CN113219169A - 生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒 - Google Patents
生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及生物检测领域,具体公开了一种生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒。每升封闭剂由包含以下原料制成:水溶性醇类有机物2.5‑9g、聚氨基葡萄糖0‑1.1g、明胶0‑0.7g、抗氧化剂0.1‑0.4g、防腐剂0.07‑0.2g,余量为水;所述水溶性醇类有机物选自乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇中的至少两种。封闭剂的制备方法包括以下步骤:按配方量将水溶性醇类有机物、聚氨基葡萄糖、明胶、抗氧化剂、防腐剂和水混合均匀。包被板经上述封闭剂封闭后制得,试剂盒包括上述制得的包被板。采用本申请的封闭剂可有效降低检测过程中的非特异性反应,假阳性结果少,诊断特异性高。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测领域,更具体地说,它涉及生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒。
背景技术
固相阻断ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。
在ELISA抗体试剂盒的制备中,一般情况下,是将可溶性抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上,血清中的抗体与抗原发生特异性反应形成抗原抗体免疫复合物。由于可溶性抗原与固相载体之间的吸附为非特异性的物理吸附,固相载体上会存在部分位置没有吸附有抗原(即固相载体上存在空白点位),固相载体与血清中的抗体之间由于表面张力的作用在此过程中也会产生非特异性吸附,即部分抗体直接吸附在固相载体上的空白点位上而并非与抗原结合,从而影响检测结果。因此在ELISA抗原包被板制备过程中,通常加入5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA(牛血清白蛋白)作为封闭剂,以减少抗体与固相载体之间的非特异性吸附,从而减少在检测过程中产生假阳性结果。
但是在实际应用中,通过实验发现,无论是采用脱脂奶粉还是BSA作为封闭剂,经封闭后,血清中的抗体依旧会与固相载体之间发生非特异性吸附,试剂盒临床检测效果依旧并不理想,假阳性结果依旧较高,诊断特异性低。
发明内容
为提高诊断特异性,解决试剂盒假阳性结果较高的问题,本申请提供一种生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒。
第一方面,本申请提供的生物检测用封闭剂采用如下的技术方案:
生物检测用封闭剂,每升封闭剂由包含以下原料制成:水溶性醇类有机物2.5-9g、聚氨基葡萄糖0-1.1g、明胶0-0.7g、抗氧化剂0.1-0.4g、防腐剂0.07-0.2g,余量为水;所述水溶性醇类有机物选自乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇中的至少两种。
进一步优选抗氧化剂为二硫苏糖醇、类胡萝卜素、黄酮类化合物中的一种。
进一步优选防腐剂为叠氮钠、1,2-己二醇、乙内酰脲中的一种。
水为三蒸水或超纯水。
通过采用上述技术方案,水溶性醇类有机物具有良好的亲水性和水溶性,对固相载体表面进行有效封闭,使得目标蛋白与固相载体之间难以接近,有效控制目标蛋白的非特异性吸附,从而减少目标蛋白与固相载体之间的非特异性吸附,提高诊断特异性。
抗氧化剂和防腐剂,具有良好的抗氧化性能和防腐性能,延长封闭剂的保质期和提高封闭剂的稳定性。采用二硫苏糖醇、类胡萝卜素或黄酮类化合物如异黄酮,均可提高封闭剂的抗氧化性能,延长封闭剂的保质期。采用叠氮钠、1,2-己二醇或乙内酰脲,均可提高封闭剂的防腐性能,与抗氧化剂一起协同改善封闭剂的稳定性。通过研究发现,抗氧化剂采用二硫苏糖醇、防腐剂采用叠氮钠延长试剂盒的保质期的效果最好,可使得制得的试剂盒至少可放置一年,依旧能保持优异的检测准确性。
优选的,水溶性醇类有机物为乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇的混合物。
通过采用上述技术方案,优化水溶性醇类有机物的组分选取,协助改善固相载体表面的生物相容性,降低非特异性反应,提高诊断特异性。
任意两种物质进行复配,得到的封闭剂的封闭效果均差于三种物质进行复配的效果,选用三种物质进行复配得到的试剂盒,不仅诊断特异性更佳,诊断敏感性也有一定程度的提升。
优选的,乙二醇、聚乙烯醇与聚乙二醇的重量比为(1-2):(1-5):(0.5-2)。
进一步优选聚乙烯醇的相对分子量为31000-50000,聚乙二醇的相对分子量为380-420。
通过采用上述技术方案,进一步优化水溶性醇类有机物各组分之间的配比,进一步降低非特异性反应,提高诊断特异性。
优选的,原料中聚氨基葡萄糖为0.5-1.1g。
通过采用上述技术方案,聚氨基葡萄糖在体系中还对蛋白质的结构具有一定的稳定作用,保留蛋白质在体系中的活性,削弱蛋白质因体系中的分子间作用力而导致自身结构松散的情况,从而提高抗原与抗体蛋白之间的特异性吸附,减少非特异性吸附的情况,从而减少假阳性结果,提高诊断特异性。
优选的,原料中明胶为0.3-0.7g。
通过采用上述技术方案,由于固相载体上会存在部分位置没有吸附有抗原(即固相载体上存在空白点位),明胶的加入可占据部分固相载体表面的空白点位,进一步降低非特异性吸附的发生,提高诊断特异性。
优选的,聚氨基葡萄糖与明胶的质量比为1:(0.5-1)。
通过采用上述技术方案,当氨基葡萄糖和明胶以一定比例同时加入时,不仅改善诊断特异性,还可协同显著提高诊断敏感性,进一步提高试剂盒的检测准确性。
第二方面,本申请提供一种生物检测用封闭剂的制备方法,采用如下的技术方案:
生物检测用封闭剂的制备方法,包括以下步骤:按配方量将水溶性醇类有机物、聚氨基葡萄糖、明胶、抗氧化剂、防腐剂和水混合均匀。
通过采用上述技术方案,制得的封闭剂可明显降低非特异性吸附,提高试剂盒的诊断特异性,同时提高诊断敏感性。
第三方面,本申请提供一种包被板,采用如下技术方案:
一种包被板,将固相载体经上述的封闭剂封闭后制得。
第四方面,本申请提供一种试剂盒,采用如下技术方案:
一种试剂盒,包括上述的包被板。
通过采用上述技术方案,采用本申请的包被板制得的试剂盒假阳性结果少,诊断特异性高。
综上所述,本申请至少具有以下有益效果之一:
1、优化水溶性醇类有机物的组分选取,协助改善固相载体表面的生物相容性,降低非特异性反应,提高诊断特异性。优化水溶性醇类有机物种类的同时,还可协助改善试剂盒的诊断敏感性。
2、聚氨基葡萄糖在体系中还对蛋白质的结构具有一定的稳定作用,保留蛋白质在体系中的活性,削弱蛋白质因体系中的分子间作用力而导致自身结构松散的情况,从而提高抗原与抗体蛋白之间的特异性吸附,减少非特异性吸附的情况,从而减少假阳性结果,提高诊断特异性。
3、明胶的加入可占据部分固相载体表面的空白点位,降低非特异性吸附的发生,提高诊断特异性。
4、当氨基葡萄糖和明胶以一定比例同时加入时,不仅改善诊断特异性,还可协同提高诊断敏感性,进一步提高试剂盒的检测准确性。
附图说明
图1是本申请的微孔板加样位置示例图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
以每毫升生物检测用封闭剂计,将水溶性醇类有机物5.8mg、二硫苏糖醇0.2mg、叠氮钠0.1mg和三蒸水993.9mg混合均匀制得。其中水溶性醇类有机物为乙二醇4.3mg和相对分子量为400的聚乙二醇1.5mg。
实施例2
与实施例1的区别在于,水溶性醇类有机物为聚乙烯醇2.9mg和聚乙二醇2.9mg,其余均与实施例1相同。
实施例3
与实施例1的区别在于,水溶性醇类有机物为乙二醇2mg、聚乙烯醇1.8mg和聚乙二醇2mg,其余均与实施例1相同。
实施例4
与实施例1的区别在于,水溶性醇类有机物为乙二醇1.8mg、聚乙烯醇3mg和聚乙二醇1mg,其余均与实施例1相同。
实施例5
与实施例1的区别在于,水溶性醇类有机物为乙二醇2.5mg、聚乙烯醇0.4mg和聚乙二醇2.9mg,其余均与实施例1相同。
实施例6
生物检测用封闭剂,将水溶性醇类有机物5.8mg、聚氨基葡萄糖0.7mg、二硫苏糖醇0.2mg、叠氮钠0.1mg和三蒸水993.2mg混合均匀制得;其中水溶性醇类有机物为乙二醇1.8mg、聚乙烯醇3mg和聚乙二醇1mg。
实施例7
生物检测用封闭剂,将水溶性醇类有机物5.8mg、明胶0.4mg、二硫苏糖醇0.2mg、叠氮钠0.1mg和三蒸水993.5mg混合均匀制得;其中水溶性醇类有机物为乙二醇1.8mg、聚乙烯醇3mg和聚乙二醇1mg。
实施例8
生物检测用封闭剂,将水溶性醇类有机物5.8mg、聚氨基葡萄糖0.7mg、明胶0.4mg、二硫苏糖醇0.2mg、叠氮钠0.1mg和三蒸水992.8mg;其中水溶性醇类有机物为乙二醇1.8mg、聚乙烯醇3mg和聚乙二醇1mg。
实施例9
与实施例8的区别在于,聚氨基葡萄糖0.4mg、明胶0.7mg,其余均与实施例8相同。
对比例
对比例1
与实施例1的区别在于,水溶性醇类有机物为聚乙二醇5.8mg,其余均与实施例1相同。
对比例2
封闭剂采用质量浓度为0.1%的牛血清白蛋白溶液。
实施例1-9和对比例1中各原料组分如表1所示。
表1原料组分
应用例
包被板应用例
应用例1
包被板的制备步骤如下:
步骤1,在固相载体上以100ul/孔的量加入已配制好的包被液,在4℃的冰箱放置16小时;16小时后取出固相载体,吸出包被液,以300ul/孔的量通过洗涤液进行清洗,然后吸出洗涤液,反复洗涤3次;
步骤2,向步骤1洗涤后的固相载体中以200ul/孔的量加入实施例1制得的封闭剂进行封闭,于25℃恒温培养箱中放置1小时,1小时后,取出固相载体,吸出封闭剂,以300ul/孔的量通过洗涤液进行清洗,然后吸出洗涤液,反复洗涤3次;
步骤3,将步骤2洗涤后的固相载体倒置于37℃恒温培养箱中,干燥1小时,制得包被板;
以2升洗涤液计,洗涤液由以下原料制成:氯化钠150g、磷酸二氢钾4.5g、十二水磷酸氢二钠67.6g、氯化钾3.8g、Tween-20 3g、超纯水余量。
包被板应用例1-11对应采用的封闭剂如表2所示。
试剂盒应用例
应用例1
一种试剂盒,包括包被板应用例1制得的包被板、样品稀释液40mL、10倍洗涤液125mL、FMDV O型HRP标记抗体30mL、TMB底物液30mL、终止液20mL、阳性对照血清1mL、阴性对照血清1mL、封板膜。
试剂盒应用例1-11对应采用的包被板如表2所示。
表2各应用例对应关系
实施例 | 包被板 | 试剂盒 |
实施例1 | 包被板应用例1 | 试剂盒应用例1 |
实施例2 | 包被板应用例2 | 试剂盒应用例2 |
实施例3 | 包被板应用例3 | 试剂盒应用例3 |
实施例4 | 包被板应用例4 | 试剂盒应用例4 |
实施例5 | 包被板应用例5 | 试剂盒应用例5 |
实施例6 | 包被板应用例6 | 试剂盒应用例6 |
实施例7 | 包被板应用例7 | 试剂盒应用例7 |
实施例8 | 包被板应用例8 | 试剂盒应用例8 |
实施例9 | 包被板应用例9 | 试剂盒应用例9 |
对比例1 | 包被板应用例10 | 试剂盒应用例10 |
对比例2 | 包被板应用例11 | 试剂盒应用例11 |
性能检测试验
性能检测试验方法:
操作步骤:
1)将所有组份从试剂盒中取出,在恒温箱(25±3℃)中放置至少60分钟,恢复至室温。
2)按照“微孔板加样位置示例图”向抗原包被板指定孔中分别加入100μL稀释后的样品以及100μL稀释后阴性对照血清(NC)、阳性对照血清(PC)。其中样品稀释及阴性、阳性对照血清稀释如下:样品采用5倍稀释。按照“微孔板加样位置示例图”在稀释板中加入120μL样品稀释液,各孔加入30μL血清样品。同样比例稀释阳性对照血清(PC)与阴性对照血清(NC),即:在稀释板A1、B1、C1、D1孔各加入120μL样品稀释液,A1、B1孔各加入30μL NC,C1、D1孔各加入30μL PC,充分混匀。
3)盖上封板膜,室温(25±3℃)下孵育1小时(±2分钟)。
4)用ELISA洗板机或微量移液器洗板,弃去孔中液体,每孔加300μL 1倍洗涤液,洗涤3次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干,严禁各步骤之间孔板出现干燥情况。
5)每孔加入100μL FMDV O型HRP标记抗体。
6)盖上封板膜,室温(25±3℃)下孵育1小时(±2分钟)。
7)重复步骤4)。
8)每孔中加入100μL TMB底物液。
9)上封板膜,室温(25±3℃)下孵育15分钟(±1分钟)。
10)每孔中加入50μL终止液,终止酶促反应。
11)使用450nm波长测量吸光度值。
12)结果判定与计算。
判定:
1)实验成立条件:
阴性对照OD450nm平均值>0.7;
阳性对照S/N平均值<0.3;
如果检测结果不在界定范围则需要重新进行检测。
2)计算方法
NC OD均值=(NC1+NC2)/2
3)样品S/N值计算公式
S/N=样品OD值/NC OD均值
4)判定标准如下:阳性:S/N≤0.5;阴性:S/N>0.5。
根据上述检测方法,将试剂盒应用例1-11制得的试剂盒对血清进行检测,同时采用GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》规定的液相阻断酶联免疫吸附试验检测口蹄疫抗体进行对标,分别记录检测出来的阳性数和阴性数,试剂盒应用例1-11和液相阻断法对标试验的结果记录在对应表中。
计算诊断敏感性和诊断特异性:
诊断敏感性=(两种方法检测出的阳性数/液相阻断法检测出的阳性数)*100%;
诊断特异性=(两种方法检测出的阴性数/液相阻断法检测出的阴性数)*100%。
表3应用例1的实验数据
表4应用例2的实验数据
表5应用例3的实验数据
表6应用例4的实验数据
表7应用例5的实验数据
表8应用例6的实验数据
表9应用例7试验结果
表10应用例8实验数据
表11应用例9实验数据
表12应用例10的实验数据
表13应用例11的实验数据
结合实施例1-3并结合表3-5可以看出,实施例1-5中水溶性醇类有机物的含量相等,而实施例1-2选用乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇中的两种物质进行复配,其制得的试剂盒在诊断特异性方面均欠佳,通过研究发现,不管是乙二醇和聚乙烯醇搭配,还是乙二醇和聚乙二醇搭配,还是聚乙烯醇和聚乙二醇搭配,在检测的诊断特异性方面,均差于选用乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇三者进行复配的效果。同时还可以看到,采用实施例3作为封闭剂,后续得到的试剂盒的诊断敏感性也有一定程度的提升。由此可以看到,优化水溶性醇类有机物的种类选取,对诊断特异性的提高具有显著作用,同时改善诊断敏感性。
结合实施例3-5并结合表5-7可以看到,实施例3-5中水溶性醇类有机物的含量相等,但乙二醇、聚乙烯醇、聚乙二醇这三者物质的配比不同,而实施例5中三者的比例在优选范围外,与实施例3和4相比,采用实施例5作为封闭剂,后续得到的试剂盒在诊断特异性方面均较差,但效果依旧稍优于实施例1和2,进一步说明选用三者进行搭配的效果更佳。由此可见,乙二醇、聚乙烯醇、聚乙二醇这三者物质的配比,对诊断特异性的提高具有一定的改善作用。水溶性醇类有机物种类的选取不仅对诊断特异性的提高具有明显效果,而且可同时在一定程度上改善诊断敏感性;而乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇也需在特定范围内才能更好的发挥作用,有效减少非特异性的吸附。
结合实施例4和6-7并结合表6和8-9可以看到,实施例6在实施例4的基础上加入聚氨基葡萄糖,采用实施例6作为封闭剂,后续得到的试剂盒在诊断特异性方面有明显的提升。实施例7在实施例4的基础上加入明胶,采用实施例7作为封闭剂,后续得到的试剂盒在诊断特异性方面也有明显的提升。通过研究发现,聚氨基葡萄糖或明胶分别加入的量需在合理范围内,聚氨基葡萄糖或明胶的量过少,对诊断特异性的提高不明显,但聚氨基葡萄糖或明胶的量过多,反而不利于诊断特异性的提高。由此可见,聚氨基葡萄糖单一加入或明胶单一加入均可使得诊断特异性明显提升。
结合实施例6-8并结合表8-10可以看到,在实施例8中既加入聚氨基葡萄糖又加入明胶,采用实施例8作为封闭剂,后续得到的试剂盒不仅诊断特异性有所提升,而且诊断敏感性显著提高。结合实施例8-9并结合表10-11可以看到,实施例9中加入的聚氨基葡萄糖和明胶的配比不在本申请的优选范围内,采用实施例9作为封闭剂,后续制得的试剂盒的诊断特异性和诊断敏感性均有一定程度的下降。由此可见,聚氨基葡萄糖与明胶需在一定配比内协同增效,共同改善诊断特异性和诊断敏感性。
结合实施例1、对比例1并结合表3和表12可以看到,对比例1中的水溶类醇类有机物选用等质量的聚乙二醇进行替换,采用对比例1作为封闭剂,后续制得的试剂盒主要在诊断特异性方面的性能有所下降。
结合实施例8、对比例2并结合表10和表13可以看到,采用本申请制得的封闭剂,相较于市面上采用牛血清白蛋白溶液作为封闭剂,其后续制得的试剂盒在诊断特异性方面显著提高,诊断敏感性也有一定程度的提升,明显增强疾病检测的准确性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.生物检测用封闭剂,其特征在于,每升封闭剂由包含以下原料制成:水溶性醇类有机物2.5-9g、聚氨基葡萄糖0-1.1g、明胶0-0.7g、抗氧化剂0.1-0.4g、防腐剂0.07-0.2g,余量为水;所述水溶性醇类有机物选自乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇中的至少两种。
2.根据权利要求1所述的生物检测用封闭剂,其特征在于:水溶性醇类有机物为乙二醇、聚乙烯醇和聚乙二醇的混合物。
3.根据权利要求2所述的生物检测用封闭剂,其特征在于:乙二醇、聚乙烯醇与聚乙二醇的重量比为(1-2):(1-5):(0.5-2)。
4.根据权利要求1所述的生物检测用封闭剂,其特征在于:原料中聚氨基葡萄糖为0.5-1.1g。
5.根据权利要求1所述的生物检测用封闭剂,其特征在于:原料中明胶为0.2-0.7g。
6.根据权利要求1-5任一项所述的生物检测用封闭剂,其特征在于:聚氨基葡萄糖与明胶的重量比为1:(0.5-1)。
7.权利要求1-6任一项所述的生物检测用封闭剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:按配方量将水溶性醇类有机物、聚氨基葡萄糖、明胶、抗氧化剂、防腐剂和水混合均匀。
8.一种包被板,其特征在于,将固相载体经权利要求1-7任一项所述的封闭剂封闭后制得。
9.一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求8所述的包被板。
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