CN113495158A - 一种样本前处理剂、一种维生素b12定量检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种样本前处理剂、一种维生素b12定量检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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王玲玲
普鹏
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Abstract

本发明提供一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法，一种样本前处理剂，包括强碱、CN‑1、二硫苏糖醇、硼酸。一种维生素B12定量检测试剂盒，包括包被有VB12‑BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物，所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品；改变现有的反应原理设计，从而实现更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。

Description

一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用 方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法。
背景技术
维生素B12(Vitamin B12)是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素，又称钴胺素或氰钴素。最初发现服用全肝可控制恶性贫血症状。作为一种人类必须的维生素，它在血液系统中对红细胞的发育以及生长有促进作用，它还参与DNA的合成、神经系统的调节以及人体内细胞的代谢等生理功能。所以长时间维生素B12的缺乏会引起巨幼细胞性贫血，也会影响婴幼儿的发育等，维生素B12的过量补充也会容易引发过敏反应等不良影响。
针对维生素B12现有的检测方法，目前主要有液相色谱-串联质谱法、维生物法、免疫学方法。其中免疫学方法因其检测快捷，成本低廉是目前临床应用的主流方法。主流的免疫学方法主要是通过检测样本中与维生素B12结合的内因子蛋白的量来间接作为维生素B12的含量，而这种检测方法不能完全准确的体现样本中维生素B12的水平。
维生素B12在体内是与蛋白相结合存在的，所以不管是哪种检测方法，维生素B12的测定需要对样本进行前处理，使其从维生素B12从结合蛋白上释放出来再进行检测。释放出来的维生素B12不稳定，需要转化成CN-络合的氰钴胺素的稳定结构。目前常用的是将氰化钠或氰化钾作为样本前处理液，但氰化钠和氰化钾都是剧毒的化合物，不利于操作并且存在污染环境的可能。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种样本前处理剂、一种维生素B12定量检测试剂盒及使用方法，改变现有的反应原理设计，从而实现更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种样本前处理剂，包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ；预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物，预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇，预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ：每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾；预处理液Ⅱ：每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇；预处理液Ⅲ：每升水溶液中含有25g硼酸。
一种维生素B12定量检测试剂盒，包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物，所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品；
包被板的制备中，包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液，封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:(3800—4200)的比例混合得到酶结合物。
酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂是Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，
(a).样本前处理包括以下步骤，
(1)根据待测样本的量，取预处理液Ⅰ：预处理液Ⅱ＝1:1的体积比，混匀，为样本处理剂；
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管，并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本，分别加入50μL的样本处理剂，混匀，室温18-23℃孵育15min；
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ，混匀，室温反应5min；
(b).实验操作包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
本试剂盒基于酶免免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。与已上市的检测试剂盒相比，本试剂盒采用固相化维生素B12抗原，酶标记抗维生素B12抗体的反应方式；并优化样本前处理剂配方，添加了强碱、CN根、二硫苏糖醇(DTT)。另外本试剂盒采用一步法反应，将辣根过氧化物酶直接偶联在抗维生素B12抗体上，减少反应时间和简化操作步骤。
附图说明
图1是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种样本前处理剂，包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ；预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物，预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇，预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ：每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾；预处理液Ⅱ：每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇；预处理液Ⅲ：每升水溶液中含有25g硼酸。
一种维生素B12定量检测试剂盒，包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物，所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品；
包被板的制备中，包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液，封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:(3800—4200)的比例混合得到酶结合物。
酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂是Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，
(a).样本前处理包括以下步骤，
(1)根据待测样本的量，取预处理液Ⅰ：预处理液Ⅱ＝1:1的体积比，混匀，为样本处理剂；
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管，并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本，分别加入50μL的样本处理剂，混匀，室温18-23℃孵育15min；
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ，混匀，室温反应5min；
(b).实验操作包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品，均为市场上普通所售产品。所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
维生素B12定量检测试剂盒的制备
1、包被板的制备
包被液为0.0.5M碳酸盐缓冲液(pH9.5)，按照1μg/mL将VB12-BSA(杭州博岳生物B1012)加入到包被液中，所用的封闭液是含有牛血清白蛋白(BSA)的Tris-HCl(pH7.4)，其按照常规的方法进行包被抗原的制备。
(1)包被液的制备：取1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3，溶于900mL纯化水中，用6MHCl调pH至9.5，定容至1000mL制得包被液；
(2)封闭液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL，得溶液A；然后在一部分溶液A中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和100g蔗糖，然后通过加入溶液A的方式定容至1000ml制得封闭液。
Na2CO3、NaHCO3、Tris、NaCl、BSA、纯化水、蔗糖、Proclin300分别为分析纯。
2、样本前处理剂的配制
样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ；预处理液Ⅰ包括使结合蛋白变性的氢氧化钠和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物六氰合铁酸钾，预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇，预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
预处理液Ⅰ的制备：取20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中，然后定容至1000mL；
预处理液Ⅱ：取3g二硫苏糖醇、15g硼酸、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中，然后定容至1000mL；
预处理液Ⅲ：取25g硼酸、5g抗坏血酸、Tween20(吐温20)2ml、Proclin300 1ml溶于900mL纯化水中，然后定容至1000mL。
氢氧化钠、六氰合铁酸钾、二硫苏糖醇、硼酸、抗坏血酸、Tween20、纯化水、Proclin300分别为分析纯。
3、本发明酶结合物的配制
缓冲液采用Tris-NaCl缓冲液，保护蛋白采用牛血清白蛋白，防腐剂采用Proclin 300。
(1)酶结合物的稀释液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL，得Tris-NaCl缓冲液；然后在一部分Tris-NaCl缓冲液中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和100g蔗糖，然后通过加入Tris-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml，制得酶结合物的稀释液。
(2)将HRP标记的抗维生素B12抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:4000的比例混合，得到的即为酶结合物。HRP标记的抗维生素B12抗体的来源及型号是fitzgerald-fii20-VR28。
Tris、NaCl、BSA、纯化水、蔗糖、Proclin300分别为分析纯。
4、校准品的配制
校准品的稀释液采用Tris-NaCl缓冲液，在缓冲液中加入保护蛋白Casein、防腐剂Proclin 300、抗环血酸、Tween20(吐温20)、庆大霉素、Proclin300。
(1)Tris-NaCl缓冲液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL，得Tris-NaCl缓冲液；
(2)稀释液的制备:在一部分Tris-NaCl缓冲液中加入30g Casein、10g的抗环血酸、1ml的Tween20、5g庆大霉素、1ml的Proclin 300，然后通过加入Tris-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml，制得校准品的稀释液；
(3)校准品的制备：将维生素B12抗原用该稀释液进行稀释，配制成0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL六个浓度的校准品。
Tris、NaCl、Casein、纯化水、抗环血酸、Tween20、庆大霉素、Proclin300分别为分析纯。维生素B12抗原的来源及型号是sigma V2876。
5、其他通用试剂组分：底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
6、试验过程
(a).样本前处理包括以下步骤，
(1)根据待测样本的量，取预处理液Ⅰ：预处理液Ⅱ＝1:1的体积比，混匀，为样本处理剂；
(2)取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管，并进行编号。用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本，分别加入50μL的样本处理剂，混匀，室温18-23℃孵育15min；
(3)再分别加入50μL的预处理液Ⅲ，混匀，室温反应5min；
(b).实验操作包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
(c)结果计算
(1)酶标仪检测：选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2)计算：本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式，即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴)，以标准品OD值为纵坐标(Y轴)，建立点到点标准曲线，从而根据曲线计算待测样本维生素B12的含量。
计算示例数据如下表表1。
表1
Figure BDA0002420194820000061
(d)本发明试剂盒临床验证
为了验证本发明维生素B12定量检测试剂盒与对比厂家Roche结果的一致性，共收集95例血清样本进行平行检测，检测结果进行临床相关性分析，结果如下表表2，根据表中数据制得相关性参考图如图1。
Figure BDA0002420194820000062
Figure BDA0002420194820000071
从图1显示比对结果表明，本发明试剂盒与对比试剂盒的现行相关R2为0.9391，证明本发明试剂盒与对比试剂盒间相关性较好。
本发明试剂盒采用直接检测样本中维生素B12的方法，更能准确展示样本中的维生素B12的含量。本发明采用氰氢根离子的络合物作为变性剂的有效成分，减弱引入氰氢根离子的毒性。另外本发明采用一步法反应，将辣根过氧化物酶直接偶联在抗维生素B12抗体上，减少反应时间和简化操作步骤，实现更方便快捷的操作方法，也更符合临床操作使用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种样本前处理剂，其特征在于：包括强碱、CN-1、二硫苏糖醇、硼酸。
2.根据权利要求1所述的样本前处理剂，其特征在于：强碱为氢氧化钠、强氧化钾之中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的样本前处理剂，其特征在于：样本前处理剂包括预处理液Ⅰ、预处理液Ⅱ、预处理液Ⅲ；预处理液Ⅰ包括强碱和使解离的VB12转化成稳定结构的氰根离子络合物，预处理液Ⅱ包括使结合蛋白与VB12解离的二硫苏糖醇，预处理液Ⅲ为含有硼酸的溶液。
4.根据权利要求3所述的样本前处理剂，其特征在于：预处理液Ⅰ：每升水溶液中含有20g氢氧化钠、0.06g六氰合铁酸钾；预处理液Ⅱ：每升水溶液中含有3g二硫苏糖醇；预处理液Ⅲ：每升水溶液中含有25g硼酸。
5.一种维生素B12定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被有VB12-BSA的包被板、酶标记的抗VB12抗体的酶结合物，如权利要求1-4任一权利要求所述的样本前处理剂、包含维生素B12抗原的校准品。
6.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒，其特征在于：包被板的制备中，包被液为0.0.5M pH9.5的碳酸盐缓冲液，封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl。
7.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒，其特征在于：酶标记的抗VB12单克隆抗体与酶结合物的稀释液按体积比1:（3800—4200）的比例混合得到酶结合物。
8.根据权利要求7所述的维生素B12定量检测试剂盒，其特征在于：酶结合物的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白是小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂是Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的维生素B12定量检测试剂盒，其特征在于：包含维生素B12抗原的校准品分别为包含0pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；包含维生素B12抗原的校准品溶液中还包括抗坏血酸、吐温20、庆大霉素。
10.根据权利要求5-9任一权利要求所述的维生素B12定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤，
（a）.样本前处理包括以下步骤，
（1）根据待测样本的量，取预处理液Ⅰ：预处理液Ⅱ=1:1的体积比，混匀，为样本处理剂；
（2）取出一定量的聚乙烯离心管或者玻璃管，并进行编号；
用微量移液器依次加入25μL校准品及待测样本，分别加入50μL的样本处理剂，混匀，室温18-23℃孵育15min；
（3）再分别加入50μL的预处理液Ⅲ，混匀，室温反应5min；
（b）.实验操作包括以下步骤，
（1）加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50µl校准品及待测样本，然后分别加入50µl系统反应液，再加入酶结合物50µl；
（2）温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
（3）洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
（4）显色：每包被孔加底物液100µl，18-23℃下避光反应20分钟；
（5）终止：每包被孔加终止液50µl，终止反应。
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