CN113495158A - 一种样本前处理剂、一种维生素b12定量检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法,一种样本前处理剂,包括强碱、CN‑1、二硫苏糖醇、硼酸。一种维生素B12定量检测试剂盒,包括包被有VB12‑BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物,所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品;改变现有的反应原理设计,从而实现更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域,具体涉及一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法。
背景技术
维生素B12(Vitamin B12)是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素,又称钴胺素或氰钴素。最初发现服用全肝可控制恶性贫血症状。作为一种人类必须的维生素,它在血液系统中对红细胞的发育以及生长有促进作用,它还参与DNA的合成、神经系统的调节以及人体内细胞的代谢等生理功能。所以长时间维生素B12的缺乏会引起巨幼细胞性贫血,也会影响婴幼儿的发育等,维生素B12的过量补充也会容易引发过敏反应等不良影响。
针对维生素B12现有的检测方法,目前主要有液相色谱-串联质谱法、维生物法、免疫学方法。其中免疫学方法因其检测快捷,成本低廉是目前临床应用的主流方法。主流的免疫学方法主要是通过检测样本中与维生素B12结合的内因子蛋白的量来间接作为维生素B12的含量,而这种检测方法不能完全准确的体现样本中维生素B12的水平。
维生素B12在体内是与蛋白相结合存在的,所以不管是哪种检测方法,维生素B12的测定需要对样本进行前处理,使其从维生素B12从结合蛋白上释放出来再进行检测。释放出来的维生素B12不稳定,需要转化成CN-络合的氰钴胺素的稳定结构。目前常用的是将氰化钠或氰化钾作为样本前处理液,但氰化钠和氰化钾都是剧毒的化合物,不利于操作并且存在污染环境的可能。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法,改变现有的反应原理设计,从而实现更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
本发明的目的是以下述方式实现的:一种样本前处理剂,包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ;预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物,预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇,预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ:每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾;预处理液Ⅱ:每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇;预处理液Ⅲ:每升水溶液中含有25g硼酸。
一种维生素B12定量检测试剂盒,包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物,所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品;
包被板的制备中,包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液,封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:(3800—4200)的比例混合得到酶结合物。
酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂;缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂是Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液;校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种;包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤,
(a).样本前处理包括以下步骤,
(1)根据待测样本的量,取预处理液Ⅰ:预处理液Ⅱ=1:1的体积比,混匀,为样本处理剂;
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管,并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本,分别加入50μL的样本处理剂,混匀,室温18-23℃孵育15min;
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ,混匀,室温反应5min;
(b).实验操作包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50μl校准品及待测样本,然后分别加入50μl系统反应液,再加入酶结合物50μl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100μl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
本试剂盒基于酶免免疫法制备而成,配合酶标仪使用,操作简便,检测速度快。与已上市的检测试剂盒相比,本试剂盒采用固相化维生素B12抗原,酶标记抗维生素B12抗体的反应方式;并优化样本前处理剂配方,添加了强碱、CN根、二硫苏糖醇(DTT)。另外本试剂盒采用一步法反应,将辣根过氧化物酶直接偶联在抗维生素B12抗体上,减少反应时间和简化操作步骤。
附图说明
图1是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种样本前处理剂,包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ;预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物,预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇,预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ:每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾;预处理液Ⅱ:每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇;预处理液Ⅲ:每升水溶液中含有25g硼酸。
一种维生素B12定量检测试剂盒,包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物,所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品;
包被板的制备中,包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液,封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:(3800—4200)的比例混合得到酶结合物。
酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂;缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂是Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液;校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种;包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤,
(a).样本前处理包括以下步骤,
(1)根据待测样本的量,取预处理液Ⅰ:预处理液Ⅱ=1:1的体积比,混匀,为样本处理剂;
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管,并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本,分别加入50μL的样本处理剂,混匀,室温18-23℃孵育15min;
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ,混匀,室温反应5min;
(b).实验操作包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50μl校准品及待测样本,然后分别加入50μl系统反应液,再加入酶结合物50μl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100μl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明,以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明,本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品,均为市场上普通所售产品。所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
维生素B12定量检测试剂盒的制备
1、包被板的制备
包被液为0.0.5M碳酸盐缓冲液(pH9.5),按照1μg/mL将VB12-BSA(杭州博岳生物B1012)加入到包被液中,所用的封闭液是含有牛血清白蛋白(BSA)的Tris-HCl(pH7.4),其按照常规的方法进行包被抗原的制备。
(1)包被液的制备:取1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3,溶于900mL纯化水中,用6MHCl调pH至9.5,定容至1000mL制得包被液;
(2)封闭液的制备:采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl,溶于900mL纯化水中,用6M HCl调pH至7.4,定容至1000mL,得溶液A;然后在一部分溶液A中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和100g蔗糖,然后通过加入溶液A的方式定容至1000ml制得封闭液。
Na2CO3、NaHCO3、Tris、NaCl、BSA、纯化水、蔗糖、Proclin300分别为分析纯。
2、样本前处理剂的配制
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ;预处理液Ⅰ包括使结合蛋白变性的氢氧化钠和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物六氰合铁酸钾,预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇,预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ的制备:取20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中,然后定容至1000mL;
预处理液Ⅱ:取3g二硫苏糖醇、15g硼酸、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中,然后定容至1000mL;
预处理液Ⅲ:取25g硼酸、5g抗坏血酸、Tween20(吐温20)2ml、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中,然后定容至1000mL。
氢氧化钠、六氰合铁酸钾、二硫苏糖醇、硼酸、抗坏血酸、Tween20、纯化水、Proclin300分别为分析纯。
3、本发明酶结合物的配制
缓冲液采用Tris-NaCl缓冲液,保护蛋白采用牛血清白蛋白,防腐剂采用Proclin 300。
(1)酶结合物的稀释液的制备:采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl,溶于900mL纯化水中,用6M HCl调pH至7.4,定容至1000mL,得Tris-NaCl缓冲液;然后在一部分Tris-NaCl缓冲液中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和100g蔗糖,然后通过加入Tris-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml,制得酶结合物的稀释液。
(2)将HRP标记的抗维生素B12抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:4000的比例混合,得到的即为酶结合物。HRP标记的抗维生素B12抗体的来源及型号是fitzgerald-fii20-VR28。
Tris、NaCl、BSA、纯化水、蔗糖、Proclin300分别为分析纯。
4、校准品的配制
校准品的稀释液采用Tris-NaCl缓冲液,在缓冲液中加入保护蛋白Casein、防腐剂Proclin 300、抗环血酸、Tween20(吐温20)、庆大霉素、Proclin300。
(1)Tris-NaCl缓冲液的制备:采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl,溶于900mL纯化水中,用6M HCl调pH至7.4,定容至1000mL,得Tris-NaCl缓冲液;
(2)稀释液的制备:在一部分Tris-NaCl缓冲液中加入30g Casein、10g的抗环血酸、1ml的Tween20、5g庆大霉素、1ml的Proclin 300,然后通过加入Tris-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml,制得校准品的稀释液;
(3)校准品的制备:将维生素B12抗原用该稀释液进行稀释,配制成0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL六个浓度的校准品。
Tris、NaCl、Casein、纯化水、抗环血酸、Tween20、庆大霉素、Proclin300分别为分析纯。维生素B12抗原的来源及型号是sigma V2876。
5、其他通用试剂组分:底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
6、试验过程
(a).样本前处理包括以下步骤,
(1)根据待测样本的量,取预处理液Ⅰ:预处理液Ⅱ=1:1的体积比,混匀,为样本处理剂;
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管,并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本,分别加入50μL的样本处理剂,混匀,室温18-23℃孵育15min;
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ,混匀,室温反应5min;
(b).实验操作包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50μl校准品及待测样本,然后分别加入50μl系统反应液,再加入酶结合物50μl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100μl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
(c)结果计算
(1)酶标仪检测:选择酶标仪波长450nm,参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2)计算:本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式,即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴),以标准品OD值为纵坐标(Y轴),建立点到点标准曲线,从而根据曲线计算待测样本维生素B12的含量。
计算示例数据如下表表1。
表1
(d)本发明试剂盒临床验证
为了验证本发明维生素B12定量检测试剂盒与对比厂家Roche结果的一致性,共收集95例血清样本进行平行检测,检测结果进行临床相关性分析,结果如下表表2,根据表中数据制得相关性参考图如图1。
从图1显示比对结果表明,本发明试剂盒与对比试剂盒的现行相关R2为0.9391,证明本发明试剂盒与对比试剂盒间相关性较好。
本发明试剂盒采用直接检测样本中维生素B12的方法,更能准确展示样本中的维生素B12的含量。本发明采用氰氢根离子的络合物作为变性剂的有效成分,减弱引入氰氢根离子的毒性。另外本发明采用一步法反应,将辣根过氧化物酶直接偶联在抗维生素B12抗体上,减少反应时间和简化操作步骤,实现更方便快捷的操作方法,也更符合临床操作使用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明整体构思前提下,还可以作出若干改变和改进,这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种样本前处理剂,其特征在于:包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
2.根据权利要求1所述的样本前处理剂,其特征在于:强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的样本前处理剂,其特征在于:样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ;预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物,预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇,预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
4.根据权利要求3所述的样本前处理剂,其特征在于:预处理液Ⅰ:每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾;预处理液Ⅱ:每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇;预处理液Ⅲ:每升水溶液中含有25g硼酸。
5.一种维生素B12定量检测试剂盒,其特征在于:包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物,如权利要求1-4任一权利要求所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品。
6.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒,其特征在于:包被板的制备中,包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液,封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
7.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒,其特征在于:酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:(3800—4200)的比例混合得到酶结合物。
8.根据权利要求7所述的维生素B12定量检测试剂盒,其特征在于:酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂;缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂是Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒,其特征在于:包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液;校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种;包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
10.根据权利要求5-9任一权利要求所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤,
(a).样本前处理包括以下步骤,
(1)根据待测样本的量,取预处理液Ⅰ:预处理液Ⅱ=1:1的体积比,混匀,为样本处理剂;
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管,并进行编号;
用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本,分别加入50μL的样本处理剂,混匀,室温18-23℃孵育15min;
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ,混匀,室温反应5min;
(b).实验操作包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50µl校准品及待测样本,然后分别加入50µl系统反应液,再加入酶结合物50µl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100µl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50µl,终止反应。
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