CN103052884A - 免疫层析用试剂组合物以及使用该组合物的测定方法 - Google Patents

Abstract

在根据免疫层析法对检体中的检测对象进行检测时，当将含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白的免疫层析用试剂组合物用作检体处理液或展开溶剂时，与使用免疫层析装置对检测对象进行检测的传统技术相比，提供了一种抑制非特异性反应、不引发抗体固定胶体金的凝集且展开速度快的免疫层析用试剂组合物，并且提供了一种高性能且高灵敏度的免疫层析法，以及一种能够使用上述免疫层析用试剂组合物进行快速、简易的病毒检测的检测试剂盒。

Description

免疫层析用试剂组合物以及使用该组合物的测定方法

技术领域

本发明涉及不引起非特异性反应的、高性能且高灵敏度的免疫层析用试剂组合物、免疫层析用检体处理液、免疫层析用展开溶剂以及使用它们的测定方法。

背景技术

近年来，作为利用抗体的特异反应性来检测样品液中的抗原的简易体外诊断试剂盒或便携式诊断装置，免疫层析用条带式免疫测定法变得越来越重要。特别是，妊娠检查试剂盒是作为非处方医药品出售的一种常见的免疫层析装置。最近，为了检测是否存在流感病毒或细菌等病原体的感染，对基于免疫层析法的简易检查工具进行了开发。

由于抗体由不溶性载体标记的免疫层析法的检查药品仅需要简易的操作、且利用其进行检查仅需要短时间，因此广泛使用。然而，与EIA相比，存在以下问题：通常灵敏度低且结果为阳性时观察到的线不清晰。

为了克服这样的问题，提出了如专利文献1中所述的可使糖或水溶性高分子化合物存在于展开溶剂的方法。然而，即使将该方法应用于使用了由不溶性载体标记的抗体的免疫层析法，仍会发生不溶性载体的凝集，并可能导致非特异性反应。展开速度慢等问题尚未能克服（参照专利文献1）。

因此，对于以下检查药品的开发具有热切的需求：即使将该检查药品应用于使用了由不溶性载体标记的抗体的免疫层析法，其也不会引起不溶性载体的凝集、不引起非特异性反应并且展开速度快。

例如，提出了通过使用着色乳胶颗粒的膜测定法而对检体中的多个检测对象进行简单分析的方法，其中，着色乳胶颗粒具有分别对应于两个以上检测对象的不同颜色。此方法对于具有假阳性倾向的检测对象特别有效，并且在两个以上的检测对象选自A型流感病毒、B型流感病毒和RS病毒时更加有效（参照专利文献2）。

在利用膜测定法的检体的简易检查方法中，提出了能够在保持高灵敏度的同时防止假阳性结果或堵塞的检体样品的过滤方法（参照专利文献3）。

在专利文献2和3中，在通过膜测定法进行检测时（其中使用了鼻腔或咽拭子液、或者鼻腔吸引液等生物体样品），作为使其中的检体悬浮的检体悬浊液，使用了含有MES缓冲液（Good缓冲液）、Triton X-100（非离子型表面活性剂）、以及牛血清蛋白或酪蛋白等蛋白质等的悬浊液。

在专利文献4中，在使用了基于免疫层析法的检查工具的呼吸道感染的检查方法中，作为对选自鼻腔或咽拭子液、以及鼻腔吸引液的检体进行处理的检体处理液，使用了含有表面活性剂（NP40等）、还原剂（2-巯基乙胺盐酸盐等）、硫氰酸化合物、螯合剂、Good缓冲液（PIPES等）等的处理液（参照专利文献4）。

然而，在专利文献2至4所述的发明中，作为标记试剂，主要使用了着色乳胶颗粒，作为检体处理液，使用了传统使用的检体处理液，这是由于他们没有特别关注检体处理液。

专利文献5关注了用于根据膜测定法进行检测的检体处理液。将含有非离子型表面活性剂（Nonion MN-811等）、牛血清蛋白和Tris-HCl缓冲液的处理液用作检体处理试剂组合物，以抑制非特异性反应（参照专利文献5）。

在专利文献6中，作为检体悬浊液组合物，使用了含有非离子型表面活性剂（Triton X-100等）、碱性氨基酸、用于稳定待检测物质的蛋白质（牛血清蛋白等）和将pH保持为3至8的缓冲液（Tris-HCl等）的处理液，由此防止了假阳性结果的出现（参照专利文献6）。

然而，专利文献2至6中所述的检体处理液或展开溶剂仍然存在无法充分抑制不溶性载体的凝集或非特异性反应的引发的问题。因此，作为展开速度快的检查药品，它们不是十分令人满意，从而热切

需求进一步的改良。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：JP-A-2000-329767

专利文献2：JP-A-2008-014751

专利文献3：JP-A-2008-122372

专利文献4：JP-A-2008-164403

专利文献5：JP-A-2009-186359

专利文献6：JP-A-2006-084351

发明内容

本发明需要解决的问题

本发明的目的是提供一种高性能和高灵敏度的免疫层析用检查药品，通过对用于免疫层析法检查药品的检体处理液或展开溶剂进行改良，使得该免疫层析用检查药品与传统技术相比不引起非特异性反应。特别是这样的目的：对用于免疫层析法检查药品的检测处理液或展开溶剂进行改良，以提供不引起抗体固定胶体金的凝集、同时展开速度快的检查药品。本发明的另一个目的是提供一种与传统技术相比，能够不引起非特异性反应而快速、简单并精确地检测检体（例如采集自呼吸疾病患者的检体，特别是鼻涕、鼻腔拭子液或痰）中的抗原（例如流感病毒、腺病毒和RS病毒等病毒）的免疫层析装置。

更具体而言，本发明的目的是提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒通过将检体处理液或展开溶剂处理过的检测样品滴加至该检测试剂盒的样品添加部，在不引发非特异性反应的同时与检体中的抗原发生特异性反应，从而能够快速、简单并高度精确地对检体进行检查。

解决问题的方法

本发明涉及免疫层析用试剂组合物，更具体而言，涉及检体处理液或展开溶剂，该免疫层析用试剂组合物在使用免疫层析装置检查检体时用作免疫层析法检查药品，并且其含有N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸（Good缓冲液的一种，并在下文被称为“Bicine”）、非离子型表面活性剂和酪蛋白。

本发明的发明者们首次发现：作为用作免疫层析法检查药品的检体处理液或展开溶剂，使用含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用试剂组合物，由此能够提供不引起抗体固定胶体金凝集、同时展开速度快的检查药品。

在本发明的检测系统中，提供了这样一种免疫层析装置，该免疫层析装置通过使用含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用试剂组合物，能够在抑制非特异性反应的同时快速、简单并高度精确地检测（例如）采集自呼吸疾病患者的检体（特别是鼻涕、鼻腔拭子液或痰等）中的抗原（例如流感病毒、腺病毒和RS病毒等病毒）。

另外，还提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒通过将检体样品滴加至该检测试剂盒的样品添加部，在抑制非特异性反应的同时与检体中的抗原发生特异性反应，从而能够快速、简单并高度精确地进行检体检查，所述检体样品用含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用检体处理液或展开溶剂处理过。

本发明提供了下列（a）至（h）所述的免疫层析用试剂组合物、使用所述免疫层析用试剂组合物的检体处理液或免疫层析用展开液、使用所述免疫层析用试剂组合物的免疫层析装置、使用所述免疫层析用试剂组合物的检测试剂盒以及使用所述免疫层析用试剂组合物的免疫层析法。

（a）本发明的第一特征在于一种免疫层析用试剂组合物，其含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

（b）本发明的第二特征在于根据（a）所述的免疫层析用试剂组合物，其中，所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(23)月桂醚。

（c）本发明的第三特征在于根据（a）所述的免疫层析用试剂组合物，其用于将纳米金颗粒用作标记物质的检测系统。

（d）本发明的第四特征在于一种免疫层析用检体处理液，其含有在（a）至（c）中任意一项所述的免疫层析用试剂组合物。

（e）本发明的第五特征在于根据（d）所述的免疫层析用检体处理液，其中，所述检体为鼻涕、鼻腔拭子液或痰中的任意一种。

（f）本发明的第六特征在于一种检测试剂盒，其含有免疫层析用检体处理液，所述免疫层析用检体处理液含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

（g）本发明的第七特征在于一种用于检测检体中的检测对象的免疫层析用展开液，其含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

（h）本发明的第八特征在于一种免疫层析法，其包括将含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白的免疫层析用展开液用作构成移动相的展开液。

发明效果

根据本发明的免疫层析用试剂组合物含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白。通过将含有这三种组分的免疫层析用试剂组合物用作检体处理液或免疫层析用展开液，可以提供不引起抗体固定胶体金的凝集、同时展开速度快的检查药品。

在本发明的检测系统中，通过使用含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用试剂组合物，提供了一种在不引起非特异性反应的情况下能够快速、简单并精确地检测（例如）采集自呼吸疾病患者的检体（特别是鼻涕、鼻腔拭子液或痰）中的抗原（例如流感病毒、腺病毒和RS病毒等病毒）的免疫层析装置。尽管抑制机制的原理的细节尚未阐明，然而通过鼻涕等检体中含有的高粘性的蛋白质而产生的标记物质之间的凝集或者标记物质与层析介质之间由于非特异性结合而导致的凝集得到了抑制，或者标记物质与层析介质上的检测试剂之间不发生非特异性反应，从而使得该装置的灵敏度不劣化，由此能够正确地判定结果。

本发明的检测试剂盒具有以下优点：由于用免疫层析用检体处理液（其含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白）处理过的检测样品被滴加至该检测试剂盒的样品添加部，并且在不引发非特异性反应的同时与检体中的抗原发生特异性反应，从而能够快速、简单并高度精确地进行检体检查。

此外，本发明的特征在于：通过将含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用展开液用作构成移动相的展开液，能够进行迅速且简易的检查。

具体实施方式

下面将对本发明进行更详细地说明。

本发明的实施方案基于免疫层析法或使用了该免疫层析法的检测方法，其为这样一种方法：通过层析材料上的抗原抗体反应，使作为各种检体中的待检测物质的检测对象（抗原）和与其特异性结合的标记物质（抗体）形成复合物；将其在免疫层析介质上沿吸收部的方向展开；并以各种检测方法对其进行确认。作为与该抗原最特异性地反应并结合的抗体，可以随意使用与该抗原特异性结合的（例如）单克隆抗体、多克隆抗体或其它公知抗体。

尽管可以随意地将酶、显色物质、荧光物质或放射性物质用作标记，然而可以考虑免疫层析法的特性（即操作简单并且检测时间短）、或者考虑抗体或抗原的种类来决定标记。

检出手段的特征在于：其能够在视觉判定中做出正确的判定，从而不损害免疫层析法的特性（即，操作简单且在相对短的时间内做出判定）。当检测必须在有限的时间内完成，或者需要精确检测时，可以结合分光光度检测和辐射检测等各种检测手段来进行检测。

对于在使用免疫层析法进行检测时对检测的精确度和非特异性反应具有很大影响的展开液进行了研究，结果表明以下实施方案是最适合的。

即，本发明的发明者们在使用含有pH缓冲液等的展开液的免疫层析检测方法中，对于有效抑制由生物亲和性引起的副反应、或者有效消除疏水性结合或电相互作用的物质进行了广泛研究，这些物质有（例如）表面活性剂、铵盐、pH缓冲液以及抑制非特异性反应的各种添加剂（例如用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质）。结果，首次发现：虽然抑制机制尚未被阐明，然而在对采集自（例如）呼吸疾病患者的检体（特别是鼻涕、鼻腔拭子液、痰等）中的抗原（例如流感病毒、腺病毒和RS病毒等病毒）进行检测时，通过使用含有Bicine、非离子型表面活性剂和酪蛋白的免疫层析用试剂组合物，可以抑制由生物亲和性引起的副反应、或者由疏水性结合和电相互作用引起的非特异性反应（噪音），同时促进了抗原抗体反应；增强了信号；并且不引发抗体固定胶体金的凝集。由此完成本发明。此外，当本发明的试剂组合物用于免疫层析检测法时，通过鼻涕等检体中含有的高粘性的蛋白质而产生的标记物质之间或者标记物质与层析介质之间由于非特异性结合而导致的凝集能够得到抑制；不发生由于层析材料的孔被堵塞而导致的展开速度的降低；并且能够抑制由于高粘性蛋白质而导致的粘度的增加，因此可以在不导致灵敏度降低的情况下进行快速的展开，从而实现快速检测。

可用于本发明的免疫层析用试剂组合物的非离子型表面活性剂的例子包括：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯（“Tween”系列，商品名）、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚（“Triton”系列，商品名）、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚（“TritonN”系列，商品名）、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺和烷基单甘油基醚等。其中，优选聚氧乙烯烷基醚。优选使用聚氧乙烯(23)月桂醚（“Brij35”，商品名）和聚氧乙烯(20)鲸蜡醚（“Brij58”，商品名）。其中，特别优选聚氧乙烯(23)月桂醚（“Brij35”，商品名）。期望的是非离子表面活性剂实质上不含除聚氧乙烯(23)月桂醚（“Brij35”，商品名）之外的非离子表面活性剂。然而，可以在不对本发明造成不良影响的条件下与其它非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂混合。

相对于免疫层析用试剂组合物的总量，用于本发明的免疫层析用试剂组合物的非离子型表面活性剂的含量在0.01至10重量%的范围内，优选在0.05至5重量%的范围内。小于0.01重量%的含量（例如0.005重量%）不足以进行正确的判定。当含量小于0.05重量%时，由于无法抑制非特异性反应，因此趋向于变得难以进行正确的判定。当含量为10%以上时，例如为12重量%或18重量%时，非离子型表面活性剂的浓度超过了所需浓度，不仅会对非特异性反应的控制造成不良影响，并且在技术上也变得毫无意义。这样的含量是不经济且浪费的。

用于本发明的提取展开液等免疫层析用试剂组合物的盐的代表性例子包括氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁。优选氯化钠。

用于本发明的提取展开液等免疫层析用试剂组合物的盐相对于免疫层析用试剂组合物整体的浓度在1mM至500mM的范围内，优选在5mM至200mM的范围内，更加优选在1mM至50mM的范围内。低于1mM的浓度（例如0.1mM）不足以有效进行蛋白质提取。500mM以上的浓度（例如1M或2M）在技术上是没有意义的。这种超过所需浓度的浓度是不经济且浪费的。

用于本发明的免疫层析用试剂组合物的盐可以单独使用，或者两种以上结合使用。

作为本发明的免疫层析用试剂组合物的组分之一的Bicine缓冲液相对于免疫层析用试剂组合物整体的浓度优选在10mM至200mM的范围内，更加优选在10mM至100mM的范围内，进一步优选在30mM至100mM的范围内。浓度低于10mM的Bicine缓冲液无法具有充分的缓冲效果，并且还无法充分抑制标记颗粒的凝集。当浓度为200mM以上时，超过了所需浓度，因此是不经济且浪费的。最合适的是将其制备成pH范围为7.7至9.1的缓冲液。

本发明的免疫层析用试剂组合物优选基本上不含有Bicine以外的缓冲液。然而，可以在不对本发明造成不良影响的范围内混合其它缓冲液。

作为本发明的免疫层析用试剂组合物的组分之一的酪蛋白，优先使用单独的酪蛋白，然而也可以使用含有酪蛋白的试剂，例如粉末状脱脂牛奶。相对于免疫层析用试剂组合物的总重量，酪蛋白的浓度优选在0.01至20重量%的范围内，更加优选在0.1至10重量%的范围内，进一步优选在0.5至5重量%的范围内。低于0.01重量%的量不足进行正确的判定，因此它不能抑制非特异性反应。20重量%以上的量在必要浓度以上，是不经济且浪费的。

在本发明的免疫层析用试剂组合物中，加入一种或两种抑制由生物亲和性引起的副反应或抑制非特异性反应的公知添加剂是可能并有效的，所述公知添加剂为（例如）用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质（如牛血清蛋白、明胶等）、高分子化合物（如聚乙二醇、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖等）、以及离子型表面活性剂或聚阴离子（如硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、硫酸软骨素等）。它们的加入不会影响本发明的效果。将用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物、离子型表面活性剂或聚阴离子、或者抗生素的一或两种保持在构成固定相的层析介质上的移动相的迁移路径上也是可能并有效的。它们的保持不影响本发明的效果。

本发明的免疫层析用试剂组合物可最适合用作展开液。其也可以最适合用作检体样品的处理液。该组合物的使用方法不限于以上方法，还可以通过将免疫层析用试剂组合物的组分设置在免疫层析介质上的移动相的迁移路径上而使用。作为展开液，通常，水被用作溶剂，并向其中添加Bicine缓冲液、酪蛋白和非离子型表面活性剂。添加顺序没有特别的限制，它们可以同时添加。当该组合物用作展开液时，可以通过将预先获得的待检测样品（检体样品）和展开液供给/滴加到样品垫（样品添加部）上、或者先将样品供给/滴加到样品垫（样品添加部）上之后再将展开液供给/滴加于样品垫（样品添加部）上来进行展开。当该组合物用作检体处理液时，将检体样品预先用该处理液进行稀释，然后将所得处理液直接作为展开液供给/或滴加到样品垫（样品添加部）上。

当本发明的免疫层析用试剂组合物的组分通过被设置在免疫层析介质上的移动相的迁移路径上而使用时，可以通过这样的方法实现：例如，在将该组合物涂布至免疫层析装置中的样品垫（样品添加部）上、或者利用该组合物含浸样品垫后，通过干燥使其担载或保持于样品垫中。在另一模式中，通过在样品添加部的端部与吸收部之间的所需位置处设置添加剂保持部，并将该组合物保持在添加剂保持部上，从而使本发明的免疫层析用试剂组合物保持或担载于免疫层析介质上。添加剂保持部可以是（例如）样品添加部或标记物质保持部，或者在免疫层析介质上。尤其是可以使该组合物仅担载或保持在样品添加部和/或标记物质保持部上。

含有本发明的检测对象的样品（检体）（例如）主要为生物体样品，其具体例子包括血液、血清、血浆、尿、唾液、髓液、汗、眼泪、羊水、乳头分泌液、鼻涕、痰、鼻腔或咽拭子液、皮肤分泌物、以及组织、细胞或粪便的提取物。

本发明的检测对象没有特别的限制，只要存在与其特异性结合的物质（例如，如抗原抗体反应中那样的特异性结合的物质）或能够制备出这样的物质即可。所述检测对象可以是本身具有抗原性的完全抗原，或者是本身没有抗原性、但可以通过化学修饰得到抗原性的半抗原（不完全抗原）。简言之，只要存在或可以制备与这些检测对象特异性结合的物质即可。该物质可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明中的检测对象的例子包括：肽类激素（生长激素（GH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、黑素细胞刺激激素（MSH）、催乳激素、促甲状腺激素（TSH）、黄体化激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、垂体激素、钙代谢调节激素、肾脏激素、胃肠激素、血管活性激素和人绒毛膜促性腺激素（hCG）等胎盘激素）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺特异抗原（PSA）、碱性磷酸酶、转氨酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）等肿瘤特异物质、免疫球蛋白G（IgG）等血清蛋白组分、类风湿因子、血清素、尿激酶、铁蛋白、P物质、雌激素（如雌激素酮）、便潜血、梅毒抗体、流感病毒、腺病毒、RS病毒、轮状病毒、HBs抗原、HBs抗体、衣原体抗原、化脓性链球菌（Streptococcus pyogens）抗原等细菌抗原、天然或合成的孕激素、睾酮等雄性激素、皮质醇等肾上腺皮质激素、其它类固醇（如胆固醇、胆汁酸、强心性类固醇和皂苷元等）、肾上腺素、多巴胺、生理活性生物碱、含氨基的精神药物、TRH等小分子肽、二碘甲状腺氨酸等甲状腺激素、前列腺素、维生素类、青霉素等抗生素、其它体内组分、以及体内投药及其代谢产物。在这些检测对象中，优选病毒，更加优选流感病毒、腺病毒和RS病毒。

最适合于本发明的检体是鼻涕、鼻腔或咽拭子液、或者痰。通过预先使用本发明的检体处理液稀释这种检体，能够确切地检测出作为检测对象的采集自呼吸疾病患者的抗原（病毒：主要是流感病毒、腺病毒、RS病毒）。

用于检测检体中的检测对象的免疫层析装置的结构和操作以及检测方法是公知的（例如，参照专利文献5）。

将预先利用本发明的检体处理液稀释检体而获得的检体样品滴加到传统的免疫层析装置的样品垫上，并在免疫层析介质上沿吸收部的方向展开检体样品，以引发抗原抗体反应，由此进行检体中的检测对象的鉴定和定量等检查。

下面将对免疫层析装置进行说明。

通常，免疫层析装置由（1）样品添加部（也被称为“样品垫”）、（2）标记物质保持部、（3）层析介质、（4）检测部（也被称为“判定部”）、（5）吸收部和（6）垫板（packing sheet）构成。

样品添加部（1）由玻璃滤纸等多孔片制成，所述玻璃滤纸等多孔片允许样品的迅速吸收，但保持力弱，使得样品迅速向反应部移动。

此外，为了更有效地抑制非特异性反应，根据需要，还可将含有Bicine、酪蛋白和非离子型表面活性剂这三种组分的本发明的免疫层析用试剂组合物涂布至样本垫（1）上、或者样品垫（1）的端部和吸收部（5）之间的任意区域上，或者可预先使用该组合物含浸样品垫或上述区域，然后通过干燥使该组合物保持或担载于其上。

标记物质保持部（2）保持有利用标记组分对试剂组分进行标记而获得的标记试剂。标记组分的例子包括：胶体金属颗粒、乳胶颗粒、酶和荧光化合物。其中，胶体金属颗粒是最适合的。试剂组分是具有识别分析物的能力的颗粒或分子，优选单克隆抗体或多克隆抗体，或者它们的片段（第二试剂）。

作为胶体金属颗粒，优选任意使用银、铂、锗、铑或钯等贵金属的单一颗粒或复合颗粒。特别是，金对于色相的变化敏感，因此是最适合的。从胶体金属颗粒的状态判定，其平均粒径为大约1至500nm，优选为大约10至250nm，更加优选为35至100nm。相对于介质，以大约0.0001至0.08重量%、优先以大约0.002至0.06重量%的量含有胶体金属颗粒。本文中使用的术语“纳米金颗粒”表示具有这样的纳米级平均直径的各种胶体金颗粒。在免疫学测定中，考虑到胶体金的粒径、粒度分布和色调，将胶体铂颗粒保持在胶体金颗粒的表面而获得的胶体金复合颗粒可以被用作免疫学测定的标记，并且可以用于增强作为蛋白质的染料的有效性。另外，通过使用胶体金标记扩增剂（label amplifier）等所谓的增感剂，能够增强测定灵敏度，所述胶体金标记扩增剂具有能够结合至金属颗粒表面的官能团和能够结合至抗体的反应基团。这些贵金属的纳米胶体能够以常规方式制备，例如，通过将公知的还原剂添加到氯化贵金属酸、硝酸贵金属酸或硝酸贵金属酸的水溶液中来制备。它们可以通过各种传统的方法进行测定，例如使用动态光散射粒度分析仪测定胶体的密度分布，然后确定平均粒径。

可以将各种出售的胶体金属颗粒和胶体金属颗粒悬浊液用作本发明中使用的胶体金属颗粒。例如，可以使用胶体金悬浊液（“LC40nm”，田中贵金属的商品）

层析介质（3）在膜载体上具有检测部（4）。膜载体没有特别的限制，只要是可以通过毛细作用吸收样品检体并使其移动即可。例如，膜载体可选自由硝化纤维素、乙酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯基醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、以及由它们的混合纤维制成的人造聚合物构成的组。

在检测部（4）中，单克隆抗体或多克隆抗体、或者其片段（第一试剂）担载并固定于硝化纤维素片上。

吸收部（5）由具有迅速吸收过剩样品的能力的材料（例如玻璃滤纸）制成。

垫板（6）是基材。通过在垫板的一个面上分别涂布粘合剂或者粘贴胶带，使垫板在该面上具有粘合性，样品添加部（1）、标记物质保持部（2）、层析介质（3）、检测部（4）和吸收部（5）的一部分或全部被牢固地结合在垫板的粘合面上。垫板（6）作为基材没有特别的限制，只要是通过压敏粘合剂使其对样品液具有不透过性或非透湿性即可。

用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂）和用于标记试剂的试剂组分（第二试剂）中的一者或两者可以是单克隆抗体或多克隆抗体。从测定灵敏度等的角度考虑，用于标记试剂的试剂组分（第二试剂）优选为特异性高的单克隆抗体。用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂）即可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。

单克隆抗体和多克隆抗体及它们的片段是公知且可以得到的。并可通过公知的方法进行制备。产生抗体的动物的例子包括人、小鼠、大鼠、兔和羊。作为免疫球蛋白，可以使用IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意一者。

单克隆抗体可以通过常规方法获得。将经抗原（例如A型流感病毒）免疫的小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞杂交。选择产生目标抗体的杂交瘤细胞，获得由其产生的单克隆抗体。例如可参照

和Milstein发表的方法（Nature,256(1975),495-497）。

多克隆抗体可通过常规方法，利用抗原（例如A型流感病毒）对可产生抗体的动物（例如人、小鼠、大鼠、兔、羊或马等）进行免疫得到抗血清，在所得的抗血清中分离获得目标抗体而获得。

尽管如本发明的实施例所述：作为用于标记试剂的试剂组分（第二试剂），使用了来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体，并且作为用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂），使用了来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体，但试剂组分并不限于此。也可以使用来自于小鼠的抗A型流感多克隆抗体。

下面是判定原理的概要。

1.将规定量（通常0.1至2ml）的检体样品（用检体处理液稀释的检体）滴加在样品垫（1）上。滴加检体样品时，虽然检体样品在样品垫（1）中被迅速吸收，但所得样品垫立即与样品一同开始移动。当利用免疫层析用试剂组合物含浸样品垫（1）时，免疫层析用试剂组合物溶解在检体样品的水分中，并与检体样品一同开始移动。

2.检体样品首先向标记物质保持部（2）移动。当检体样品通过该部位时，标记物质保持部（2）上所保持的标记试剂（第二试剂）溶解在样品的水分中，并与样品一同移动。

3.接着，溶解于检体样品水分中的标记试剂通过层析介质（3）上的检测部（4）。此处，溶解在检体样品中的免疫层析试剂组合物抑制了非特异性结合反应。当检体样品含有检测对象（例如抗原）时，由于抗原抗体特异性结合反应，它以夹在抗体和标记试剂之间的方式与该抗体发生特异性反应并结合，由此使检测部（4）着色，所述抗体担载并固定于检测部（4）上。当检体样品不含有检测对象（例如抗原）时，标记试剂溶解于样品的水分中，即使样品通过层析介质（3）上的检测部（4），也不会发生特异性结合反应。因此，检测部（4）没有被着色。

4.最后，样品的水分移动至吸收部（5）。

由此可以对检体样品中的检测对象（例如抗原）的存在与否做出正确的判定。

实施例

尽管下面将以实施例对本发明的效果进行说明，然而本发明并不局限于此。在本发明中，如果没有特别说明，比率、份和%等以重量计。

[实施例1=Brij35]

（1）层析介质上的判定部的制备

作为膜，使用了由硝化纤维素制成的薄片（“HF120”，商品名；Millipore的商品，300mm×25mm）。利用含有5重量%异丙醇的磷酸缓冲液（pH7.4）将来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体（第一抗体）稀释为1.0mg/ml的浓度。将所得溶液（150μL）以1mm的宽度涂布于膜上，然后在50℃下干燥30分钟，之后在室温下干燥过夜，制得免疫层析介质。

（2）标记物质溶液的制备

将0.1ml由磷酸缓冲液（pH7.4）稀释为0.05mg/ml的浓度的来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体（第二抗体）添加到0.5ml胶体金悬浮液（“LC40nm”，田中贵金属的商品）中，随后将其在室温下静置10分钟。然后，添加0.1ml含1重量%的牛血清蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，随后将其在室温下静置10分钟。充分搅拌后，以8000×g离心15分钟。除去上清液后，加入含1重量%BSA的磷酸缓冲液（pH7.4）。以上述方式制得标记物质溶液。

（3）免疫层析用试验片的制备

将300μL10重量%的海藻糖水溶液和1.8ml蒸馏水添加到300μL上述制备的标记物质溶液，将得到的混合物均匀添加到15mm×300mm的玻璃纤维垫（Millipore公司的商品）上，然后在真空干燥机中干燥，制得标记物质保持部件。接着，将上述制备的层析介质、标记物质保持部件、用作样品添加部的样品垫（Millipore的商品：300mm×30mm）、以及用于吸收展开的样品或标记物质等的吸收垫粘合到垫板制的基材上。用切割机将所得层叠体切割为5mm宽的切片，将此切片用作免疫层析用试验片。

（4）检体处理试剂的制作

制备50mM含有2重量%酪蛋白、25mM KCl、1重量%Brij35（Takara Bio Inc.的商品）和0.095%叠氮化钠的Bicine缓冲液（pH8.5），将所得缓冲液用作对鼻涕、痰或鼻腔拭子液等检体进行处理的试剂。

（5）判定

使用上述制备的免疫层析用试验片，根据以下方法对样品中A型流感病毒的存在与否进行测定。

具体为，将吸引器的管的一端插入吸引泵，管的另一端插入未患流感的人的鼻腔，并将吸引泵设置为负压，由此采集鼻涕。利用检体处理试剂将这样采集到的鼻涕稀释20倍，得到阴性检体样品。向阴性检体样品中添加购买的非活性A型流感病毒，得到25ng/mL或50ng/mL的蛋白质浓度，由此获得阳性检体样品。将阴性检体样品和阳性检体样品各150mL置于免疫层析用试验片的样品垫上并展开，15分钟后进行目视判定。当确认到红色检测线时，样品被判定为“+”；当确认到红线，但其为非常浅的红线时，样品被判定为“±”；当没有确认到红线时，样品被判定为“-”。结果如表1所示。

[实施例2=Tween20]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，使用聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯（Tween20，商品名）替换了Brij35。结果如表1所示。

[实施例3=Triton X-100]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，使用聚氧乙烯(10)对叔辛基苯基醚（Triton X-100，商品名）替换了Brij35。结果如表1所示。

[对比例1=Tricine]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，使用作为仲胺的Tricine（pH8.5）替换了Bicine。结果如表1所示。

[对比例2=BES]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，使用作为叔胺的2-{N,N-二(2-羟乙基)氨基乙磺酸}（Good缓冲液之一，下面将简称为“BES”）（pH8.0）替换了Bicine。结果如表1所示。

[对比例3=BSA]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，使用BSA替换了酪蛋白。结果如表1所示。

[对比例4=无Brij35]

按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，没有使用Brij35。结果如表1所示。

表1

如上所述，在实施例1至3中，通过使用含有Bicine、酪蛋白和非离子型表面活性剂（Brij35、Tween20或Triton X-100）的检体处理试剂组合物，得到了即不引发抗体致敏胶体金（antibody-sensitized colloidal gold）的凝集也不引发非特异性反应、并且展开速度快的展开液。

除了以Tricine用作缓冲液替换掉Bicine之外、按照与实施例1相同的方式进行测定（对比例1），此时在浓度为25ng/mL的阳性检体样品中确认到红线，但是其颜色非常浅。此外，由于发生了抗体致敏胶体金的凝集，因此作为检查试剂盒，它是不令人满意的。

除了以BES替换掉Bicine之外、按照与实施例1相同的方式进行测定（对比例2），此时在浓度为25ng/mL的阳性检体样品中没有确认到红线。在浓度为50ng/mL的阳性检体样品中虽然确认到红线，但颜色非常浅。此外，发生了抗体致敏胶体金的凝集，并且展开速度慢，这妨碍了正确判断，因此作为检测试剂盒，此样品是不理想的。

除了以BSA替换掉酪蛋白之外、按照与实施例1相同的方式进行测定（对比例3），此时对于阴性检体样品发生了非特异性反应，并且还发生了抗体致敏胶体金的凝集，这妨碍了正确判断。

除了不使用Brij35之外、按照与实施例1相同的方式进行测定（对比例4），此时对于阴性检体样品发生了非特异性反应。此外，发生了抗体致敏胶体金的凝集，并且展开速度慢，这妨碍了正确判断。

这些结果表明：在使用免疫层析法的测定中，通过将含有Bicine（作为缓冲液）、酪蛋白（作为促进抗原抗体反应和抑制非特异性反应的蛋白质）和非离子型表面活性剂这三种组分的试剂组成物用作检体处理液，可以在不引发抗体致敏胶体金凝集且展开速度快的前提下做出正确的判定，因此产生了显著的效果。

接下来，制备含有各种浓度的Bicine的检体处理液，并对流感病毒进行检测和测定（实施例4和5）。按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，变更了用于制备检体处理试剂的Bicine的浓度。结果如表2所示。

表2

由上述结果确认：在实施例4和5中，即使Bicine的浓度分别变更为200mM和100mM，也没有发生抗体致敏胶体金的凝集和非特异性反应，此外，它们的展开速度与实施例1同样快。

工业实用性

当本发明的展开溶剂或检体处理液被用于所述免疫层析法时，具有不发生抗体致敏胶体金的凝集并且展开速度快的优异有益效果，所述免疫层析法将纳米金颗粒用作标记物质，并利用抗原抗体反应对检测对象进行检测。由于这样的有益效果，使得高灵敏度和快速的临床检查成为可能，从而具有高度的工业实用性。

已经详细地或参照某些特定的实施方案对本发明进行了说明。对本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以做出各种变更或修改。

本发明基于2012年8月3日提交的日本专利申请（日本专利申请No.2010-174930），其内容以引用的方式并入本文。所有引用的参考文献作为整体并入本文。

Claims (8)

1.一种免疫层析用试剂组合物，其含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

2.根据权利要求1所述的免疫层析用试剂组合物，其中，所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(23)月桂醚。

3.根据权利要求1所述的免疫层析用试剂组合物，其用于将纳米金颗粒用作标记物质的检测系统。

4.一种免疫层析用检体处理液，其含有根据权利要求1至3中任意一项所述的免疫层析用试剂组合物。

5.根据权利要求4所述的免疫层析用检体处理液，其中，所述检体为鼻涕、鼻腔或咽拭子液、或者痰中的任意一种。

6.一种检测试剂盒，其含有免疫层析用检体处理液，所述免疫层析用检体处理液含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

7.一种用于检测检体中的检测对象的免疫层析用展开液，其含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。

8.一种免疫层析法，其包括将含有非离子型表面活性剂、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白的免疫层析用展开液用作构成移动相的展开液。