CN108490195A - 一种维生素b12免疫法测定方法及其试剂 - Google Patents

Abstract

本发明是一种均相酶测定技术的免疫学检测的方法及其试剂，用于测定样品中维生素B12（Vitamin B12，VB12）的含量。该方法采用抗VB12特异性抗体、酶‑VB12复合物，利用酶‑VB12复合物与抗VB12特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‑VB12复合物活性受到抑制，通过测定反应体系中酶活性的变化，从而得到结合的酶标记物数量，从而得到待测样品中VB12的含量。该方法的优点是可以像普通生物化学酶方法一样，实现免疫学测定，从而在全自动生化分析仪上同时测定多个样品。

Description

一种维生素B12免疫法测定方法及其试剂

技术领域

本发明涉及到小分子与蛋白质定向连接、小分子成分和检测方法，属于医学免疫体外诊断领域。是基于均相的免疫学酶法测定。尤其涉及一种检测方法和试剂盒的制备，特别是一种VB12检测试剂及其制备和检测方法。

背景技术

维生素B12又称氰钴胺素、钴胺素、外源因子、动物蛋白因子，是唯一含有矿物质的维生素，是一种人体通过饮食获得的必需的营养物质，参与各种代谢过程，促进红细胞的成熟和维持神经系统的正常功能。其缺乏可以引起疲劳、头晕和味觉下降等各种临床表现，但由于症状较分散，容易被忽视，因此血中维生素B12浓度的检测对于判断维生素B12缺乏至关重要。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12在体内具有许多重要的生物学功能：

1、促进甲基转移；

2、促进红细胞的发育和成熟，使肌体造血机能处于正常状态，预防恶性贫血，维护神经系统健康；

3、以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；

4、具有活化氨基酸的作用和促进核酸的生物合成，可促进蛋白质的合成，它对婴幼儿的生长发育有重要作用；

5、代谢脂肪酸，使脂肪、碳水化合物、蛋白质被身体适当运用；

6、消除烦躁不安，集中注意力，增强记忆及平衡感；

7、是神经系统功能健全不可缺少的维生素，参与神经组织中一种脂蛋白的形成。

大量的研究表明维生素B12贫乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。维生素B12缺乏也是怀孕早期流产、反复性流产的危险因素之一。近十年来，尤其随着多中心、大规模的社区随机对照研究的开展，表明检测维生素B1水平在贫血、神经系统疾病、出生缺陷、评价指标、营养强化等方面具有重要意义。

目前，定量测定VB12的方法，有微生物学法，高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)以及放射免疫法(RIA)。微生物法的优点是成本低，能够检测到极低浓度的叶酸或B12水平，缺点是由于微生物法不能够区分叶酸或B12，准确度较低，重复性较差，无法形成统一标准；高效液相色谱法，仪器昂贵，通量小，需要专业技术人员；放射免疫存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)均受样本基质、缓冲体系以及pH影响较大，不同试剂盒检测结果偏差较大，不利于仪器自动化和标准化。

抗VB12抗体的制备难度较高，存在特异性不好的缺点。与维生素B1，维生素B2，维生素B6以及叶酸等存在较大的交叉反应，特异性差，制备的试剂特异性差。有文献报道类似VB12这种小分子的半抗原制备方法决定了制备的抗体的特异性和亲和力。小分子同载体蛋白的连接位点决定了制备抗体的特异性，要保证小分子的特异性抗原决定簇不在半抗原偶联过程中被破坏。载体蛋白同半抗原合适的连接臂长度能够保证小分子的充分暴露，如果过长，会大大降低小分子的免疫原性，太短，载体蛋白会影响小分子的结构。本发明采用特异性的连接臂，通过连接位点的定向选择，羧基位点或者氨基位点，充分暴露VB12的免疫位点，从而获得高亲和力及高特异性的抗体。本发明还采用特异性的连接载体兔白蛋白、人白蛋白和鼠白蛋白，而不采用通用的连接载体如牛血清白蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白等，主要是因为与牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等耦联的VB12刺激产生的抗血清也含有针对牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等的抗体，可能导致假阳性结果；而血蓝蛋白的分子量较大，偶联得到的半抗原容易影响甚至屏蔽小分子的抗原表位，造成制备的抗体亲和力低。而使用兔血清白蛋白做载体免疫的兔子不太可能产生针对兔子自身的蛋白的抗体，且亲和力和特异性更优于其他载体。

目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的VB12检测试剂，尤其是适合自动化检验的试剂。

本发明采用酶偶联VB12复合物，与抗VB12特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‐VB12复合物的活性就受到抑制。样品中的VB12与酶‐VB12复合物竞争性结合抗VB12特异性抗体。样品中的VB12越多，结合的抗体就越多。酶‐VB12复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中VB12的含量。检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，具有较高的应用价值。

发明内容

本检测方法基于免疫学反应，采用均相免疫的酶学测定方法，将小分子VB12与酶通过蛋白质连接技术形成复合物，与样品中的待测VB12与抗VB12特异性抗体竞争结合，通过酶活性的高低来实现样品中VB12浓度的检测。该方法可以提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中VB12含量的均相酶免疫检测试剂及其制备方法。该试剂可应用于临床中广泛使用的各种类型的自动生化分析仪，从而达到大规模样品的测定要求，提高了实用性。

本发明提供了检测VB12的试剂盒，包含试剂R1，试剂R2，缓冲液，稳定剂，VB12参考标准品的液体试剂盒或包含试剂R1，试剂R2，VB12参考标准品的干粉试剂盒。

进一步的，一个优选的技术方案是：

一种VB12均相免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗VB12特异性抗体、用于检测抗VB12特异性抗体‐VB12复合物的检测试剂制备及检测方法；上述VB12均相免疫检测试剂盒基于以下原理：含有VB12的生物样品同VB12‐G6PDH酶复合物竞争结合抗VB12特异性抗体；VB12‐G6PDH酶复合物与抗VB12特异性抗体形成免疫结合物后，其催化底物葡萄糖‐6‐磷酸的活性降低或丧失，反应产物NADH的量也降低；测定样品中VB12的浓度量越高，竞争到的抗VB12特异性抗体越多，抗VB12特异性抗体对VB12‐G6PDH酶复合物的活性抑制越低，则反应生成的NADH量越多；根据测定NADH的量计算，从而得到样品中的VB12含量。

根据这一发明目的，进一步的一个优选实施方案：其中制备VB12免疫原用于制备抗VB12特异性抗体。优选的利用VB12的羟基基团同载体蛋白交联，优选连接基团-CO-(CH2)n-COO-，优选n为2～6；载体蛋白优选兔白蛋白；免疫动物优选新西兰大白兔；化学偶联方式优选琥珀酸酐法和碳二亚胺法；上述优选方法制备的抗VB12特异性抗体对VB12亲和力高，特异性好，与维生素B1，维生素B2，维生素B6以及叶酸均无交叉反应。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中制备VB12-酶复合物用于测定VB12测定试剂盒。优选的酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)；优选的采用VB1羟基基团同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联，-CO-(CH₂)_n-COO-，优选n＝2～4；VB12与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的交联方法优选混合酸酐法；VB12与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联的酶活保护剂优选葡萄糖-6-磷酸NADH；上述保护剂葡萄糖-6-磷酸优选浓度10mM-100mM，NADH优选浓度为10-100mM；采用合理的酶保护剂，优先占据G6PDH的酶活性中心，避免VB12-G6PDH偶联过程中酶活中心的破坏而导致的酶活丧失。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中VB12测定试剂盒中R1试剂缓冲液优选甘氨酸缓冲液；PH优选4.0‐8.0；葡萄糖‐6‐磷酸浓度优选10‐100mM；NaCl浓度优选10‐200mM；NAD+浓度优选10‐100mM；0.001％‐0.01％叠氮钠；吐温‐20浓度优选的为0.01％‐0.1％；BSA优选的为0.1％‐0.5％；

抗VB12抗体优选的为0.01‐2％。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中VB12测定试剂盒中R2试剂缓冲液优选TRIS缓冲液；PH优选7.0-9.0。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中R2的稳定剂是0.2％-0.5％牛血清白蛋白，5％-20％甘油，1％-5％甘露醇，0.001％-0.01％叠氮钠，0.1-2mM EDTA，0.1％-1％PEG20000。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中所述的VB12标准品为添加了VB12纯品人血清或其它类似血清基质的液体。优选地，选择添加了VB12纯品的人血清的液体。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，利用VB12免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)将持测样本与抗VB12特异性抗体接触；

2)根据待测样本中VB12与抗VB12特异性抗体的结合情况；

优选利用自动分析仪测定NADH产生速率，判断样本中VB12的含量；

所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。

本发明和已有技术比较，其技术进步是显著的。本发明中通过蛋白质定向连接技术所获得的VB12免疫原特异性强、免疫原性高。通过载体蛋白的优选，采用兔白蛋白定向偶联VB12小分子，获得抗VB12多克隆抗体。所制备出的抗VB12特异性抗体特异性强、亲和力高。本发明通过将载体蛋白与VB12羟基位点的定向选择性连接，同时中间加入连接臂，大大提高了VB12抗体的特异性识别能力。含有上述抗VB12特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的VB12含量，本试剂为液体双试剂，可用于检测血清或血浆中VB12的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。

附图说明

图1：VB12衍生物的生物化学结构；

图2：VB12衍生物合成图；

图3：VB12均相酶免疫反应标准曲线图；

图4：VB12均相酶免疫相关性分析图。

具体实施方式

实施例一：VB12衍生物的合成及其结构确认

以下实施例中使用的VB12衍生物的生物化学结构如图1所示：

该VB12衍生物的具体合成步骤如图2所示：

1)称取23.7mg的VB12和22mg琥珀酸酐，加入3.0mL无水吡啶，80℃回流2h，旋转蒸发除去吡啶，加入4mL超纯水，用5mL×4乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压旋干，得浅红色固体，即VB12衍生物(式4)。

对上述浅红色固体纯化产物进行结构鉴定

1)利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温为25℃，流速为0.4mL/min，检测波长为224nm，流动相为乙腈-水，梯度洗脱。LCMS结果显示：纯度>95％；保留时间5.931min。

上述结果，可以确定该浅红色固体化合物为图1所示的VB12衍生物。

实施例二：RSA-VB12免疫原合成

RSA-VB12免疫原由兔蛋白RSA与式4所示的VB12衍生物的-CO-(CH₂)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝2为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下:

1)将60mg RSA溶解于6ml 0.1M pH8.3的PBS中，上述溶液置于烧杯A中；

2)将50mg VB12衍生物、0.6ml二甲基酰胺DMF、0.5ml乙醇、1ml 10mM pH5.0的MES缓冲液、68mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、22mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于烧杯B中，于室温下搅拌反应1小时。

3)将烧杯B中的溶液缓慢滴加到烧杯A中，得到混合溶液，并2-8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性PBS缓冲液透析纯化，得到RSA-VB12免疫原，储存于-70℃。

类似的，n取1～10范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式1所示的VB12免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是牛血清白蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。

本发明仅公开了连接基团R为-CO-(CH₂)n-COO-，且n＝2的VB12衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，但是不同长度连接臂对VB12结构暴露程度不同；免疫原性强弱与所合成的VB12衍生物分子结构及所选载体种类有关，使用不同n值的VB12衍生物制备的VB12免疫原均有不同的免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有不同的性质。

实施例三：抗VB12特异性抗体的制备

将上述制得的RSA-VB12免疫原采用常规方法免疫新西兰大白兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下:

用PBS将上述合成的RSA-VB12免疫原稀释至2.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对新西兰大白兔背部皮下多点免疫。

2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述新西兰大白兔免疫一次，之后每隔三周免疫一次，共计免疫4次。

对上述新西兰大白兔取血，分离纯化得到抗VB12特异性抗体。

实施例四：VB12-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标偶联物的制备

1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：

a.称取43mg规格为200KU的G6PDH，室温溶解于10ml含有0.1M Tris、2mM MgCl₂和0.9％NaCl的溶液中，该溶液pH＝8.3；

b.加入390mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，250mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及1mL卡必醇；

c.逐滴加入2.6mL二甲基亚砜；

2)VB12衍生物的激活

a)在氮吹状态下称取100mg VB12衍生物，溶解于800μL DMF中；

b)使上述溶液温度降到-10℃；

c)加入7.5μL三丁胺；

d)加入4.9μL氯甲酸异丁酯；

e)-10℃搅拌1小时；

3)G6PDH与VB12衍生物的偶联

a)将上述激活的VB12衍生物溶液缓慢加入到上述溶解的G6PDH溶液中；

b)2-8℃搅拌过夜；

4)纯化产物

通过透析纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-VB12酶标偶联物，于2-8℃下储存。

实施例五：VB12免疫检测试剂的制备

VB12均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗VB12特异性抗体、用于检测抗VB12特异性抗体-VB12复合物的酶试剂，包括：VB12-G6PDH酶标偶联物和酶的底物。

VB12均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免酶试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是分开放置的，所以将酶的底物与上述抗VB12特异性抗体混合在一起。也就是说，VB12均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下:

试剂R1的制备：20mM NAD，30mM,葡萄糖-6-磷酸G6P、55mM pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；加入1％-0.1％的抗VB12特异性抗体到上述均相酶底物中，在本实施例中具体比例为0.5％。

试剂R2的制备：0.1M、pH＝8.5的Tris缓冲液中加入0.01％-1％制备的VB12-G6PDH酶标偶联物，在本实施例中具体比例为0.05％。

上述VB12免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：

1)将持测样本与抗VB12特异性抗体接触；

2)根据待测样本中VB12与抗VB12特异性抗体的结合情况，利用酶试剂判断样本中VB12的含量；

具体的，检测时，将待测样本加到试剂R1中，待测样本中的VB12与试剂A中的抗VB12特异性抗体发生特异性结合，生成抗VB12特异性抗体-VB12复合物；再加入试剂R2，此时试剂R2中的VB12-G6PDH酶标偶联物与试剂R1中抗VB12特异性抗体发生特异性结合，未与抗VB12特异性抗体结合的VB12-G6PDH酶标偶联物与底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测抗VB12特异性抗体-VB12复合物的酶试剂，酶试剂根据待测样本中VB12上述抗VB12特异性抗体的结合情况判断待测样本中VB12的含量。

由于VB12-G6PDH酶标偶联物与待测样本中的VB12竞争性结合抗VB12特异性抗体，所以，待测样本中VB12的量越多，均相酶溶液中游离的VB12-G6PDH酶标偶联物的量越多，酶促反应越快，导致OD₃₄₀上升越快。

上述待测样本为生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。

作为一种优选的方案，上述待测样本为血清或血浆。

实施例六：VB12均相酶免疫检验

1、获得标准曲线:设置日立7060全自动生化分析仪反应参数(见表1)。操作过程为：先加试剂R1，再加入标准品，37度孵育5min，最后加入试剂R2。加入试剂R2后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率。如图1所示。

表1日立7060全自动生化分析仪反应参数

通过本发明得到的VB12均相酶免试剂的标准曲线，临床收集10个样本，重复检测10次，求出均值，并算出变异系数。变异系数小于10％时，则说明试剂盒具有较好的重复性。

表2精密度试验

从图表数据可以看出，十个样品检测变异系数均小于6％，说明VB12均相酶免疫试剂盒重复性良好，精密度高。

实施例七：干扰物试验

选择几种常见的药物，或者人体内的内源性物质进行干扰试验，这些物质同维生素B12结构具有相似性，结果见表3

表3常见干扰物试验

化合物名称	测试浓度	交叉反应率
			维生素B1	1000pmol/L	<0.01％
维生素B2	1000pmol/L	<0.01％
			维生素B6	1000pmol/L	<0.01％
叶酸	1000pmol/L	<0.01％
			维生素A1	1000pmol/L	<0.01％
维生素A2	1000pmol/L	<0.01％

VB12均相酶免疫试剂同上述干扰物的交叉反应率均小于0.1％，表明本发明制备的VB12抗体是特异性识别VB12的抗体，并且该均相试剂能够准确测定VB12的含量。

实施例八：相关性分析

将本发明的VB12均相酶免测定试剂与高效液相色谱法测定人血清中VB12方法比较，结果见表4。

相关性曲线见图4，可见二者拟合良好。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.一种测定样品中VB12的方法，由试剂R1、试剂R2和VB12参考标准品的组成，其特征在于，（a）试剂R1中含有抗VB12特异性抗体、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（b）试剂R2含有酶-不对称二甲基精氨酸复合物、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（c）当试剂R1和R2反应时，样品中的VB12与酶-VB12复合物竞争性结合抗VB12特异性抗体，样品中的VB12越多，结合的抗体就越多，酶-VB12复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化，可以得到样品中VB12的含量。

2.根据权利要求1所述的检测VB12的试剂盒，

试剂R1：甘氨酸10-200mM

NaCl 10-200mM

葡萄糖-6-磷酸 10-200mM

NAD⁺ 10-100mM

吐温-20 0.01%-0.1%

BSA 0.01%-0.5%

抗VB12抗体 0.01-2%

防腐剂 0.001%-0.01%

PH 4.0-8.0；

试剂R2：

TRIS 10-200mM

0.2%-0.5% 牛血清白蛋白

甘油 5%-20%

甘露醇 1%-5%

防腐剂 0.001%-0.01%

EDTA 0.1-2mM

PEG20000 0.1%-1%

G6PDH-VB12复合物 0.01%-0.5%

PH7.0-10.0。