CN102089660A - 键合有反应性物质的微粒的稳定化方法及含有该微粒的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于：提供通过在反应性物质键合微粒的分散液中使该微粒稳定来长时间维持分散液中的反应性物质键合微粒的反应性的方法。本发明提供键合有具有反应性的物质的微粒的稳定化方法，该方法包括使含硫氨基酸或其衍生物分散于该微粒的分散液中的工序。作为含硫氨基酸，优选为半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸。本发明的方法特别在使聚阴离子、葡聚糖等沉降抑制物质共存于分散液中时有用。

Description

键合有反应性物质的微粒的稳定化方法及含有该微粒的试剂

技术领域

本发明涉及键合有抗体或抗原等具有反应性的物质的微粒(以下简称反应性物质键合微粒)的稳定化方法及使用该反应性物质键合微粒的免疫测定用试剂。特别是涉及主要在临床检查领域用于利用抗原抗体反应的免疫学测定的反应性物质键合微粒的稳定化方法及使用该反应性物质键合微粒的免疫测定用试剂。

背景技术

近年来，在临床检查等各种检查中，正在谋求自动化和测定时间的缩短化。例如，利用免疫反应测定生物样品中的微量物质的方法得到广泛使用。作为该免疫测定方法，可列举出RIA法、EIA法、免疫比浊法、胶乳凝集法、胶体金凝集法、免疫色谱法等。其中，胶乳凝集法、胶体金凝集法等使用键合有具有反应性的物质的微粒(反应性物质键合微粒)的方法由于不需要反应液的分离和洗涤操作，所以特别适合测定的自动化和短时间化。

但是，上述胶乳凝集法和胶体金凝集法由于反应性物质键合微粒在分散液中不稳定，因为沉降或自身凝集等无法长时间维持反应性，所以存在难以在不降低测定精密度的情况下长时间保存试剂的问题。

专利文献1中记载了包括使选自聚阴离子及其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和丙三醇的至少1种共存于反应性物质键合微粒分散液中的工序的反应性物质键合微粒沉降抑制方法。该方法通过抑制试剂溶液中的反应性物质键合微粒沉降使反应性物质键合微粒稳定化。但是，当长时间保存含有反应性物质键合微粒的试剂时，反应性物质键合微粒发生自身凝集，存在反应性降低的问题。

专利文献2中记载了添加金属离子和螯合剂作为稳定剂的方法，专利文献3中记载了添加钙离子、镁离子、硫酸葡聚糖、胆酸、去氧胆酸、黄尿酸或这些物质的盐的方法。但是，依然存在自身凝集、反应性降低等问题。

而专利文献4中记载了以在具有硫醇基和氨基的化合物共存下还原氯金酸为特征的具有阳离子性表面的金纳米粒子的制备方法(权利要求项1)。在专利文献5中记载了作为包覆混合单层膜的金属质纳米粒子的硫普罗宁(チオプロニンtiopronin)单层膜保护金纳米粒子的合成法(实施例3)。专利文献6中记载了免疫反应性凝集剂，其特征在于，相对于金粒子介由半胱氨酸中的硫原子键合含有至少1个上述半胱氨酸的肽(权利要求1)。但是，这些均是示出仅以提高反应性为目的而将物质键合于金粒子表面上的金粒子的制备方法的文献，并未公开金粒子的稳定化方法。

在先技术文献

专利文献

专利文献1 : 日本特开2007-114129号公报

专利文献2 : 日本特开2000-146967号公报

专利文献3 : 日本特开平11-101799号公报

专利文献4 : 日本特开2005-287507号公报

专利文献5 : 日本特表2005-534810号公报

专利文献6 : 日本特开2006-317401号公报 。

发明内容

发明所要解决的课题

因此，为了在不降低测定精密度的情况下实现试剂的长时间保存，需要使反应性物质键合微粒在分散液中稳定化，从而长时间维持反应性的技术。

因此，本发明的目的在于：提供在反应性物质键合微粒的分散液中使该微粒稳定化的方法。本发明的目的还在于：提供含有可长时间维持反应性的反应性物质键合微粒的、在不降低测定精密度的情况下可长时间保存的试剂。

解决课题的手段

本发明人为达成上述课题而进行深入研究，结果发现：在反应性物质键合微粒的分散液中，通过使含硫氨基酸或其衍生物共存，可使反应性物质键合微粒稳定化，且可长时间维持反应性物质键合微粒的反应性，从而完成本发明。

本发明提供键合于具有反应性的物质的微粒的稳定化方法，该方法包括使含硫氨基酸或其衍生物共存于该微粒的分散液中的工序。

在1个实施方式中，上述含硫氨基酸为选自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少1种。

在其它实施方式中，在上述分散液中以0.001~2.0质量%的比例含有上述含硫氨基酸或其衍生物。

在另一实施方式中，包括进一步使沉降抑制物质共存于上述分散液中的工序。

在另一实施方式中，上述沉降抑制物质为选自聚阴离子及其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和丙三醇的至少1种。

在另一实施方式中，上述聚阴离子为硫酸葡聚糖或肝素。

在另一实施方式中，上述键合有具有反应性的物质的微粒为键合有抗体或抗原的胶体金粒子。

本发明的试剂含有键合有具有反应性的物质的微粒和含硫氨基酸或其衍生物，因此使该微粒稳定化。

在1个实施方式中，上述含硫氨基酸为选自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸中的至少1种。

在其它实施方式中，在上述试剂中以0.001~2.0质量%的比例含有上述含硫氨基酸或其衍生物。

在另一实施方式中，上述试剂进一步含有沉降抑制物质。

在另一实施方式中，上述沉降抑制物质为选自聚阴离子及其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1种。

在另一实施方式中，上述聚阴离子为硫酸葡聚糖或肝素。

在另一实施方式中，上述键合有具有反应性的物质的微粒为键合有抗体或抗原的胶体金粒子。

本发明还提供含有上述试剂的试剂盒。

本发明进一步提供包括将上述试剂和样品混合的工序的自动化免疫测定方法。

发明效果

根据本发明，在用于在临床检查等领域中利用抗原抗体反应的免疫学测定的反应性物质键合微粒的分散液中，可使该微粒稳定化。根据本发明，可提供含有长时间维持反应性的反应性物质键合微粒的试剂。通过使用本发明的试剂，使得在不降低测定精密度的情况下长时间保存试剂成为可能。

附图说明

[图1] 示出添加各种浓度的蛋氨酸时半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂(抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体键合胶体金试剂)反应性的经时变化的图。

[图2] 示出在添加各种含硫化合物时半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂(抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂A)反应性的经时变化的图。

[图3] 示出在添加各种氨基酸时半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂(抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂B)反应性的经时变化的图。

具体实施方式

1. 反应性物质键合微粒的稳定化方法

在本说明书中，反应性物质键合微粒的稳定化是指反应性物质键合微粒的反应性在实质上无经时变化，即反应性得到长时间维持。通过使反应性物质键合微粒稳定化，可提供含有该微粒的、在不降低测定精密度的情况下可长时间保存的试剂。

本发明的反应性物质键合微粒的稳定化方法包括使含硫氨基酸及其衍生物共存于该微粒的分散液中的工序。

本发明的方法中使用的反应性物质键合微粒为可用作免疫测定试剂的微粒，优选为胶乳粒子和金属胶体粒子。作为金属胶体粒子，有金、银、硒等的胶体粒子，胶体金粒子通常容易利用，故优选使用。胶体金粒子可使用市售品，也可通过本领域技术人员通常采用的方法(例如用枸橼酸钠还原氯金酸的方法)制备。胶体金粒子的粒径为通常5nm~100nm、优选30nm~60nm的范围。

对于键合于上述微粒的物质，只要是特异性键合于测定对象物质的物质，则可以利用。例如可列举出抗体、还原IgG、抗体的F(ab’)₂片段或Fab’片段、抗原、受体、凝集素、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等具有键合亲和性的物质。

在本发明的方法中，使用含硫氨基酸或其衍生物。在本说明书中，将这些化合物称为稳定化物质。稳定化物质可单独使用或将2种以上组合使用。

在本说明书中，含硫氨基酸是指天然的含硫氨基酸以及在天然的氨基酸中导入了硫原子的氨基酸。另外，衍生物意味着有机化学中通常使用的概念，是指取代物、加合物等。

在作为上述稳定化物质的含硫氨基酸中，作为天然的含硫氨基酸，例如可列举出半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸，作为含硫氨基酸的衍生物，例如可列举出蛋氨醇、蛋氨醛(メチニナールmethioninal)、蛋氨酰胺、2-烷基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、半胱氨醇、 半胱氨醛(システイナールcysteinal)和半胱氨酰胺。半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸已市售，故而在本发明中优选利用这些化合物。特别优选蛋氨酸。

本发明的方法使上述稳定化物质共存于上述反应性物质键合微粒的分散液中。共存的手段无特殊限制。例如，可向反应性物质键合微粒的分散液中加入稳定化物质，也可向稳定化物质或用分散剂稀释稳定化物质得到的稀释液中加入反应性物质键合微粒，或可将反应性物质键合微粒和稳定化物质混合，将该混合物加入分散剂中。需要说明的是，分散剂无特殊限制，例如可使用水或使用下述缓冲剂的缓冲液等。

在本发明的方法中，分散液中的反应性物质键合微粒的浓度可以是该领域通常所采用的浓度。

在本发明的方法中，共存于分散液中的稳定化物质的浓度可根据稳定化物质的种类适当设定。例如，在含硫氨基酸的情况下，优选为0.001~2.0质量%，更优选为0.005~1.0质量%，进一步优选为0.02~0.5质量%。

在本发明的方法中，也可向分散液中进一步适当添加沉降抑制物质。在本说明书中，沉降抑制物质是指通过共存于反应性物质键合微粒的分散液中来抑制该微粒的沉降的物质。

作为上述沉降抑制物质，例如可列举出聚阴离子或其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇或丙三醇。沉降抑制物质可单独使用或将2种以上组合使用。

作为属于上述沉降抑制物质中的1种的聚阴离子，例如可列举出硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明质酸和硫酸软骨素。作为聚阴离子的盐，例如可列举出硫酸葡聚糖钠、肝素钠等。在聚阴离子或其盐中，从沉降抑制效果高的观点出发，优选使用具有硫酸基的水溶性高分子化合物。这样的化合物为例如硫酸葡聚糖、肝素、硫酸葡聚糖钠和肝素钠。

在本发明的方法中，共存于分散液中的沉降抑制物质的浓度可根据沉降抑制物质的种类适当设定。例如，在聚阴离子或其盐的情况下，优选为0.3~5.0质量%，更优选为0.5~2.0质量%，进一步优选为0.7~1.1质量%。在葡聚糖或环糊精的情况下，优选为0.1~5.0质量%，更优选为0.2~1.8质量%，进一步优选为0.5~1.5质量%。在聚乙二醇的情况下，优选为0.3~5.0质量%，更优选为0.5~3.0质量%。在丙三醇的情况下，优选为5~40质量%，更优选为10~35质量%。

在本发明的方法中，作为其它稳定化物质，也可向分散液中进一步适当添加金属离子及螯合剂(专利文献2)，选自钙离子、镁离子、硫酸葡聚糖、胆酸、去氧胆酸、黄尿酸及这些化合物的盐的至少1种(专利文献3)。

在本发明的方法中，分散液中可进一步适当含有目前所使用的缓冲剂、糖及糖醇、白蛋白、聚乙二醇、氯化钠、防腐剂及其它物质。

根据本发明的方法，可使稳定化物质共存于反应性物质键合微粒的分散液中，由此可使反应性物质键合微粒稳定。因此，通过使用该方法，使得在分散液中长时间维持该微粒的反应性成为可能。特别是在使聚阴离子、葡聚糖等沉降抑制物质共存于分散液中时有用。

2. 含有反应性物质键合微粒和稳定化物质的试剂

本发明的试剂含有上述反应性物质键合微粒和上述稳定化物质，根据需要含有上述沉降抑制物质、其它稳定化物质、缓冲剂、糖、糖醇、白蛋白、氯化钠、防腐剂及其它添加剂。

本发明的试剂由于使反应性物质键合微粒稳定化，所以可长时间维持该微粒的反应性。作为本发明的试剂的保存温度，优选为25℃以下，更优选为10℃以下，进一步优选为8℃以下。作为本发明的试剂的其它保存条件，优选为暗处且低湿度下。

本发明的试剂通常为液状，作为使用反应性物质键合微粒的试剂、特别是在该领域通常所使用的免疫测定用试剂使用。

本发明的试剂中的反应性物质键合微粒浓度和稳定化物质浓度无特殊限制。从提高反应性物质键合微粒的稳定性的观点出发，优选为在上述方法中所采用的浓度范围内。

作为本发明的试剂可含有的缓冲剂，可列举出磷酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，琥珀酸缓冲液，甘氨酰甘氨酸、MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、HEPES(N-2-羟乙基-哌嗪-N’-乙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸))、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷)等的Good缓冲液等。上述缓冲剂优选按照试剂中的pH为5~9或浓度为1~100mM的条件含有。

作为本发明的试剂可含有的糖和糖醇，可列举出葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等。上述糖或糖醇在试剂中的浓度优选为0.01~10.0质量%。

作为本发明的试剂可含有的白蛋白，可列举出牛血清白蛋白(BSA)等。白蛋白在试剂中的浓度优选为0.001~1.0质量%。

作为本发明的试剂中可含有的防腐剂，可列举出叠氮化钠等。防腐剂在试剂中的浓度优选为0.01~0.5质量%。

作为本发明的试剂中可含有的其它添加剂，可列举出吐温20、聚乙二醇月桂醚、5-溴水杨酸、水杨酸钠、苯甲酸钠、苯磺酸钠、苯酚、麝香草酚等。

如上所述，本发明的试剂由于使反应性物质键合微粒稳定化，所以可长时间维持该微粒的稳定性。因此，当使用该试剂进行免疫测定时，在不降低测定精密度的情况下长时间保存试剂成为可能。

3. 试剂盒

本发明的试剂盒含有包含上述反应性物质键合微粒和稳定化物质的试剂(本发明的试剂)。该试剂盒例如可用于采用胶乳凝集法、胶体金凝集法等的免疫测定，特别是可用于自动化免疫测定。

当将本发明的试剂盒用作免疫测定用试剂盒时，该试剂盒通常可由含有辅助样品的稀释、样品在免疫反应前的预处理及免疫反应的成分等的第一试剂，含有本发明的试剂的第二试剂，和根据需要用于制备标准曲线的测定对象物质标准品构成。

本发明的试剂盒可根据本发明的试剂中的微粒所键合的反应性物质，以样品中的各种物质作为测定对象。作为可成为测定对象的物质(测定对象物质)，例如可列举出白蛋白、血红蛋白、血红蛋白A1c、肌红蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、铁蛋白、α-胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9、前列腺特异抗原、C反应性蛋白(CRP)、纤维素分解产物(FDP)、胃蛋白酶原I和II、胶原等蛋白质，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白等脂蛋白，脱氧核糖核酸、核糖核酸等核酸，碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、脂酶、淀粉酶等酶，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白，乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、幽门螺旋杆菌及与之相对应的抗体等与感染症有关的抗原或抗体，氟哌啶醇、溴哌利多等药物，性激素等激素等。

作为含有供测定的测定对象物质的样品，可列举出血液、血浆、血清、尿、粪便(混悬液)、髄液、腹水等生物样品，从环境中取得的样品或其提取物等。

4. 自动化免疫测定方法

本发明的自动化免疫测定方法使用本发明的试剂进行。该自动化免疫测定方法由于在试剂中使反应性物质键合微粒稳定化，可长时间维持反应性，所以即使使用长时间保存的试剂也可得到精密度高的测定值。

具体而言，本发明的自动化免疫测定方法通过将样品、第一试剂和本发明的试剂(第二试剂)放于自动分析装置中，将第一试剂和第二试剂依次自动混合于样品中来进行。第一试剂和第二试剂的比例可酌情设定。优选将本发明的试剂(第二试剂)稀释至2~9倍，更优选将其稀释至3~5倍。

实施例

以下根据实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明不受这些实施例限定。在以下实施例中，只要无特殊记载，%均表示质量/容量%(W/V%)。

制备例1：胶体金溶液的制备

边搅拌边向1L的95℃蒸馏水中加入2mL的10%氯金酸水溶液，在1分钟后加入10mL的2%枸橼酸钠水溶液，进一步搅拌20分钟，然后冷却至30℃。待冷却后，用0.1%碳酸钾水溶液调节至pH7.1。

制备例2：抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体键合胶体金试剂的制备

将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体(Dako Japan Inc. (ダコ・ジャパン株式会社))用含有0.05%叠氮化钠的10mM HEPES (pH7.1)稀释，制成50μg/mL的浓度。将100mL的该抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体溶液加入到约1L的在制备例1中制备的胶体金溶液中，在冷藏下搅拌2小时。进一步添加110mL的含有5.46%甘露醇、0.5%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%叠氮化钠的10mM HEPES (pH7.1)，于37℃搅拌90分钟。接着，于8000rpm下离心分离40分钟，除去上清液，然后加入约1L的含有3%甘露醇、0.1%BSA和0.05%叠氮化钠的5mM HEPES (pH7.5) (A溶液)，将抗体键合胶体金分散。进一步于8000rpm下离心分离40分钟，除去上清液，用含有1.5%硫酸葡聚糖钠的A溶液分散抗体键合胶体金，使总量为240mL，制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体键合胶体金试剂。

制备例3：抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG的制备

将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体(Dako Japan Inc.)用含有0.05%叠氮化钠、5mM EDTA·2Na和150mM氯化钠的10mM HEPES (pH7.1) (B溶液)进行透析，然后用B溶液进行稀释，使浓度达到10mg/mL。向该抗体溶液中添加2-巯基乙胺盐酸盐，使浓度达到6mg/mL，待溶解后于37℃加热90分钟。使用凝胶过滤色谱柱除去2-巯基乙胺盐酸盐，制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG。

制备例4：抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂的制备

将在制备例3中制备的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG用含有0.05%叠氮化钠的10mM HEPES (pH7.1)稀释，制成50μg/mL的浓度。将100mL的该抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG溶液加入到1L的在制备例1中制备的胶体金溶液中，在冷藏下搅拌2小时。进一步添加110mL的含有5.46%甘露醇、0.5%BSA和0.05%叠氮化钠的10mM HEPES (pH7.1)，于37℃搅拌90分钟。接着，于8000rpm下离心分离40分钟，除去上清液，然后加入约1L的A溶液，将还原IgG键合胶体金分散。进一步于8000rpm下离心分离40分钟，除去上清液，用含有1.5%硫酸葡聚糖钠的A溶液分散抗体敏化胶体金，使总量为240mL，制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂A。用含有1.25%硫酸葡聚糖钠的A溶液分散抗体敏化胶体金，使总量为240mL，制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂B。

制备例5：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第一试剂的制备

向含有5%氯化钠、0.2%EDTA、0.2%烷基苯二磺酸钠盐和0.35%聚氧乙烯月桂醚的0.5M Bis-Tris (pH6.7)缓冲液中添加1.0~2.5%左右的作为反应促进剂的聚乙二醇，制成半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第一试剂。

实施例1：蛋氨酸的添加效果的研究

向在制备例2中制备的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体键合胶体金试剂中添加蛋氨酸，使其浓度达到0.005%、0.02%、0.05%、0.1%或0.5%，制成半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度为8mg/L的样品的测定中，对因保存引起的第二试剂反应性的经时变化进行研究。作为对照，将未添加蛋氨酸的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体键合胶体金试剂作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。将第二试剂于25℃保存，在开始时、4日后、8日后、20日后和39日后，使用在制备例5中制备的第一试剂，按照如下所示的方法进行研究。

(研究方法)

向3μL的样品中注入200μL的第一试剂，于37℃加热约5分钟，接着注入100μL的第二试剂，使之于37℃反应，通过日立7070自动分析装置，在505nm的主波长和660nm的副波长下测定测光点18至24的吸光度变化量。将经过各种保存时间后的吸光度变化量相对于保存开始时的吸光度变化量的比例作为第二试剂的反应性(%)。结果如表1和图1所示。

[表1]

由表1和图1的结果可知，在未添加蛋氨酸的情况下，保存20日后的第二试剂的反应性约降低20%。但在含有0.5%蛋氨酸的情况下，仅降低约5%。即使在保存39日后，在未添加蛋氨酸的情况下确认降低30%以上，但在含有0.5%蛋氨酸的情况下，仅降低约7%。在保存39日后，即使在含有0.005%蛋氨酸的情况下，仍比未添加蛋氨酸的情况高约7%，由此可确认添加蛋氨酸带来稳定化效果。由此可知，通过使蛋氨酸共存于抗体結合胶体金粒子的分散液中，可使该粒子稳定化。

实施例2：蛋氨酸和半胱氨酸的添加效果的研究

向在制备例4中制备的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂A中分别添加蛋氨酸或半胱氨酸，使蛋氨酸的浓度达到0.03%、0.06%或0.12%，使半胱氨酸的浓度达到0.03%，制成半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度为8mg/L的样品的测定中，对因保存引起的第二试剂反应性的经时变化进行研究。作为对照，以按照浓度达到0.03%的条件添加6’,6’-二硫吡啶二甲酸或N-乙酰基硫脲的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂A和无添加的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂A作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。将第二试剂冷藏保存，在开始时、2周后、5周后、9周后和13周后，使用在制备例5中制备的第一试剂，按照与实施例1相同的方法进行测定。结果如表2和图2所示。

[表2]

由表2和图2的结果可知，在无添加的情况下，保存13周后的第二试剂的反应性降低约15%。但是，在含有蛋氨酸或半胱氨酸的情况下，基本上未降低。另一方面，在含有是含硫化合物但不是氨基酸或其衍生物的6’,6’-二硫吡啶二甲酸或N-乙酰基硫脲的情况下，确认到与无添加的情况同等以上的降低。由此可知，通过使蛋氨酸或半胱氨酸共存于还原IgG键合胶体金粒子的分散液中，可使该粒子稳定化。

实施例3：氨基酸的添加效果的研究

向在制备例4中制备的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂B中分别添加蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，使其浓度均达到0.02%，制成半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度为4mg/L的样品的测定中，对因保存引起的第二试剂反应性的经时变化进行研究。作为对照，将无添加的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C还原IgG键合胶体金试剂B作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定用第二试剂。将第二试剂冷藏保存，在开始时、2个月后、4个月后和6个月后，使用在制备例5中制备的第一试剂，按照与实施例1相同的方法进行测定。结果如表3和图3所示。

[表3]

由表3和图3的结果可知，作为氨基酸，在含有谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸的情况下，第二试剂的反应性与无添加的情况同等地降低。但是，在含有蛋氨酸的情况下，即使在6个月后页基本未降低。另外，在含有蛋氨酸的情况下也未发现因自身凝集而引起凝集物的产生。由此可知，在氨基酸中，通过使作为含硫氨基酸的蛋氨酸共存于还原IgG键合胶体金粒子的分散液中，可使该粒子稳定化。

工业上的可利用性

根据本发明，可使反应性物质键合微粒稳定化。因此，可提供该微粒稳定化了的试剂。就该试剂而言，该微粒的反应性得到长时间维持。因此，当使用该试剂进行免疫测定时，使得在不降低测定精密度的情况下长时间保存试剂成为可能。该试剂和含有该试剂的试剂盒对于自动化免疫装置特别有用。

Claims (16)

1.键合有具有反应性的物质的微粒的稳定化方法，所述方法包括使含硫氨基酸或其衍生物共存于所述微粒的分散液中的工序。

2.权利要求1的方法，其中，所述含硫氨基酸为选自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少1种。

3.权利要求1或2的方法，其中，在所述分散液中以0.001~2.0质量%的比例含有所述含硫氨基酸或其衍生物。

4.权利要求1~3中任一项的方法，其中，所述方法包括进一步使沉降抑制物质共存于所述分散液中的工序。

5.权利要求4的方法，其中，所述沉降抑制物质为选自聚阴离子及其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和丙三醇的至少1种。

6.权利要求5的方法，其中，所述聚阴离子为硫酸葡聚糖或肝素。

7.权利要求1~6中任一项的方法，其中，所述键合有具有反应性的物质的微粒为键合有抗体或抗原的胶体金粒子。

8.试剂，所述试剂含有键合有具有反应性的物质的微粒和含硫氨基酸或其衍生物。

9.权利要求8的试剂，其中，所述含硫氨基酸为选自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少1种。

10.权利要求8或9的试剂，其中，在所述试剂中以0.001~2.0质量%的比例含有所述含硫氨基酸或其衍生物。

11.权利要求8~10中任一项的试剂，其中，所述制剂进一步含有沉降抑制物质。

12.权利要求11的试剂，其中，所述沉降抑制物质为选自聚阴离子及其盐、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和丙三醇的至少1种。

13.权利要求12的试剂，其中，所述聚阴离子为硫酸葡聚糖或肝素。

14.权利要求8~13中任一项的试剂，其中，所述键合有具有反应性的物质的微粒为键合有抗体或抗原的胶体金粒子。

15.试剂盒，所述试剂盒含有权利要求8~14中任一项的试剂。

16.自动化免疫测定方法，所述测定方法包括将权利要求8~14中任一项的试剂和样品混合的工序。

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