CN109613243A - 一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种完全均相测定髓过氧化物酶(MPO)的检测试剂盒及检测方法。本发明完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒，包括试剂1、试剂2、触发剂；试剂1包括0.5μg/mL‑2μg/mL的吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体；试剂2包括0.05μg/mL‑0.3μg/mL的HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体、0.01％‑0.5％的氧化酶。本发明还提供一种基于该试剂盒的完全均相测定髓过氧化物酶(MPO)的检测方法。本发明的检测试剂盒及检测方法灵敏度高、准确度好，无需包被，无需洗涤分离，反应时间明显缩短，操作更加简便，结合仪器检测能够满足临床检测要求。

Description

一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种完全均相测定髓过氧化物酶的化学发光检测试剂盒及检测方法。
背景技术
髓过氧化物酶(MPO)是一种过氧化物酶超家族亚铁血红素酶，相对分子量为150KD，主要存在于中性粒细胞内，是中性粒细胞活化的标志物。在生理状态下，MPO与H2O2反应最终生成HOCl，HOCl可以与一些氨基酸反应生成氯胺(NH2Cl)，NH2Cl有很强的抗微生物作用，提高自身免疫力，在机体防御中发挥着重要的作用。但机体过多的HOCl会氧化人体内的脂质、蛋白和DNA等，从而对机体造成损伤。其中最主要的影响就是引起动脉粥样硬化(AS)。研究发现MPO催化的产物HOCl氧化LDL最终导致泡沫细胞的形成。可以通过与NO合成酶反应导致NO的合成减少，导致血管舒张功能受损。还能引起斑块的不稳定，最终导致血栓的形成。在2015中国研究型医院高峰论坛中也提出了髓过氧化物酶这一话题，并且突出和强调了这一物质在心脑血管当中的前瞻性和重要性。在AS的监测过程中发现，MPO的敏感性远高于cTnI，因此MPO有望成为心血管疾病尤其是冠心病的诊断和预后新的标志物。
目前，检测MPO主要采用的方法有连续监测法、酶联免疫吸附法(ELISA)和流式细胞仪测定法等。连续监测法易受其他过氧化物酶(例如嗜酸性粒细胞过氧化物酶)和某些血红素蛋白(例如血红蛋白、肌红蛋白)的干扰。酶联免疫吸附法灵敏度不高，测定时间长，难以实现全自动化检测。流式细胞仪测定法技术程序比较复杂，需使用特殊仪器。相对于以上方法，化学发光法具有明显的优势，具有精确度高，无污染，检测速度快等优势。但目前还未开发MPO的化学发光检测方法，且传统的化学发光本身存在一些缺陷，需要包被、洗涤分离，操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种完全均相测定髓过氧化物酶的化学发光检测试剂盒及其方法，该试剂盒属于化学发光法，具有化学发光检测方法的优势，同时无需包被，无需洗涤分离，反应快速，操作简便。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1、试剂2、触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体1；试剂2包括HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2、氧化酶。
在一种实施方式中，所述试剂1和所述试剂2包括缓冲液；所述缓冲液是pH6.0-8.0、5mM-100mM的PBS缓冲液。优选pH6.8-7.8、20mM-80mM的PBS缓冲液；进一步优选20mM-60mM的PBS缓冲液；再进一步优选20mM-40mM的PBS缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂1包括0.5μg/mL-2μg/mL吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体1、0.02％-0.2％硫代硫酸钠；优选0.8μg/mL-1.5μg/mL吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体1、0.05％-0.12％硫代硫酸钠。
进一步的，所述试剂1还包括：0.1％-1％BSA、0.1％-1％甘露醇、0.04％-0.1％ProClin 300。在一些实施方式中，所述试剂1优选包括：0.2％-0.8％BSA或0.3％-0.6％BSA、0.2％-0.8％甘露醇或0.3％-0.6％甘露醇、0.05％-0.08％ProClin 300。
进一步的，所述试剂1包括30mM pH7.6PBS缓冲液、1μg/mL吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体1、0.1％硫代硫酸钠、0.5％BSA、0.4％甘露醇和0.05％ProClin300。试剂中硫代硫酸钠是为防止吖啶酯被氧化，甘露醇和BSA对抗体具有一定的保护作用。各组分是组合起来发挥作用，有效地提高了试剂稳定性和信噪比。
在一些实施例中，所述试剂2包括0.05μg/mL-0.3μg/mL HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2、0.02％-0.1％VC或0.02-0.1％还原型谷胱甘肽、0.01％-0.05％EC Oxyrase；优选0.1μg/mL-0.2μg/mL HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2、0.04％-0.08％VC或0.04-0.08％还原型谷胱甘肽，0.02％-0.04％EC Oxyrase。
进一步的，所述试剂2还包括0.2％-1.5％甘露醇，0.1％-1％聚乙二醇20000，0.01％-0.2％酶稳定剂，0.04％-0.1％ProClin 300。在一些实施方式中，可以是0.5％-1％甘露醇；0.2％-0.8％聚乙二醇20000或0.4％-0.6％聚乙二醇20000；0.05％-0.15％酶稳定剂；0.05％-0.08％ProClin 300。
进一步的，试剂2包括30mM pH7.6PBS缓冲液、0.15μg/mL HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2、0.05％VC或0.05％还原型谷胱甘肽、0.03％EC Oxyrase、0.5％的甘露醇、0.5％聚乙二醇20000，0.1％酶稳定剂，0.05％ProClin 300。试剂中各组分是组合起来发挥作用，VC可以防止自由基传递到相邻的抗原抗体符合物种，有效地降低了本底；EC Oxyrase可以除掉溶剂中氧，保护VC不被氧化，提高试剂的稳定性；多元醇及酶稳定剂保护HRP标记抗体的稳定性。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括校准品；所述校准品由冻干保护液稀释后真空冷冻干燥；所述校准品包括50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和800ng/mL的MPO抗原、10mM-100mM的PB缓冲液(磷酸盐缓冲液)、0.1％-2％BSA、0.2％-2％聚乙二醇20000、0.1％-1％甘氨酸、0.1％-1％甘露醇、0.04％-0.1％的ProClin300。在一些实施方式中，优选可以是20mM-80mM PB缓冲液或40mM-60mM PB缓冲液、0.2％-1.5％BSA或0.5％-1％BSA、0.2％-1.5％聚乙二醇20000或0.5％-1％聚乙二醇20000、0.2％-0.8％甘氨酸或0.4％-0.6％甘氨酸、0.2％-0.8％甘露醇或0.4％-0.6％甘露醇、0.05％-0.08％ProClin300。
在一些实施方式中，所述校准品包括50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和800ng/mL的MPO抗原、20mM PB缓冲液、0.5％BSA、1％聚乙二醇20000、0.5％甘氨酸、0.5％甘露醇、0.04％-01％的ProClin300。校准品中各组分是组合起来发挥作用，能够保护MPO的稳定性，提高检测试剂结果的可靠性。
在一些实施方式中，所述触发剂包括H2O2和对羟基肉桂酸。
一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测方法，操作方法包括步骤：
(1)加入样品、试剂1和试剂2，混匀后孵育；
(2)加入触发剂后立即检测1-3s(优选2s)内的发光值，计算检测时间内曲线下的峰面积(AUC)。
进一步的，所述检测方法中样品：试剂1：试剂2：触发剂的体积比为1：8：8：15。
本发明有益效果：
本发明检测试剂盒属于完全均相反应，无需包被，无需洗涤分离，孵育时间仅为15min，与现有方法相比反应时间明显缩短，操作更加简便。
本发明试剂盒利用吖啶酯标记抗髓过氧化物酶抗体1、抗原、辣根过氧化物酶标记抗髓过氧化物酶抗体2形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，加入触发剂后立即连续检测一段时间(通常是1-3s)，计算其峰面积，髓过氧化物酶的含量与其峰面积成正相关。其检测原理为辣根过氧化物酶氧化试剂底物中的过氧化氢可产生自由基，自由基随即氧化抗人髓过氧化物酶抗体上的吖啶酯，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内中扩散，故只有形成抗体-抗原-抗体复合物才能反应反光。
本发明的校准品保护液能够有效地保护MPO抗原的活性，提高MPO抗原的稳定性，确保检测结果的准确性。
本发明在试剂1添加抗氧化剂对吖啶酯有一定保护作用，提高试剂1的稳定性；试剂2中添加抗氧化剂可以明显降低本底，确保检测结果的准确性，同时加入氧化酶去除溶液中的氧化性物质提高了抗氧化剂的稳定性，增强了试剂2的稳定性。
附图说明
图1为校准曲线图，其中X轴表示峰面积，Y轴表示髓过氧化物酶浓度值；
图2为本发明实施例2试剂与深对比试剂盒(酶联免疫吸附法)的相关性对比图，其中X轴表示对比试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是本发明试剂盒测定的血清结果。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1、髓过氧化物酶校准品的制备
根据表1本发明校准品的基质液配方进行配制
表1准品的基质液配方
配制校准品基质液，用此基质液将髓过氧化物酶抗原稀释成相应浓度的校准品，浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和800ng/mL(S1-S5)，分装成0.5mL/瓶，真空冷冻干燥。校准品基质液为S0(0ng/mL)。校准品可以溯源到深圳海格德生产的人髓过氧化物酶测定试剂盒(酶联免疫法)(以下简称对比试剂盒)，注册证号：粤械注准20162400868。
实施例2、吖啶酯标记抗髓过氧化物酶抗1体制备
取250μg抗髓过氧化物酶抗体1(先用20mM PBS稀释到1mg/mL)，加入40μL的吖啶酯，加710μL的20mM PBS。在旋转仪上室温孵育1h即可。再用缓冲液(30mM pH7.6PBS缓冲液、0.1％硫代硫酸钠、0.5％BSA、0.4％甘露醇和0.05％ProClin300)稀释到工作浓度。
依此方法，制备了包括0.5μg/mL、1μg/mL和2μg/mL吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体1的试剂1。经过试验发现，吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体的不同浓度仅导致发光值高低差异，对检测结果并无显著影响。
实施例3、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B抗体制备
利用商品化HRP标记试剂盒标记抗髓过氧化物酶抗体2抗体，再用标记物缓冲液(30mM pH7.6PBS缓冲液、0.05％VC或0.05％还原型谷胱甘肽、0.03％EC Oxyrase、0.5％的甘露醇、0.5％聚乙二醇2000020000，0.1％的酶稳定剂，0.05％ProClin 300。)稀释到工作浓度。
依此方法，制备了包括0.05μg/mL、0.15μg/mL和0.3μg/mL HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2的试剂2。HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体2的不同浓度仅导致发光值高低差异，对检测结果并无显著影响。
实施例4、一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒性能测试
采用全自动化学发光仪免疫分析仪扫描读取试剂盒的校准信息，通过使用校S1-S5校正该项目的校准主曲线，校准检测系统。
检测方法：加入5μL样品，试剂1和试剂2各40μL，混匀后37℃孵育15min，加入触发剂75μL后立即检测2s内的发光值，计算2s内曲线下的峰面积(AUC)，绘制得到校准曲线图见图1。
1.检测试剂灵敏度
检测试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的峰面积，计算其平均值M和标准差SD，计算出M+2SD所对应的峰面积值(表2)，根据0浓度校准品与50ng/mL相邻浓度校准品之间的浓度-峰面积结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。结果如表2，本发明的检测试剂盒的灵敏度为0.88ng/mL。
表2检测试剂灵敏度结果
2.试剂盒的重复性实验
检测两个浓度水平的质控样本，各重复10次，计算变异系数(CV)，分别计算每个质控样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。结果如表3。
表3试剂盒重复性实验结果
3.本发明试剂盒的线性实验
将接近线性范围上限的高值样品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样品须接近线性范围的下限，每一浓度的样本均重复测定3次，计算其平均值，用线性回归方法计算结果平均值和对应浓度的相关系数r。以下表格中三个批次实验结果表明本发明试剂可直接检测的样本浓度为：本试剂盒在50-800ng/mL范围内，线性相关系数R为0.9996。结果如表4。
表4试剂盒线性实验结果
4.试剂盒的方法学比对实验
使用本发明试剂盒和对比试剂盒(深圳海格德生产的人髓过氧化物酶测定试剂盒(酶联免疫法)，注册证号：粤械注准20162400868)分别采用全自动发光免疫分析仪对40份新鲜人血清按各自的参数同时进行测定，对测定值进行相关性回归分析，测定结果见图2。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R2＝0.9993，回归方程y＝1.01x-4.2413。结果表明本试剂与已上市对比试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
5.抗干扰实验
取新鲜混合血清，分成5等份，按照下表5加入相应的干扰物质，取本发明试剂盒测定血清中髓过氧化物酶的含量，测定结果如表5所示。
相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物样本的测定均值)/无干扰物样本的测定均值×100％。
表6结果表示，本发明试剂盒不受黄疸(胆红素＜30mg/dL)、脂血(甘油三酯＜2000mg/dL)、溶血(血红蛋白＜1000mg/dL)和生物素＜60mg/L的干扰，说明本发明试剂盒的抗干扰能力较强。
表5干扰物质浓度
表6测定结果
实施例5：检测试剂中不同组分对性能影响
1.试剂1中硫代硫酸钠对试剂1稳定性影响
配制试剂1时不添加硫代硫酸钠，其它成分不变，考察试剂1在37℃放置14天及4℃放置60天后与第0天相比各浓度校准品的峰面积保留率。结果如表7。
表7硫代硫酸钠对试剂R1的稳定性
吖啶酯容易被氧化，添加硫代硫酸钠可以消耗溶液中的氧化型物质，可以保护吖啶酯，从而提高试剂1的稳定性，同时还发现添加硫代硫酸钠可以获得更好的峰型。
2.硫代硫酸钠浓度对试剂1稳定性的影响
分别选用含硫代硫酸钠0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％的缓冲液配制试剂1，其它成分不变，考察不同硫代硫酸钠浓度的试剂1在37℃放置14天与第0天相比相比各浓度校准品的峰面积保留率，结果如表8。
表8不同浓度硫代硫酸钠对试剂R1热稳定性的影响
硫代硫酸钠的浓度增加试剂1的热稳定越好，当浓度为0.1％-0.2％时各浓度校准品的保留率均在95％左右，无明显差异。比较信噪比发现当硫代硫酸钠浓度增加信噪比有下降趋势，故硫代硫酸钠的最佳浓度选为0.1％。
3.VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
配制试剂2时不添加VC或还原型谷胱甘肽，其它成分不变，检测本底S0的峰面积，结果如表9。
表9 VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
添加抗氧化剂VC或还原型谷胱甘肽能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，确保自由基只能在在抗原-抗体复合物的分子内传递，从而降低了本底，提高了检测结果的准确性。
4.VC或还原型谷胱甘肽浓度对本底影响
改变抗氧化剂(VC或还原型谷胱甘肽浓度)浓度，其它成分不变，检测本底如表10。
表10不同浓度VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
从表10可以看出当VC或还原型谷胱甘肽浓度大于0.05％时本底基本保持不变，故VC或还原型谷胱甘肽最佳浓度为0.05％。
5.EC Oxyrase对试剂2稳定性影响
配制试剂2时不添加EC Oxyrase，其它成分不变，将试剂2放置37℃1天和14天，检测本底S0的峰面积，结果如表11。
表11 EC Oxyrase对试剂2稳定性影响
如表11可知，添加EC Oxyrase的试剂2在37℃放置14天后的本底基本不变。ECOxyrase对VC和还原型谷胱甘肽有保护作用，提高试剂2的稳定性。
6.EC Oxyrase浓度对试剂2稳定性影响
配制不同浓度EC Oxyrase的试剂2，其它成分不变，将试剂2放置37℃14天后检测本底的变化率。结果如表12。
表12 EC Oxyrase浓度对试剂2稳定性影响
EC Oxyrase浓度 0.01％ 0.02％ 0.03％ 0.04％ 0.05％
S0变化率 14.28％ 5.89％ 3.98％ 3.73％ 3.69％
由表12可知，当EC Oxyrase浓度大于0.03％时S0的变化率在5％以内，故ECOxyrase最佳浓度选择0.03％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂1、试剂2、触发剂；试剂1包括0.5μg/mL-2μg/mL的吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体；试剂2包括0.05μg/mL-0.3μg/mL的HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体、0.01％-0.5％的氧化酶。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1还包括pH6.0-8.0的5mM-100mM的PBS缓冲液、0.02％-0.2％硫代硫酸钠、0.1％-1％BSA、0.1％-1％甘露醇和0.04％-0.1％ProClin 300。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括30mM pH7.6的PBS缓冲液、1μg/mL吖啶酯标记的抗髓过氧化物酶抗体、0.1％硫代硫酸钠、0.5％BSA、0.4％甘露醇和0.05％ProClin300。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2中的氧化酶为EC Oxyrase。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2还包括pH6.0-8.0的5mM-100mM的PBS缓冲液、0.02％-0.1％VC或0.02％-0.1％还原型谷胱甘肽、0.2％-1.5％甘露醇、0.1％-1％聚乙二醇20000、0.01％-0.2％酶稳定剂和0.04％-0.1％ProClin 300。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2包括30mM pH7.6的PBS缓冲液、0.15μg/mL HRP标记的抗髓过氧化物酶抗体、0.05％VC或0.05％还原型谷胱甘肽、0.03％EC Oxyrase、0.5％的甘露醇、0.5％聚乙二醇20000、0.1％酶稳定剂、0.05％ProClin300。
7.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述触发剂包括H2O2和对羟基肉桂酸。
8.如权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括MPO抗原、10mM-100mM的PB缓冲液、0.1％-2％BSA、0.2％-2％聚乙二醇20000、0.1％-1％甘氨酸、0.1％-1％甘露醇、0.04％-0.1％的ProClin300。
9.一种完全均相测定髓过氧化物酶的检测方法，其特征在于，操作方法包括步骤：
(1)加入样品、试剂1和试剂2，混匀后孵育；
(2)加入触发剂后立即检测1-3s内的发光值，计算检测时间内曲线下的峰面积(AUC)。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中样品：试剂1：试剂2：触发剂的体积比为1：8：8：15。
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