CN102333886A

CN102333886A - 液相均相测定

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Publication number: CN102333886A
Application number: CN201080009871XA
Authority: CN
Inventors: H·阿哈万·塔夫狄; D·宾格; 陈英; R·德席尔瓦; T·麦克勒农; J·门多萨; B·厄德戈德; M·萨尔瓦蒂; N·沙皮尔; 谢文华
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: JP2012519285A; EP2401392B1; JP5844643B2; US20100267071A1; WO2010099486A1; CA2753598C; US9029092B2; US20150212005A1; US10036708B2; KR101851797B1; USRE49466E1; BRPI1008760B1; CA2753598A1; KR20110134426A; AU2010217756B2; JP2015172604A; CN102333886B; PL2401392T3; EP2401392A1; BRPI1008760A2

Abstract

本发明公开了用于检测怀疑含有反应物的样品中反应物的方法、试剂、试剂盒和系统，其中所有的试剂皆可溶于水溶液。一种测定方法包括：在反应物存在的条件下，处理怀疑含有反应物的样品，使活化剂达到反应构型，化学发光化合物将其激活。样品还被处理以减少与分析物不相关的信号。最后，用引发剂溶液处理该样品，借此由被激发的化学发光化合物产生光。没有试剂与某一表面或其他固相相连接。

Description

液相均相测定

背景技术

特异性结合测定是用于检测物质存在或含量的测试方法，并且是以特异性识别和与特异性结合伴侣结合一起为基础的。免疫测定是特异性结合测定的实例，其中抗体可结合于特定的蛋白质或化合物。在这些实例中，抗体是特异性结合配对成员中的成员。核酸结合性测定是另一种类型，其中互补核酸链是特异性结合配对。特异性结合测定构成了较宽的和正在发展的技术领域，其能够精确地检测疾病状态、传染性生物体和非监管药物。在过去的几十年中，一直进行这些工作，以便设计出具有所要求的灵敏度、动态范围、实用性、广泛适用性和适合自动化的分析和测定方法。这些方法能够被大体分组为两个类型。

均相的方法利用特异性结合分析物的反应来调节或者产生可检测信号，无需要求在对分析物特异的反应物和非分析物特异性的反应物之间的分离步骤。异相的形式则依赖于被分析物结合的和游离的(未被结合于分析物)的可检测地标记的特异性结合伴侣之间的物理分离。分离典型地要求关键的反应物被固定化到一些类型的固体基材上，以使得一些类型的物理过程例如过滤、沉积、聚结或者磁力分离可以被采用；并且典型地还要求洗涤步骤，以便除去游离的可检测地标记的特异性结合伴侣。

依赖于产生化学发光信号并且与分析物含量相关联的测定方法已经经历提高的应用。这些方法能够使用相对简单的仪器进行，仍然可显示良好的分析特性。特别地，使用酶标记的用于分析物的特异性结合伴侣和化学发光的检测用酶底物的方法已经得到了广泛应用。普通的标记酶包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。

美国专利6,911,305公开了一种方法，用于在第一薄膜上检测结合于敏化剂、或用敏化剂标记的探针的多聚核苷酸分析物。该薄膜和携带有固定化化学发光前体的第二薄膜相接触。激发在夹心薄膜中的敏化剂可产生单线态氧，单线态氧可与化学发光前体反应从而在第二薄膜上产生可引发的化学发光化合物。该可引发的化学发光化合物可与试剂起反应从而在第二薄膜上产生化学发光，用于检测分析物。这些方法并不依赖于用于使反应物进行接触的特异性结合反应；相反，第二薄膜用作试剂输送装置。

美国专利6,406,913公开的测定方法包括在一定条件下处理怀疑含有分析物的介质，使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光化合物获得密切接近。该光敏剂当用光源辐照时可产生单线态氧；单线态氧可通过溶液扩散至化学发光化合物，并且当密切接近化学发光化合物时，单线态氧可激活该化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与介质中的分析物含量有关。在一种实施方式中，至少一种光敏剂或化学发光化合物与悬浮的颗粒相关联，并且特异结合性配对成员被与其相结合。

美国专利申请公开US20070264664和US20070264665公开了用于进行特异性结合配对分析的测定方法，涉及固定化化学发光化合物与活化剂化合物的反应，所述活化剂化合物借助于特异性结合反应而进入反应性构造中。其不要求分离或者除去过量的未结合的化学发光化合物或者活化剂。与现有测定技术相比，这些测定形式提供了优良的操作便利性和在自动化中的灵活性。尽管具有这些优点，在测定方法设计和性能中附加的改进始终是分析方法开发人员的目标。本发明公开的测定方法通过提供简单的灵敏度改进的测定法而满足了这些需要。

发明内容

具体实施方式

定义

烷基--含有1-20个碳的支链、直链或者环烷基团，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。在此使用的低级烷基是指含有8个以下碳原子的那些烷基。

分析物--测定中在待检测样品中的物质。一种以上具有对分析物的特异性结合亲合力的物质将被用于检测分析物。该分析物可以是蛋白质、肽、抗体、或半抗原，与这些分析物结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸或低聚核苷酸，其可以被互补的核酸或低聚核苷酸结合。该分析物可以是任何其他可形成特异性结合配对成员的物质。其他示例性的分析物类型包括：药物比如甾族化合物、激素、蛋白质、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、非监管药物、维生素、抗菌药物、抗真菌药物、抗病毒药物、嘌呤、抗肿瘤药试剂、安非他明、氮杂化合物、核苷酸、和前列腺素、以及所有这些药物的代谢产物、杀虫剂和杀虫剂的代谢产物、以及受体。分析物还包括细胞、病毒、细菌和真菌。

活化剂--一种化合物，还可被认为是标记，其具有活化化学发光化合物的功能以使得在存在的条件下产生化学发光。

被活化剂标记sbm或者活化剂特异性的结合成员共轭物--在测定混合物中的反应物，该混合物至少包括连接构造中的下述物质：a)用于分析物的特异性结合成员；和b)具有活化化学发光化合物效果的活化剂化合物或标记。

抗体：包括全长免疫球蛋白及天然或基因工程化的片段。

芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、和苯乙基。

芳基--含有芳香环的基团，该基团含有1至5个碳环的芳香环，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。

生物材料--包括，例如：全血、抗凝血的全血、血浆、血清、组织、动植物细胞、细胞内容物、病毒、以及真菌。

化学发光化合物--一种化合物，其还可以被称为标记，其可例如通过被转化为另一种在电子激发态下形成的化合物而参与引起光辐射的反应。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体跃迁至激发态并发光。

化学发光标记的固定化sbm--在测定混合物中的反应物，该混合物至少包括连接构造中的下述物质：a)用于分析物的特异性结合成员；b)化学发光化合物或标记；和c)固相。

连接--在此使用的该术语是指两个以上化学物种或者支持材料被通过化学法连接，例如通过一个以上共价键，或者被动地附着例如通过吸附、离子吸引，或者特异性结合过程比如亲合性结合。当这些物种或者材料彼此相连接时，能够涉及一种以上连接类型。

剂量反应--信号比如测定反应所产生的化学发光，其与样品中分析物的含量相关。

杂烷基--一种烷基，其上至少一个环或非末端链中的碳原子被选自N、O、或S的杂原子取代。

杂芳基--一种芳基，其上1至3个的环中碳原子被选自N、O、或S的杂原子取代。例举的基团包括：吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。

样品--在测定中含有或者怀疑含有待测分析物的混合物。分析物包括，例如：蛋白质、肽、核酸、激素、抗体、药物、和甾族化合物。可以在本公开的方法中使用的典型样品包括：身体的液体，比如血液，其可以是当收集血液标本时通常见到的抗凝血的血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。其他类型的样品包括：溶剂、海水、工业用水样品、食品样品和环境样品比如土壤或水、植物材料、真核生物、细菌、质粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的细胞。

sbp(特异性结合伴侣)--特异性结合配对成员或特异性结合伴侣是包括生物分子在内的一种分子，具有针对另一种物质(比如分析物)的特异性结合亲合性。用于分析物的两个特异性结合伴侣，最好是在分析物上具有不同的结合位点，可以称为特异性结合配对。

SSIA(Selective Signal Inhibiting Agent，选择性信号抑制剂)--一种在本公开的测定反应混合物中提供的化合物，其使得非专一性信号或者背景信号与从测定反应混合物的化学发光产生反应所产生的对分析物特异的信号相比会以更大量降低。

固体支持物--一种大小至少为1微米的材料，具有一个其上能固定测定成分的表面。材料可以呈如下形式：颗粒、微粒、纳米颗粒、金属胶体、纤维、纸张、珠子、膜片、滤纸及其他支撑物比如试管、微孔板、芯片、载玻片、和微阵列。

可溶性的、溶解性、增溶--一种物质与另一种物质均匀混合的能力或者趋势。在本公开中，溶解性和相关术语一般指的是固体在液体中的特性，例如在缓冲水溶液中的SSIA。固体的可溶性是指它们在溶剂(例如液体)中丧失它们的结晶形状并变成呈分子状态或呈离子状态溶解或者分散、从而形成真溶液的程度。相反：二相系统，其中一个相由分布在整个一体物质内的小颗粒(包括微粒或者胶体大小的颗粒)组成，不论是否被稳定化以阻止沉淀、还是未被稳定化。

取代--是指基团上至少一个氢原子被非氢基团置换。应该注意，关于被取代基团，本文中指的是可以存在多个置换位点，除非另有明确说明。

反应容器--一种容纳样品和其他根据本发明测定法的成分的容器或装置。包括例如，不同大小和形状的试管、微孔滴定板。

公开

本发明公开提供了均相测定方法，特别是在分析物结合化学发光标记特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结合伴侣共轭物(conjugate)结合后，使用分析物化学发光检测的均相测定方法。均相测定及其方法的进行可以不需要使游离的特异性结合伴侣与复合体中已被结合的特异性结合伴侣相分离的步骤。

本发明公开提供了快速简单的均相测定法，其利用特异性结合配对反应来检测物质的存在、位置和含量。该测定要求使用在液相中的连接于第一个特异性结合伴侣的化学发光化合物(化学发光标记(的)sbp，化学发光标记(的)特异性结合伴侣)、共轭于第二个特异性结合配体的活化剂化合物(活化剂标记(的)特异性结合伴侣)、选择性信号抑制剂(SSIA)、增强剂、以及引发剂溶液。

与其他均相测定相比，本公开的基本实施方式，包括活化剂标记特异性结合伴侣和化学发光标记特异性结合伴侣在内的所有反应物皆可溶于水溶液。实际上，本发明的测定不需要或不使用固相。本测定方法与其他均相测定法不同的另一点是，不需要特殊化的构造物--也就是设计成带有可检测成分的被标记的特异性结合配对成员，该配对成员不被活化或者只有在与另一成分在一个复合体中结合后才能产生某种可检测信号。与本发明公开的测定系统相比，其他均相测定系统的制备是复杂、困难或昂贵的，因为那些方法需要这种特殊化的成分。而本发明的测定法提供了一种使测定设计与开发更简单、更灵活的方法，并更容易应用于较宽范围的分析物。不同于常规的异相或基于分离的测定方法，本发明的测定方法不采用分离步骤或工艺将游离的特异性结合伴侣与已结合在复合体中的特异性结合伴侣区分开来。通过使用避免分离步骤的本测定方法，使得测定的控制简化了，测定时间得以缩短，自动化变得更容易。

在本发明公开的测定方法中，化学发光标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣和选择性信号抑制剂(SSIA)被一同加入到含有样品的水溶液中。在一个实施方式中，当可被特异性结合伴侣成员识别的分析物存在于样品中时，化学发光标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣各自结合于分析物上的不同区域。产生与分析物相关的特异性信号，在刚一加入引发剂溶液就开始检测。在另一个实施方式中，提供分析物的化学发光标记类似物比便应用于竞争测定模式中。分析物和化学发光标记的类似物竞争性地结合于活化剂标记的特异性结合伴侣。在竞争性结合测定的一个实施方式中，化学发光标记的类似物和活化剂标记的特异性结合伴侣的复合体可以被预先形成，加入分析物以取代被标记的类似物。在另一个实施方式中，化学发光标记的类似物、分析物、活化剂标记的特异性结合伴侣在未预先形成结合性复合体的情况下被混合一起。产生与分析物相关的特异性信号，在刚一加入引发剂溶液就开始检测。信号与测定模式中的分析物浓度逆向相关。

作为特异性结合伴侣与分析物结合的结果，使活化剂与化学发光化合物呈可操作地接近，这样活化剂可有效地地活化反应，在刚一加入引发剂溶液时就产生化学发光。活化剂与化学发光化合物的反应可活化或改变化学发光化合物，使得用引发剂溶液处理导致进一步生成光的反应。术语“可操作地接近”是指，化学发光化合物和活化剂足够接近，包括并且直至物理接触，这样它们能够进行反应。相对于检测分析物浓度所需的量，可以向系统中提供过量的活化剂标记的特异性结合伴侣和/或化学发光标记的特异性结合伴侣。在加入引发剂溶液和检测之前不除去多余的未结合的活化剂标记的特异性结合伴侣、未结合的化学发光共轭物，因为它们的存在和测定系统中固相的缺乏并不会抑制化学发光检测信号与分析物的量之间精确地建立关联。因为未结合的被标记的特异性结合伴侣能够经受相同的化学发光检测反应，并且反应物不与固相连接(没有有用的相关性，即使最好的情况)，所以信号与反应物的相关性也非常有限，这是期望的。按照经验，这个特点通常将导致测定失败。

令人惊讶的是，这个问题已经通过在这本发明的方法中使用选择性信号抑制剂而被克服。在本方法中，溶液中不与固相连接的反应物、未被去除的多余活化剂的存在、多余化学发光化合物的存在并不丧失进行灵敏的、特异性的、分析物浓度依赖性的结合测定的能力。这个发现是不可预知的或预料不到的。特别是当活化剂是催化剂比如酶时(当分子在溶液中游离反应时，酶通常每秒可以诱导数百数千倍的反应)，预料不到的是已被结合的活化剂可以有效地区别排除于游离的活化剂反应，以便在整个较宽的分析物浓度范围内产生剂量反应信号。而且，发明者还发现，极好的区别性源于特定的SSIA化合物的加入。通过使用SSIA，在化学发光标记与活化剂标记(两者通过被标记的特异性结合配对成员与分析物的复合体而呈反应构型)之间的反应所产生的信号与来自存在的(但并不存在于该复合体中)标记物的信号的比率被戏剧化地提高。

参考示意图1，可以理解SSIA在改进的测定灵敏度中的功能。游离(未与分析物结合)的和被复合的化学发光标记(的)特异性结合伴侣(CLsbp)与活化剂标记(的)特异性结合配对(ALsbp)有多种不同的组合方式，当加入引发剂溶液时，这些方式都可能对所观察的化学发光信号有贡献。四种建议的反应图列于如下：

1被结合的ALsbp+被结合的CLsbp→特异性信号

2被结合的ALsbp+游离的CLsbp→非特异性信号

3游离的ALsbp+被结合的CLsbp→非特异性信号

4游离的ALsbp+游离的CLsbp→非特异性信号

如上所示，四种不同类型的化学发光化合物与活化剂的配对能在混合反应中反应；但只有第一种类型产生了与测定中分析物的含量相关的信号。SSIA取得了令人惊讶的作用，相对于1反应所产生信号，它选择性地抑制2-4反应所产生的信号量。在一些实施方式中，四种反应都会减弱，但2-4反应的信号相应地减少更多，即SSIA取得了同样的作用。

在本发明的实施方式中，提供了通过分析物与用于分析物的特异性结合伴侣之间的特异性结合反应来分析所样品中所关注的分析物的方法，其中，一个特异性结合伴侣被用活化剂化合物标记，该活化剂可以催化剂比如酶、尤其是过氧化氢酶。另一个用于分析物的特异性结合伴侣被化学发光化合物标记。标记的sbp与分析物的结合生成带标记的复合体。化学发光化合物经受被活化剂诱导的在加入引发剂溶液后引起的化学发光反应。化学发光的结果与样品中分析物的含量有关。特异性结合配对反应和化学发光反应由所有溶解在溶液中的成分完成，典型的溶液是水溶液。显著地，提供的被标记的特异性结合伴侣的含量相对于样品中分析物的量是过量的，从而使得不是所有的标记sbp都与分析物生成复合体。即使多余的标记sbp能参与化学发光反应，但并不从反应溶液中去除。未在复合体中、也未被按常规除去的标记sbp的反应性会阻止这种均相测定的进行，因为会产生不可接受的高信号，这种高信号不是由于存在分析物介导的复合体形成而产生的。在许多情况下，这种如此多的“背景”信号的产生使得无法得到有用的剂量反应关系。为了能够进行均相的非分离式测定，当所有为化学信号产生所必需的反应成分呈结合性复合物形式和游离或未结合形式这两种形式存在时，必须提供除物理分离之外的某种手段来区分已被结合的和未被结合的标记sbp。针对这个问题，本发明提供了一种长期被追求的溶液，提供了所有成分都在溶液中的测定方法，不进行分离。不同于已知的均相测定方法，本方法不需要或不使用特别设计的标记结合伴侣，这些结合性伴侣能够不经受产生信号的反应，除非它们被带入在结合性复合体中。

在发明实施的测定方法中，被结合于具有分析物的复合体中的标记sbp成员与游离的标记sbp成员的必要区分是通过向反应溶液中提供选择性信号抑制剂(SSIA)而实现的。向反应溶液中加入有效量的SSIA可导致来自已结合的标记sbp成员的信号超过包括来自任何未结合的标记sbp成员的信号在内的背景信号，相比未使用SSIA的情况超过程度极其明显。当信号对背景关系的这一改进被实现时，测定的效用得以增强，包括更高程度的检测灵敏度。

在一个实施方式中，提供的测定方法尤其是特异性测定方法中，由于分析物的存在，使得化学发光标记的sbp和活化剂标记的sbp经由至少一个特异性结合反应而得以可操作地接近，其中已结合的活化剂标记的sbp可激活一旦加入引发剂溶液就产生化学发光的反应，该反应用以检测分析物的存在、位置和量。

在另一个实施方式中，本发明的测定方法还与传统测定方法不同的是，不去除存在的未结合的活化剂标记的sbp，这些未结合的活化剂标记的sbp在测定中相对于与分析物特异结合的量大量剩余，不要求洗涤或分离多余的未结合的活化剂标记的sbp。在另一个实施方式中，本发明的方法也不用除去相对于与分析物特异结合的量有剩余的未结合的化学发光共轭物，不需要洗涤或分离未结合的化学发光共轭物的步骤。

测定组成，即：含有分析物的样品、活化剂标记的sbp，化学发光标记的sbp，选择性信号抑制剂及引发剂溶液可以被陆续加入试管，不需要洗涤或分离，并且读取发光。除了最后加入的引发剂溶液之外的测定组成可以以任何次序或组合加入试管中。在一个实施方式中，在注入引发剂溶液前，样品和活化剂标记sbp可以被预先混合并加入含有化学发光标记sbp的试管中。

使用化学发光底物和酶标记的结合物的常规测定法要提供大大过量于标签酶的量的化学发光底物。通常，底物/酶的摩尔比率可以超过十的九次幂，即，过量十亿倍。据相信，在常规的测定中有必要供应这样极大过量的化学发光化合物，以便确保充分的底物供应，用于连续的酶法转化，并且该过程确保在测定中足够的检测灵敏度。申请人发现，有可能设计出高灵敏度的测定方法，其将化学发光化合物对活化剂的比率减小了几个数量级。就这点来说，在此描述的这些方法本质上不同于已知的酶联测定方法。

通过省去如上所述和如下所述示例性测定法显示的洗涤和分离步骤，提供了使测定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定次数、由不完全的洗涤带来的内测定变化性、以及成本。同时，增强了自动化和小型化测定性能的能力，具有自动化和小型化伴随的所有固有优点。

按本发明方法进行的测定法包括提供特异性结合伴侣(sbp)来特异性地结合或捕捉所关注的分析物。特异性结合伴侣能直接或间接地结合待检测的分析物。随后进一步向特异性结合伴侣提供直接或间接地附着于其上的化学发光标记化合物。化学发光标记可以由如下所详述的不同途径得到。各个情况下，化学发光标记稳定地、或不可逆地被直接或间接地以可维持“化学发光标记sbp”水溶性的方式与特异性结合伴侣相连接。术语“不可逆地”是指：在待进行的测定中的使用条件下，基本上不从化学发光标记sbp中除去化学发光标记。倘若在使用条件下标记被稳定附着、且仍保持在化学发光标记sbp上，则被动或非共价附着也是可以考虑的。

该测定法进一步包括提供具有分析物的活化剂标记sbp和与化学发光标记sbp连接的用于分析物的特异性结合伴侣，并且允许这些组成形成特异性结合复合体。样品、化学发光标记sbp、催化剂标记sbp可以被以任意次序分别加入、或者以组合形式陆续或同时加入，也可以提前混合作为组合物加入。分析物与标记的sbp成员的结合一般要求一段时间。在一些实施方式中，可以如此进行：为使结合反应发生，结合成分经可选的延迟时间被陆续加入。

当结合性复合体形成后，加入引发剂溶液以产生用来检测分析物的化学发光，并且检测化学发光。典型地，光强度水平的峰值或光强度以固定的时间间隔积分，或测量所有积分的光强度。所产生光的量与反应试管中样品含有的分析物的量相关。通过按通常已知方法建立校准曲线，光的量可以被用来确定反应物的数量。当光的发射在继引发剂溶液加入后迅速发生时，期望的是，或者用机械方法测量开始用合适的注射器添加的时间、或者用已经置于检测中的反应试管进行添加步骤。反应物的适宜量、容积、稀释度、特异性结合配对反应的温育时间、反应物浓度等，可以由常规测定法事先确定，参考进行特异性结合测定方法的标准论述，之后详述的实施例可以作为指南。

本测定和方法中所用sbp成员的浓度和含量将取决于如下这些因素：分析物浓度、所期望的结合速度/测定时间、共轭物的成本和可用性、sbp成员的非特异性结合度等。通常sbp成员以至少等于最低的预期分析物的浓度存在，更常见的是，以等于至少最高的期望的分析物浓度存在。并且，对于非竞争性测定，浓度可以是分析物最高浓度的10倍到10⁶倍。通常sbp成员的浓度小于10^-4M，更多的情况是小于10^-6M，经常是在10^-11到10^-7M之间。与sbp成员连接的活化剂或化学发光化合物的含量通常是至少1个分子/每sbp成员，可以高到10²或更高。在许多实施方式中，与sbp成员连接的活化剂或化学发光化合物的量是1-20个分子。例举的活化剂对化学发光化合物的比率被提供于工作实施例中。

化学发光标记(的)sbp

本方法需要使用与第一个特异性结合伴侣相连接的化学发光化合物(化学发光标记sbp)，在本发明公开的测定和方法中，化学标记sbp可溶于水溶液。在本公开的测定和方法中，不同于在其他亲合性测定和方法中看到的那样，化学发光标记化合物未被固定在诸如微粒、多孔板膜片、滤纸、试管、试纸、移液吸头等固体表面。

化学发光标记sbp包括化学发光标记化合物和特异性结合配对中的一个成员。

在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括一个以上化学发光标记化合物。

在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝。

在一些实施方式中，化学发光标记化合物直接与特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝连接。在另一些实施方式中，一个以上化学发光标记化合物被直接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个拷贝。直接连接，也称为直接标记，包括共价结合作用、离子结合作用、以及疏水作用。在一种实施方式中，化学发光标记与分析物特异性结合伴侣共价连接。

在一些实施方式中，化学发光标记化合物被间接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝。在另一些实施方式中，一个以上化学发光标记化合物被间接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个拷贝。间接连接除化学发光标记化合物和特异性结合配对成员之外还可包括一种或多种辅助物。

辅助物可溶于水溶液，含有一种以上辅助物的化学发光标记sbp可溶于水溶液。

在不同的实施方式中，辅助物包括：可溶性蛋白质(例如链霉亲合素、亲合素、中性亲合素、生物素、阳离子化牛血清白蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血蓝蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片断或部分)、可溶性的合成树状聚体(如PAMAM)、可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶性的天然聚合物(如功能化的右旋糖苷、氨基右旋糖苷的多糖、低聚核苷酸、蛋白质、及其组合物)、脂质体、胶束、泡囊、及一种以上可溶合成聚合物、可溶天然聚合物和可溶性蛋白质的组合物(如免疫球蛋白G/生物素/链霉亲合素/PAA)。其他可溶于水溶液、并能使一个以上化学发光标记化合物sbp附着的辅助物，预想可以应用在本发明和方法中。

在一些的实施方式中，化学发光标记共价连接的辅助物是蛋白质或肽。例举的可溶蛋白质包括白蛋白、亲合素、链霉亲合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血蓝蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它们的任意组合物。在一种实施方式中，辅助物是通用抗体比如IgG，其中化学发光标记与通用抗体通过可维持分析物特异性捕捉抗体的结合亲合力的方式共价连接。在另一个化学发光标记sbp实施方式中，化学发光化合物经由生物素-链霉亲合素或生物素-中性亲合素的结合而连接一个以上sbp。当化学发光化合物处于链霉亲合素共轭时，化学发光标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接例如可以使特异性结合伴侣成为一个生物素共轭物。生物素-链霉亲合素的选择性排列(arrangement)及类似的连接已为人所知。作为选择，化学发光标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接可以利用用于sbp或化学发光化合物与一个以上附加的辅助物之间附着的连接。

在另一种实施方式中，与化学发光标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。。使用聚合物辅助物用于连接化学发光化合物的测定形式能够通过共价键比如生物素-亲合素共轭物而连接于分析物特异性结合伴侣，，或者通过使用通用捕捉成分比如种类特异性免疫球蛋白的间接附着来连接。

在优选的实施方式中，化学发光标记sbp包括辅助物，该辅助物选自多糖或可溶性自组装(self-assembling)蛋白质。在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些实施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有10kDa到500kDa的平均分子量。在另外一些实施方式中，有25～150kDa的平均分子量。在进一步的实施方式中，化学发光标记sbp包括平均分子量为50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更进一步的实施方式中，化学发光标记sbp包括平均分子量为70kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。

在许多实施方式中，化学发光标记sbp的平均直径在5nM到800nM的区间内。在优选的实施方式中，包含可溶性蛋白质、或其他可溶性自然或合成聚合物、或它们的组合物，化学发光标记sbp的平均直径在200nM到600nM的区间内；在进一步的实施方式中，在300nM到500nM的区间内。

活化剂标记(的)sbp

本发明的方法要求使用连接于第一个特异性结合伴侣的活化剂化合物(活化剂标记sbp)。

在本发明公开的测定和方法中，活化剂标记的sbp可溶于水溶液。在本公开的测定和方法中，不同于在其他亲合性测定和方法中看到的那样，活化剂化合物不固定在诸如微粒、多微孔板、膜片、滤纸、试管、试纸、移液吸头等固体表面。

活化剂标记sbp包括一个活化剂标记化合物和一个特异性结合配对。

在一些实施方式中，一个活化剂标记sbp中含有一个以上活化剂化合物。

在一些实施方式中，一个活化剂标记sbp中含有一个以上特异性结合配对成员的拷贝。

在一些实施方式中，一个活化剂化合物直接连接一个以上特异性结合配对的拷贝。在一些实施方式中，一个以上活化剂标记化合物直接连接一个特异性结合配对成员的拷贝。直接连接，也称为直接标记，包括共价结合作用，离子结合作用，疏水作用。在一种实施方式中，活化剂标记与分析物特异性结合伴侣共价连接

在一些实施方式中，活化剂标记化合物间接连接一个以上特异性结合配对成员的拷贝。在另一些实施方式中，一个以上活化剂标记化合物间接连接特异性结合配对成员的一个拷贝。间接连接在活化剂标记化合物和特异性结合配对成员之外包括辅助物。

辅助物通常可溶于水溶液。含有一个以上辅助物的活化剂标记sbp可溶于水溶液。在不同的实施方式中，辅助物包括可溶性蛋白质，例如链霉亲合素，亲合素，中性亲合素，生物素，阳离子化BSA，fos蛋白，jun蛋白，匙孔血蓝蛋白″KLH″，合成或天然的免疫球蛋白及其片断或部分，可溶的合成树状聚体(如PAMAM)，可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶的天然聚合物，如功能化右旋糖苷，氨基右旋糖苷的多糖，低聚核苷酸，蛋白质，及其组合物，脂质体，胶束，泡囊，及一个以上可溶合成聚合物，可溶天然聚合物和可溶性蛋白质的组合物(如免疫球蛋白G/生物素/链霉亲合素/PAA)。其他可溶于水溶液并能使一个以上化学发光标记化合物，特异性结合伴侣附着的辅助物，预想可以应用在本发明和方法中。

在一些的实施方式中，活化剂标记共价连接的辅助物是蛋白质或肽。例举的可溶蛋白质包括白蛋白、亲合素、链霉亲合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血蓝蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它们的任意组合物。在一种实施方式中，辅助物是通用抗体比如IgG，其中活化剂标记与通用抗体通过可维持分析物特异性捕捉抗体的结合亲合力的方式共价连接。在另一个活化剂标记sbp实施方式中，活化剂经由生物素-链霉亲合素或生物素-中性亲合素的结合而连接一个以上sbp。当活化剂处于链霉亲合素共轭时，活化剂标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接例活化剂如可以使特异性结合伴侣成为一个生物素共轭物。生物素-链霉亲合素的选择性排列(arrangement)及类似的连接已为人所知。作为选择，活化剂标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接可以利用用于sbp或活化剂与一个以上附加的辅助物之间附着的连接。

在另一种实施方式中，与活化剂标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。。使用聚合物辅助物用于连接活化剂化合物的测定形式能够通过共价键比如生物素-亲合素共轭物而连接于分析物特异性结合伴侣，，或者通过使用通用捕捉成分比如种类特异性免疫球蛋白的间接附着来连接。

在优选的实施方式中，活化剂标记sbp包括辅助物，该辅助物选自多糖或可溶性自组装(self-assembling)蛋白质。在一些实施方式中，活化剂标记sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些实施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有10kDa到500kDa的平均分子量。在另外一些实施方式中，有25～150kDa的平均分子量。在进一步的实施方式中，活化剂标记sbp包括平均分子量为50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更进一步的实施方式中，活化剂标记sbp包括平均分子量为70kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。平均分子量在70kDa。

在大部分实施方式中，活化剂标记sbp的平均直径在200kDa到3000kDa的范围内。在一些的实施方式中，活化剂标记sbp的平均分子量在350kDa到1500kDa。

活化剂标记

活化剂化合物形成了被活化剂标记的sbp的一部分，其还可以被认为是活化剂特异性结合成员共轭物。被活化剂标记的sbp具有双重作用：1)在测定中，通过特异性结合伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而特异性地经受与分析物含量成比例的特异性结合反应，和2)通过活化剂部分激活化学发光化合物。被活化剂标记的sbp的活化剂部分是具有活化化学发光化合物的效果的化合物，使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂标记的化合物包括具有过氧化物酶类活性的含有过渡金属盐和复合物以及酶的化合物，尤其是含有过渡金属的酶，更尤其是过氧化物酶。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表中第3-12族的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰、铬、以及钒。

可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括，例如：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶和来源于Arthromyces ramosus的过氧化物酶、以及在白腐真菌中产生的Mn依赖性过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他已知并不是酶、但是具有过氧化物酶状活性的仿过氧化物酶的化合物包括：铁复合物，比如亚铁原卟啉、以及Mn-TPPS4(Y.-X.Ci，et al.，Mikrochem.J.，52：257-62(1995))。上述这些物质可催化底物的化学发光氧化，并且应明确地认为包含于在此使用的过氧化物酶含义的范围内。

在一些实施方式中，在用于产生化学发光的方法中，被活化剂标记的sbp可以包括过氧化物酶和生物分子的共轭物或复合物，唯一的附带条件是：该共轭物可显示出过氧化物酶活性或过氧化物酶状活性。可以结合于一种以上过氧化物酶分子的生物分子包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。还可以在本发明公开的方法中使用包含或者结合过氧化物酶的复合物，比如脂质体、胶束、泡囊和因连接生物分子而具功能化的聚合物。

选择性信号抑制剂(SSIA)

本发明的选择性信号抑制剂是这样的化合物：当其被包括在包含游离的和/或被分析物结合的化学发光标记的sbp、游离的和/或被分析物结合的被活化剂标记的sbp、增强剂和引发剂溶液的测定反应混合物中时，从被分析物结合的标记sbp成员得到的信号超过背景信号的程度显著地大于没有SSIA时发生的超出程度。

反应方法中存在的一种以上选择性信号抑制剂的浓度在10^-6M和10^-1M之间、常常在10^-6M和10^-2M之间、经常在10^-5M和10^-3M之间、有时在10^-5M和10^-4M之间。在一些实施方式中，在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度在5x10^-6M和5x10^-4M之间。在更进一步的实施方式中，在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度在5x10^-5M和5x10^-4M之间。

选择性信号抑制剂能够被作为单独的试剂或者浓度比在待进入的反应溶液中更高的溶液提供。本实施方式中，实测量的工作溶液被定量加入反应溶液中，以达到期望的反应浓度。在另一个实施方式中，选择性信号抑制剂被合并进入含有一种或多种被标记的sbp成员的溶液中。在另一个实施方式中，选择性信号抑制剂被作为引发剂溶液的组分提供。

选择性信号抑制剂提高信噪比的程度将依据化合物的一致性和使用时的浓度、连同其它因素而改变。该程度能够被作为提高倍数的术语，其中该倍数为在特定的分析物浓度下通过使用选择性信号抑制剂而进行的测定中的信噪比与在相同的分析物浓度下在不含选择性信号抑制剂情况下进行的测定中的信噪比相比较的倍数。提高倍数＞1是改进的测定方法的量规和选择性信号抑制剂的有益效果的证据。在本发明的实施方式中，可取得至少2比如至少5、并包括至少10、或至少50的提高倍数。参照下述实施例，将可看到，提高倍数能够在测定范围内作为分析物浓度的函数而改变。例如，提高倍数可以随着分析物浓度增加而提高。在另一个实施方式中，提高倍数随浓度的变化可以导致较为线性的校准曲线，即化学发光强度对分析物浓度的曲线。

下面的表中列出了，但不限于，能够有效地具有选择性信号抑制剂功能的化合物。利用本发明的公开教导，包括测定法的常规应用和在实施例中描述的筛选试验方法，能够找到未明确叙述的另外的化合物。

表1.选择性信号抑制剂

在一些实施方式中，选择性信号抑制剂选自二烃基羟胺。

在一些实施方式中，选择性信号抑制剂选自在对位或邻位有至少两个羟基的芳香化合物。典型的化合物列在表2中。

表2

在一些实施方式中，选择性信号抑制剂选自在对位或邻位有至少一个羟基和一个氨基的芳香化合物。典型的化合物列在表3中。

表3

在一些实施方式中，选择性信号抑制剂选自于具有至少两个在碳-碳双键上取代的羟基的化合物。典型的化合物列在表4中。

表4

在一种实施方式中，选择性信号抑制剂选自含氮杂环化合物。典型的化合物列在表5中。

表5

在一种实施方式中，选择性信号抑制剂以作为如下受保护的化合物形式被提供：其刚一接触过氧化物就能转变为活性的SSIA。合适的受保护的SSIA化合物例如选自于羟基或氨基被取代的芳基硼酸化合物。典型的化合物在表6中。

表6

在一种实施方式中，选择性信号抑制剂选自表7中的化合物。

表7

在各种不同的实施方式中，以上一个以上选择性信号抑制剂可在本发明的测定、方法或试剂盒中组合使用。选择性信号抑制剂在水溶液中的溶解度为10倍于工作溶液中的溶解度。工作溶液定义为浓缩水溶液，如此将一部分浓缩液加至反应混合物中就可在添加引发剂溶液之后得到所要求的终浓度。

用于选择性信号抑制剂工作溶液的合适水溶液可包含一种以上以下额外成分：盐、生物缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、包括乙醇、甲醇、乙二醇在内的醇类、除垢剂。在一些实施方式中、水溶液可包括Tris缓冲水溶液、25％乙醇/75％Tris缓冲水溶液、25％乙醇/75％Triton-X-100(1％)水溶液、10％0.1N NaOH/90％Tris缓冲水溶液。一个例子是、Tris缓冲水溶液组成有TRIS缓冲盐水、表面活性剂、＜0.1％叠氮化钠、0.1％ProClin

300(罗门哈斯公司)，在这里被称为缓冲液II，可以通过商业途径从贝克曼考尔特公司(加州Brea市)得到。

引发剂溶液与增强剂

引发剂溶液提供了产生化学发光所需的激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光标签反应而进行化学发光反应所必需的反应物。其可以具有代替该功能或者除该功能之外的促进活化剂化合物作用力的作用。例如，当活化剂是过氧化物酶时，将会发生这种情况。在一种实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。例举的过氧化物包括过氧化氢、过氧化脲和过硼酸盐。在引发剂溶液中使用的过氧化物浓度可以在一定数值范围内变化，典型该范围为约10^-8M至约3M、更通常为约10^-3M至约10^-1M。在另一个实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物和增强化合物，所述增强化合物可促进具有过氧化物酶活性的活化剂的催化转化。

有代表性的实施方式使用作为活化剂的过氧化物酶结合物、被9，10-二氢化吖啶标记的分析物的特异性结合伴侣(其中，通过特异性结合伴侣与9，10-二氢化吖啶标记的下文中所述化合物进行反应而提供9，10-二氢化吖啶标签)、以及包含过氧化氢的引发剂溶液。该过氧化物与过氧化物酶反应，估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。这种改变状态的酶与增强剂分子反应，促进酶的催化转化。由增强剂或酶形成的反应性种类可和保持与酶接近的标记的9，10-二氢化吖啶反应。化学发光反应包含由化学发光化合物与过氧化物形成的中间体的进一步反应，以产生最终的反应产物和光。

将某些增强化合物并入引发剂溶液可以促进酶的反应性或者减少背景信号，或者同时具有这两种功能。被包括在这些增强剂中的物质是已知可增强过氧化物酶反应的酚类化合物和芳香胺。在美国专利5,171,668中公开的吩噁嗪或者吩噻嗪化合物与靛酚或吲哚苯胺化合物的混合物可以在本发明中被用作增强剂。取代的羟基苯并噁唑、2-羟基-9-芴酮、以及在美国专利5,206,149中公开的化合物

也可以在本发明中用作增强剂。在美国专利No.5,512,451中公开了取代的和未被取代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酐衍生物，在此也考虑将其归入在本发明公开中有用的增强剂范围内。例举的酚类增强剂包括，但不限于：对苯基苯酚、对碘苯酚、对溴苯酚、对羟基桂皮酸、对咪唑基苯酚、醋氨酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚以及6-溴-2-萘酚。

还可以使用选自如上所述这些种类的一种以上增强剂的混合物。

在本发明的实施方式中有用的另外的增强剂包括羟基苯并噻唑化合物和具有如下化学式II和III的吩噁嗪以及吩噻嗪。

在吩噁嗪和吩噻嗪增强剂氮原子上的被取代的R基包括：1-8个碳原子的烷基，以及用磺酸盐或羧酸盐基团取代的1-8个碳原子烷基。例举的增强剂包括：3-(N-吩噻嗪基)-丙烷磺酸盐、3-(N-苯基嗪基)丙烷磺酸盐、4-(N-苯基嗪基)丁烷磺酸盐、5-(N-苯基嗪基(phenoxazinyl))-戊酸盐、以及N-甲基苯基嗪(N-methylphenoxazine)和相关同系物。在引发剂溶液中使用的增强子浓度可以在一定数值范围内变化，典型地，该范围为约10^-5M至约10^-1M、更通常为约10^-4M至约10^-2M。

检测本发明公开的反应是用引发剂溶液进行的，该引发剂溶液是典型的缓冲水溶液。合适的缓冲液包括任何常用的能够保持允许化学发光反应进行的环境的缓冲液。典型地，引发剂溶液将具有约5至约10.5的pH值。示例性的缓冲液包括：磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、三(羟基-甲基氨基)甲烷[tris]、甘氨酸、Tricine、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺MOPS、HEPES、MES等等。

引发剂溶液还可以含有一种以上除垢剂或者聚合物表面活性剂，以增强产光反应的发光效率或者提高测定的信/噪比。在本发明公开的实施方式中有用的非离子表面活性剂包括，例如：聚环氧乙烷烷基酚类、聚环氧乙烷醇类、聚环氧乙烷醚类和聚环氧乙烷山梨糖醇酯类。可以使用包括季铵盐化合物比如CTAB和季鏻盐化合物在内的单体阳离子表面活性剂。还可以使用包括那些含有季铵和鏻盐基团的阳离子表面活性剂的聚合型阳离子表面活性剂。

在一种实施方式中，引发剂溶液是组合物，其包含缓冲水溶液、浓度为约10^-5M至约1M的过氧化物、以及浓度为约10^-5M至约10^-1M的增强剂。该组合物可以任选地含有包括表面活性剂、金属螯合剂以及防腐剂在内的添加剂，以抑制或最小化微生物污染。引发剂溶液pH值一般在6.0-9.0。在一些实施方式中，pH值为6.5-8.5。在进一步的实施方式中，pH值在7.0-8.0。

特异性结合配对

特异结合性配对成员或特异性结合伴侣(sbp)在此定义为一种分子，其对于另一种物质具有特异性结合亲合力，包括生物分子。特异结合性配对成员包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。特异性结合配对中的每一个特异结合性配对成员对于相同的物质(例如分析物)具有特异性结合亲合力。在特异性结合配对中，每一个特异结合性配对成员与另一个特异结合性配对成员是不相同的，至少体现在如下方面：在分析物上的结合位点，特异结合性配对成员将不会竞争或者重叠。例如，如果特异性结合配由两个抗体组成，则每个sbp抗体具有在分析物上不同的、非竞争性的表位。

特异性结合物质包括，但不限于：抗体和抗体片段、抗原、半抗原和它们的同源抗体、生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、蛋白质A和IgG、互补核酸或低聚核苷酸、凝集素和碳水化合物。

除上述的抗原-抗体、半抗原-抗体或者抗体-抗体配对之外，特异性结合配对还可以包括互补的低聚核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素蛋白-生物素、激素-受体、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白质A、结合性蛋白-受体、核酸-核酸结合蛋白、以及核酸-抗核酸抗体。在筛选药物候选对象中使用的受体测定法是本发明方法的另一应用领域。这些结合性配对的任何一种皆可以适合于在本发明方法的三组分夹心技术或者如上所述的二组分竞争性技术中使用。

化学发光化合物

在本发明公开的实施方式中用作的化学发光标签的化合物具有通式：CL-L-RG，其中，CL表示化学发光的部分，L表示连接化学发光部分和活性基团的连接部分，并且RG表示用于偶联于另一种材料的活性基团部分。术语“化学发光基团”并且和“化学发光部分”与术语“连接部分”和“连接基团”可互换地使用。化学发光部分CL包括经受与活化剂的反应的化合物，该反应导致其被转化为激活的化合物。激活的化合物与引发剂溶液的反应形成电子激发态化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体跃迁至激发态并发光。优选地，但并非必需，CL基团、活化剂和引发剂溶液的化学发光反应快速发生在非常短暂的时间间隔的整个期间；在一种实施方式中，发光反应在几秒内达到峰强度。

在本公开的一个具体实施方式中，化学发光化合物能够被氧化，从而当存在活化剂和引发剂溶液时产生化学发光。通过结合连接物和反应性基团而能够用作化学发光标签的示例性种类的化合物包括：芳香环二酰基酰肼，比如氨基苯二酰一肼(鲁米诺)；和在结构上相关的环状酰肼，包括异氨基苯二酰一肼、氨丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨己基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲氨基萘-1，2-二羧酸酰肼、环上取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2，3-二羧酸酰肼、菲-1，2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼；以及在Masuya等的美国专利No.5,420,275和Yamaguchi的美国专利No.5,324,835中公开的其他2，3-二氮杂萘二酮类似物。

据认为，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物将具有本发明公开中使用的化学发光标签化合物的化学发光部分的功能。本技术领域已知有许多各种结构分类的化合物在这些条件下可以产生化学发光，这样的化合物包括：呫吨染料例如荧光素、曙红、罗达明染色剂、或对甲氨基酚染料、芳香胺和杂环胺。另一个例子是化合物MCLA，即，2-甲基-6-(对甲基苯基)-3，7-二氢化咪唑并[1，2-a]吡嗪-3-酮。另一个例子是吲哚基醋酸，另一个是异丁醛，后者典型地附有用于提高可见光产出的荧光能量受体。三羟基芳香化合物焦性没食子酸、间苯三酚和红培酚个别地或者其组合是其他的化合物例子，可以用作本公开的化学发光标签化合物中的化学发光的部分。

在包括本公开方法中有用的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇(AK)在内的化学发光标签化合物组中的一种实施方式中，包括具有化学式IV的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，基团R¹-R¹¹中的至少一个是化学式-L-RG的标记性取代基。其中，L是连接基团，其可以是化学键或另一种二价或多价的基团；RG是反应基团，其使化学发光标签化合物能够被结合于另一种化合物；R¹、R²和R³是含有1到50个非氢原子的有机基团，并且R⁴-R¹¹中的每一个是氢或无干扰性的取代基。标记性取代基-L-RG能够存在于R¹或R²中的一个上，虽然其还可以作为取代基存在于R³上或者R⁴-R¹¹之一上。

在化学式IV的化合物中的基团R¹和R²可以是含有1到约50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子的任何有机基团，其允许光产生。而上句的后一句话是指，当通式I的化合物经受本发明公开的反应时，激发态产物化合物被产生并且其可以涉及一种以上化学发光中间体的产生。激发态产物可以直接地发射光，或者可以通过能量传递而将激发能传递至荧光受体，引起光从荧光受体发出。在一种实施方式中，R¹和R²选自于含1-20个碳原子的取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳烷基。当R¹或R²是取代基时，其可以用1-3个原子或基团取代，所述基团选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、糖基、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基、C(＝O)NHNH₂、季铵、以及季鏻基团。在一种实施方式中，R¹或R²用化学式-L-RG的标记性取代基取代，此处L是连接基团，而RG是反应基团。

基团R³是含有1到50个除满足基团中原子的原子价所要求的必需数量的H原子之外的非氢原子的有机基团，所述非氢原子选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子。在一种实施方式中，R³含有1到20个非氢原子。在另一个实施方式中，有机基团选自由含1-20个碳原子的烷基、取代烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳烷基所构成的组。在另一个实施方式中，用于R³的基团包括取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、取代或未取代的苯甲基、烷氧基烷基、羧基烷基和烷基磺酸基团。当R³是取代基时，其可以用1-3个原子或基团取代，所述基团选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、糖基、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基、季铵、以及季鏻基团。基团R³可以被结合于R⁷或R⁸以构成5元环或6元环。在一种实施方式中，R³用化学式-L-RG的标记性取代基取代。

在化学式IV的化合物中，基团R⁴-R¹¹各自独立地是H或取代基团，其允许产生激发态产物并且通常含有1到50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素的原子。有代表性的取代基团可以包括，但不限于：烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、氨甲酰、氰基、以及磺酸酯基团。相邻基团的配对，例如R⁴-R⁸或者R⁸-R⁶，可以被结合一起，从而形成包括至少一种融合于环中的附接有两个基团的5元环或6元环的碳环或杂环体系。这样融合的杂环可以含有N、O或S原子，并且可以如上所述含有除H之外的环取代基。一种以上的基团R⁴-R¹¹可以是化学式-L-RG的标记性取代基。在一种实施方式中，R⁴-R¹¹选自氢、卤素和烷氧基比如甲氧基、乙氧基、叔丁氧基等等。在另一个实施方式中，化合物的基团以R⁸、R⁶、R⁹或R¹⁰之一为卤素，而R⁴-R¹¹中的其他基团是氢原子。

取代基团可以以各种量并入、并且选择在9，10-二氢化吖啶环上的环或者链位置，以便改变化合物的特性或者便于合成。这些特性包括，例如，化学发光量子产率、酶反应速度、最大光强度、光发射持续时间、光的发射波长以及在反应介质中的溶解度。具体的取代基和它们的效果被显示在下述具体的实施例中，然而，无论如何不应将其视为对本公开保护范围的限制。为便于合成，优选通式I的化合物具有皆为氢原子的R⁴至R¹¹中的每一个。

在另一个实施方式中，化合物组具有下述化学式V，其中，R⁴至R¹¹中的每一个都是氢。基团R¹、R²和R³被限定如上。

通式IV或V的标记性化合物具有作为基团R¹或R²上取代基的基团-L-RG。在一种实施方式中，标记性化合物具有化学式VI。

有代表性的标记化合物具有如下结构。附加的示例性化合物以及它们在连接于其他分子和固体表面的用途在下述具体的实施例中有描述。如下显示的结构显示了化学式CL-L-RG的示例性化合物。

表8

上述特异性的AK化合物和上述通式IV、V和VI的化合物能够被有机化学家通过使用一般已知的方法制备出来，这些方法包括方法在公布的专利申请US2007/0172878中被公开。在一个示例性的方法中，使N-取代的以及任选地环上取代的9，10-二氢化吖啶环化合物与强碱起反应，接着与CS₂反应，从而形成9，10-二氢化吖啶二硫代羧酸酯。该二硫代羧酸酯可通过惯常的方法进行酯化，以便安置R¹表示的取代基之一。得到的9，10-二氢化吖啶二硫酯被再次在非质子溶剂中用强碱比如正丁基锂(n-BuLi)或NaH去除质子化，并且用含有离去基团和R²部分的合适试剂进行S-烷基化。对有机化学领域的技术人员而言，显而易见R²部分可以经受进一步的操作，以便安置合适的反应基团。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,491,072、5,523,212、5,593,845和6,030,803中公开的9，10-二氢化吖啶酯、硫酯和氨磺酰。在该类中，化学发光标签化合物具有下述化学式VII所示的化学发光部分CL，其中，Z是O、S或NR¹¹SO₂Ar，其中R¹¹是烷基或芳基，其中Ar是芳基或烷基取代芳基，其中R¹是C_1-8烷基、卤素取代的C_1-8烷基、芳烷基、芳基、或者用下述基团取代的芳基：烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷氧基、烷氧基烷基、卤素、羰基、羧基、氨甲酰、氰基、三氟甲基、三烷基铵、硝基、羟基、氨基和巯基；其中，R²选自于烷基、杂烷基、芳基、以及芳烷基；并且其中，R^3-10皆是氢或者1个或2个选自于烷基、烷氧基、羟基、以及卤素的取代基；并且R^3-10的其余是氢。在一种实施方式中，R^3-10皆是氢并且R¹是标记性取代基。在另一个实施方式中，R^3-10之一是标记性取代基并且R^3-10中的其它是氢。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,922,558、6,696,569和6,891,057中公开的杂环化合物。在一种实施方式中，这些化合物包括杂环，该杂环包含氮、氧或者其上可键结环代双键的含硫五元环或六元环或多元环基团，该杂环的末端碳原子可用选自氧和硫原子的两种原子取代。

在另一个实施方式中，化学发光标签化合物包含如下化学式VIII所示的化学发光的9，10-二氢化吖啶烯醇衍生物，其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基、以及含1-20个碳原子的芳烷基，所述碳原子中的任何一个可以用1-3个基团取代，所述基团选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基、SO₃ ^-基、OSO₃ ^-2基、糖基、PO₃ ^-基、OPO₃ ^-2基、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团；其中，X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、烷基或包含1-20个碳原子的芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基、SO₃ ^-基、糖基和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团(其中R′和R″是独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基)、三甲硅烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子，其中Z选自于O和S原子，其中R⁶选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基，其中R^7-14各自是氢、或者1个或2个取代基是选自于烷基、烷氧基、羟基、以及卤素，并且其余的R^7-14是氢。在一个实施方式中，R^7-14中的每一个都是氢，并且R¹是标记性取代基。在另一个实施方式中，R^7-14之一是标记性取代基，并且R^7-14中的其它是氢。

在另一个实施方式中，化学发光标签化合物包含如下化学式IX所示的化学发光化合物，其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基、以及含1-20个碳原子的芳烷基，所述碳原子中的任何一个可以用1-3个基团取代，所述基团选自于羰基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基、SO₃ ^-基、OSO₃ ^-2基、糖基、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团；其中，X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、包含1-20个碳原子的烷基或芳基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基、SO₃ ^-基、糖基和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团(其中R′和R″是独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基)、三甲硅烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子，其中，Z¹和Z²各自选自于O和S原子，并且其中R²和R³独立地选自于氢和C₁-C₈烷基。

连接基团(L)。在本发明公开中使用的任何化学发光化合物中的连接基团可以是化学键、原子、二价基团和多价基团、或者是直链或支链原子，其中一些可以是环状结构的一部分。该取代基通常含有1至约50个非氢原子、更通常1至约30个非氢原子。在另一个实施方式中，含有链的原子选自C、O、N、S、P、Si、B以及Se原子。在另一个实施方式中，含有链的原子选自C、O、N、P以及S原子。在链中除碳原子以外的原子的数量通常是1-10。卤素原子可以作为取代基存在于链或环上。典型的包含可连接的取代基的官能团包括：亚烷基，亚芳基，亚链烯基，醚，过氧化物，羰基例如酮、酯、碳酸酯、硫酯，或者酰胺基，胺，脒，氨基甲酸酯，脲，亚胺，二酰亚胺，二酰亚胺盐，碳二亚胺，肼，重氮，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸酯，硫醚，二硫化物，亚砜，砜，磺酸酯，硫酸酯，以及硫脲基团。在另一个实施方式中，连接基团是含1-20个原子的亚烷基链，其末端为：-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-、或者-C(＝O)NR-基团，其中R是C_1-8烷基。在另一个实施方式中，连接基团是含3-30个原子的聚(亚烷氧基)链，其末端为：-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-、或者-C(＝O)NR-基团，其中R是C_1-8烷基。

反应基团。反应基团RG是原子或基团，其存在可以促进通过共价连接或者物理力而键合于另一种分子。在一些实施方式中，例如，当反应基团是离去基团比如卤素原子或甲苯磺酸盐基团、并且化学发光标签化合物被通过亲核置换反应而共价连接于另一种化合物上时，本发明公开的化学发光标签化合物连接至另一种化合物或者物质将涉及从反应基团上丧失一种以上原子。

在一种实施方式中，RG是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团。本领域的技术人员将很容易理解，待被用这样一种包含NHS酯基的标记化合物所标记的物质将会与该物质上的一部分(典型地为胺基)反应，在该过程中会断开酯C-O键，释放N-羟基琥珀酰亚胺，并且在所述物质的原子(如果为胺基，就是N)和所述标记化合物的羰基碳之间形成新的化学键。在另一个实施方式中，RG是肼部分-NHNH₂。如同本技术领域已知的那样，该基团会与待标记的物质中的羰基反应，从而形成酰肼连接物。

在其他实施方式中，当发生加成反应例如Michael加成时、或者当反应基团是异氰酸酯或者异硫氰酸酯基团时，化学发光标签化合物通过形成共价键而连接至另一种化合物将涉及反应基团内部化学键的重构。在另一些其他的实施方式中，连接不会涉及共价键形成，但涉及物理力，而在这样情况下反应基团保持不变。而物理力是指吸引力，比如氢键吸引力、静电吸引力或者离子吸引力；疏水性吸引力比如碱基堆积；以及特异性亲合力交互作用比如生物素-链霉抗生物素蛋白交互作用、抗原-抗体交互作用、以及核苷酸-核苷酸交互作用。

用于将标记化学结合至有机分子和生物分子的反应基团包括，但不限于，下述基团：a)胺反应性基团：-N＝C＝S、-SO₂Cl、-N＝C＝O、-SO₂CH₂CF₃；b)硫醇反应基团：-S-S-R；c)羧酸反应基团：-NH₂、-OH、-SH、-NHNH₂；d)羟基反应基团：-N＝C＝S、-N＝C＝O、-SO₂Cl、-SO₂CH₂CF₃；e)醛类/酮反应基团：-NH₂、-ONH₂、-NHNH₂；以及f)其他反应基团，例如、R-N₃、R-C≡CH。

在一种实施方式中，反应基团包括OH、NH₂、ONH₂、NHNH₂、COOH、SO₂CH₂CF₃、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺醚和顺丁烯二酰亚胺基团。

双功能偶联剂还可以用于用适度反应性的基团将标记偶联到有机分子和生物分子上(参见L.J.Kricka，配体-结合物测定法。Marcel Dekker公司出版，纽约，1985年，第18-20页，表2.2；和T.H.Ji，“双功能试剂”，酶学方法。91，580-609(1983))。有两种类型的双功能试剂：并入最终结构的双功能试剂，以及不并入最终结构、并且仅起偶联两种反应物作用的双功能试剂。

水溶液

适合本发明公开的水溶液一般是含有大于50％的水的溶液。在此描述的水溶液适合于使用包括反应混合物、样品稀释剂、校准溶液、化学发光标记的sbp溶液、被活化剂标记的sbp溶液、增强剂溶液、以及引发剂溶液；或者一种以上下述溶液的浓缩液：化学发光标记的sbp、被活化剂标记的sbp、增强剂、引发剂、样品、和/或选择性信号抑制剂。在许多实施方式中，水溶液是缓冲水溶液。合适的缓冲水溶液包括常用缓冲液中的任何一种，这些缓冲液能够维持水溶液中环境、维持分析物溶解性、维持反应物溶解性、并且允许化学发光反应进行。缓冲液包括：磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、三(羟基-甲基氨基)甲烷[tris]、甘氨酸、Tricine、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺、MOPS、HEPES、MES等等。典型地用于本发明公开的水溶液将具有大约5至约10.5范围内的pH。

合适的水溶液可包含一种或多种下述附加成分：盐，生物学缓冲液，醇类包括乙醇、甲醇、乙二醇，以及除垢剂。在一些实施方式中，水溶液包括Tris缓冲液水溶液比如缓冲液II(TRIS缓冲盐水，表面活性剂，＜0.1％叠氮化钠，0.1％ProClin

300(罗门哈斯公司)，可以通过商业途径从加州Brea市的贝克曼考尔特公司得到)。

在一些实施方式中，使用模拟人类血清的水溶液。一个这样的合成基质被是具有0.1％ProClin300的20MMPBS、7％BSA、pH7.5。合成基质可以用于，但不限于，样品稀释剂、校准溶液、化学发光标记的SBP溶液、被活化剂标记的SBP溶液、增强剂溶液、以及引发剂溶液。术语“PBS”涉及通常意义的本技术领域已知的磷酸盐缓冲盐水。术语“PBS”涉及通常意义的本技术领域已知的牛血清白蛋白。

测定模式

测定模式需要特异性结合反应来调节化学发光标记sbp上的化学发光标记与活化剂标记sbp上的活化剂标记的接近度。

在另一种实施方式中，使用分析物类似物，其含有活化剂-分析物类似物共轭物。活化剂-分析物类似物共轭物或活化剂-分析物共轭物将会与分析物进行竞争，来结合用于分析物的特异性结合伴侣。显然，在这类测定方法中，得到的结果是，样品中分析物的含量与化学发光强度逆向相关。

除通过用于结合性抗原或其他蛋白质的抗体或者其他抗体经由免疫测定法进行化学发光标签的连接之外，本发明的方法可以使用化学发光标记的核酸，用于通过互补核酸的结合来检测核酸。在这点上，该应用就核酸的大小而言没有特别限定，仅有的标准是，互补伴侣有足够的长度以便允许稳定的杂交。在此使用的核酸包括基因长度的核酸、核酸的较短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一种都可以是单链的或者是双链的。在本发明的使用核酸作为特异性结合伴侣的实施方式中，核酸可被共价连接或者物理地固定化在固体支持物的表面上，以捕获分析物核酸。可以将化学发光标记附着以便俘获核酸，或者可以按如上所述将标签与支持物相连接。该俘获核酸将具有与分析物核酸的序列区域完全的或者基本上完全的序列互补性。当基本上互补时，俘获核酸可以具有不与分析物互补的末端突出部分、末端环状部分或内部环状部分，只要其不会妨碍或者抑制与分析物的杂交。反向位置也可以出现在其中突出或环位于分析物核酸内部的位置。俘获核酸、分析物核酸、活化剂共轭物、以及第三核酸允许杂交。该第三核酸与分析物核酸的序列区域基本上互补，所述序列区域不同于与俘获核酸互补的区域。俘获核酸和针对分析物的活化剂共轭物核酸的杂交可以同时或者是依序地连续进行。该技术的结果是，借助于可使活化剂接近附接于支持物表面的化学发光标记的特异性杂交反应，使该化学发光标签转变为针对活化剂的反应构型。按如上所述提供引发剂溶液并且检测化学发光。

另一个实施方式包括一种变化，其中使用分析物与活化剂的共轭物。该分析物核酸-活化剂共轭物和分析物核酸将竞争性地与用于分析物核酸的特异性结合伴侣相结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈逆相关性。

除基于抗体和基于核酸的体系之外，其他特异性结合配对，例如通常为本领域的普通技术人员所熟知的结合测定法，可以用作根据本公开的测试方法的基础。也可以使用抗体-半抗原配对。示例性的配对有：抗荧光素/抗荧光素配对、地高辛配基/抗地高辛配基配对、以及硝基苯基/抗硝基苯基配对。

检测

通过任何合适的已知手段比如光度计、X射线胶片、高速感光胶片、CCD摄像机、闪烁计数器、化学光度计或可见光手段，可以检测通过本发明的方法发射的光。每种检测手段具有不同的光谱灵敏度。人眼是优选地对绿光灵敏，CCD摄像机显示出对红光的最高灵敏度，X射线胶片具有对紫外线、蓝光或绿光的最大应答，这些都是可利用的。检测装置的选择将取决于其应用和成本、方便性考虑、以及是否需要产生经常记录。在那些光发射过程迅急的实施方式中，更有利的是，在检测装置正使用的情况下，进行引发反应以产生化学发光。例如，可以在适合于接受试管或微孔板的壳体内，在放置于光度计中或者被置于CCD摄像机前的试管或微孔板中进行检测反应。

应用

本发明的测定方法发现了在许多类型的特异性结合配对测定法中的应用性。在这些应用中，首要的应用是化学发光酶联免疫吸咐分析法，比如ELISA。进行免疫化学步骤的各种测定形式和方案已为本领域技术人员所熟知，并且包括竞争性测试和夹心法测试。可以通过根据本发明公开的免疫测定法测试的物质种类包括：蛋白质、肽、抗体、半抗原、药物、甾族化合物及其他通常在免疫测定技术领域已知的物质。

本发明的方法还可用于核酸检测。在一个实施方式中，一种方法利用了酶标记的核酸探针。例举的方法包括：溶液杂交测定法、通过Southern杂交的DNA检测、Northern杂交的RNA检测、DNA测序、DNA指纹图谱法、集落杂交以及菌斑杂交法(plaque lift)，其进行过程对本领域的技术人员而言是众所周知的。

试剂盒

本发明的目的还在于提供根据本发明的方法进行测定的试剂盒。

在本发明的另一种实施方式中，试剂盒中含有的材料包括：化学发光标记sbp、活化剂标记sbp、选择性信号抑制剂、和引发剂溶液。在一些实施方式中，这些测定材料以水溶液方式制备。在一些实施方式中，一种以上测定材料以浓缩水溶液方式制备。将测定材料的浓缩水溶液提供为呈一定体积形式的反应混合物，以达到每种测定材料理想的最终浓缩。在一些实施方式中，提供附加的水溶液用于稀释浓缩水溶液。在其他实施方式中，以冻干或固体形态提供一种以上测定材料。在这些实施方式中，可以提供附加的水溶液用于将冻干或固体的测定材料转变为水溶液或浓缩水溶液。

在一些试剂盒的实施方式中，每种测定材料设置于独立容器中。在其他试剂盒的实施方式中，一种以上的测定材料设置于共用容器中。在另一些试剂盒的实施方式中，一种以上测定材料被设置于一个以微孔分隔开的共用容器中，其中每个微孔中都装有测定材料。

试剂盒在包装产品组合中可以包括：化学发光标签，其或者是游离的标签化合物、化学发光标记的特异性结合伴侣，或者是化学发光标记的辅助物质比如封闭性蛋白质；同时还有引发剂溶液和使用说明书。如果化学发光标记是由使用者进行的话，试剂盒还可以任选地含有活化剂共轭物、分析物标准样、对照物、稀释剂和反应缓冲液。

系统

通过使用一个系统，本发明公开所述的测定方法可以自动用于快速进行。用于进行本公开的测定的系统要求流体处置能力，能够等分并释放引发剂溶液至含有其他反应物的反应容器中，并读取所产生的化学发光信号。在这样一种系统的实施方式中，光度计被定位于当注射引发剂溶液时最接近反应容器的位置处。更适宜的是，包括光度计或其他检测设备的检测系统，与注入引发剂溶液的液体处理系统相连接而运作。另外，用于进行本公开的测定的自动化系统具有流体处置能力，能够等分并释放其他反应物和样品至反应容器中。在一种实施方式中，用于进行本发明测定方法的系统包括：一个运送样品到反应混合物中的液体处理系统，一个运送化学发光标记sbp、活化剂标记sbp、选择性信号抑制剂到反应混合物中的液体处理系统，一个运送引发剂溶液到反应混合物中来释放化学发光信号的液体处理系统，与一个检测化学发光信号的检测系统。其中运送引发剂溶液的液体处理系统与检测系统相连接而运作，用以在注入引发剂溶液时或随引发剂溶液的注入而测量化学发光信号的释放。取决于系统构造，这些液体处理系统可以是相同或不同的系统。

改进版的DXI 800仪器被改造，以便进行本发明公开的测定方法。未进行改变的DXI 800仪器的进一步说明可购买贝克曼考尔特公司的UniCel DXI使用指南

2007，在此引入本文以供参考。为了用于进行在此描述的方法，DXI

800免疫测定仪器通过并入光子计数光度计(与商业化使用的DXI 800仪器为相同型号)而改进，设置该光子计数光度计用于检测，其在注射引发剂溶液期间、以及在注射引发剂溶液后即刻进行检测时靠近反应容器的位置(离反应容器大约19mm)。

在DXI

800免疫测定仪内部的底物输送系统被用于输送引发剂溶液。为了方便起见，根据在此描述的方法的测定中并不需要的DXI800免疫测定仪上的一些附加部件被移去，这些附加部件例如是磁铁和用于分离和洗涤的抽吸系统，这些部件是常规的免疫测定所必需的，但是在本发明的方法中不使用。为了便于自动反应容器处理、吸取试剂、检测，使用改进的DXI

800免疫测定仪，并且温度控制在37℃。可以类似地使用商品化的测试设备，来进行在此描述的测定方法，只要该设备能够或者可以被改进得能将引发剂溶液注入反应容器中、并且以并行的或几乎并行的方式启动化学发光信号检测即可。其他仪器实例在下文中列出。化学发光信号的检测可以历时非常短，为几个毫秒，比如一个循环的光电倍增管(PMT)，或者可以延长为几秒钟。收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。

化学发光信号的检测可以历时非常短，为几个毫秒，比如一个循环的光电倍增管(PMT)，或者可以延长为几秒钟。收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。例如，在如下所述的典型工艺中，光强度合计为0.25秒、集中闪光。在其他的工艺中，光强度合计为5秒，第一个0.5秒在注射之前被延迟。

实施例

术语表

AHTL：N-乙酰基高半胱氨酸内酯

AK：9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇

CKMB：肌酸激酶同工酶

DMF：二甲基甲酰胺

EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

HRP：辣根过氧化物酶

MS-PEG：胺类-反应性线型聚乙烯乙二醇聚合物，具有末端甲基

Na₂EDTA：乙二胺四乙酸钠盐

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺

PEG：聚乙二醇；具体地说低聚物、或者分子量为＜20,000g/mol的聚合物

PEO：聚环氧乙烷；具体地说分子量为＞20,000g/mol的聚合物

PMP：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

PSA：前列腺特异性抗原

Sulfo-SMCC：硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羰酸酯

TBS：Tris-缓冲盐水

TnI：肌钙蛋白I；cTnI是心脏的肌钙蛋白I

Tris：2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇，亦称三(羟甲基)氨基甲烷

Tween

-20：聚氧化乙烯(20)单月桂酸钠；商品化购自Sigma-Aldrich公司，圣路易斯市(密苏里州)。

材料

已知浓度的样品：在测定和下述测定法中使用的已知浓度的样品，典型地通过下述方法制备：在不含分析物的人类血清中加入所指定分析物的纯化蛋白质。例如，已知PSA蛋白的PSA样品制备方法是将源自人类精液的PSA掺入不含PSA的女性血清中，达到在下面实施例的表格中显示的PSA浓度。样品如果使用前被储存，则需在4℃下储存或呈冰冻状态，使用前要解冻。通常按照制备校准液样品组的方法制备已知浓度的样品，所述校准液样品组用于产生标准曲线，该标准曲线与测定方法相结合，以确定未知分析物浓度的样品中的分析物浓度。

包含有增强剂的引发剂溶液：在许多下述实施例中使用的引发剂水溶液称为引发剂溶液A。引发剂溶液A含有在具有大约3％乙醇、25mM Tris缓冲水溶液pH 8.0中的8mM对羟基桂皮酸、1mM Na2EDTA、105mM过氧化脲、以及0.2％吐温

-20。所有组分都是购自各个供应商比如密苏里州圣路易市的Sigma公司。

缓冲液II：(Tris缓冲盐水、表面活性剂、＜0.1％叠氮化钠、以及0.1％ProClin300(罗门哈斯公司)，购自加州Brea市的贝克曼考尔特公司)。

仪器

改进版DXI800免疫测定仪(贝克曼考尔特公司)：改进的DXI

800仪器被用于进行下述几个实施例中标注的测定方法。为了用于进行在此描述的方法，DXI

800免疫测定仪器通过并入光计数光度计(与商业化使用的DXI 800仪器为相同型号)而改进，设置该光计数光度计用于检测，其在注射引发剂溶液期间、以及在注射引发剂溶液后即刻进行检测时靠近反应容器的位置(离反应容器大约19mm)。在DXI

800免疫测定仪内部的底物输送系统被用于输送引发剂溶液。为了方便起见，根据在此描述的方法的测定中并不需要的DXI

800免疫测定仪上的一些附加部件被移去，这些附加部件例如是磁铁和用于分离和洗涤的抽吸系统，这些部件是常规的免疫测定所必需的，但是在本发明的方法中不使用。为了便于自动的反应容器处理、吸取试剂、检测，使用改进的DXI800免疫测定仪，温度控制在37℃。可以类似地使用商品化的测试设备，来进行在此描述的测定方法，只要该设备能够或者可以被改进得能将引发剂溶液注入反应容器中、并且以并行的或几乎并行的方式启动化学发光信号检测即可。其他仪器实例在下文中列出。

化学发光信号的检测可以历时非常短，为几个毫秒，比如一个循环的光电倍增管(PMT)，或者可以延长为几秒钟。收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。

Luminoskan Ascent

滴定板光度计，(赛默飞世尔科技公司，Waltham，马萨诸塞州)。未改装。于室温操作本方法。

SpectraMax

L微孔板光度计，(Molecular Devices公司，Sunnyvale，加州)未改装。于室温用快速测读动力学模式操作本方法。

实施例1.筛选有SSIA效力的化合物

A.用均相PSA免疫测定法筛选SSIA

该实施例提供了一个用于测试在本发明公开的测定中具有SSIA功能的候选化合物的方法。在蛋白质PSA的模型筛选免疫测试中进行测试。使用96孔微量滴定板形式进行小鼠抗PSA测试。含有30μL小鼠抗PSA-AK1(66ng)、30μL小鼠抗PSA-HRP偶联物(7.8ng)、36μL的人类女性血清、以及24μL的PSA校准剂的溶液被移入每个孔中。孔板在37℃下孵育10分钟。将5μL等分的受测化合物(多种浓度)加至每个孔中。通过加入100μL的引发剂溶液A的溶液引发化学发光。在加入引发剂溶液后，使用Luminoskan Asent

平板光度计(赛默飞世尔科技公司，Waltham，麻萨诸塞州)，将化学发光闪光被积分5秒钟。

每个候选化合物都测试至少两个水平的PSA：0和129ng PSA/mL(校准剂S5)和/或2ng PSA/mL(校准剂S2)。为简便起见，对于每个候选化合物仅给出了一个有代表性的浓度。如果S5/S0相对于对照物得到提高，则化合物在提高测定性能方面被认为是有效的。在本发明筛选中，优选提高倍数至少是2(S5/S0≥大约20-30)，并且优选提高倍数至少是5(S5/S0≥大约50)，更优选S5/S0是≥100。在该筛选试验中，发现许多化合物显示出作为SSIA有效的，但发现其它化合物没有效果或者效果有限。

表9：受测化合物，最终浓度及S5/S0

B.用来筛选有效的选择性信号抑制剂(SSIA)的模型系统

还开发出模型体系，并且将其用于筛选并选出具有一定特征的化合物，该特征在本发明公开的测定中具有选择性信号抑制剂的功能。该模型体系使用共轭于BSA(牛血清白蛋白)的微粒、以及生物素化HRP，作为被活化剂标记的特异性结合配对。该BSA用链霉抗生物素蛋白和9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇化学发光标签(AK1)进行了标记，作为化学发光标记的sbp。在模型体系中，将含量变化的Btn-HRP以0、1、10、100和250ng/ml的浓度加至所述化学发光标记的特异性结合配对中。加入另外的未标记的HRP，达到在每个反应混合物中总的HRP浓度为500ng/ml。向化学发光标记的sbp微粒提供未标记HRP与被活化剂标记的sbp的组合，以便模拟样品。还加入作为SSIA的用于评估的化合物。然后以一种本发明公开的测定的方式，通过添加引发剂溶液来引发该模型体系的反应混合物。

C.模型系统材料的制备：

为了制备在微粒上的化学发光标记的sbp，用4倍摩尔过量的生物素-LC-硫代NHS(Pierce生物技术公司，Rockford，美国伊利诺伊州)对胎牛血清白蛋白(BSA)进行生物素化。经由脱盐或者透渗析除去未被结合的反应物。该生物素-BSA然后在20mM磷酸钠pH 7.2∶二甲亚砜75∶25(v/v)中与5倍摩尔过量的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇AK1起反应，接着在相同的缓冲液中脱盐。该二元标记(生物素和AK1)的BSA然后在0.1M硼酸盐缓冲液pH 9.5中，以每mg微粒大约20μg标记的BSA的浓度，在40℃处，与甲苯磺酰基活化的

(Invitrogen公司，Carlsbad，美国加利福尼亚州)偶联16-24h。在偶联后，微粒用0.2M TRIS碱、2％SDS、pH～11在40℃下解吸1h。解吸过程重复一个附加的时间。微粒然后被悬浮于0.1％BSA/Tris缓冲盐水(BSA/TBS)缓冲液中，并且以每mg微粒大约15μg SA的浓度加入链霉抗生物素蛋白(SA)。在室温下将链酶抗生物素蛋白与微粒混合45-50分钟。然后微粒洗涤三次，并且悬浮于相同的BSA/TBS中。这些碱性微粒的载荷是大约5μg生物素化蛋白质每mg微粒。

用4倍摩尔过量的生物素-LC-硫代NHS(Pierce生物技术公司，Rockford，美国伊利诺伊州)对HRP(罗氏诊断公司，美国印第安纳州印第安纳波利斯市)进行生物素化。另一选择是，也能使用25倍摩尔过量的生物素-PEO4-NHS。经由脱盐或者透渗析除去未被结合的反应物。

将每个用于评估的SSIA化合物以至少10倍于工作浓度的浓度溶于缓冲液II中。

D.用模型系统测试程序

将25μL的1mg/mL二元标记(生物素和AK1)的BSA M280颗粒与45μL的缓冲液II中工作浓度SSIA相混合。通过加入15μL的缓冲液II将测定体积调整为85μL。1加入15μL含有不同比率Btn-HRP∶HRP(生物素化HRP的含量为0、1、10、100和250ng/mL不等)的样品。反应混合物于37℃下孵育30分钟，然后加入100μL的引发剂溶液，记录光强度。包括引发剂溶液在内的反应混合物总体积是200μL，SSIA的终浓度为100μM。

表10

表11

表12

显示可本发明公开的测定法中作为SSIA使用的化合物包括：抗坏血酸，抗坏血酸的6-棕榈酸酯和5，6-异亚丙基衍生物，2-氨基苯酚，4-氨基-3-羟基苯甲酸，4-氯代儿茶酚和TROLOX(一种生育酚衍生物)，它们通过与对照物比较S0值而显示出背景信号减少，并且通过提高S1/S0值而显示出信噪比提高。

模型系统中，显示出SSIA效果不足的化合物有：谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、硫辛酸(一种二硫化物)、PEG化生育酚、N-乙酰-5-甲氧基色胺(色胺衍生物)、TEMPOL(稳定的硝基氧)、烟碱酰肼、烟酸、白藜芦醇、以及两种丙烯酰胺/二丙烯酰胺溶液。包括α和γ-生育酚在内、尿酸、以及阿魏酸在内的第二个化合物组出显示在75-88％范围内的S0信号减少，但并没有显示出S1/S0的提高直至第三校准剂水平在10ng/mL Btn-HRP。

使用如上所述的改进版Dxl免疫测定系统(贝克曼考尔特公司，Brea，加州)进行筛选测试。

实施例2：

以下实施例显示了有和无SSIA时的分析物无固相的免疫测定。该测定包括两种直接标记的抗体，每个抗体都对分析物有特异性结合亲合力。在此实施例中，为前列腺特异性抗体(PSA)。第一种抗体，为了方便由“Ab1”表示，其共价连接于一个以上(常常是2个)AK11分子。第二种抗体，由“Ab2”表示，其与HRP共价结合。材料的制备，测定的操作和结果如下所述。

A.Ab1-AK共轭物的制备

在下列实施例中，9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇化学发光化合物的NHS酯，在这里称为AK1(如上所示)被共价连接于前列腺特异性抗体(PSA)。下面的方法也可以被用于制备其他抗原的化学发光标记抗体或其他9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇化学发光化合物

AK1，一种氨基反应性的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇化学发光化合物以10mM于DMSO中制备。向3mg(6.6mg/mL)含PSA单克隆抗体的pH 7.4PBS中，加入10倍摩尔过量的AK1，黑暗中室温温育1小时。在用pH 7.4PBS平衡后的PD-10脱盐柱上纯化产物。产物含有共价连接于AK11上的抗单克隆(AK1的反应产物)，如下所示，用波浪线表示与抗体的连接键，AK11连接于抗体上可用的氨基基团。测量280和384nm处的吸光度来确定IgG浓度和AK11/IgG比率(3个AK11∶1个IgG)。

B.Ab-2-HRP共轭物的制备

在接下来的代表性合成工序中，辣根过氧化物酶(HRP)共价连接于抗体，前列腺特异性抗体(PSA)。按照在此教授的方法，可以制备其他的酶标抗体。

C.HRP的活化

将10mg HRP(Roche，10-814-393-001)溶解于2.0mL的1x PBS(137mMNaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH值为7.4)中。将DMSO(25ug/uL)中30倍摩尔过量的sulfo-SMCC(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)加入HRP溶液中，在黑暗中温育1小时。马来酰亚胺活化的HRP用PD-10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)于pH 7.4PBS中进行纯化。HRP浓度用分光光度法确定，使用消光系数2.275mL/mg-cm，波长403nm。

D.抗PSA单克隆抗体(Ab2)的活化

将50倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷盐酸盐(赛默飞世尔科技，Piscataway，新泽西州)加入到含有单克隆PSA抗体的pH 7.4PBS中，室温下在黑暗中反应1小时。单克隆PSA抗体，被指代为Ab2，其PSA结合位点不同于实施例2中的Ab1。硫醇化的抗体用PD-10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)于pH 7.4的PBS中纯化。抗体浓度用分光光度法确定，使用消光系数1.4mL/mg-cm，波长280nm。

E.Ab2-HRP共轭物的制备

将5倍过量的活化HRP加入活化-Ab2溶液中，得到共轭反应混合物。共轭反应混合物室温下于黑暗中在摇床上温育2小时。通过向共轭反应混合物中依次加入过量的L-半胱氨酸和碘乙酰胺(每步15分钟)，阻断未反应的硫醇和马来酰亚胺基团。在第一步中，加入过量(0.025倍反应容积)的50mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐(溶解于pH 7.4PBS中)，温育15分钟。在第二步中，与50mM pH 8.5硼酸盐(0.08倍反应容积)一起，加入过量(0.04倍反应容积)的50mg/mL碘乙酰胺(溶解于pH 7.4PBS中)到反应混合物中，在避免光照情况下于室温下额外温育15分钟。共轭物用pH 7.4PBS平衡后的Superdex 200柱子(GEHealthcare，Piscataway，新泽西州，Part No.17-5175-01)纯化。汇集含有共轭物的级分，并且HRP/IgG比率用分光光度法来确定，如A部分和B部分所述。计算出HRP/IgG比率为1.4.

SSIA存在时用直接酶标sbp进行PSA测定

Ab1-AK11共轭物以10μg/ml置于pH 7.4PBS中。Ab2-HRP共轭物0.25μg/ml置于pH 7.4PBS中。在第一个反应容器中，将25μlAb1-AK11共轭物、去离子水中的600μM抗坏血酸和25μlAb2-HRP共轭物加入到25μl样品中，温育15分钟。与没有SSIA的情况相比教，在第二个反应容器中，将25μl的Ab1-AK11共轭物、25μl水、25μl的Ab2-HRP共轭物加入到25μl样品中，温育15分钟。

紧接着温育后，通过注入100μl引发剂溶液A，启动第一个反应容器中的化学发光反应。与引发剂溶液注入反应容器中同时地，用置入光子计数光电倍增管(PMT)的光度计检测化学发光信号。收集整个3.85秒过程中的信号，将化学发光信号数据储存于电脑中。

每份样品用以上测定方法测三次。对于每个测定样品，从引发剂溶液开始注入反应容器中125毫秒开始，在整个495毫秒时间区间，收集RLU数据，每份样品每个单独轮次测定合计三次，取平均数，结果列于表13。计算每个浓度值的信噪比率(S/S0)。表13中的数据可用来生成刻度曲线，用于分析未知PSA浓度的样品。

表13.

接下来的实施例显示了有或无SSIA时，根据本公开的用直接标记的抗体进行分析物的无固相的免疫测定。从表13所示结果来看，无SSIA的直接标记抗体的测定在所测定PSA浓度的全部范围内都没有(分析物)剂量效应。相反，含有根据本发明SSIA的直接标记免疫测定法是有效的，从0(对照)到所有5个PSA浓度值都有剂量效应。因此，含SSIA的直接标记免疫测定法可以成功使用于测定其他样品中未知分析物的浓度。同样，加入SSIA在整个浓度范围(PSA，从0到101.6ng/mL)内都提高了信噪比(S/S0)。

实施例3：用于PSA测定的AB1-AK1、AB2-HRP共轭物

使用直接标记的化学发光标记sbp和活化剂标记sbp如下所述在溶液中进行对于PSA的测定。该实验另外还探究了使用具有不同纯度的共轭反应物的结果。

鼠抗PSA(MxPSA)(111μL，9mg/mL)和AK1NHS酯(106μL，1mg/mLDMF原液)在0.1M硼酸盐缓冲液pH 8.25(784μL)中反应。混合物在室温下混合90分钟。移去100μL反应混合物，加入2.6μL赖氨酸溶液(2mg/mL)并混合30分钟。此反应混合物于PBS缓冲液中稀释，用于“未提纯共轭物”的测定。按照本技术领域熟知的方法，用脱盐柱纯化以同样方法制备的共轭物，以便用于“已提纯共轭物”测定。

将30μL的MxPSA-AK1共轭物溶液(67ng)、24μL校准液(0-129ng/mLPSA)、30μL的MxPSA-HRP共轭物(7.8ng)、及36μL血清吸入白色微滴度板的孔中。滴定板于37℃下温育10分钟。加入5μL抗坏血酸溶液(5.5mM)。将滴定板放置于注射式微滴定板光度计中。用光度计加入100μL引发剂溶液A，从加入引发剂溶液起读取3秒钟化学发光信号。

“未纯化的”和“已纯化的”MxPSA-AK1共轭物反应的化学发光信号强度(相对发光单位，RLU)与反应混合物中PSA浓度的关系在下表中列出。

表14

当表14中显示的数据被转换为重对数坐标图时，会显示化学发光信号强度log值相对于PSA浓度log值在[PSA]为0.5ng/mL到129ng/mL区间无变化，大约呈线形，不论反应物MxPSA-AK1共轭物的纯度如何。

实施例4：竞争性免疫测定法

在竞争性免疫测定反应中，提供了利用化学发光标记俘获抗体结合被标记的分析物的分析物均相免疫测定。样品分析物环磷腺苷(″cAMP″)被HRP共轭从而得到cAMP-HRP反应物，其在俘获抗体(″俘获Ab″)上竞争分析物cAMP，该俘获抗体与AK5共轭形成俘获抗体-AK5复合体。这样，在俘获抗体-AK5-cAMP-HRP复合体刚一形成、并且加入在此描述的引发剂溶液时，就能观察到化学发光(即″光亮″)，光亮显示俘获抗体-AK5-cAMP-HRP复合体的形成。未与HRP共轭的分析物(cAMP)竞争俘获抗体-AK1复合体，当加入引发剂溶液时，产物俘获抗体-AK5-cAMP复合物不会产生化学发光(即，″无光″)。因此，分析物cAMP会竞争俘获抗体-AK5复合体，从而抑制俘获抗体-AK1-cAMP-HRP复合体产生的信号。

将兔抗cAMP(IMMUNOTECH，Marseille)0.1mg(20.3μL，来自4.93mg/mL原液)加入于1.7mL离心试管内162μL的0.1M硼酸钠缓冲液pH 8.25中。加入17.6μgAK5(17.6μL，来自1mg/mL DMF原液)。试管在快速涡旋混合后，置于回转摇床上室温下保持1小时。加入1.2uL L-赖氨酸(来自3mg/mL原液)以猝灭反应。反应混合物以(1∶1)稀释于0.4％BSA和PBS中，于4℃下贮存。cAMP-HRP按照文献制备，参见例如，JImmunological Methods，1992，155 31-40。cAMP购买自Sigma(圣路易斯，密苏里州)。于PBS中制备30nM cAMP原液，进一步在PBS中稀释，从而制成测定的样品校准液。见表15。

竞争性免疫测定方案如下。将AK5标记的单克隆兔抗cAMP(0.275μg/mL)(3μL)、HRP标记的cAMP(0.09375ug/mL)(3μL)和cAMP校准液(4μL)加入白色聚苯乙烯384低容量滴定板中。共轭物溶液在BSA中为0.2％。在室温下温育30分钟后，加入1μL 2-氨基酸(0.6875mM)，随后加入引发剂溶液(10μL)。引发剂溶液包含25mM pH 8Tris、8mM的p-羟基苯乙烯酸、1mM EDTA、0.2％吐温-20和0.1M过氧化脲。刚一注入引发物就立即测量光强度(Spectromax)1秒钟。反应物温育时不暴露于光照，也不经摇动。

如以下的表15所示，校准液的使用范围为0.137nM到10000nM。数据列在表15中，cAMP的IC₅₀值经计算为2.6nM。数据表明，当分析物cAMP水平超过100nM，可以达到化学发光信号的竞争抑制作用。

表15.cAMP的竞争性免疫测定

nM	平均值	信号抑制
			0	91646	0％
0.137	89089	3％
			0.412	83377	9％
1.23	66207	28％
			3.7	31156	66％
11.1	4576	95％
			33.3	943	99％
100	315	100％
			1000	173	100％
10000	167	100％

实施例5：制备包括化学发光标记、生物素化BSA、中性亲合素和抗体的化学发光标记sbp

该实施例描述了“四聚体”支架(scaffold)或复合物，通过生物素与链霉亲合素的非共价相互作用经自组装而形成。该实施例还显示了使用四聚体支架进行的分析物免疫测定。

A.用化学发光化合物和生物素标记BSA：

用sulfo-NHS-LC-生物素(赛默科技，Rockford，伊利诺斯州)标记的牛血清白蛋白(BSA)和AK1-NHS酯(Lumigen，Southfield，密歇根州)以每摩尔BSA中7摩尔AK1、每摩尔BSA中3摩尔生物素的摩尔比率混合，如实施例17所述，用PD-10脱盐柱纯化混合物。

B.中性亲合素-IgG共轭物的制备

如实施例2所述制备硫醇化抗-PSA单克隆抗体。

将3倍摩尔过量的马来亚酰胺活化的中性亲合素(赛默科技)加入到硫醇化的单克隆抗-PSA溶液(5mg)中，室温下在旋转器上黑暗中温育一小时。通过在共轭反应混合物中依次加入L-半胱氨酸和碘乙酰胺(每步15分钟)，封闭未反应的硫醇和马来亚酰胺基团。在用pH 7.4PBS平衡后的Superdex

200柱子(GE Healthcare，Piscataway新泽西州)上纯化共轭物，以便除去未反应的中性亲合素。汇集包含共轭物的HPLC级分，用来制备四聚体支架复合物。

C.制备含有中性亲合素共轭的IgG和标记的BSA的支架复合物

如上所述，将3倍摩尔过量的标记BSA加入到中性亲合素共轭的IgG中，在室温下30分钟允许形成复合物。如上所述，最终产物用HPLC纯化，产物贮存于4℃下，直到下次使用。

D.用四聚体支架进行的PSA免疫测定

基本上按照实施例2所述的方法进行PSA的免疫测定。简而言之，于反应容器中将相同体积的(每份25μL)四聚体支架、HRP共轭物、600μM抗坏血酸和PSA样品混合，于37℃下温育15分钟。温育后，在反应容器中注入100μL引发剂溶液A来启动化学发光反应。在注入的同时，用带光电倍增管(PMT)的光度计检测化学发光信号275毫秒，储存数据于电脑中。

如前所述，制备已知PSA浓度的样品，以达到表16中所示的PSA浓度。如上所述分析这些样品，数据被用来生成刻度曲线，来分析未知PSA浓度的样品。

表16.

实施例6.制备化学发光标记的辅助物、生物素化抗体和自组装链霉亲合素-IgG聚合物

在这个实施例中，将AK1标记的链霉亲合素与生物素化抗体混合，从而通过自组装形成聚合物。这些自组装的链霉亲合素/生物素-IgG聚合物可用作支架用于分析物免疫测定。

A.制备AK1标记的链霉亲合素

将AK11(Lumigen，Southfield，密歇根州)以30mg/mL的浓度溶解于无水DMSO中。将6摩尔当量加入10.1mg/mL于包含50mM NaCl的水中制备链霉亲合素溶液(链霉亲合素-plus

Prozyme，San Leandro，加州)中。反应允许在黑暗中进行60分钟，随后通过体积排阻色谱用pH 7.2PBS平衡后的Sephadex

G-25柱子(GE Healthcare，Piscataway新泽西州)进行纯化，通过紫外光谱使用下列等式确定AK11∶蛋白质的摩尔比率：

[AK11]＝A384/11,380cm-1M-1

[链霉亲合素]＝(A280-(A384/(A384/A280AK1)))/176,000cm-1M-1

第二个等式用来校正AK1在波长280nm处的吸光率。在这些条件下，4.3AK1每链霉亲合素的AK11∶链霉亲合素的摩尔比94％被达到。

制备AK11标记的抗cTnI单克隆抗体

按照实施例2所述的方法制备AK1标记的抗体，不同之处在于相对于IgG的15倍摩尔过量的AK1被用来制备直接标记的IgG。

B.制备生物素化抗cTnI单克隆抗体

将10倍摩尔过量的NHS-LC-生物素(赛默科技，Rockford，伊利诺斯州)加入抗cTnI单克隆抗体中，混合物在室温下温育2小时。生物素化抗体在pH 7.2PBS中通过渗析进行纯化，用商品生物素定量试剂盒(赛默科技)确定的生物素∶抗体的摩尔比率是4.9。

C.制备自组装聚合物支架

通过将2摩尔当量的生物素化cTnI抗体加入到1摩尔当量的AK11标记的链霉亲合素来制备自组装聚合物。混合物于黑暗中在室温下温育90分钟，以允许复合物生成。如实施例3所述，反应混合物用Superdex

200柱子纯化。汇集对应于(800kDa-＞1.5MDa)高分子量共轭物的HPLC级分，于4℃下贮存，直到使用。

D.cTnI免疫测定

cTnI免疫测定按如下方法进行。将每25μL自组装聚合物支架、或作为对照的直接标记抗体、HRP共轭物、600μM抗坏血酸和样品混合于反应容器中，温育15分钟。温育后，通过将100μL引发剂溶液A注入到反应容器中，启动化学发光反应。在注入引发剂溶液到反应容器中的同时，用带光电倍增管(PMT)的光度计检测化学发光信号275毫秒，数据储存于电脑中。

通过将已知含量的天然cTnI加入到正常人类血清中，以达到表17所示cTnI浓度，制备出已知浓度的cTnI样品。每份样品按如上所述方法(以及在实施例4中描述的PSA免疫测定)分析三次。对于每份测定样品在特定的时间区间内所收集的RLU数据，合计后取三次测定值的平均数。对于每个已知浓度的样品，确定其信噪比。

表17

表17中的数据显示，对于两种测定形式，在从0到190ng/mL的分析物TnI浓度范围内免疫测定的成功的剂量效应。实施例6的结果还显示出光强度的增加(平均RLU所示)、以及相对于使用9，10-二氢吖啶直接标记的抗体由于测定使用自组装链霉亲合素/生物素-IgG(抗体)聚合物而使信噪比率(S/S0)得以提高。

实施例7：制备包含化学发光标记、KLH、链霉亲合素-生物素-偶联抗体的化学发光标记sbp

该实施例显示了钥孔血蓝蛋白(KLH)在大聚合物支架的制备中的使用。马来酰亚胺活化的KLH与抗体共轭，并被AK1标记，以形成支架。实施例还显示了这种支架在分析物免疫测定中的应用。

A.cTnI单克隆抗体的硫醇化

通过下述方法使单克隆抗-cTnI硫醇化：在pH 9.0下，将50mM N-乙酰基高半胱氨酸内酯(AHTL)(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)加入到抗体中，允许混合物室温下反应1小时。如实施例2所述，被硫醇化的抗体用PD-10脱盐柱纯化。

B.KLH支架的制备与标记

将3.4mg硫醇化的抗cTnI加入10mg马来酰亚胺活化的KLH(#77605产品，赛默科技)中，所形成的溶液于室温下温育2小时。标记抗体-KLH共轭物的方法是，将溶解于0.7mL DMSO的0.9mg AK1-NHS酯加入溶液中，允许反应15分钟。然后共轭物使用30kDa MWCO Ultracell离心浓缩机(Millipore，Billerica，马萨诸塞州)通过缓冲液置换法(20mM磷酸盐，1mM EDTA)进行纯化。

C.使用大蛋白KLH支架的免疫测定

如实施例6所述，使用大蛋白KLH支架进行cTnI的免疫测定。按照实施例6中所述的方法制备已知cTnI浓度的样品。简而言之，将等体积(25μL)的10μg/mL(归一化为IgG浓度)KLH支架、1μg/mL HRP共轭物、水中600mM抗坏血酸与样品于反应容器中进行混合。混合物与100μL引发剂溶液A(也就是引发剂溶液)一起温育，从而启动化学发光反应。化学发光反应开始后，样品用SpectraMax

L微孔光度计调至快速测读动力学模式读数，化学发光信号记录大约0.12到0.21秒的时间段。免疫测定的结果列于表18中。

表18.

[cTnI]，ng/mL	RLU平均值
		0	20,675
0.1	61,589
		25.0	32,757,125

实施例8：制备包含化学发光标记、链霉亲合素微粒和生物素化抗体的化学发光标记sbp

该实施例描述了由AK1标记的链霉亲合素通过去溶剂化法而制备蛋白微粒的方法。在与生物素化抗体偶联后，链霉亲合素微粒可以被用作免疫测定的支架。

A.制备蛋白微粒

如实施例6所述制备AK1标记的链霉亲合素。将9.8mg(2mL)AK1标记的链霉亲合素加入到4mL玻璃反应小瓶中，用特氟龙搅拌棒以350rpm恒定速率搅拌。然后将2.8mL无水乙醇(Sigma-Aldrich，圣路易斯市，密苏里州)以2mL/分钟的速率逐滴加入，直到溶液变浑浊。然后将12μL 5％戊二醛溶液(Sigma-Aldrich；以1∶10稀释于蒸馏水)加入反应中，再另外混合60分钟，以便使通过去溶剂化形成的微粒中的链霉亲合素亚基发生交联。戊二醛的摩尔量等于9.8mg链霉亲合素中残存的赖氨酸的数量。然后加入12μL的0.832M乙醇胺水溶液(Sigma-Aldrich)以便终止反应，接着加入2.8μL的20％吐温

-20水溶液，以稳定微粒。

将微粒置入Slide-A-Lyzer透析盒(赛默科技，Rockford，伊利诺斯州)中，在含有0.01％吐温-20的pH 7.4PBS中于4℃下透析。透析缓冲液(1L)在24小时期间内换两次，以去除反应副产物。使用商业购买的二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(#23227产品，赛默科技)，测定微粒溶液中的链霉亲合素的浓度。使用SA-21链霉亲合素(E280＝3.2cm-1mg/mL-1)在已知浓度下制定标准，并且由标准或校准曲线计算微粒中蛋白质浓度。

用Delsa^TMNano Zeta电位和亚微米粒度分析仪(贝克曼考尔特)以光子相关谱法分析已纯化的微粒，发现其有大约4微米的平均直径。通过变化在此描述的条件(用于微粒去溶剂化的溶剂的体积、反应pH等)，可以达到理想的微粒粒度(约200nm到4μm)。

B.用链霉亲合素微粒测定cTnI

AK1标记的链霉亲合素微粒用PH 7.4的PBS中的生物素化抗-cTnI抗体涂覆，涂覆比例是0.23mg IgG每mg微粒。混合物在室温下温育，同时温和摇动30分钟使生物素化IgG与链霉亲合素微粒络合。然后将微粒在10,000x g下离心分离5分钟，除去含有未结合的IgG的上清。将微粒丸粒悬浮于含有0.1％吐温-20的pH 7.4PBS中，使链霉亲合素最终浓度为100μg/mL。

在测定稀释液中制备含有50μg/mL被抗-cTnI抗体(浓度为0.15μg/mL)包裹的链霉亲合素微粒、辣根过氧化物酶共轭物、375μM抗坏血酸和1mg/mL IgG(BCI编号270904)的混合物。通过加入70μL HRP共轭物/微粒混合物和30μL的每个样品到反应容器中，进行测定。通过将已知量的天然cTnI(Scipac，Sittingbourne UK)掺入正常人类血清中，制备已知cTnI浓度的样品，样品浓度由AccuTnI测定(贝克曼考尔特)所产生的剂量值进行赋值。在室温下温育15分钟后，样品用SpectraMax

L微孔板光度计(MDSAnalytical Technologies)以快速动力测读模式读数。以350μL/秒的速率注入同等体积的引发剂溶液A以启动化学发光反应，同时监测化学发光信号。使用SoftMax Pro软件分析数据。在启动化学发光后30毫秒开始，以20个数据点的累加值(10毫秒积分时间)报告数值，结果显示于表19中。

表19.

[cTnI]，ng/mL	RLU平均值
		22.900	10,055,867
5.100	2,296,862
		1.290	299,171
0.322	180,060
		0.031	49,456
0.000	37,747

实施例9：对于使用包含右旋糖苷支架和SSIA的化学发光标记sbp进行PSA测定的测定成分浓度变化

下面的实施例显示了使用包含可溶性右旋糖苷支架直接标记的化学发光化合物和抗体的化学发光标记sbp进行的分析物免疫测定。

在该实施例中，用于PSA的单克隆抗体特异性结合配对中的一个成员被共轭于一个用AK1偶联的右旋糖苷分子，如下面的实施例10所述，不同的是抗体被硫醇化并被共价连接于AK11标记的、马来酰亚胺活化的右旋糖苷。抗PSA-右旋糖苷共轭物被制备成10μg/ml、2.5μg/ml或0.5μg/ml的水溶液，如下表所示。第二个单克隆PSA抗体按如前所述方法被共轭于HRP，并且被制备成0.5μg/ml、0.1μg/ml或0.03μg/ml的水溶液，如下表所示。

通过将25μl样品放置入两个反应容器的每一个中进行测定。将25μl Ab1溶液、25μl水、25μlAb2溶液加入在第一个反应容器内的样品中，温育15分钟。在第二个反应容器中，将25μl的Ab1溶液、去离子水中浓度为200或500μM(如下表所示)的抗坏血酸(Sigma，圣路易斯，密苏里州)和25μlAb2溶液加入25μl样品中，温育15分钟。温育之后，在每个反应容器中注入100μl引发剂溶液A，启动化学发光反应。在注入引发剂溶液到反应容器中的同时，用置入光子计数光电倍增管(PMT)的光度计检测化学发光信号，信号收集持续3.85秒，数据储存于电脑中。

每份样品用以上测定方法测三次。对于每个测定样品，从开始向反应容器内注入引发剂溶液82.5毫秒开始收集在495毫秒时间区间内的RLU数据，每份样品每个单独轮次测定三次，合计取平均数，结果列于表20中。计算每个浓度值下的信噪比率(S/S0)。表20中的数据可用来生成校准曲线，用于分析未知PSA浓度的样品。

如前所述制备已知浓度的样品。依照前述方法将每份样品分析三次。

表20

这些接下来的示范性测定法使用与之前实施例相似的反应物。将PSA特异性结合配对中的一个成员共轭于一个偶联AK1的右旋糖苷分子，制备成10μg/ml、2.5μg/ml或0.5μg/ml水溶液，如下表所示。第二个单克隆PSA抗体按如上所述方法被共轭于HRP，制备成0.5μg/ml、0.1μg/ml或0.03μg/ml水溶液，如下表所示。

每份样品按照下列方法分析三次。

通过将25μl样品置于反应容器中，然后加入25μl Ab1溶液、如下表所示水中浓度为200或500μM的抗坏血酸、以及25μlAb2溶液，形成反应混合物，从而进行测定。混合仅通过每个反应物的释入，之后温育15分钟。温育后，在每个反应容器中注入100μl引发剂溶液A，启动化学发光反应。反应产生光，用光子计数光度计检测3.85秒，RLU数据储存于电脑中。

每份样品用以上测定方法测三次。对于每个受测样品，从引发剂溶液开始注入反应容器125毫秒开始收集在495毫秒时间区间内的RLU数据，每份样品每个单独轮次测定三次，合计取平均数，结果列于表21-23中。计算每个浓度值下的信噪比率(S/S0)和％CV。表中的数据可用来生成校准曲线，用于通过使用实施例中的材料与指导来分析未知PSA浓度的样品。

实施例9结果显示了使用不同的化学发光标记sbp、活化剂标记sbp和SSIA浓度和不同反应物比率的成功的免疫测定。实施例9的方法适用于确定未知样品中的分析物浓度，包括根据标准法生成用于确定PSA浓度的校准曲线。

表21

表22

表23

实施例10：制备包含化学发光标记、右旋糖苷-链霉亲合素支架、和生物素-偶联的抗体的化学发光标记sbp，用于在不同SSIA存在情况下测定TNI、CKMB和肌红蛋白。

A.用化学发光化合物、氨基和巯基活性的异双功能交联剂标记氨基修饰的右旋糖苷：

将5.2mg NHS-(PEO)8-马来酰亚胺(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)和22.1mg AK1、一种9，10-二氢吖啶烯酮二硫代缩醛-NHS酯、铵盐溶于DMSO至30mg/mL，合并，并加入在聚丙烯反应容器内的以14mg/mL溶于pH 7.2PBS的35mg 70kDa聚氨基右旋糖苷(Helix Research，#1209产品；70摩尔NH2/摩尔右旋糖苷)中。反应混合物室温下避光温育45分钟。通过将共轭物与10μL MS(PEG)8(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)一起在黑暗中室温下另外温育10分钟，聚氨基右旋糖苷上未反应的氨基基团被封闭。被活化的右旋糖苷用微量离心方法(14K x g，1分钟)澄清，并且在用含有1mMEDTA的pH 7.2PBS平衡后的Sephadex G-25柱子(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)上纯化，操作依照厂商说明书。

B.链霉亲合素的硫醇化：

将50倍摩尔过量的(5.63mg)2-亚氨基硫烷(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)加入到45mg(10mg/mL)链霉亲合素-plus

(Prozyme，Hay ward，加州)。将pH7.4PBS(1mL)加入到混合物中以提高反应物的pH值到7.0。混合物于室温下黑暗中温育45分钟。硫醇化的链霉亲合素在用包含1mM EDTA的pH 7.2PBS平衡后的Sephadex

G-25柱子(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)上纯化，操作根据厂商说明书。

C.硫醇化链霉亲合素与AK-衍生化并被马来酰亚胺活化的右旋糖苷的共轭

下一步，将活化后的右旋糖苷(A)与硫醇化的链霉亲合素(B)组合，并于室温下避光反应过夜。未反应的马来酰亚胺和硫醇基团随后用两步工艺封闭：第一步，将过量(0.025倍于反应体积)的50mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐(溶于pH 7.4PBS)加入共轭物中并温育15分钟；第二步，将过量(0.04倍于反应体积)的50mg/mL碘乙酰胺(溶于pH 7.4PBS)加入反应混合物中，与50mM pH 8.5硼酸盐(0.08倍于反应体积)一起，在室温下再避光温育15分钟。

D.纯化链霉亲合素-右旋糖苷-AK1共轭物

共轭物用微量离心方法(14K x g，2分钟)澄清，在用pH 7.4PBS平衡后的Superdex200柱子(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)上纯化，该柱子安装在Gold

HPLC系统(贝克曼考尔特公司，Brea，加州)上，该系统带有Binary Gradient 125泵并配连有Gilson FC 203B级分收集器的Diode Array 168 Detector上。设计流速为1mL/分钟；样品注入循环(loop)体积-1mL；分级(fractionation)-1mL/级分)。小心收集共轭物级分，用来排除少量的共轭后洗脱的未反应链霉亲合素。汇集的共轭物中链霉亲合素浓度用BCA蛋白测定法(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)确定，使用作为标准的预先确定浓度下的链霉亲合素plus

AK1浓度用分光光度法(E384＝13.6mg-1mL-1)确定。计算出的链霉亲合素浓度和共轭物汇集液中的AK∶链霉亲合素的摩尔比分别是1.47mg/mL和18∶1。

E.xPSA单克隆抗体的生物素化

通过将6倍摩尔过量的的NHS-(PEO)4-生物素(赛默飞世尔科技，Waltham，马萨诸塞州)(溶于DMSO至2mg/mL)加入到6mg MxPSA抗体(7.6mg/mL于pH 7.4PBS中)中，制备生物素化的PSA抗体。室温下温育60分钟后，生物素化抗体在用pH 7.4PBS平衡后的Sephadex G-25柱子(GE Healthcare，Piscataway，新泽西州)上纯化，操作根据厂商说明书。

F.生物素化抗体偶联于链霉亲合素-右旋糖苷-AK共轭物

进行偶联的方法是：将链霉亲合素-右旋糖苷-AK共轭物(1.47μg/mL)与生物素化的抗-PSA单克隆抗体(2μg/mL)在稀释液中(100mM pH 8.0Tris，150mM NaCl，0.2％吐温-20，0.1mM EDTA，1％BSA)一起温育30分钟。这对应于链霉亲合素∶生物素化抗体2∶1的摩尔比率。

G.用右旋糖苷支架化学发光标记sbp和SSIA测定TnI、CKMB或肌红蛋白

该实施例显示了检测分析物如Troponin I，CKMB或肌红蛋白的测定方法。对于每个测定，所用的特异性结合配对是一对单克隆抗体，每个抗体针对规定分析物上不同的抗原位点具有特异性。对于每个测定，第一个抗体被生物素化并被共轭于右旋糖苷-AK1-链霉亲合素支架(″Ab支架″)，该支架的制备方法与上面的实施例5中所述相似，共轭物在水溶液中的浓度为0.5μg/ml到2μg/ml。每个测定的第二个抗体按如上所述用HRP共轭(″HRP共轭物″)，共轭物在水溶液(100mM Tris，150mM NaCl pH 8.0，0.2％吐温20，0.1mM EDTA，1％BSA)中的浓度为0.25μg/ml或1μg/ml。

每个测定的操作方法是，将25μlAb支架、25μl 600μM水中的抗坏血酸、25μl样品和25μL HRP共轭物加入到反应容器中。反应混合物于37℃温育15分钟。反应容器置于适合光度计中检测，然后加入100μL引发剂溶液A，记录几秒时间的光强度。累计对应于集中于峰值信号经过大约302.5毫秒时间的光度计收集的数据，每份样品测定三轮次，取平均数，列于表24-26中。计算每份样品的信噪比。

该实施例的结果显示范本测定法对于其他分析物的应用。另外，实施例成功显示了利用不同浓度和反应物比率的化学发光标记sbp、活化剂标记sbp和SSIA的测定。实施例7的方法适用于确定未知样品中的分析物浓度，包括生成校准曲线，用以根据标准法确定TnI、CKMB或肌红蛋白浓度。

表24.TnI

表25.CKMB

表26.肌红蛋白

使用上述的改进版Dxl

(贝克曼考尔特)自动化免疫测定系统进行测定。

H.在TnI测定中使用不同SSIA进行测定

根据本发明，在TnI测定系统内容中显示了多种浓度等级的5种不同SSIA。抗坏血酸、TROLOX、吩噁嗪、3-氨基酪氨酸和2-氨基酸的浓缩原溶液，都可从Sigma Aldrich得到，以100mM制备于去离子水中。在反应试管中有400μL缓冲水溶液(100mM Tris，150mM NaCl，0.1mM EDTA，0.2％吐温-20和1％BSA，pH8.0)中的0.5μg/mL TnI M6抗体-HRP共轭物、400μL缓冲水溶液pH 8.0中的AK1-Dex70/31-链霉亲合素级分1)2∶1SA/Ab在2μg/mL Ab、和400μL含有已知浓度TnI分析物的校准标准液。为每个校准浓度准备一个试管。75μL Ab-HRP共轭物、支架和标准液的预混合溶液用octapet送入Corning/Sostar 96孔聚丙烯微孔板(白色，Corning Cat.#3355)的每个孔中，在室温下温育38-49分钟。下一步，将25μL 2mM、1mM或0.5mM的每种抗氧化剂浓缩溶液用可重复移液管吸入孔中。滴定板摇动10秒以便混合，并温育5到33分钟。用SpectraMax L带注射器的滴定板光度计进行检测。测读基线，接着将100μL引发剂溶液A注入每个孔中，测读化学发光信号。

表27：包含引发剂溶液体积的反应混合物中的信噪比和SSIA最终浓度。

结论：在这个有代表性的TnI溶液形态测定形式中，显示出所测试的所有SSIA都有效地提高了信噪比。

实施例11：制备包含化学发光标记、PAA支架和链霉亲合素-生物素-偶联抗体的化学发光标记sbp

该实施例描述了具有偶联于链霉亲合素的聚(丙烯酸)骨架、并共轭于生物素化抗体的支架的形成。该实施例还描述了使用PAA支架的用于分析物的免疫测定。

A.用化学发光生物素和生物素标记聚丙烯酸(PAA)：

2mg聚丙烯酸(PAA)钠盐(Polysciences，Warrington PA)溶解于0.4mL 100mM pH 6.0MES中。将50摩尔当量(20mg)EDC(赛默科技)和6mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸(赛默科技)溶于去离子水中，并加入PAA溶液中，同时进行混合来活化羧酸酯基团。活化20分钟后，将50摩尔当量(0.843mg)生物素-PEG4-酰肼(赛默科技)和制备于无水DMSO中的50摩尔当量(1.01mg)AK1-酰肼加入到PAA溶液中，并在室温下混合反应过夜。被标记的PAA使用10kDa MWCO离心浓缩机用缓冲液置换法(Millipore，Billerica MA)于pH 7.2PBS中纯化，5次置换后恢复到原始PBS中的体积。被生物素和AK1标记的PAA被命名为PAA-B。

B.用链霉亲合素偶联被标记的PAA

0.75mg/mL被生物素和AK1标记的PAA(PAA-B)的溶液制备于pH 7.4PBS中。100μA-B与13.75μL 10mg/mL链霉亲合素(Prozyme，Hay ward加州)溶液混合，相当于链霉亲合素对PAA为2∶1摩尔比率，混合物在4℃温育过夜。

C.生物素化抗体与链霉亲合素-PAA共轭物偶联形成最终支架

按照前面的实施例中所述的方法使抗体生物素化。通过使链霉亲合素-PAA-B共轭物与生物素化抗-cTnI在4℃温育过夜，将链霉亲合素-PAA-B共轭物与抗体偶联，形成PAA支架。链霉亲合素∶抗体摩尔比率为1∶1到1∶4。

D.使用PAA支架免疫测定TnI

PAA支架可如实施例6所述用于检测比如cTnI分析物的测定方法。TnI的第一个抗体与如上所述制备的PAA-AK1-链霉亲合素支架共轭，以2μg/L备在水溶液中。然后将第二个抗体共轭于HRP，以0.5μg/mL制备于水溶液，如实施例2所述。

按照实施例17所述方法进行免疫测定。简而言之，等体积的PAA支架、HRP共轭物、600μM的水中抗坏血酸与分析物样品被一起在96-孔微孔板上混合。

cTnI样品制备方法是，加入已知量的天然心脏肌钙蛋白I(Scipac；Sittingbourne UK)到正常人类血清中，如实施例6所述。简而言之，将已知浓度的TnI掺入正常人类血清中，并按照上述测定法分析。数据可用来生成分析未知浓度TnI的校准曲线。

表28.

b：通过用链霉亲合素作为标准液由尺寸排除色谱分析法计算输出值(SA∶PAA摩尔比)。

实施例12：制备化学发光标记sbp、PAA支架和硫醇化抗体

该实施例描述了AK1标记的PAA支架的制备，通过使用EDC化学法来制备马来酰亚胺，及经由硫醇-马来亚酰胺反应用单克隆抗TnI(284)抗体来共轭。该实施例也显示了用PAA支架用于分析物的免疫测定。

A.用化学发光化合物和异基双功能交联剂标记PAA

按实施例11所述的方法制备用AK1和马来亚酰胺标记的PAA(摩尔质量大约225,000。不同的是将于无水DMSO中制备的20摩尔当量的(N-[k-马来酰亚胺十一酸]酰肼)(赛默科技)和20摩尔当量的AK2加入到PAA溶液中，搅拌于室温下反应1小时。标记的PAA用10kDa MWCO Slide-A-Lyzer

透析盒(赛默科技)于pH 7.2PBS中渗析纯化。最终PPA浓度是1.4mg/ml，渗析过程中假设聚合物无损失。

B.单克隆抗-TnI(284)抗体的硫醇化

单克隆抗-TnI(284)抗体使用前于100mM pH 6.0MES缓冲液中渗析。Traut′s试剂(2-亚氨基硫烷盐酸盐)(赛默科技)以2mg/mL浓度溶于去离子水中。将6.4mg3.2mg/mL浓度的抗体与2.36μL的2-亚氨基硫烷(10摩尔当量每当量抗体)室温下反应1小时。硫醇化的抗体在用pH 7.2含有1mM EDTA的PBS平衡后的PD-10脱盐柱(GEHealthcare，Piscataway新泽西州)上纯化。

C.硫醇化抗体与用AK1和马来亚酰胺标记的PAA偶联

将105μL浓度1.4mg/ml的用AK1和马来亚酰胺标记的PAA溶液立即与0.6mg浓度为3.8mg/mL的硫醇化单克隆抗-TnI(284)抗体(相当于6当量抗体每当量PAA)混合。反应在4℃进行，反应产物用尺寸排除HPLC纯化。单独的HPLC产物级分(如表29中所示的Fr3，Fr4和Fr5)在免疫反应中评估。

D.用PAA支架免疫测定单克隆抗-TnI抗体

用被AK1和马来亚酰胺标记的PAA支架对单克隆抗-TnI进行免疫测定，如实施例20所述。简而言之，将等体积的被AK1和马来亚酰胺标记的PAA支架、HRP共轭物、600μM水中抗坏血酸和样品一起在反应容器中搅拌30分钟。混合物与100μL引发剂溶液A(也就是引发剂溶液)一起温育，以启动化学发光反应。反应开始后，样品在SpectraMaxL微孔板光度计上用快速测读动力学模式读数，记录大约0.12到0.21秒时间区间内的化学发光信号。对于每份样品，在通过加入引发剂溶液启动之前，收集5个基线读数。表29报告的数值是不同数据点的总和。

表29.

实施例13：制备包含化学发光标记、自组装聚合物及链霉亲合素-生物素-偶联抗体的化学发光-标记sbp

在下面的实施例中，将AK标记的链霉亲合素与生物素化聚丙烯酸(PAA)及通过自组装形成的聚合组合物相混合。这些自组装聚合物功能如同分析物免疫测定中的支架材料。

A.制备生物素化PAA

按照实施例6所述方法制备AK1标记的链霉亲合素和生物素化单克隆cTnI284抗体。

将200mg的225kDa聚(丙烯酸)钠盐溶于70mL的100mM pH 6.0MES中。为了活化羧酸酯基团，将2g的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳酰二亚胺盐酸盐和0.9g的N-羟基磺酸琥珀酰亚胺)溶于10mL去离子水中，并于混合下加入到PAA溶液中。在20分钟的活化后，45mg以2.25mg/mL浓度制备于无水DMSO中的生物素-PEG4-酰肼加入到PAA溶液中，室温下搅拌过夜。然后将生物素化PAA宰去离子水中充分渗析以去除反应副产品。渗析后，用SpeedVac

浓缩器(Thermo/Savant)在真空下干燥生物素化聚合物，干燥后的聚合物(110mg)以2mg/mL浓度溶于pH 7.2PBS中。用商品HABA试剂盒(赛默科技)确定生物素∶PAA的摩尔比率(25生物素∶PAA)。

实施例14：用PAA制备包含化学发光标记、自组装聚合物的化学发光标记sbp。

在此实施例中，生物素化聚丙烯酸(PAA)被用来终止聚合反应、并在聚合物形成后用来稳定，该聚合反应用于通过自组装形成聚合组合物，如实施例6所述。简而言之，生物素化抗体以最优摩尔比率与AK1标记的链霉亲合素组装(如前所述)。然后加入生物素化聚丙烯酸(PAA)来稳定自组装聚合物。

A.制备自组装聚合物

2.66mg/mL浓度的生物素化IgG与按实施例7所述方法制备的0.584mg/mL浓度的AK1标记的链霉亲合素相混合。将不同比率(从0.25到1.25)的生物素化IgG∶AK1标记链霉亲合素的混合物在4℃下温育过夜来进行自组装。

B.制备杂合构造物(Hybrid Constructs)

将自组装构造分成等份体积，以不同的PAA∶链霉亲合素摩尔比率(从0到1)加入生物素化PAA。在4℃下进行反应，温育过夜以形成稳定的杂合PAA构造物。

C.用PAA杂合支架进行免疫测定

如实施例11所述进行用PAA杂合支架免疫测定单克隆抗-TnI的操作。简而言之，等体积的PAA支架、HRP共轭物、600mM水中抗坏血酸和样品混合于一个反应容器中。将混合物与引发剂溶液A(也就是引发剂溶液)温育，启动化学发光反应。化学发光反应启动后，样品在SpectraMax

L微孔板光度计上用快速测读动力学模式读数，记录大约0.12到0.21秒时间区间内的化学发光信号。免疫测定的结果示于表30A-30E。

表30A

表30B

表30C

表30D

表30E

实施例15：制备包含化学发光标记、聚合HRP共轭物与链霉亲合素-生物素-偶联抗体的化学发光标记sbp

这个实施例显示了IgG聚合共轭物、酶辣根过氧化物酶(HRP)的制备及其作为液相免疫测定支架材料的应用。

A.制备HRP-IgG共轭物

对于酶的高碘酸盐氧化，将HRP以10mg/mL浓度溶于水。将100μL新制备的0.088M高碘酸钠在4℃下边搅拌边加入HRP中，反应适当时间(也就是20到40分钟)。加入二醇例如乙烯乙二醇来终止氧化反应，在4℃另外温育20分钟。将被氧化的酶在PD10柱子上脱盐，并洗提入适当的反应缓冲溶液比如PBS中，以便从过量氧化的和终止的反应物中分离出酶。

通过还原氨化反应制备氧化HRP与IgG的共轭物。将IgG与氧化HRP以1∶1的体积比、IgG比HRP为1∶4-15的摩尔比率混合。混合物在室温下反应两小时或过夜。加入10μL5M硼氢化物并在室温下反应30分钟。通过渗析或用脱盐法分离反应产物以便去除过量的还原剂。然后通过将共轭物施加于SE HPLC柱子上并收集分子量为450到1500KDa的共轭物，分离出产物。评估HRP∶IgG的比率，于标准SpectraMax液相SPARCL免疫测定中测试共轭物。

对于特异性分析物比如心脏肌钙蛋白I(cTnI)的免疫测定，使用下列的共轭物A、B或C按实施例11所述方法进行。简而言之，将等体积的IgG(33μg/mL)、HRP共轭物A、B或C(5mg/mL)、500μM水中抗坏血酸、以及样品一起于96孔微孔板中混合。混合物与引发剂溶液A(也就是引发剂溶液)一起温育，以启动化学发光反应。对于这些测定，将cTnI单克隆抗体M06以最终浓度1-10mg/mL脱盐加入100mM pH 9.6重碳酸盐缓冲液中。表31显示了用聚合HRP共轭物A、B或C进行cTnI免疫测定的结果。这些共轭物基本按如下所述方法制备：

B.制备单克隆cTnI抗体用于与氧化的HRP共轭

在与氧化的HRP共轭之前，将cTnI单克隆抗体用缓冲液置换成pH 7.2PBS(共轭物A&B)或pH 9.6碳酸钠(共轭物C)。

C.共轭物A和B：氧化HRP

HRP以5mg/mL溶于水。将100μL浓度为8.74mg/mL(0.088M)新鲜制备的高碘酸钠，在4℃下边搅拌边加入每毫升HRP中。混合物在室温下反应。对于共轭物A，反应时间大约20分钟；对于共轭物B，大约40分钟。对于每5mg HRP，加入17μL乙烯乙二醇并另外在4℃下温育20分钟，以终止氧化反应。1.0mL氧化后的酶在用pH 7.2PBS平衡后的PD10柱子上脱盐，以去除过量氧化物和猝灭试剂。

D.与IgG共轭

对于共轭物A和B，将2.5mg氧化的HRP与0.4695mL(2.5mg)IgG反应。共轭物反应过夜。新鲜制备10μL 4mg/mL硼氢化钾，并在每毫升反应混合物加入10μL此溶液。反应于室温下以缓慢持续的转化(inversion)进行30分钟。然后通过脱盐成PBS来分离产品混合物，以去除过量的还原剂。对于共轭物A和B，脱盐步骤后的IgG浓度是4.26mg/mL。共轭和还原后，通过将共轭物施加于SE HPLC柱子上、并收集分子量为450到1500KDa的共轭物来分离产物。按前述方法估算HRP∶IgG比率。

E.共轭物C：HRP的氧化

将HRP以5mg/mL溶于水。将100μL浓度8.74mg/mL(0.088M)新鲜制备的高碘酸钠在4℃边搅拌边加入每毫升HRP中。混合物在室温下反应20分钟。对于每5mgHRP，加入17μL乙烯乙二醇，以终止氧化反应，混合物另外在4℃下温育20分钟。

将1.0mL氧化的酶在PD10柱子脱盐成合适的反应缓冲液，比如1mM pH 4.5醋酸盐缓冲液，以便从过量氧化物和猝灭试剂中分离出酶。

D.与IgG共轭

将氧化的HRP与IgG用还原胺化法共轭。IgG与氧化的HRP以1∶1体积比、IgG比HRP为1∶4-15的摩尔比混合，混合物在室温下反应两小时或过夜。在即将进行化合反应前，将100μL 100mM pH 9.6碳酸盐缓冲液加入1mL氧化的HRP中。将1mL IgG与氧化的HRP以1∶1的体积比、IgG∶HRP大约1∶4的摩尔比混合，反应最少2小时。通过将所形成的共轭物立刻加入20μL新鲜制备的4mg/mL硼氢化钾中进行还原反应。还原反应可室温下以缓慢持续的转化进行30分钟。通过脱盐成PBS来分离混合物，以去除过量的还原剂。

共轭与还原后，通过将共轭物施加于SE HPLC柱子、并收集450至1500KDa分子量的共轭物来分离产品。按前述方法估算HRP∶IgG比率。

表31.

此说明书中的所有公开和专利申请，本领域技术人员以此为基础可以理解本发明，在此将其全部并入本文作为参考。

上述不同的实施方式只是作为举例，不能被解释为对发明的限制。本领域技术人员按照在此描述的实施方式和例举的应用，在不脱离本发明的实质精神和范围(此为下列权利要求所阐明)的情况下，也能很容易做出对本发明的不同修改和变化。

Claims

1.一种测定样品中分析物的方法，该测定方法包括：

通过以任何次序或同时加入下列物质，在水溶液中形成反应混合物：

样品，

化学发光标记的特异性结合伴侣，

活化剂标记的特异性结合伴侣，和

选择性信号抑制剂，

其中所有成分皆可溶于水溶液，

其中所述化学发光标记的特异性结合伴侣和所述活化剂标记的特异性结合伴侣可与样品中的分析物相结合，形成结合性复合体。

在反应混合物中加入引发剂溶液，其中引发剂溶液可释放出一种可检测的化学发光信号，该信号与反应混合物中与分析物结合的化学发光标记的特异性结合伴侣及活化剂标记的特异性结合伴侣的量相关。

2.如权利要求1所述的测定样品中分析物的方法，其特征在于，以任何次序或同时加入从而形成反应混合物的物质进一步包括增强剂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂可引起，在具有分析物的复合体中化学发光标记与活化剂标记之间的反应所产生的信号比率，超过不在这样的复合体中时化学发光标记与活化剂标记之间的反应所产生的信号比率。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组：在邻位或对位有至少两个羟基的芳香化合物，在邻位或对位有至少一个羟基和一个氨基的芳香化合物，在C-C双键上有至少两个取代的羟基的化合物，以及氮杂环化合物。

5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组：抗坏血酸，异抗坏血酸，Trolox，L-抗坏血酸6-棕榈酸酯，5，6-异亚丙基-L-抗坏血酸，BHT，谷胱甘肽，尿酸，生育酚，儿茶酚。

6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣包含直接或间接地连接于特异性结合配对成员的化学发光标记化合物，其中所述化学发光标记选自下组：芳香环二酰基肼，三羟基芳香化合物，9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩醛化合物，9，10-二氢化吖啶酯，9，10-二氢化吖啶硫酯，9，10-二氢化吖啶磺胺，9，10-二氢化吖啶硫醇衍生物，以及下述化学式VI所示的化合物，

其中R¹选自：烷基，链烯基，炔基，具有1到20个碳原子的芳烷基，其中任意一个碳可以被选自下组的1-3个基团取代：羰基，羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基团，OSO₃ ^-2基团，糖基，PO₃ ^-基团，OPO₃ ^-2基团，卤素原子，羟基，硫醇基，氨基，季铵基，或季鏻基；X选自：C₁-C₈烷基，芳基，芳烷基，具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基团，糖基，三烷基甲硅烷基，碱金属阳离子，碱土金属阳离子，铵基，三烷基鏻阳离子和由式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基，其中R′和R″独立地选自：C₁-C₈烷基，氰烷基，芳基和芳烷基；Z¹和Z²分别选自：O或S原子；R²和R³独立地选自：氢和C₁-C₈烷基。

7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的固定化特异性结合成员包含直接或间接地连接于特异性结合成员的化学发光标记化合物，其中所述化学发光标记是下式所示的化合物，

其中，

指化学发光标记上与特异性结合成员对应的附着点，R¹和R²独立地选自：被取代或未被取代的烷基，被取代或未被取代的链烯基，被取代或未被取代的炔基，被取代或未被取代的芳基，被取代或未被取代的有1-20个碳原子的芳烷基，其中当R¹或R²是被取代的基团时，它可以被1-3个选自下组的基团取代：羰基，羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基，OSO₃ ^-2基，糖基，PO₃ ^-基，OPO₃ ^-2基，卤素原子，羟基，硫醇基，氨基，C(＝O)NHNH₂基，季铵基，季鏻基；R³选自下组：烷基，被取代的烷基，被取代或未被取代的链烯基，被取代或未被取代的炔基，被取代或未被取代的芳基，被取代或未被取代的1-20碳原子的芳烷基，苯基，被取代或未被取代的苯甲基，烷氧烷基，羧烷基，以及烷基磺酸基，其中当R³是被取代的基团时，它可以被1-3个选自下组的基团取代：羰基，羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基，OSO₃ ^-2基团，糖基，PO₃ ^-基团，OPO₃ ^-2基团，卤素原子，羟基，硫醇基，氨基，季铵基，以及季鏻基。

8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂标记的特异性结合伴侣包含直接或间接连接于特异性结合配对成员的活化剂标记，其中活化剂标记选自下组：过渡金属盐，过渡金属络合物和酶，所述活化剂标记具有过氧化物酶活性。

9.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂标记化合物是过氧化物酶。

10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结伴侣中的至少一个包含选自下组的辅助物质：可溶性蛋白质，链霉亲合素，亲合素，中性亲合素，生物素，阳离子化牛血清白蛋白，fos蛋白，jun蛋白，可溶性合成树状聚合物，可溶性合成聚合物，可溶性天然聚合物，多糖，右旋糖苷，寡核苷酸，脂质体，胶束，以及泡囊。

11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其特征在于，增强剂是促进具有过氧化物酶活性的活化剂的催化周转的一种化合物或多种化合物的混合物。

12.如权利要求11中任一项所述的方法，其特征在于，所述增强剂选自下组：酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法中，其特征在于，所述引发剂溶液包含过氧化物化合物。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法中，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的增强剂：酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法中，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结合伴侣分别与样品中的分析物结合。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣包括连接于分析物类似物的化学发光标记，并且所述分析物和所述化学发光标记的类似物竞相与活化剂标记的特异性结合伴侣结合。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所有成分皆可溶于水溶液。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，没有成分直接或间接地共轭于微粒或其他固相。

19.一种用于检测样品中分析物的试剂盒，其包括：

分析物的第一个特异性结合伴侣，

共轭于所述第一个特异性结合伴侣的化学发光化合物，

分析物的第二个特异性结合伴侣，和

共轭于所述第二个特异性结合伴侣的活化剂化合物，

选择性信号抑制剂，以及

引发剂溶液。

20.如权利要求19所述的试剂盒中，其特征在于，所有的成分皆可溶于水溶液。

21.如权利要求19-20中任一项所述的试剂盒，其特征在于，没有成分直接或间接地共轭于微粒或其他固相。

22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组：在邻位或对位有至少两个羟基的芳香化合物，在邻位或对位有至少一个羟基和一个氨基的芳香化合物，在C-C双键上至少有两个取代的羟基的化合物，以及氮杂环化合物。

23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物选自下组：芳香环二酰基肼，三羟基芳香化合物，9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩醛化合物，9，10-二氢化吖啶酯，9，10-二氢化吖啶硫酯，9，10-二氢化吖啶磺胺，9，10-二氢化吖啶硫醇衍生物，下式VI所示的化合物，

其中R¹选自：烷基，链烯基，炔基，有1到20碳的芳烷基，其中任意一个碳可以被选自下组的1-3个基团取代：羰基，羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基团，OSO₃ ^-2基团，糖基，PO₃ ^-基团，OPO₃ ^-2基团，卤素原子，羟基，硫醇基，氨基，季铵基，季鏻基；X选自：C₁-C₈烷基，芳基，芳烷基，有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基，三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基，SO₃ ^-基团，糖基，三烷基甲硅烷基，碱金属阳离子，碱土金属阳离子，铵基，三烷基鏻阳离子和由式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基，其中R′和R″独立地选自：C₁-C₈烷基，氰烷基，芳基和芳烷基；Z¹和Z²分别选自：O或S原子；R²和R³独立地选自：氢和C₁-C₈烷基。

24.如权利要求19到23中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述活化剂化合物选自过渡金属盐、过渡金属络合物和酶，所述活化剂标记具有过氧化物酶活性。

25.如权利要求19-24中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的过氧化物：过氧化氢，过氧化脲，过硼酸盐。

26.如权利要求19-25中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的增强剂：酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。

27.一种用于进行权利要求1所述测定方法的系统，其包括：

将样品输送到反应混合物中的液体处理系统，

将化学标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣、选择性信号抑制剂输送到反应混合物中的液体处理系统，

将引发剂溶液输送到反应混合物中以便释放化学发光信号的液体处理系统，以及

用以检测化学发光信号的检测系统，

其中，用以输送引发剂溶液的所述液体处理系统与所述检测系统协调作用，以便在注入引发剂溶液时或注入后测量化学发光信号释放。