201;全文 *
Berta Esteban-Fernández de Ávila等.Disposable amperometric magnetoimmunosensor for the sensitive detection of the cardiac biomarker amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide in human serum.《Analytica Chimica Acta》.2013, *
B-Type Natriuretic Peptide (BNP) Detection Using Electrochemical Immunosensor Based On Sandwich ELISA With Horseradish Peroxidase-Tetramethylbenzidine System;Yeni Wahyuni Hartati等;《Procedia Technology》;20171231;全文以及图1 *
化学发光免疫法检测Ｂ型利钠肽的检测限值和功能灵敏度研究;李飞等;《检验医学与临床》;20110930;第8卷(第18期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112710852A (zh) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9234047B2 (en) Preparing hapten-specific antibodies and their application for immunodiagnostics and research
CN116124721A (zh) 庆大霉素检测试剂盒
CN106556592B (zh) 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法
CA2165970A1 (en) Mca assay/kit for detecting metal cations
US20140206023A1 (en) Methods, Kits & Antibodies for Detecting Intact Fibroblast Growth Factor 21
CN112710852B (zh) 一种gnp多肽的检测试剂盒及检测方法
CN102967709A (zh) 检测玉米赤霉烯酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用
JP2665503B2 (ja) インシュリン様成長因子の免疫分析を可能にするインシュリン様成長因子に対するモノクローナル抗体対
US6800608B2 (en) Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
CN109180519B (zh) 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法
US8900816B2 (en) Assay for anti-EGFRvIII antibodies
JPH08507603A (ja) マルチクローナル抗体フォーマットで結合タンパク質を用いた競合イムノアッセイ
EP2518084B1 (en) Method for measuring human insulin and measurement reagent
CN109239368A (zh) 测定孕酮的方法及试剂盒
Zhang et al. Fluorescence polarization immunoassay based on fragmentary hapten for rapid and sensitive screening of polymyxins in human serum
Hong et al. A monoclonal antibody sandwich ELISA for vitamin D-binding protein (VDBP) is unaffected by Gc-globulin phenotype peptides and actin and demonstrates reduced levels in sepsis and non-sepsis intensive care patients
CA1341113C (en) Immunoassay for activator peptides
JPS63292061A (ja) 完全無傷なプラコラーゲンペプチド（３型）およびプロコラーゲン（３型）の選択的な免疫学的測定法
CN108490195A (zh) 一种维生素b12免疫法测定方法及其试剂
EP3531129A1 (en) Immunoassay method using anti-human bnp fragment (4-32) antibody
CN103163302B (zh) 一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒
CN110317246B (zh) 人mog抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒
Cernoch et al. Production and analytical characterization of neopterin immunoreagents for biosensor developments
CN110317254A (zh) 人mbp抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒
CN114994304B (zh) 一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant