CN109613281A - 一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学检验领域，公开了一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法。所述检测试剂盒包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。本发明的试剂盒能够利用化学发光法实现完全均相测定氧化低密度脂蛋白，检测过程无需包被，无需洗涤分离，具有灵敏度高、准确度好、反应时间短的特点，结合仪器检测能够满足临床快速检测要求。

Description

一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验领域，具体涉及一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的化学发光检测试剂盒及其方法。
背景技术
天然的低密度脂蛋白(LDL)核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，其约占LDL总脂肪酸含量的35％-70％，LDL中的PUFAs在自由基或其他氧化剂作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的过氧化脂质，引起连锁的自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和载脂蛋白B(ApoB)发生结合，产生新的抗原决定簇，形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。
ox-LDL可以通过细胞毒性作用和化学趋化作用，影响血管平滑肌增殖，加速泡沫细胞形成，影响纤溶和凝血等机制促进动脉粥样硬化(As)的发生和发展。ox-LDL是As发生的强危险指标，并与冠心病的发生和发展密切相关。ox-LDL可致使巨噬细胞转化为泡沫细胞；As斑块中也可找到ox-LDL的存在。此外，ox-LDL可以转化为免疫原，诱发体内产生相应的抗体与ox-LDL形成抗原抗体复合物。ox-LDL由清道夫途径，在促进胆固醇的堆积和泡沫细胞形成的同时，释放出多种细胞因子等物质，这些物质可能破坏血管内皮细胞，诱导平滑肌细胞增殖，进一步加速As进程。
目前氧化低密度脂蛋白抗原多是通过硫酸铜氧化LDL得到，保存条件仅能在2-8℃，冷冻后有明显的降解，且有效期约为6个星期。部分校准品冻干复溶后2-8℃仅能保持一周的稳定性。校准品的不稳定性极大地影响到检测试剂的稳定性和结果的准确性。
目前氧化低密度脂蛋白常用的检测方法有：1)ELISA法，是目前测定ox-LDL特异性较好的检测方法；2)共轭双烯法，是一种较为广泛使用的反应LDL氧化易感性的检测方法；3)硫代巴比妥酸反应物化学测定法，该法基于化学原理测定ox-LDL；4)相对电泳迁移速率法，在脂质过氧化反应中，LDL上的卵磷脂在卵磷脂酶的作用下生成溶血卵磷脂和多聚不饱和脂肪酸，多聚不饱和脂肪酸在氧自由基的作用下生成脂质过氧化物，同时发生磷脂水解等反应使LDL结构发生变化，生成醛类物质与ApoB中的游离氨基结合导致其负电荷增加，表现在电泳迁移率加快；5)抗ox-LDL自身抗体测定法，通过检测抗ox-LDL自身抗体来间接反应ox-LDL水平。然而，目前的这些检测方法均存在灵敏度不高、操作复杂、反应时间长、检测结果不准确等缺点。
相对于以上方法，化学发光法具有明显的优势，具有精确度高，无污染，检测速度快等优势。但目前还未开发ox-LDL的化学发光检测方法，且传统的化学发光本身存在一些缺陷，如需要包被、洗涤分离，操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法，该试剂盒属于化学发光法，具有化学发光检测方法的优势，同时无需包被，无需洗涤分离，反应快速，操作简便。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。
本发明的检测试剂盒利用吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白抗体、抗原、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B(Apo B)抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，无需包被，加入触发剂后立即连续检测一段时间(通常是1-3s)，计算其峰面积，氧化低密度脂蛋白的含量与其峰面积成正相关。其检测原理为辣根过氧化物酶氧化触发剂中的过氧化氢和对羟基肉桂酸可产生自由基，自由基随即氧化抗氧化低密度脂蛋白抗体上的吖啶酯，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内中扩散，故只有形成抗体-抗原-抗体复合物才能反应发光。
本发明的检测试剂盒灵敏度高、准确度好、反应时间短，结合仪器检测能够满足临床大批量快速检测的需求。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1还包括还原剂1，所述还原剂1为硫代硫酸钠；所述试剂2还包括还原剂2和氧化酶，所述还原剂2为维生素C或还原型谷胱甘肽，所述氧化酶为EC氧化酶(EC Oxyrase)。硫代硫酸钠的作用是为防止吖啶酯被氧化，维生素C或还原型谷胱甘肽可以防止自由基传递到相邻的抗原抗体复合物，有效地降低了本底；EC Oxyrase可以除掉溶剂中氧，保护VC不被氧化，从而提高试剂的稳定性。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL和还原剂1 0.02-0.2w/v％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂2 0.02-0.1w/v％和氧化酶0.01-0.5w/v％。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL和还原剂1 0.1w/v％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂2 0.05w/v％和氧化酶0.03w/v％
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1还包括缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和防腐剂；所述试剂2还包括缓冲液、甘露醇、聚乙二醇、酶稳定剂和防腐剂；
所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL、还原剂1 0.02-0.2w/v％、BSA 0.1-1w/v％、甘露醇0.1-1w/v％和防腐剂0.04％-0.1％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂2 0.02-0.1w/v％、氧化酶0.01-0.5w/v％、甘露醇0.2-1.5w/v％、聚乙二醇20000 0.1-1w/v％、酶稳定剂0.01-0.2w/v％和防腐剂0.04-0.1w/v％。
甘露醇和BSA对抗体具有一定的保护作用，多元醇及酶稳定剂保护HRP标记抗体的稳定性；各组分联用有效地提高了试剂稳定性和信噪比。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL、还原剂1 0.1w/v％、BSA0.5w/v％、甘露醇0.5w/v％和防腐剂0.05％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂2 0.05w/v％、氧化酶0.03w/v％、甘露醇0.5w/v％、聚乙二醇200000.5w/v％、酶稳定剂0.1w/v％和防腐剂0.05w/v％。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述稳定剂包括BSA和聚乙二醇20000，所述氧化剂为硫酸铜。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品由氧化低密度脂蛋白抗原和冻干保护液经冷冻干燥后得到，所述冻干保护液包括稳定剂和氧化剂。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述冻干保护液还包括缓冲液和防腐剂，所述冻干保护液包括下述浓度的组分：缓冲液10-100mM、BSA 0.1-2w/v％、聚乙二醇20000 0.2-2w/v％、硫酸铜2-20μM和防腐剂0.04-0.1w/v％。
本发明采用ox-LDL抗原与含有BSA、聚乙二醇20000和硫酸铜的冻干保护液经冻干获得的校准品，冻干保护液中的组分能够有效地保护ox-LDL抗原的活性，提高ox-LDL抗原的稳定性，从而确保检测结果的准确性。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述冻干保护液包括下述浓度的组分：缓冲液20mM、BSA 0.5w/v％、聚乙二醇20000 1w/v％、硫酸铜10μM和防腐剂0.04-0.1w/v％，所述校准品由氧化低密度脂蛋白抗原和冻干保护液按照1～16U:1L的比例稀释经冷冻干燥后得到。
本发明的校准品采用ox-LDL抗原与冻干保护液经冷冻干燥获得，能够有效地保护ox-LDL抗原的活性，提高ox-LDL抗原的稳定性，确保检测结果的准确性。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述缓冲液为PBS缓冲液，pH值为6.0～8.0。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述PBS缓冲液的pH值为7.6。
作为本发明所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述防腐剂为ProClin300。
本发明还提供了上述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的检测方法，在待测样本中加入试剂1和试剂2，混合均匀后37℃孵育5～30min，加入触发剂，立即测定最终反应物的发光值，计算待测样本中氧化低密度脂蛋白的含量，其中，待测样本、试剂1、试剂2和触发剂的体积比为1:8:8:15。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种完全均相测定血液中氧化低密度脂蛋白含量的试剂盒，抗原抗体能够反应充分，提高了抗体的利用率，降低了试剂盒的成本。
2、本试剂盒相比以往的化学发光法，抗原抗体无需固定于固相载体，从而没有改变抗体的空间结构，使抗体结合表位充分暴露，保留最强的特异性。使本发明具有更高的灵敏度和准确度。
3、本试剂盒相比以往的化学发光法，无需经过包被及固定抗体的过程，产品生产时间上大大缩短，从而保证抗原抗体活性不受影响。保证了检测具有更好的重复性。
4、本发明在检测过程中不需要洗涤过程，不需要大量的洗涤液并减少了废弃物的排放，更利于临床上使用及其对废弃物的处理。
5、本发明的冻干保护液结合真空冷冻干燥技术提高了试剂盒中校准品的稳定性，保证检测结果的准确性。
6、本发明中通过试剂R1和试剂R2中各个组分的选择，特别是试剂中抗氧化剂及氧化酶的存在，不仅使本发明试剂盒在使用中信号背景大大降低，而且保证了检测试剂的稳定性；试剂盒的灵敏度、准确性和重复性显著增加。
附图说明
图1为采用实施例4和实施例5组成的试剂盒测定得到的标准曲线图，其中X轴表示峰面积，Y轴表示氧化低密度脂蛋白浓度值；
图2为实施例4和实施例5组成的试剂盒与Mercodia AB生产的氧化低密度脂蛋白检测试剂盒(酶联免疫吸附法)的相关性对比图，其中X轴表示Mercodia AB试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是本发明试剂盒测定的血清结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例涉及的抗氧化低密度脂蛋白抗体和HRP标记试剂盒标记抗载脂蛋白B抗体购自BioPorto Diagnostics A/S(ANTIBODYSHOP)。
实施例1、氧化低密度脂蛋白校准品的制备
本发明氧化低密度脂蛋白校准品的冻干保护液包括以下浓度的组分：
根据上述比例配制校准品的冻干保护液，用此冻干保护液将氧化低密度脂蛋白抗原稀释成相应浓度的校准品，浓度分别为1U/L、2U/L、6U/L、10U/L和16U/L(S1-S5)，分装成0.5mL/瓶，真空冷冻干燥。校准品稀释液为S0(0U/L)。校准品可以溯源到Mercodia生产的氧化低密度脂蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)(以下简称对比试剂盒)，注册证号：国械注进20162402874。
实施例2、氧化低密度脂蛋白校准品的制备
本实施例的氧化低密度脂蛋白校准品与实施例1相比，添加10μM的CuSO4，其它成分及操作不变。
实施例3、冻干校准品稳定性考察
取实施例1和实施例2各浓度校准品瓶放置37℃考察14天热稳定性，同时取各浓度校准品1瓶用0.5mL纯化水复溶后放置2-8℃，考察复溶后30天稳定性。以20mM PBS稀释ox-LDL抗原作为对照组。用对比试剂盒测定第0天和稳定性末各校准品的浓度，按照说明书进行操作，计算保留率。结果如表1所示。
表1实施例1～2和对照组的校准品的14天热稳定性和30天稳定性结果
由表1可知，对照组的ox-LDL热稳定性和复溶稳定性明显比实施例1和实施例2差；实施例2中添加CuSO4后的热稳定性和复溶稳定性的保留率明显提高。由此可见，本发明能够保证校准品的稳定性，确保测定结果的可靠性。
实施例4、吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白抗体制备
取250μg抗氧化低密度脂蛋白抗体(先用20mM PBS稀释到1mg/mL)，加入40μL的吖啶酯，加710μL的20mM PBS，在旋转仪上室温孵育1h即可；再用标记物缓冲液稀释到工作浓度，所述标记物缓冲液包括以下浓度组分：30mM pH 7.6PBS缓冲液、0.1w/v％硫代硫酸钠、0.5w/v％BSA、0.4w/v％甘露醇和0.05w/v％ProClin300。
依此方法，制备了包括浓度分别为1μg/mL、3μg/mL和5μg/mL吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白抗体的试剂1。经过试验发现，吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体的不同浓度仅导致发光值高低差异，对检测结果并无显著影响。
实施例5、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B抗体制备
利用商品化HRP标记试剂盒标记抗载脂蛋白B抗体，再用标记物缓冲液稀释到工作浓度，该标记物缓冲液包括以下浓度组分：30mM pH 7.6PBS缓冲液、0.05w/v％VC或0.05w/v％还原型谷胱甘肽、0.03w/v％EC Oxyrase、0.5w/v％的甘露醇、0.5w/v％聚乙二醇20000，0.1w/v％的酶稳定剂，0.05w/v％ProClin30。
依此方法，制备了包括浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL和2μg/mL HRP标记抗Apo B抗体的试剂2。经过试验发现，HRP标记的抗Apo B抗体的不同浓度仅导致发光值高低差异，对检测结果并无显著影响。
实施例6、一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒性能测试
采用全自动化学发光仪免疫分析仪扫描读取试剂盒的校准信息，通过使用校准品S1-S5校正该项目的校准主曲线，校准检测系统。
检测方法：加入5μL待测样本，试剂1和试剂2各40μL，混匀后37℃孵育15min，加入75μL触发剂(过氧化氢和对羟基肉桂酸)后立即检测2s内的发光值，计算2s内曲线下的峰面积(AUC)。本实施例可采用全自动化学发光免疫分析仪检测反应产物的发光值，例如：进德HomoG100。
1.检测试剂灵敏度
检测试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的峰面积，计算其平均值M和标准差SD，计算出M+2SD所对应的峰面积值，根据零浓度校准品与1U/L相邻浓度校准品之间的浓度-峰面积结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。结果如表2。
表2检测试剂灵敏度结果
2.试剂盒的重复性实验
检测两个浓度水平的质控样本，各重复10次，计算变异系数(CV)，分别计算每个质控样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。结果如表3。
表3试剂盒重复性实验结果
测定次数 质控1(U/L) 质控2(U/L)
1 6.00 10.20
2 6.05 10.02
3 6.06 9.95
4 5.97 10.17
5 5.88 10.28
6 5.86 10.00
7 5.82 9.76
8 6.02 10.15
9 5.83 10.26
10 5.87 10.02
M 5.94 10.08
SD 0.09 0.16
CV 1.57％ 1.6％
3.本发明试剂盒的线性实验
将接近线性范围上限的高值样品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样品须接近线性范围的下限，每一浓度的样本均重复测定3次，计算其平均值，用线性回归方法计算结果平均值和对应浓度的相关系数r。以下表格中三个批次实验结果表明本发明试剂可直接检测的样本浓度为：本试剂盒在1-16U/L范围内，线性相关系数R为0.9996，结果如表4。
表4试剂盒线性实验结果
4.试剂盒的方法学比对实验
使用本发明试剂盒和对比试剂盒分别采用全自动发光免疫分析仪对40份新鲜人血清按各自的参数同时进行测定(本发明试剂盒检测前需将样本稀释10倍，对比试剂盒检测前需将样本稀释6561倍)，对测定值进行相关性回归分析，测定结果见图2。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R2＝0.9999，回归方程y＝1.0118x-0.0121。结果表明本试剂与已上市对比试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
5.试剂盒的特异性实验
检测浓度为200mg/dL极低密度脂蛋白，200mg/dL低密度脂蛋白，60mg/dL高密度脂蛋白。具体结果如表5所示，交叉验证结果均＜1U/L，说明本试剂盒具有很高的特异性。
表5试剂盒交叉反应结果
6.抗干扰实验
取新鲜混合血清，分成5等份，按照下表6加入相应的干扰物质，取本发明试剂盒测定血清中氧化低密度脂蛋白的含量，测定结果如表7所示。
相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物样本的测定均值)/无干扰物样本的测定均值×100％。
表6干扰物质浓度
表7测定结果
表7结果表明，本发明试剂盒不受黄疸(胆红素＜30mg/dL)、脂血(甘油三酯＜2000mg/dL)、溶血(血红蛋白＜1000mg/dL)和生物素＜60mg/L的干扰，说明本发明试剂盒的抗干扰能力较强。
实施例7：检测试剂中不同组分对性能影响
1.试剂1中硫代硫酸钠对试剂1稳定性影响
配制试剂1时不添加硫代硫酸钠，其它成分不变，考察试剂1在37℃放置14天及4℃放置60天后与第0天相比各浓度校准品的峰面积保留率。结果如表8。
表8硫代硫酸钠对试剂R1的稳定性
吖啶酯容易被氧化，添加硫代硫酸钠可以消耗溶液中的氧化型物质，可以保护吖啶酯，从而提高试剂1的稳定性，同时还发现添加硫代硫酸钠可以获得更好的峰型。
2.硫代硫酸钠浓度对试剂1稳定性的影响
分别选用含硫代硫酸钠0.02w/v％、0.05w/v％、0.1w/v％、0.15w/v％、0.2w/v％的缓冲液配制试剂1，其它成分不变，考察不同硫代硫酸钠浓度的试剂1在37℃放置14天与第0天相比相比，各浓度校准品的峰面积保留率，结果如表9。
表9不同浓度硫代硫酸钠对试剂R1热稳定性的影响
随着硫代硫酸钠的浓度增加，试剂1的热稳定越好，当浓度为0.1-0.2w/v％时各浓度校准品的保留率均在95％左右，无明显差异。比较信噪比发现，当硫代硫酸钠浓度增加信噪比有下降趋势，故硫代硫酸钠的最佳浓度选为0.1w/v％。
3.VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
配制试剂2时不添加VC或还原型谷胱甘肽，其它成分不变，检测本底S0的峰面积，结果如表10。
表10VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
添加抗氧化剂VC或还原型谷胱甘肽能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，确保自由基只能在在抗原-抗体复合物的分子内传递，从而降低了本底，提高了检测结果的准确性。
4.VC或还原型谷胱甘肽浓度对本底影响
改变抗氧化剂(VC或还原型谷胱甘肽浓度)浓度，其它成分不变，检测本底如表11。
表11不同浓度VC或还原型谷胱甘肽对本底影响
从表11可以看出当VC或还原型谷胱甘肽浓度大于0.05w/v％时本底基本保持不变，故VC或还原型谷胱甘肽最佳浓度为0.05w/v％。
5.EC Oxyrase对试剂2稳定性影响
配制试剂2时不添加EC Oxyrase，其它成分不变，将试剂2放置37℃1天和14天，检测本底S0的峰面积，结果如表12。
表12EC Oxyrase对试剂2稳定性影响
有表12可知，添加EC Oxyrase的试剂2在37℃放置14天后的本底基本不变。ECOxyrase对VC和还原型谷胱甘肽有保护作用，提高试剂2的稳定性。
6.EC Oxyrase浓度对试剂2稳定性影响
配制不同浓度EC Oxyrase的试剂2，其它成分不变，将试剂2放置37℃14天后检测本底的变化率。结果如表13。
表13EC Oxyrase浓度对试剂2稳定性影响
EC Oxyrase浓度 0.01w/v％ 0.02w/v％ 0.03w/v％ 0.04w/v％ 0.05w/v％
S0变化率 15.36％ 6.35％ 4.27％ 4.18％ 4.23％
由表13可知，当EC Oxyrase浓度大于0.03w/v％时S0的变化率在5％以内，故ECOxyrase最佳浓度选择0.03w/v％。
由此可见，本发明检测试剂盒利用吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白抗体、抗原、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，属于完全均相反应，检测过程无需包被，无需洗涤分离，具有灵敏度高、准确度好、反应时间短的优点。
经过试验发现，本发明采用的检测试剂盒配方可以根据实际使用需要进行适当调整，所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL、还原剂1 0.02-0.2w/v％、BSA 0.1-1w/v％、甘露醇0.1-1w/v％和防腐剂0.04％-0.1％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂2 0.02-0.1w/v％、氧化酶0.01-0.5w/v％、甘露醇0.2-1.5w/v％、聚乙二醇20000 0.1-1w/v％、酶稳定剂0.01-0.2w/v％和防腐剂0.04-0.1w/v％。
本发明中采用的冻干保护液也可以根据实际需要调整配方，包括下述浓度的组分：缓冲液10-100mM、BSA 0.1-2w/v％、聚乙二醇20000 0.2-2w/v％、硫酸铜2-20μM和防腐剂0.04-0.1w/v％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。
2.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1还包括还原剂1，所述还原剂1为硫代硫酸钠；所述试剂2还包括还原剂2和氧化酶，所述还原剂2为维生素C或还原型谷胱甘肽，所述氧化酶为EC氧化酶。
3.根据权利要求2所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL和还原剂1 0.02-0.2w/v％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂2 0.02-0.1w/v％和EC氧化酶0.01-0.5w/v％；
优选地，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL和还原剂1 0.1w/v％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂2 0.05w/v％和氧化酶0.03w/v％。
4.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1还包括缓冲液、牛血清白蛋白、甘露醇和防腐剂；所述试剂2还包括缓冲液、甘露醇、聚乙二醇、酶稳定剂和防腐剂；
所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL、还原剂1 0.02-0.2w/v％、牛血清白蛋白0.1-1w/v％、甘露醇0.1-1w/v％和防腐剂0.04％-0.1％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂2 0.02-0.1w/v％、氧化酶0.01-0.5w/v％、甘露醇0.2-1.5w/v％、聚乙二醇20000 0.1-1w/v％、酶稳定剂0.01-0.2w/v％和防腐剂0.04-0.1w/v％。
5.根据权利要求4所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL、还原剂1 0.1w/v％、牛血清白蛋白0.5w/v％、甘露醇0.5w/v％和防腐剂0.05％；
所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂2 0.05w/v％、氧化酶0.03w/v％、甘露醇0.5w/v％、聚乙二醇20000 0.5w/v％、酶稳定剂0.1w/v％和防腐剂0.05w/v％。
6.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括牛血清白蛋白和聚乙二醇20000，所述氧化剂为硫酸铜。
7.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品由氧化低密度脂蛋白抗原和冻干保护液经冷冻干燥后得到，所述冻干保护液包括稳定剂和氧化剂。
8.根据权利要求7所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述冻干保护液还包括缓冲液和防腐剂，所述冻干保护液包括下述浓度的组分：缓冲液10-100mM、牛血清白蛋白0.1-2w/v％、聚乙二醇200000.2-2w/v％、硫酸铜2-20μM和防腐剂0.04-0.1w/v％；
优选地，所述冻干保护液包括下述浓度的组分：缓冲液20mM、牛血清白蛋白0.5w/v％、聚乙二醇20000 1w/v％、硫酸铜10μM和防腐剂0.04-0.1w/v％，所述校准品由氧化低密度脂蛋白抗原和冻干保护液按照1～16U:1L的比例稀释经冷冻干燥后得到。
9.根据权利要求4、5或8所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，pH值为6.0～8.0，优选地，pH值为7.6。
10.根据权利要求1～9任一项所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，在待测样本中加入试剂1和试剂2，混合均匀后37℃孵育5～30min，加入触发剂，立即测定最终反应物的发光值，计算待测样本中氧化低密度脂蛋白的含量，其中，待测样本、试剂1、试剂2和触发剂的体积比为1:8:8:15。
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