JP3539277B2 - 酵素免疫測定装置及び該装置を用いる測定法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置、及び該装置を用いる酵素免疫測定法(EIA)に関する。
【0002】
【従来の技術】
輸液可能なメンブレンを利用した簡易型EIAが知られている。この方法では基質を展開液に溶解しておくか又はメンブレン上に点着しておく。基質は、添加された検体を伴い展開液とともに移動し、陽性検体では、酵素との反応により検出ゾーンでの発色が観察される。基質を展開液に含む時には保存中に基質の分解を起こしやすい。そこで、メンブレン上に基質を点着する方法が基質を安定に保てるため、現在では主流となっている(例えば、特開平9−133681号参照)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、基質をメンブレン上に点着する方法では、陽性検体の場合に観察される発色が明瞭でなく、正確な判定が行いずらかった。従って、本発明は、検出ゾーンで生ずるシグナルを明瞭に観察し得る方法及び装置を提供することを課題とした。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、検体と反応した酵素標識試薬が充分に検出ゾーンで反応した後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型EIA及び装置を見出し本発明を完成した。
【0005】
本発明のEIA装置は、展開器材の一端に展開液と接触する展開液供給ゾーン、他の一端に展開液吸収ゾーンを付設し、該展開器材には拡散的に添加した酵素標識試薬、展開器材に非拡散的に結合した抗原又は抗体からなる検出ゾーン、検体点着ゾーンを設け、更に糖又は水溶性高分子化合物からなる基質展開を遅延させる物質と基質とを拡散的に添加した基質ゾーンを設けることができる。この装置では、検体点着ゾーンに検体を添加し、各試薬が添加された展開器材に展開液を供給するだけで免疫測定を行うことができる。基質ゾーンには、基質に添加する糖又は水溶性高分子化合物は基質と混合して添加することができる。また、糖又は水溶性高分子化合物は、展開器材の基質上又は基質の近傍に添加することができる。本発明に用いる糖又は水溶性高分子化合物は、展開器材上の展開液による基質の展開を遅延させる物質であり、例えば糖、水溶性高分子化合物等を使用することができる。糖としては、単糖、オリゴ糖又は多糖であってよく、例えばショ糖、トレハロース、ラクトース、マンノース、グルコース、アラビノース、キシロース、マルトース、デキストラン、アミロースデンプン等を挙げることができる。水溶性高分子化合物としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリアスパラギン酸、ポリ乳酸、ポリエチレンイミン、カゼイン、アルカリ処理カゼイン、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン等を挙げることができる。本発明の糖又は水溶性高分子化合物は、以下に示す使用量の範囲において水に溶解する化合物であれば各種分子量のものを用いることができる。
【0006】
また、本発明の基質ゾーンには、発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。発色基質は、標識酵素のアルカリ性ホスファーゼの測定には5−ブロモ−4−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム(BCIP)、5−ブロモ−6−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム、p−ニトロフェニルリン酸等、β−ガラクトシダーゼの測定には、5−ブロモ−4−クロロ−インドリル−β−ガラクトピラノシド、5−ブロモ−6−クロロ−インドリル−β−ガラクトピラノシド、o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド等、パーオキシダーゼの測定には、例えば1,2−フェニレンジアミン、3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン、2,2’−アジノビス−(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)等を用いることができる。蛍光基質は、アルカリ性ホスファターゼの測定には4−メチルウムベリフェリル・ホスフェート、β−ガラクトシダーゼの測定には、4−メチルウムベリフェリル・β−D−ガラクトシド等を用いることができる。発光基質は、アルカリ性ホスファーゼの測定には3−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3”−ホスフォリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン 二ナトリウム塩(AMPPD)、3−(4−クロロ−2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3”−ホスフォリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン 二ナトリウム塩(CSPD)等、β−ガラクトシダーゼの測定には、3−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3”−β−D−ガラクトピラノシル)フェニル−1,2−ジオキセタン等を挙げることができる。
【0007】
展開器材に添加する基質量は、特に限定されず、各測定物質によっても異なるが、通常水又は緩衝液に5〜40mg/ml、好ましくは10〜30mg/mlの濃度で溶解した溶液を展開器材に2〜10μl添加される。本発明の糖又は水溶性高分子化合物は、基質溶液に対し、1〜15%、好ましくは3〜10%添加することができる。また、展開器材に添加した基質は、0℃〜50℃又は凍結乾燥によって乾燥することが好ましい。
【0008】
本発明の展開器材は、展開液を輸液可能な矩形のメンブレン等であり、この材質は免疫測定に用いられるセルロース、ニトロセルロース等のセルロース又はセルロース誘導体、ガラス繊維等から構成された多孔質膜であることが好ましい。この展開器材の一端部には、展開液供給ゾーン、他の一端には展開液吸収ゾーンを設けることができる。
【0009】
本発明の展開器材に拡散的に添加される標識試薬は、測定物質と免疫反応する抗原又は抗体を酵素で標識して製造され、EIAで用いられる周知の酵素標識抗体又は酵素標識抗原を使用することができる。また、展開器材の設けられる検出ゾーンには、測定物質の抗体又は抗原と反応する抗原又は抗体が展開器材に物理吸着又は化学結合により非拡散的に結合される。さらに、検出ゾーンは、ゼラチン粒子等の粒子に抗原又は抗体を結合させた感作粒子を展開器材に添加して形成することもできる。
【0010】
本発明のEIA装置の断面図を図1に例示する。本発明のEIA装置1では、メンブレン2に前記糖又は水溶性高分子化合物と基質との混合物を含有した基質ゾーン3、メンブレンの一方の端部に設けた展開液供給ゾーン4、酵素標識試薬ゾーン5、検体点着ゾーン6、検出ゾーン7及びメンブレンの他方の端部に展開液吸収ゾーン8を設けることができる。基質ゾーン3は、メンブレンの展開液供給ゾーンから輸液方向の下流側、且つ酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けることが好ましい。酵素標識試薬ゾーン5には、酵素で標識された抗体又は抗原が展開液よって移動可能な状態で前記メンブレン上に設けたパッドに含有される。また、検出ゾーン7では、前記メンブレンには検体中の測定対象物質と免疫反応する抗原又は抗体がメンブレンにライン状に結合している。展開液11は破壊可能なシール部材12によって密封され、EIA装置の端部に付設された展開液槽10から展開液供給ゾーン4を通ってメンブレン2に展開液11を供給することができる。展開液吸収ゾーン8は吸水性の不織布で構成される。展開液吸収ゾーンは通常メンブレンよりも厚く形成されるが、このことは必須ではない。展開液供給ゾーン4は、前記展開液吸収ゾーン8の吸水性の不織布と同じ不織布をメンブレンに重ね合わせて構成することもできる。
【0011】
更に、本発明のEIA装置は、試薬類が添加された前記展開器材を例えば特開平10−104236号に記載されたプラスチック製のカセットに載置し、測定に用いることが好ましい。
【0012】
本発明では、測定物質の抗原又は抗体を含むを思われる検体を前記EIA装置の検体点着ゾーンに点着した後、水又は緩衝液からなる展開液を展開液供給ゾーンに供給することにより測定を開始することができる。検体点着ゾーンに添加された検体は、酵素標識試薬と反応をした後、展開液により展開して検出ゾーンで充分に反応が行われて結合する。次いで糖又は水溶性高分子化合物によって基質が遅延して展開し、検出ゾーンに到達して酵素との反応が起こる。検体中に測定物質が含まれない場合には、酵素標識試薬は検出ゾーン留まらずに展開液吸収ゾーンに吸収されてしまい、検出ゾーンの発色、蛍光、発光等のシグナルは観察されない。検体中の測定物質の測定は、展開液を前記EIA試薬の展開液供給ゾーンに供給後、通常10〜20分後にカセットに開けられた窓から検出ゾーンのシグナルを測定することにより行うことができる。また、前記展開液には、所望により更に発色、蛍光又は発光の増幅物質、安定化剤、防腐剤などを添加することもできる。
【0013】
【実施例】
以下実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1 HBs抗原の測定
5mm×50mmのニトロセルロース(ミリポア社製)からなるメンブレンの両端に、吸水性の不織布からなる展開液供給ゾーン及び展開液吸水ゾーンを設けた。メンブレンに付設した展開液吸収ゾーンから展開液の展開方向の上流側の部分に、抗HBs抗体を塗布乾燥して検出ゾーンとした。次いで、メンブレンの検出ゾーンの上流側にアルカリ性ホスファターゼ標識抗HBs抗体を含む吸水性不織布からなるパッドを重ね酵素標識試薬ゾーンとし、該ゾーン上を検体点着ゾーンとした。また、酵素標識試薬ゾーンの上流側には、下記表1に示す糖又は水溶性高分子化合物を5%含む20mg/mlの5−ブロモ−4−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム(BCIP)溶液5μlを添加し、37℃で風乾し基質ゾーンとした。このメンブレンを、特開平10−104236号に記載の展開液槽と展開液供給手段を持つ反応カセット内に納めて免疫測定装置とした。
【0014】
前記免疫測定装置の検体点着ゾーンに検体液として、濃度7.5ng/mlのHBs抗原を含む陽性血清25μl加え、反応カセットの展開液槽から展開液をメンブレンに供給し、測定を開始した。展開液供給後、15分経過後の検出ゾーンの発色強度を目視で測定した。同一の陽性検体で3回ずつ測定した結果を表1に示す。また、陰性検体を用いて15分後、30分後の測定結果を表1に示す。更に、BCIP溶液に糖又は水溶性高分子化合物を含有しない基質ゾーンを設けた装置による測定結果(無添加;比較例)を表1に示す。
【0015】
尚、表1中の記号は、検出ゾーンにおいて、−:ラインが認められない、±:青色が認められるがラインとして認められない、+:青色のラインが認められる、++:濃く鮮明な青色ラインが認めれることを示す。
【0016】
【表1】
【0017】
実施例2 抗HBs抗体の測定
実施例1記載の免疫測定装置において、抗HBs抗体とアルカリ性ホスファターゼ標識抗HBs抗体の代わりにそれぞれHBs抗原とアルカリ性ホスファターゼ標識HBs抗原を用いて抗HBs抗体測定用の装置を製造した。
【0018】
前記免疫測定装置の検体点着ゾーンに検体液として、濃度16mIU/mlの抗HBs抗体を含む陽性血清25μl加え、反応カセットの展開液槽から展開液をメンブレンに供給し、測定を開始した。展開液供給後15分後の検出ゾーンの発色強度を目視で測定した。同一の陽性検体で3回ずつ測定した結果を表2に示す。また、陰性検体を用いて15分後、30分後の測定結果を表2に示す。更に、BCIP溶液に糖又は水溶性高分子化合物を含有しない基質ゾーンを設けた装置による測定結果(無添加;比較例)を表2に示す。
【0019】
尚、表2中の記号は、前記表1と同じである。
【0020】
【表2】
【0021】
【発明の効果】
本発明の測定装置では、陽性の検体であれば検出ゾーンに明瞭なシグナルが認められる。従って、この装置で測定すると、検出ゾーンのシグナルから極めて容易に判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の装置例を模式的に示す断面図である。
【符号の説明】
1 EIA装置
2 メンブレン
3 基質ゾーン
4 展開液供給ゾーン
5 酵素標識試薬ゾーン
6 検体点着ゾーン
7 検出ゾーン
8 展開液吸収ゾーン
10 展開液槽
11 展開液
12 シール部材
Claims (5)
- 酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置において、前記糖及び水溶性高分子化合物は、基質と混合して基質ゾーンに添加され、該基質ゾーンは展開液の輸液方向からみて酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けられる簡易型酵素免疫測定装置。
- 酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置において、前記糖及び水溶性高分子化合物は、基質ゾーンの基質上又は基質の近傍に添加され、該基質ゾーンは展開液の輸液方向からみて酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けられる簡易型酵素免疫測定装置。
- 糖が、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マンノース、グルコース、アラビノース、キシロース、マルトース、デキストラン又はアミロースデンプンである請求項1又は2記載の測定装置。
- 水溶性高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸、ポリ乳酸、ポリエチレンイミン、カゼイン、アルカリ処理カゼイン、アルブミン、オボアルブミン又はゼラチンである請求項1又は2記載の測定装置。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の測定装置を用いる免疫測定法。
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