CN108291906A - 心肌肌钙蛋白i测定试剂以及方法 - Google Patents

心肌肌钙蛋白i测定试剂以及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子的心肌肌钙蛋白I测定试剂；以及一种心肌肌钙蛋白I的测定方法，其包括在聚阴离子性高分子的存在下，使用针对心肌肌钙蛋白I的抗体，对血液样品中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。

Description

心肌肌钙蛋白I测定试剂以及方法
技术领域
本发明涉及心肌肌钙蛋白I测定试剂以及方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白I是构成参与心肌收缩的调节的心肌肌钙蛋白复合体的3种亚基之一。心肌肌钙蛋白I在心脏中进行特异性表达，若心肌细胞受到伤害，则放出到血液中，因此，作为心肌梗塞的血液诊断标记而利用。
作为与心肌肌钙蛋白I的测定关联的技术，有以下报道。
在专利文献1中记载了，通过利用含有指定的阴离子性表面活性剂(具有1个磺酸酯基的烷基)的基质，而能够使心肌肌钙蛋白I稳定化。
专利文献2中记载了，在心肌肌钙蛋白I的免疫学测定中，能够利用2价的阳离子。
此外，以下的报道虽不关于心肌肌钙蛋白I的测定，但与蛋白质的免疫学测定相关联。
专利文献3中记载了，为抑制随着抗原抗体反应而产生的非特异性反应，在血清中加入聚阴离子。
专利文献4中记载了，为抑制间接免疫凝集测定中的非特异性反应，可以利用以硫酸酯基代替羟基的一部分而成的葡聚糖化合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/116005号
专利文献2：国际公开第2012/115221号
专利文献3：日本特开昭57-182169号公报
专利文献4：日本专利第3327070号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
心肌肌钙蛋白I用于心肌梗塞的诊断，但由于血液样品的种类不同，心肌肌钙蛋白I的测定值有时显示不同的值。例如，已知将血清用作血液样品时的心肌肌钙蛋白I的测定值以及将血浆用作血液样品时的心肌肌钙蛋白I的测定值不一定显示相同值。另外，在医疗现场，含有各种抗凝固剂(例如、肝素、EDTA、柠檬酸)的采血管被用于血浆的制备，但由于用于血浆的制备的抗凝固剂的种类不同，血浆中的心肌肌钙蛋白I的测定值有时显示不同的值。因此，在测定心肌肌钙蛋白I量的心肌梗塞的诊断中，存在有时不易采用不依赖血液样品的种类的一定值作为心肌肌钙蛋白I的cut off值的问题。
此外，由于早期进行对急性心肌梗塞的处置对生命预后的改善很重要，因此，对于急性心肌梗塞的诊断要求迅速性。因此，对于急性心肌梗塞的诊断，与要进行血块的凝集反应以及血块的除去这些消耗时间的处理的血清相比，更广泛使用不需要该处理的血浆。但是，如上所述，由于血浆的制备中所用的抗凝固剂的种类不同，心肌肌钙蛋白I的测定值有时显示不同的值。因此，在测定心肌肌钙蛋白I量的心肌梗塞的诊断中，通常指定血浆的制备中要用的抗凝固剂的种类、进一步指定采血管的种类。但是，如果能够以一定的值测定心肌肌钙蛋白I量而并不依赖采血管的种类，则在不需要指定采血管的种类这一点上通用性优良，而且还能够避免随着指定外的采血管的误用等不注意而产生的问题，因此优选。因此，期望开发一种能够以一定的值测定心肌肌钙蛋白I量而并不依赖血浆的制备中要使用的采血管的种类的方法。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人为解决上述技术问题深入研究的结果发现，通过在聚阴离子性高分子的存在下测定心肌肌钙蛋白I量，能够抑制各种样品之间的心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离，以及能够解决上述问题，从而完成本发明。
即，本发明提供以下的[1]～[11]。
[1]一种心肌肌钙蛋白I测定试剂，其含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子。
[2]根据[1]所述的试剂，其中，聚阴离子性高分子含有选自硫酸酯基、磺酸酯基、以及羧酸酯基中的基团。
[3]根据[1]或[2]所述的试剂，其中，所述试剂含有含所述抗体以及所述高分子的溶液。
[4]根据[3]所述的试剂，其中，所述溶液中的所述高分子的浓度为0.06mg/mL以上、且85mg/mL以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的试剂，其中，所述抗体为固定化抗体。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的试剂，其还含有心肌肌钙蛋白I的其它抗体。
[7]根据[6]所述的试剂，其中，所述其它抗体为标识化抗体。
[8]一种心肌肌钙蛋白I的测定方法，其包括：在聚阴离子性高分子的存在下，使用针对心肌肌钙蛋白I的抗体，对血液样品中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
[9]根据[8]所述的方法，其中，血液样品为血浆。
[10]根据[8]或[9]所述的方法，其包括以下(1)～(3)：
(1)制备针对心肌肌钙蛋白I的抗体、聚阴离子性高分子、以及血液样品的混合液；
(2)对混合液进行培养；以及
(3)对混合液中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
[11]根据[10]所述的方法，其中，所述混合液中的所述高分子的浓度为0.05mg/mL以上、且5.0mg/mL以下。
发明的效果
根据本发明，能够抑制各种样品之间的心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离。因此，本发明中，就对心肌肌钙蛋白I量进行测定的心肌梗塞的诊断而言，具有如下优点：容易采用不依赖血液样品的种类的一定值作为心肌肌钙蛋白I的cut off值。此外，本发明中还具有如下优点：能够以一定的值对心肌肌钙蛋白I量进行测定而并不依赖血浆的制备中要使用的采血管的种类。
附图说明
图1是表示使用了实施例1中记载的试剂A的、不存在葡聚糖硫酸钠时的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。(a)表示血清与肝素血浆的发光强度的相关性；(b)表示血清与EDTA血浆的发光强度的相关性；以及(c)表示血清与柠檬酸血浆的发光强度的相关性(在图2～11中也相同)。直线的斜率接近1，表示血清与血浆的测定值之差越小，血清与血浆的测定值的背离越得到抑制(在图2～11中也相同)。
图2为表示使用了含有0.77mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂A)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图3是表示使用了含有1.55mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂A)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图4是表示使用了实施例1中记载的试剂B，且葡聚糖硫酸钠不存在时的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图5是表示使用了含有0.5mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图6是表示使用了含有1.0mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图7是表示使用了含有2.0mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图8是表示使用了含有1.5mg/mL的葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图9是表示使用了含有1.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图10是表示使用了含有1.5mg/mL的聚丙烯酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
图11是表示使用了含有1.5mg/mL的N-月桂酰肌氨酸钠的抗体结合粒子溶液(试剂B)的心肌肌钙蛋白I的测定中的血清与血浆的发光强度的相关性的图表。
具体实施方式
＜1.本发明的试剂＞
本发明提供一种心肌肌钙蛋白I测定试剂，其含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子。
利用本发明的试剂测定的心肌肌钙蛋白I(cTnl)是构成参与心肌收缩的调节的心肌肌钙蛋白复合体的3种亚基(肌钙蛋白I、C以及T)之一。本发明中待测定的心肌肌钙蛋白I，为来自任意动物的心肌肌钙蛋白I，但优选为来自哺乳动物(例如、人、猴子、黑猩猩等灵长类；小鼠、大鼠、兔子等啮齿类；狗、猫等宠物动物；猪、牛等家畜；马、羊等使唤动物)的心肌肌钙蛋白I，更优选为来自灵长类的心肌肌钙蛋白I，特别优选为来自人的心肌肌钙蛋白I。关于来自人的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列，例如参照GenBank：CAA62301.1。当然，来自人的心肌肌钙蛋白I并不限定于参照上述编号所的氨基酸序列所形成心肌肌钙蛋白I，也可以为其突变体(例如，天然产生的突变体)。此外，本发明中测定的心肌肌钙蛋白I可以为游离型、与肌钙蛋白C和/或肌钙蛋白T的复合体的形式、以及与自身抗体等其他分子的复合体的形式中的任意形式。
本发明的试剂中所含的针对心肌肌钙蛋白I的抗体是将心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列的至少一部分作为表位进行识别的抗体。作为通过针对心肌肌钙蛋白I的抗体进行识别的表位，已知有以特异性表位为主的各种表位(例如、Filatov vl et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.1998，45(6)：1179-1187；国际公开第2012/115221号)。因此，针对心肌肌钙蛋白I的抗体没有特别的限定，可以为对这样的各种表位进行识别的抗体，但优选为使用了针对心肌肌钙蛋白I的抗体的并在心肌肌钙蛋白I的临床检查中广泛使用的表位。作为这样的表位，在来自人的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列中，例如，可列举出：包含第20位～第60位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位(例如，由第24位～第40位、或第41位～第49位氨基酸残基形成的肽)、包含第61位～第120号位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位(例如、由86～90号位的氨基酸残基形成的肽)、包含第130位～第150位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位、以及包含第160位～第209位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位。优选针对心肌肌钙蛋白I的抗体为对心肌肌钙蛋白I特异性表位(特别是人心肌肌钙蛋白I特异性表位)进行识别的抗体。
针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体的任一种。针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以是免疫球蛋白(例如，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)的任意同型。此外，针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以为全长抗体。全长抗体是指，含有重链以及轻链的抗体(例如、含有2个Fab部分以及Fc部分的抗体)，所述重链以及轻链分别含有可变区以及恒定区。此外，针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以为来自这样的全长抗体的抗体片段。抗体片段为全长抗体的一部分，例如，可列举出：恒定区缺失抗体(例如、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv)。此外，针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以为单链抗体等修饰抗体。
针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以使用以往公知的方法制作。例如，针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以使用上述的表位作为抗原进行制作。此外，对上述的表位进行识别的心肌肌钙蛋白I的多数抗体由于在市场上销售，因此，可以使用这样的市场上销售的产品。
针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以被固定化为固相。本说明书中，有时仅将被固定化为固相的抗体称作固定化抗体。作为固相，例如，可列举出：可收纳或搭载液相的固相(例如、板、膜、试管等支撑体；以及孔板、微流路、玻璃毛细管、纳米柱、整体柱等容器)；以及可悬浮或分散在液相中的固相(例如、粒子等固相载体)。作为固相的材料，例如可列举出：玻璃、塑料、金属、碳。此外，作为固相的材料，可使用非磁性材料、或磁性材料，但从操作的简便性等观点考虑，优选磁性材料。固相优选为固相载体，更优选为磁性固相载体，进一步更优选为磁性粒子。作为抗体的固定化方法，可利用以往公知的方法。作为这样的方法，例如可列举出：物理吸附法、共价结合法、利用亲和性物质(例如，生物素、链霉亲和素)的方法、以及离子结合法。在特定的实施方式中，针对心肌肌钙蛋白I的抗体为被固定化成固相的抗体，优选为被固定化成磁性固相的抗体，更优选为被固定化成磁性粒子的抗体。
针对心肌肌钙蛋白I的抗体可以利用标识物质进行标识化。本说明书中，有时将利用标识物质进行了标识化的抗体单纯称为标识化抗体。作为标识物质，例如，可列举出：酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、虫荧光素酶、β半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如，链霉亲和素、生物素)、荧光物质或蛋白质(例如，荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质)、发光或吸光物质(例如、荧光素、水母发光蛋白、吖啶鎓)、放射性物质(例如、3H、14C、32P、35S、125I)。此外，本发明的方法中使用2次抗体(例如，后述进一步形成的抗体)时，2次抗体可以利用这样的标识物质进行标识化。
本发明的试剂中还可以含有聚阴离子性高分子。
在本发明中，术语“聚阴离子性高分子”是指含有多个阴离子性部分的高分子。术语“阴离子性部分”是指带负电荷的基团或原子。作为阴离子性部分，例如，可列举出：硫酸酯基〔-O-S(＝O)2-O-〕、磺酸酯基〔-S(＝O)2-O-〕、羧酸酯基〔-C(＝O)-O-〕、磷酸酯基〔-O-P(＝O)(-O-)2〕、磷酸氢酯基〔-O-P(＝O)(-OH)(-O-)〕、带负电荷的硫原子〔-S-〕、以及带负电荷的氧原子基〔-O-〕。优选阴离子性部分为选自硫酸酯基、磺酸酯基、以及羧酸酯基中的基团。聚阴离子性高分子可以含有1种或2种以上的阴离子性部分。在此，聚阴离子性高分子中所含的阴离子性部分的数量，只要能够抑制心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离即可，没有特别的限定，可以由于阴离子性部分的种类不同而不同，但通常为5个以上，优选为15个以上，更优选为30个以上。聚阴离子性高分子中所含的阴离子性部分的数量可以为500个以下、400个以下、或300个以下。聚阴离子性高分子的分子量只要能够抑制心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离即可，没有特别的限定，可以由于阴离子性部分的种类及数量、以及聚阴离子性高分子的种类不同而不同，但通常为500以上，优选为1000以上，更优选为3000以上。此外，聚阴离子性高分子的分子量可以为100000以下、70000以下、或50000以下。另外，聚阴离子性高分子如后所述为聚阴离子性聚合物时，分子量只要没有特别说明，是指重均分子量。
聚阴离子性高分子可以为盐的方式。作为盐，例如，可列举出：无机盐以及有机盐。作为无机盐，例如，可列举出：铵盐以及金属盐。作为金属盐，例如，可列举出钠盐、钾盐等一价金属盐；钙盐、镁盐等二价金属盐。作为有机盐，例如，可列举出：用烷基取代而成的铵盐、含氮杂环化合物盐(例如，吡啶鎓盐)。
在优选的实施方式中，聚阴离子性高分子可以为含有重复单元的聚合物，所述重复单元含有如上所述的1种或2种以上的阴离子性部分。在本发明中，有时将含有含1种或2种以上的阴离子性部分的重复单元的聚合物称作“聚阴离子性聚合物”。聚阴离子性聚合物可以含有除含1种或2种以上的阴离子性部分的重复单元以外的结构单元。因此，聚阴离子性聚合物可以为均聚物，也可以为共聚物(例如、嵌段共聚物)。此外，聚阴离子性聚合物可以为线状聚合物、具有分支结构的聚合物、或者树枝状大分子。而且，聚阴离子性聚合物可以为由含有阴离子性部分的单体(根据需要，与其他结构单元的嵌段单元)的聚合而得到的聚合物，或者为通过在不含阴离子性部分的聚合物中导入多个阴离子性部分而得到的聚合物(例如，专利第3327070号公报中记载的、羟基由硫酸酯进行取代而成的葡聚糖化合物)，优选为通过含有阴离子性部分的单体进行聚合而得到的聚合物。聚阴离子性聚合物可以为盐的形式。
本发明中，就聚阴离子性聚合物中的重复单元的数量而言，只要能够抑制心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离即可，没有特别的限定，例如，可以为5个以上、10个以上、15个以上、20个以上、30个以上、或40个以上。聚阴离子性聚合物中，含有阴离子性部分的重复单元的数量，例如，可以为500个以下、400个以下、或300个以下。
具体地，作为聚阴离子性聚合物，例如，可列举出：聚硫酸化合物(例如，葡聚糖硫酸、硫酸软骨素)、聚磺酸化合物(例如，聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸)、聚羧酸化合物(例如，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚富马酸)、聚阴离子性多糖类(例如，葡聚糖硫酸、羧甲基葡聚糖、卡拉胶、黄原胶)、以及聚阴离子性蛋白质(例如，聚天冬氨酸、聚谷氨酸)。优选聚阴离子性聚合物可以为葡聚糖硫酸、聚苯乙烯磺酸、或聚丙烯酸。
聚阴离子性高分子可以通过以往公知的方法制作。例如，可以通过对含有阴离子性部分的单体进行聚合的方法，或者在不含阴离子性部分的高分子中导入阴离子性部分的方法制作。作为聚阴离子性高分子，可以使用市场上销售的产品。
此外，本发明的试剂，除含有上述针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子以外，还可以含有其它抗体。作为其它抗体，例如，可列举出：对与上述针对心肌肌钙蛋白I的抗体不同的表位进行识别的心肌肌钙蛋白I的其它抗体；对针对心肌肌钙蛋白I的抗体的恒定区进行识别的抗体；以及对针对心肌肌钙蛋白I的抗体与心肌肌钙蛋白I的复合体进行识别的抗体。这样进一步形成的抗体，例如，可以作为2次抗体使用。
在特定的实施方式中，就本发明的试剂而言，作为进一步形成的抗体，含有对与针对心肌肌钙蛋白I的抗体不同的表位进行识别的心肌肌钙蛋白I的其它抗体。如上所述的其它抗体识别的表位的详细情况，与对上述的针对心肌肌钙蛋白I的抗体进行了详述的表位相同(但是，组合使用时，表位的种类不同)。通过针对心肌肌钙蛋白I的抗体进行识别的表位、与通过心肌肌钙蛋白I的其它抗体进行识别的表位的组合，没有特别的限定。例如，作为针对心肌肌钙蛋白I的抗体，使用对包含第20位～第60位的氨基酸残基的肽部分中所发现的特定的表位(例如，包含第24位～第40位、或包含第41位～第49位的氨基酸残基的肽)进行识别的抗体时，作为心肌肌钙蛋白I的其它抗体，可以使用对以下表位进行识别的抗体：该特定表位以外的表位，例如，包含第20位～第60位的氨基酸残基的肽部分中发现的其它表位(例如，包含第24位～第40位、或者第41位～第49位的氨基酸残基的肽)；包含第61位～第120位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位(例如，包含第86位～第90位的氨基酸残基的肽)；包含第130位～第150位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位；或包含第160位～第209位的氨基酸残基的肽部分中发现的表位。例如，在利用三明治法的情况下，优选使用如上所述的其它抗体。
而且，本发明的试剂，可以含有除上述的物质以外的成分。作为这样的成分，例如，可列举出：缓冲液或稀释液(例如，MES缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液)、上述的标识物质、以及与标识物质反应的基质(例如，标识物质为酶的情况下，为酶的基质)。就缓冲液的pH而言，与作为含有抗体的缓冲液的pH通常所采用的pH相同，但使用含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体的缓冲液时，作为该缓冲液的pH，需要使聚阴离子性高分子中的阴离子性部分维持为负电荷的状态的pH。这样的pH由于聚阴离子性高分子的种类不同而不同，例如为5～9，优选为5.6～7.6。
本发明的试剂可以在使用针对心肌肌钙蛋白I的抗体的免疫测定中利用。作为这样的免疫测定，例如，可列举出直接竞争法、间接竞争法、以及三明治法。此外，作为这样的免疫测定，可列举出：化学发光免疫(CLIA)(例如，化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、免疫比浊法(TIA)、酶免疫测定法(EIA)(例如、直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、以及三明治ELISA)、放射免疫(RIA)、乳胶凝集反应法、荧光免疫(FIA)、以及免疫层析法。
本发明的试剂以彼此隔离的方式或在组合物的方式中含有各构成成分。具体而言，各构成成分可以以分别被收纳在不同的容器(例如，小管、平板)中的方式而提供，但可以以一部分的构成成分为组合物的方式(例如、相同溶液中)被提供。或者，本发明的试剂也可以以装置的方式而提供。具体地，可以以构成成分的全部被收纳在装置中的方式而提供。或者，可以以构成成分的一部分被收纳在装置中的方式而提供，也可以以残留的部分未被收纳在装置中的方式(例如，被收纳在不同的容器中的方式)而提供。此时，未被收纳在装置中的构成成分，可以在对目标物质进行测定时，通过被注入到装置中而被使用。
在特定的实施方式中，含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子的本发明的试剂，以在相同或不同的容器中含有关于针对心肌肌钙蛋白I的抗体的溶液或粉末、以及关于聚阴离子性高分子的溶液或粉末的试剂盒的方式而提供，但从省略准备制备的工序等观点考虑，可以以在相同溶液中含有心肌肌钙蛋白I、以及针对心肌肌钙蛋白I的抗体的方式(预混合)而提供。本发明的试剂中，聚阴离子性高分子以溶液的方式被提供时，溶液中的聚阴离子性高分子的浓度，也由于与要分析的样品的混合比例、以及稀释倍率等使用条件的不同而不同，例如为0.06mg/mL以上、且85mg/mL以下。溶液中的聚阴离子性高分子的浓度，优选为0.08mg/mL以上、更优选为0.2mg/mL以上、更进一步优选为0.8mg/mL以上。此外，溶液中的聚阴离子性高分子的浓度，优选为8.5mg/mL以下、更优选为4.0mg/mL以下、更进一步优选为3.0mg/mL以下。
优选的实施方式中，本发明的试剂可以具有与应当采用的免疫测定的种类相应的构成。例如，采用三明治法时，本发明的试剂，可以含有作为必需的构成成分的i)针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及ii)聚阴离子性高分子；以及作为任意的构成成分的iii)心肌肌钙蛋白I的其它抗体、iv)标识物质、v)稀释液(缓冲液)；以及、根据需要添加的vi)与标识物质进行反应的基质。i)以及ii)的构成成分，可以包含在相同溶液中。iii)的构成成分可以利用iv)标识物质进行标识化。优选针对心肌肌钙蛋白I的抗体能够被固定化为磁性粒子。本发明的试剂的构成的具体例有i’)含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体进行固定化的磁性粒子、以及聚阴离子性高分子的缓冲液、ii’)含有心肌肌钙蛋白I的其它抗体(利用标识物质进行标识化)的缓冲液、以及iii’)稀释液(缓冲液)。
就本发明的试剂而言，由于血液样品中的心肌肌钙蛋白I量能够以不依赖血液样品种类的一定的值的形式进行测定，因此，例如，可以用作血液样品的检查药。此外，就本发明的试剂而言，从血液样品中的心肌肌钙蛋白I量能够以不依赖血液样品种类的一定的值的形式进行测定的事实可知，认为通过将混入到样品中的多种多样的杂质的影响排除，能够使心肌肌钙蛋白I与抗体的相互作用稳定化，因此认为，在混入有多种多样的杂质的除血液样品以外的样品中的心肌肌钙蛋白I量的测定中也优选。作为血液样品等样品，可以使用经过预处理的样品。作为这样的预处理，例如，可列举出：离心、分级、萃取、过滤、沉淀、加热、冷冻、冷藏、以及搅拌。
在优选的实施方式中，本发明的试剂可以作为疾病(例如，急性心肌梗塞、心肌炎)的诊断药使用。作为样品，优选血液样品。
作为血液样品，可以利用任意种类的血液样品，例如，可列举出血清以及血浆。作为血浆，可以利用利用抗凝固剂处理过的血浆(例如，在含有抗凝固剂的采血管中收集的血浆)。作为这样的抗凝固剂，例如，可列举出：肝素、EDTA、柠檬酸及它们的盐、以及氟化钠，但并不限定于此。此外，作为血液样品，可以利用来自任意动物的血液样品，但优选为如上所述的哺乳动物的血液样品，更优选为如上所述的灵长类的血液样品。从人的临床应用的观点考虑，特别优选人的血液样品。
作为EDTA血浆，通常，使用在全血样品中加入适量EDTA盐(例如，若为EDTA二钠，为约1.5mg/mL或约2.0mg/mL；或者，若为EDTA二钾，为约1.8mg/mL、约1.85mg/mL、或约1.9mg/mL)，颠倒混和后，通过离心分离而除去血球成分之后的EDTA血浆。作为柠檬酸血浆，通常使用在全血样品中加入适量柠檬酸盐(例如，若为柠檬酸钠，为约3.2mg/mL)，颠倒混和后，通过离心分离而除去血球成分后的柠檬酸血浆。作为肝素血浆，通常使用在全血样品中加入适量肝素盐(例如，若为肝素钠，为约13IU/mL)，颠倒混和后，通过离心分离而除去血球成分后的肝素血浆。
本发明的试剂是能够抑制该心肌肌钙蛋白I测定值在各种血液样品之间的背离的试剂。各种血液样品之间的测定值的背离比例(将作为基准的血液样品(例如为血清)的测定值设为a，将与作为基准的血液样品进行比较的血液样品(例如为EDTA血浆、柠檬酸血浆、肝素血浆)的测定值设为b时，为测定值a与测定值b之差的绝对值|a-b|与测定值a的百分率，以(|a-b|/a)×100(％)算出)，优选为小于15％，更优选为小于10％，进一步优选小于5％，更进一步优选小于1％，特别优选小于0.5％。
＜2.本发明的方法＞
此外，本发明提供一种心肌肌钙蛋白I的测定方法。本发明的方法包括，在聚阴离子性高分子的存在下，使用针对心肌肌钙蛋白I的抗体对血液样品中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。心肌肌钙蛋白I、针对心肌肌钙蛋白I的抗体、聚阴离子性高分子、以及血液样品的定义，实例以及优选的实例如上所述。
就本发明的方法中使用的聚阴离子性高分子而言，只要存在能够对由于血液样品的种类而产生的心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离进行抑制的量即可。
就心肌肌钙蛋白I量的测定而言，例如，可以通过上述的免疫测定进行。虽没有特别的限定，但其中优选三明治法和/或化学发光酶免疫测定法(CLEIA)。
具体而言，本发明的方法可以包括以下(1)～(3)。
(1)制备针对心肌肌钙蛋白I的抗体、聚阴离子性高分子、以及血液样品的混合液；
(2)对混合液进行培养；以及
(3)对混合液中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
在工序(1)中，混合液可以如下制备：适当混合针对心肌肌钙蛋白I的抗体的溶液或粉末、聚阴离子性高分子的溶液或粉末、以及血液样品、以及根据需要添加的稀释液。作为溶液或稀释液，例如，可列举出：水(例如，蒸馏水、灭菌水、灭菌蒸馏水、以及纯水)、以及如上所述的缓冲液，但优选缓冲液。可以优选预先制备含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子的溶液，接着，对如上所述进行操作而制备的溶液与血液样品、以及根据需要添加的稀释液进行混合。
混合液中的聚阴离子性高分子的浓度，只要为能够抑制由血液样品种类的不同引起的心肌肌钙蛋白I量的测定值的背离的浓度即可，没有特别的限定，可以因样品的种类的不同而不同，但例如为0.05mg/mL以上、且5.0mg/mL以下。混合液中的聚阴离子性高分子的浓度可以优选为0.1mg/mL以上，更优选为0.3mg/mL以上，更进一步优选为0.5mg/mL以上。此外，混合液中的聚阴离子性高分子的浓度可以优选为2.0mg/mL以下，进一步优选为1.5mg/mL以下，更进一步优选为1.0mg/mL以下。
工序(2)中，就混合液的培养而言，可以在对于形成能够在血液样品中存在的、心肌肌钙蛋白I与针对心肌肌钙蛋白I的抗体的复合体而言充分的时间下及合适的温度下进行。如上所述的时间与通常的免疫测定中采用时间是相同的时间，例如为1分钟～24小时。如上所述的温度与通常的免疫测定采用温度是相同的温度，例如为5～40℃。
工序(3)中，就混合液中的心肌肌钙蛋白I量的测定而言，可以通过利用针对心肌肌钙蛋白I的抗体，在如上所述的免疫测定中进行。通过对混合液中的心肌肌钙蛋白I量进行测定，可以评价存在于血液样品中的心肌肌钙蛋白I量。
本发明的方法，可以包括预处理的工序。作为这样的工序，例如，可列举出：离心、分馏、萃取、过滤、沉淀、加热、冷冻、冷藏、以及搅拌。
本发明的方法，由于能够以不依赖血液样品种类的一定的值对血液样品中的心肌肌钙蛋白I量进行测定，因此，例如，能够用于利用血液样品的检查。优选本发明的方法用于如上所述的疾病的诊断中。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[实施例1]心肌肌钙蛋白I测定试剂的制备、测定法以及待测样品的制备
作为心肌肌钙蛋白I测定试剂，制备抗体配对不同的以下的试剂A以及试剂B。
＜试剂A＞
·抗体结合粒子溶液(固定化抗体溶液)：制备含有0.025％(w/v)的抗体结合磁性粒子、50mM的2-吗啉乙磺酸(MES)、1.0％(w/v)的来自牛血清的白蛋白(BSA)、以及50mM的NaCl的抗体结合粒子溶液(pH6.8)，所述抗体结合磁性粒子通过在羧基化磁性粒子(富士REBIO株式会社制造)上结合对作为表位的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列(例如参照GenBank：CAA62301.1、以下相同)第41位～第49位进行识别小鼠单克隆抗体而得到。
·标识化抗体溶液：制备含有0.5μg/mL的标识化抗体、50mM的MES、2.5％(w/v)的BSA、100mM的NaCl、0.3mM的ZnCl2、以及1.0mM的MgCl2的标识化抗体溶液(pH6.8)，所述标识化抗体通过利用碱性磷酸酶(高比活性、糖降低的重组体、Roche株式会社制造)对下述抗体进行标识而得到，所述抗体对作为表位的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列第86位～第90位进行识别。
将这些溶液填充至自动免疫测定装置(lumipulse G1200、富士REBIO株式会社制造)用的药筒(cartridge)。
＜试剂B＞
·抗体结合粒子溶液(固定化抗体溶液)：制备含有0.025％(w/v)的抗体结合磁性粒子、50mM的2-吗啉乙磺酸(MES)、1.0％(w/v)的BSA、以及50mM的NaCl的抗体结合粒子溶液(pH6.8)，所述抗体结合磁性粒子通过在羧基化磁性粒子(富士REBIO株式会社制造)上结合下述小鼠单克隆抗体而得到，所述小鼠单克隆抗体对作为表位的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列第24位～第40位进行识别。
·标识化抗体溶液：制备含有0.5μg/mL的标识化抗体、50mM的MES、2.5％(w/v)的BSA、100mM的NaCl、0.3mM的ZnCl2、以及1.0mM的MgCl2的标识化抗体溶液(pH6.8)，所述标识化抗体通过利用碱性磷酸酶(高比活性、糖降低的重组体、ロシュ制造)对下述抗体进行标识而得到，所述抗体对作为表位的心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列第41位～第49号进行识别。
将这些溶液填充至自动免疫测定装置(lumipulse G1200、富士REBIO株式会社制造)用的柱体。
使用自动免疫测定装置(lumipulse G1200、富士REBIO株式会社制造)，按照以下的步骤对待测样品的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
(1)将待测样品100μL分注到抗体结合粒子溶液150μL中，制备第1反应液。第1反应液在搅拌后在37℃下培养10分钟，形成结合于磁性粒子的抗心肌肌钙蛋白I抗体与待测样品中所含的心肌肌钙蛋白I抗原的免疫复合体。
(2)培养后，磁性粒子由于磁石被集中于管壁，在除去未与磁性粒子结合的物质。然后，重复进行清洗液(lumipulse(注册商标)清洗液、富士REBIO株式会社制造)的注入以及清洗液的除去，清洗磁性粒子。
(3)清洗后，混合标识化抗体溶液250μL以及磁性粒子，制备第2反应液。第2反应液在37℃下培养10分钟，形成免疫复合体，所述免疫复合体由固定化于磁性粒子上的抗心肌肌钙蛋白I抗体-心肌肌钙蛋白I抗原-利用碱性磷酸酶进行了标识的抗心肌肌钙蛋白I抗体构成。
(4)培养后，磁性粒子再次由于磁石被集中于管壁，除去未与磁性粒子结合的物质。然后，重复进行清洗液的注入以及清洗液的除去，清洗磁性粒子。
(5)将含有AMPPD(3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷·二钠盐)的基质液(lumipulse(注册商标)、富士REBIO株式会社制造)200μL加到磁性粒子中，搅拌后在37℃下培养5分钟。基质液中所含的AMPPD由于间接结合于磁性粒子的碱性磷酸酶的催化剂作用发生分解，放出在波长为477nm处具有最大发光的光。发光强度反映与磁性粒子结合的心肌肌钙蛋白I量，因此，可以通过测定波长为477nm处的发光强度，来对心肌肌钙蛋白I量进行测定。
作为待测样品，准备4例或5例的心肌肌钙蛋白I高值检体(ProMedDx公司制造)以及4例或5例的血清血浆配对检体(由相同的供体得到的血清、EDTA血浆、柠檬酸血浆以及肝素血浆)，将心肌肌钙蛋白I高值检体添加到血清血浆配对检体中并使其成为1/10容量以下进行制备。
[实施例2]心肌肌钙蛋白I测定中的葡聚糖硫酸钠对血清血浆相关性的影响
将葡聚糖硫酸钠(葡聚糖硫酸钠5000、和光纯药工业株式会社制造)添加到试剂A的抗体结合粒子溶液中，并使其成为0mg/mL、0.77mg/mL、1.55mg/mL、2.32mg/mL(第1反应液中的浓度分别为0mg/mL、0.462mg/mL、0.930mg/mL、或1.392mg/mL)，测定待测样品。将结果示于在表1以及图1～图3中。各测定值是波长477nm处的发光强度(计数值)。对于各检体，计算出各血浆的计数值相对于血清的计数值的百分率，然后，计算出它们的平均值，从而得到配对血清计数值(平均)。实施例3以及实施例4中的配对血清计数值(平均)为同样地得到的值。
[表1]
表1.使用了试剂A的心肌肌钙蛋白I的测定
其结果，在葡聚糖硫酸钠不存在的测定中，待测样品的测定值在血清、EDTA血浆、柠檬酸血浆、以及肝素血浆间差异较大(表1、以及图1～3)。另一方面，通过使用含有葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液，在葡聚糖硫酸钠的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，使待测样品的测定值在血清、EDTA血浆、柠檬酸血浆、以及肝素血浆间大概一致(表1、以及图1～3)。
从以上可以明确看出，通过在葡聚糖硫酸钠的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，血清与血浆的测定值的背离得到了抑制。
[实施例3]葡聚糖硫酸钠存在下的心肌肌钙蛋白I测定中的抗体表位的种类对血清血浆相关性的影响
将葡聚糖硫酸钠(葡聚糖硫酸钠5000、和光纯药工业株式会社制造)添加到试剂B的抗体结合粒子溶液中，使其为0mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、或2.0mg/mL(第1反应液中的浓度分别为0mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、1.2mg/mL)，其它条件与实施例2相同，对待测样品进行测定。将结果示于表2以及图4～图7中。各测定值为波长为477nm处的发光强度(计数值)。
[表2]
表2.使用了试剂B的心肌肌钙蛋白I的测定
其结果，使用了试剂B，其使用了与在实施例2中使用的试剂A中所使用的抗体配对(固定化抗体以及标识化抗体)不同的、对心肌肌钙蛋白I抗原的部位进行识别的抗体配对(固定化抗体以及标识化抗体)，由于使用含有葡聚糖硫酸钠的抗体结合粒子溶液，在葡聚糖硫酸钠的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，使得待测样品的测定值在血清、EDTA血浆、柠檬酸血浆、以及肝素血浆间大概一致(表2、以及图4～7)。
从以上可知，通过在葡聚糖硫酸钠的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，使得血清与血浆的测定值的背离得到抑制，而不依赖于抗体所识别的心肌肌钙蛋白I的表位位置。
[实施例4]心肌肌钙蛋白I测定中的各种聚阴离子性高分子对血清血浆相关性的影响
将葡聚糖硫酸钠(葡聚糖硫酸钠5000、和光纯药工业株式会社制造)、聚苯乙烯磺酸钠(重均分子量：～70000、Sigma Aldrich制造)、聚丙烯酸钠(重均分子量：～5100、SigmaAldrich制造)、N-月桂酰肌氨酸钠(分子量为271、nacalai tesque制造)或L-天冬氨酸(分子量为133、和光纯药工业株式会社制造)添加到试剂B的抗体结合粒子溶液中，使其为1.5mg/mL(第1反应液中的浓度为0.9mg/mL)，其它条件与实施例2以及实施例3相同，对待测样品进行测定。将结果示于表3以及图8～图11中。各测定值为波长为477nm处的发光强度(计数值)。
[表3]
表3.聚阴离子高分子存在下的心肌肌钙蛋白I的测定
a:葡聚糖硫酸钠
b:聚苯乙烯磺酸钠
c:聚丙烯酸钠
d:N-月桂酰肌氨酸钠
e:L-天冬氨酸
其结果，通过在葡聚糖硫酸钠、聚苯乙烯磺酸钠、或聚丙烯酸钠(聚阴离子性高分子)的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，使得待测样品的测定值在血清、EDTA血浆、柠檬酸血浆、以及肝素血浆间大概一致(表3、以及图8～11)。另一方面，在作为低分子阴离子性化合物(含有阴离子性部分的低分子化合物)的、N-月桂酰肌氨酸钠、L-天冬氨酸的存在下，血清与各种血浆的测定值的背离未减轻。
从以上可以明确看出，通过在聚阴离子性高分子的存在下进行心肌肌钙蛋白I的测定，血清与各种血浆的测定值的背离得到抑制。

Claims (11)

1.一种心肌肌钙蛋白I测定试剂，其含有针对心肌肌钙蛋白I的抗体、以及聚阴离子性高分子。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中，聚阴离子性高分子含有选自硫酸酯基、磺酸酯基、以及羧酸酯基中的基团。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其中，所述试剂含有含所述抗体以及所述高分子的溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂，其中，所述溶液中的所述高分子的浓度为0.06mg/mL以上、且85mg/mL以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的试剂，其中，所述抗体为固定化抗体。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的试剂，其还含有心肌肌钙蛋白I的其它抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂，其中，所述其它抗体为标识化抗体。
8.一种心肌肌钙蛋白I的测定方法，其包括：在聚阴离子性高分子的存在下，使用针对心肌肌钙蛋白I的抗体，对血液样品中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，血液样品为血浆。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其包括以下(1)～(3)：
(1)制备针对心肌肌钙蛋白I的抗体、聚阴离子性高分子、以及血液样品的混合液；
(2)对混合液进行培养；以及
(3)对混合液中的心肌肌钙蛋白I量进行测定。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述混合液中的所述高分子的浓度为0.05mg/mL以上、且5.0mg/mL以下。
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