JPH0778503B2 - シート状診断デバイス - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、いくつかの作用セクターよりなり、そして生
物学的流体中の物質または被分析物（analyte）の検出
または定量測定に用いられる固体診断デバイスに関す
る。
物学的流体中の物質または被分析物（analyte）の検出
または定量測定に用いられる固体診断デバイスに関す
る。
診断方法において、特定の化合物を同定および測定する
ことができるようになつたため、医薬の投与、生理活性
化合物またはその二次生産物および感染症の診断のモニ
ターが可能となつている。この点に関し、免疫検定法
（RIA、ELISAおよび凝集試験）は特に重要である。これ
らの試験に用いられる特異的結合反応は免疫学的相互作
用、例えば抗原−抗体またはハプテン−抗体相互作用に
限らず、生物学的親和性を有する相互作用、例えばレク
チン−糖または活性化合物−受容体なども利用される。
ことができるようになつたため、医薬の投与、生理活性
化合物またはその二次生産物および感染症の診断のモニ
ターが可能となつている。この点に関し、免疫検定法
（RIA、ELISAおよび凝集試験）は特に重要である。これ
らの試験に用いられる特異的結合反応は免疫学的相互作
用、例えば抗原−抗体またはハプテン−抗体相互作用に
限らず、生物学的親和性を有する相互作用、例えばレク
チン−糖または活性化合物−受容体なども利用される。
従来の試験は高感度で特異的ではあるが、それらは試験
に長時間（大抵の場合数時間あるいは数日間も）要しま
た多くの試験段階例えば免疫反応、洗浄段階および酵素
反応などを要するため便利な応用形態を呈していない。
前述の長い試験時間は救急診断法に用いるのにはふさわ
しくない。
に長時間（大抵の場合数時間あるいは数日間も）要しま
た多くの試験段階例えば免疫反応、洗浄段階および酵素
反応などを要するため便利な応用形態を呈していない。
前述の長い試験時間は救急診断法に用いるのにはふさわ
しくない。
本発明に記載されているような一体化された乾燥化学試
験エレメントは試験実施を簡素化しまた試験時間を短縮
する。
験エレメントは試験実施を簡素化しまた試験時間を短縮
する。
固相検出を用いる不均質免疫検定法の免疫反応、作用の
遂行および「結合相−遊離相（bound−free）」分離の
ためのすべての成分が一体化されているシート状試験エ
レメントは、これまで全く記載されていない。
遂行および「結合相−遊離相（bound−free）」分離の
ためのすべての成分が一体化されているシート状試験エ
レメントは、これまで全く記載されていない。
試験用帯状片アセンブリにおいては免疫反応段階、およ
び結合相および遊離相の分離は方向付けられた液体流に
より不均質試験で行われるのに対し、薄層を相互に重ね
たものにより働く試験エレメントアセンブリ（フイルム
法）では、拡散による制御、および濃度勾配により方向
付けられる過程が可能な推進力である。螢光標識が西独
特許出願公開第3,329,728号（特開昭57−144341号）お
よびEP A0,097,952号（特開昭57−114359号）明細書に
用いられている。その標識は低分子量を有し、従つて拡
散により制御される過程を促進する。しかしながら、試
験は高められた温度で行われなければならない。これら
２つのケースの最初のものにおいて、遊離相と結合相の
両者が評価されている。フイルム法では、溶媒の吸収は
膨潤性成分を水和されるかまたは毛細空隙を充填するこ
とにより行われる。相互に積層された層を有するアセン
ブリの場合には、上層と底層だけが、主たる困難を伴う
ことなく検出に利用できるにすぎない。反応段階が行わ
れた後は、試薬を中間に位置する層の成分と反応させる
ことは困難である。本発明に用いられるような相前後し
て位置するゾーンを有する試験片アセンブリにおいて
は、基本的に各ゾーンは、測定のためにもまた必要とな
るかもしれない試薬の添加のためにも、上からもまた下
からも接近しうる。
び結合相および遊離相の分離は方向付けられた液体流に
より不均質試験で行われるのに対し、薄層を相互に重ね
たものにより働く試験エレメントアセンブリ（フイルム
法）では、拡散による制御、および濃度勾配により方向
付けられる過程が可能な推進力である。螢光標識が西独
特許出願公開第3,329,728号（特開昭57−144341号）お
よびEP A0,097,952号（特開昭57−114359号）明細書に
用いられている。その標識は低分子量を有し、従つて拡
散により制御される過程を促進する。しかしながら、試
験は高められた温度で行われなければならない。これら
２つのケースの最初のものにおいて、遊離相と結合相の
両者が評価されている。フイルム法では、溶媒の吸収は
膨潤性成分を水和されるかまたは毛細空隙を充填するこ
とにより行われる。相互に積層された層を有するアセン
ブリの場合には、上層と底層だけが、主たる困難を伴う
ことなく検出に利用できるにすぎない。反応段階が行わ
れた後は、試薬を中間に位置する層の成分と反応させる
ことは困難である。本発明に用いられるような相前後し
て位置するゾーンを有する試験片アセンブリにおいて
は、基本的に各ゾーンは、測定のためにもまた必要とな
るかもしれない試薬の添加のためにも、上からもまた下
からも接近しうる。
本発明はすべての試薬成分を含有し、そして作用シーケ
ンスに必要なすべての成分のみならず、作用シーケンス
自体をも一体化された形で含み、そして被分析物の溶液
をこの目的のために設計されたデバイスの作用領域と接
触させそして被分析物を信号発生系を介して単一作用領
域（固相ゾーン）で検出することにより生物学的親和性
特性を有する被分析物を検出できるようにしたシート状
診断デバイスに関する。
ンスに必要なすべての成分のみならず、作用シーケンス
自体をも一体化された形で含み、そして被分析物の溶液
をこの目的のために設計されたデバイスの作用領域と接
触させそして被分析物を信号発生系を介して単一作用領
域（固相ゾーン）で検出することにより生物学的親和性
特性を有する被分析物を検出できるようにしたシート状
診断デバイスに関する。
同じ溶液中の成分としての第２の被分析物または更なる
被分析物は、これら被分析物が第１被分析物とは異なる
生物学的親和性特性を有すれば、このデバイスにより同
時に検出することができる。それらはまた、単一作用領
域（それらに適した固相ゾーン）で第１被分析物と同様
にして検出される。第２の、または別の被分析物の検出
のための作用領域は、シート状デバイスにおいて第１被
分析物の検出のための作用領域の前または後に位置して
いる。このデバイスはまた、ある被分析物、およびこの
被分析物の様々な測定範囲に対し適切ないくつかの固相
ゾーンを含むことができる。このデバイスはすべての反
応成分および試薬を脱水された形で含む。
被分析物は、これら被分析物が第１被分析物とは異なる
生物学的親和性特性を有すれば、このデバイスにより同
時に検出することができる。それらはまた、単一作用領
域（それらに適した固相ゾーン）で第１被分析物と同様
にして検出される。第２の、または別の被分析物の検出
のための作用領域は、シート状デバイスにおいて第１被
分析物の検出のための作用領域の前または後に位置して
いる。このデバイスはまた、ある被分析物、およびこの
被分析物の様々な測定範囲に対し適切ないくつかの固相
ゾーンを含むことができる。このデバイスはすべての反
応成分および試薬を脱水された形で含む。
シート状デバイスは、水性溶液吸収能を有する材料の帯
状片１枚または相前後して配置する数枚よりなる。それ
ら帯状片は固体支持体に固定される。それらは特定の診
断剤に必要な試薬成分を含有し、従って成分セクターま
たは作用領域となる。帯状片形状デバイスの一方の端に
位置する作用セクター（移動相適用ゾーン）を被分析物
溶液中に浸漬することにより、あるいは該溶液を塗布す
ることにより該溶液と接触させる。その溶液はすべての
作用領域を通過移行する。帯状片を構成する支持体材料
の吸収能により生じる液体の流れは、帯状片形状デバイ
スの他方の端で停止する。
状片１枚または相前後して配置する数枚よりなる。それ
ら帯状片は固体支持体に固定される。それらは特定の診
断剤に必要な試薬成分を含有し、従って成分セクターま
たは作用領域となる。帯状片形状デバイスの一方の端に
位置する作用セクター（移動相適用ゾーン）を被分析物
溶液中に浸漬することにより、あるいは該溶液を塗布す
ることにより該溶液と接触させる。その溶液はすべての
作用領域を通過移行する。帯状片を構成する支持体材料
の吸収能により生じる液体の流れは、帯状片形状デバイ
スの他方の端で停止する。
試料をデバイスのクロマトグラフイ・セクシヨンに直接
適用する必要はない。それはまた、デバイス上に位置し
そして試料から血液細胞を除去する機能を有する吸収性
材料に適用することもできる。試料は過をうけた後デ
バイスに達する。この過過程では、乾燥状態でフイル
タ中に存在する成分から試薬を溶出することにより、試
薬の添加を同時に行うことができる。かかる成分により
干渉因子を溶液から除去することができる。すなわち、
例えば、オキシダーゼやペルオキシダーゼを標識剤とし
て用いる場合に干渉する、検体中に存在するアスコルビ
ン酸は適当な酸化剤により無害化することができる。更
にまた、フイルムは吸着により検体から干渉因子を除去
する吸着剤の機能も有しうる。この試験のために検体を
調整するための、過、吸着および試薬混合機能は、移
動相適用ゾーンによつて遂行させることもできる。
適用する必要はない。それはまた、デバイス上に位置し
そして試料から血液細胞を除去する機能を有する吸収性
材料に適用することもできる。試料は過をうけた後デ
バイスに達する。この過過程では、乾燥状態でフイル
タ中に存在する成分から試薬を溶出することにより、試
薬の添加を同時に行うことができる。かかる成分により
干渉因子を溶液から除去することができる。すなわち、
例えば、オキシダーゼやペルオキシダーゼを標識剤とし
て用いる場合に干渉する、検体中に存在するアスコルビ
ン酸は適当な酸化剤により無害化することができる。更
にまた、フイルムは吸着により検体から干渉因子を除去
する吸着剤の機能も有しうる。この試験のために検体を
調整するための、過、吸着および試薬混合機能は、移
動相適用ゾーンによつて遂行させることもできる。
個々の作用領域における溶媒分布は使用材料の吸着能お
よび寸法に依存する。
よび寸法に依存する。
移動相適用ゾーンは計量要素の機能を有しうる（西独特
許第3,043,608号および第2,332,760号、および米国特許
第3,464,560、第3,600,306号、第3,667,607号、第3,90
2,847号、第4,144,306号および第4,258,001号明細書参
照）。それは、試験要素の機能に必要とされる様々な試
薬を乾燥状態で含有することができる。移動相適用ゾー
ンは試験要素の一方の端に位置し、そして単に溶液、例
えば試料の溶液中に浸漬するかまたは試料の溶液を塗布
するだけで所定量の液体で完全に飽和するところとな
り、次いで後続のゾーンへよりゆつくりとそして制御さ
れた形でその液体を放出する一片の布帛紙であつてもよ
い。移動相適用ゾーンは、デバイスの他方の端、すなわ
ち吸収ゾーンの終端まで移動するのに充分な液体を吸収
するような寸法を有する。
許第3,043,608号および第2,332,760号、および米国特許
第3,464,560、第3,600,306号、第3,667,607号、第3,90
2,847号、第4,144,306号および第4,258,001号明細書参
照）。それは、試験要素の機能に必要とされる様々な試
薬を乾燥状態で含有することができる。移動相適用ゾー
ンは試験要素の一方の端に位置し、そして単に溶液、例
えば試料の溶液中に浸漬するかまたは試料の溶液を塗布
するだけで所定量の液体で完全に飽和するところとな
り、次いで後続のゾーンへよりゆつくりとそして制御さ
れた形でその液体を放出する一片の布帛紙であつてもよ
い。移動相適用ゾーンは、デバイスの他方の端、すなわ
ち吸収ゾーンの終端まで移動するのに充分な液体を吸収
するような寸法を有する。
移動相適用ゾーンと吸収ゾーンとの間には、試験の実施
のための反応成分が含まれ、そして試験実施のすべての
反応段階が行われる作用領域が配設される。試験実施の
ための反応成分の一部を試料適用ゾーンに収納しておく
こともできる。吸収ゾーンは、過剰の、および自由に動
きうる試薬成分および信号発生系の反応生成物を吸収す
る機能を有する。
のための反応成分が含まれ、そして試験実施のすべての
反応段階が行われる作用領域が配設される。試験実施の
ための反応成分の一部を試料適用ゾーンに収納しておく
こともできる。吸収ゾーンは、過剰の、および自由に動
きうる試薬成分および信号発生系の反応生成物を吸収す
る機能を有する。
各種作用領域の構成分としての１枚または２枚以上の帯
状片の形の吸収性支持体は、選択に応じて、セルロー
ス、セルロースの化学的誘導体、または多孔質もしくは
繊維質構造および充分な親水性特性を有するプラスチッ
ク、または合成膜中に埋設されたセルロースまたはシリ
カゲルなどの粒子、および親水性ではあるが非水溶性化
されている天然物から構成されていてもよい。異なる材
料から構成される帯状片の組合せを用いることもでき
る。適当な吸収性材料は個々の診断デバイスに対し設定
された要件に基づいて選択される。
状片の形の吸収性支持体は、選択に応じて、セルロー
ス、セルロースの化学的誘導体、または多孔質もしくは
繊維質構造および充分な親水性特性を有するプラスチッ
ク、または合成膜中に埋設されたセルロースまたはシリ
カゲルなどの粒子、および親水性ではあるが非水溶性化
されている天然物から構成されていてもよい。異なる材
料から構成される帯状片の組合せを用いることもでき
る。適当な吸収性材料は個々の診断デバイスに対し設定
された要件に基づいて選択される。
免疫学的結合特性を有する反応成分、例えば抗原、ハプ
テンまたは抗体はデバイスの様々な態様に取り込むこと
ができる。レクチンに結合する糖タンパクまたはオリゴ
サツカライドを検出する場合には、生物学的親和性を有
する１つの反応成分は特定のレクチンであつてもよい
が、免疫学的親和性を有する第２の反応成分はレクチン
のそれ以外の被分析物上の結合点に対する抗体であつて
もよい。微生物の活性化合物を検出する場合には、１つ
の結合パートナーはその活性化合物に対する受容体物質
とすることができ、一方の第２の結合パートナーは活性
化合物上のもう１つの結合点に対する抗体であることが
できる。
テンまたは抗体はデバイスの様々な態様に取り込むこと
ができる。レクチンに結合する糖タンパクまたはオリゴ
サツカライドを検出する場合には、生物学的親和性を有
する１つの反応成分は特定のレクチンであつてもよい
が、免疫学的親和性を有する第２の反応成分はレクチン
のそれ以外の被分析物上の結合点に対する抗体であつて
もよい。微生物の活性化合物を検出する場合には、１つ
の結合パートナーはその活性化合物に対する受容体物質
とすることができ、一方の第２の結合パートナーは活性
化合物上のもう１つの結合点に対する抗体であることが
できる。
生物学的親和性を有する１つの結合パートナーは反応の
進行過程で結合するようになるか、または、被分析物の
検出のために設計された作用領域（固相ゾーン）の支持
体材料にすでに結合している。それは固有結合パートナ
ーとも呼ばれる。他の結合パートナー（１種または複数
種）は支持体材料中に存在する。それらには標識を施
す。
進行過程で結合するようになるか、または、被分析物の
検出のために設計された作用領域（固相ゾーン）の支持
体材料にすでに結合している。それは固有結合パートナ
ーとも呼ばれる。他の結合パートナー（１種または複数
種）は支持体材料中に存在する。それらには標識を施
す。
標識には様々な可能性が知られているが中でも酵素標識
が好ましい。それは、色素原基質系または螢光または化
学発光を生じる基質系を必要とする。化学発光標識は、
試薬の添加後にのみ測定される標識のもう一つの例であ
る。化学発光それ自体または後者（基質系）により励起
された螢光のいずれかを測定することができる。大抵の
場合に、螢光標識は、試薬の添加を要せずして測れる。
しかしながら、ある種の希土類元素キレートを用いる場
合などは、試薬を添加した結果としてのみ測定されるべ
き螢光団を生成させるか、または第１螢光団により励起
されるようになるかまたは第１螢光団を励起する第２螢
光団を添加することも望ましいことでありうる。螢光は
ある時点で、時間の関数として、あるいは螢光偏光とし
て測定することができる。
が好ましい。それは、色素原基質系または螢光または化
学発光を生じる基質系を必要とする。化学発光標識は、
試薬の添加後にのみ測定される標識のもう一つの例であ
る。化学発光それ自体または後者（基質系）により励起
された螢光のいずれかを測定することができる。大抵の
場合に、螢光標識は、試薬の添加を要せずして測れる。
しかしながら、ある種の希土類元素キレートを用いる場
合などは、試薬を添加した結果としてのみ測定されるべ
き螢光団を生成させるか、または第１螢光団により励起
されるようになるかまたは第１螢光団を励起する第２螢
光団を添加することも望ましいことでありうる。螢光は
ある時点で、時間の関数として、あるいは螢光偏光とし
て測定することができる。
検出に必要な試薬は分離段階の後、様々な方法で検出さ
れるべき免疫複合体（コンプレツクス）と反応するよう
誘導することができる。信号発生系の一部は固相ゾーン
に位置することができる。固相を充分洗浄後、標識の検
出に必要な試薬を結合相の検出を伴う布均質免疫検定法
において、様々な態様で低速で放出することができる。
次に、可能な例を挙げる。
れるべき免疫複合体（コンプレツクス）と反応するよう
誘導することができる。信号発生系の一部は固相ゾーン
に位置することができる。固相を充分洗浄後、標識の検
出に必要な試薬を結合相の検出を伴う布均質免疫検定法
において、様々な態様で低速で放出することができる。
次に、可能な例を挙げる。
主要液体流に対し並行に配されるが、より低速で流動し
そして移動相溜めから出発し、標識成分含有ゾーンの前
に入る液体流による試薬の適用。この並行流体流は、よ
り低速にクロマトグラフイを行う吸収性媒体、例えば適
度に低速にクロマトグラフイを行う紙、または所々「進
路を１時的に妨害する成分（components temporarily b
locking the wav）」、例えば溶液に移行する際に高粘
度を付与するポリマー（例えばポリビニールアルコール
またはデキストラン）で含浸した紙を用いることにより
制御することができる。
そして移動相溜めから出発し、標識成分含有ゾーンの前
に入る液体流による試薬の適用。この並行流体流は、よ
り低速にクロマトグラフイを行う吸収性媒体、例えば適
度に低速にクロマトグラフイを行う紙、または所々「進
路を１時的に妨害する成分（components temporarily b
locking the wav）」、例えば溶液に移行する際に高粘
度を付与するポリマー（例えばポリビニールアルコール
またはデキストラン）で含浸した紙を用いることにより
制御することができる。
固相を充分洗浄後（すなわちクロマトグラフイ完了
後）、試薬の適用を、試験要素の固体成分である要素を
押下げる（press down）ことにより行うことができる。
この「押下げ」は機械的に、または液体流の作用による
離間片を除くことにより行うことができる。例えば、試
薬含有要素の押下げは、フラツプをまたは離間片により
支持された紙片を押下げることにより行うことができ
る。液体流の作用による試薬含有要素の下方移行は例え
ばその固相、水溶性ポリマーおよび試薬担体（例えば適
当に含浸された紙片）を相互に積層することにより行う
ことができる。
後）、試薬の適用を、試験要素の固体成分である要素を
押下げる（press down）ことにより行うことができる。
この「押下げ」は機械的に、または液体流の作用による
離間片を除くことにより行うことができる。例えば、試
薬含有要素の押下げは、フラツプをまたは離間片により
支持された紙片を押下げることにより行うことができ
る。液体流の作用による試薬含有要素の下方移行は例え
ばその固相、水溶性ポリマーおよび試薬担体（例えば適
当に含浸された紙片）を相互に積層することにより行う
ことができる。
液体流中への試薬の導入遅延は固相が充分洗浄された後
でのみカプセルから現われるマイクロカプセル化された
試薬を用いるか、またはマトリツクス内でゆつくり溶解
する成分に付着した試薬をコーテイングすることにより
行うことができる。
でのみカプセルから現われるマイクロカプセル化された
試薬を用いるか、またはマトリツクス内でゆつくり溶解
する成分に付着した試薬をコーテイングすることにより
行うことができる。
特別な酵素標識の場合に提供される１つの可能な手段は
次のとおりである。すなわち、ペルオキシダーゼ標識を
用いる場合には、グルコースオキシダーゼ・ゾーンを固
相ゾーンの前におくことができる。次にグルコースおよ
び色素原を液体流に取込むことができ、その結果グルコ
ースオキシダーゼの後方で呈色させることができる。認
めうる呈色は、適度のペルオキシダーゼ濃度で充分なH2
O2がそのオキシダーゼにより形成される場合にのみ観察
される。この過酸化物形成はゆつくりと始まり、至適濃
度に達し、そして最終的に酵素阻害を生じ従つて呈色を
自動的に停止させる高濃度に達する。この呈色は、H2O2
受容体、例えば緩和な還元剤としてのチオエーテル、ま
たは酵素カタラーゼをオキシダーゼ・ゾーンに、または
後者の前方に取込めば、調整することができる。
次のとおりである。すなわち、ペルオキシダーゼ標識を
用いる場合には、グルコースオキシダーゼ・ゾーンを固
相ゾーンの前におくことができる。次にグルコースおよ
び色素原を液体流に取込むことができ、その結果グルコ
ースオキシダーゼの後方で呈色させることができる。認
めうる呈色は、適度のペルオキシダーゼ濃度で充分なH2
O2がそのオキシダーゼにより形成される場合にのみ観察
される。この過酸化物形成はゆつくりと始まり、至適濃
度に達し、そして最終的に酵素阻害を生じ従つて呈色を
自動的に停止させる高濃度に達する。この呈色は、H2O2
受容体、例えば緩和な還元剤としてのチオエーテル、ま
たは酵素カタラーゼをオキシダーゼ・ゾーンに、または
後者の前方に取込めば、調整することができる。
この例では、標識検出試薬は、酵素を用いた遅延回路に
より作られる。固相ゾーンでの呈色は、このゾーンが液
体流によつて非特異的に結合した標識が不含となるよう
充分に洗浄された後でのみ開始する。
より作られる。固相ゾーンでの呈色は、このゾーンが液
体流によつて非特異的に結合した標識が不含となるよう
充分に洗浄された後でのみ開始する。
固相ゾーンの調製手段はいくつか可能である。そこに固
定される成分は試験要素の一部である吸収性支持体に化
学共有結合によりまたは吸着により付着させることがで
きる。これらの成分は吸収性支持体に適用後に適用部位
に固定されたままの粒子分散体に結合させることができ
る。例えば、表面に特異受容体を有する細胞の懸濁液、
例えばスタフイロコツカス・オーレウス・コワンＩ（St
aphylococcus aureus Cowan I）菌体、または生物学的
親和性を有する結合パートナーを表面に結合した状態で
担持するラテツクス粒子は、ペーパーマトリツクスに固
定するのにふさわしい。ピペツト操作可能な支持体に結
合された試験用帯状片の成分およびそのデバイスの未結
合成分も風乾によりそのエレメントの吸収性マトリツク
ス上に乾燥することができる。凍結乾燥段階は全く必要
ではない。
定される成分は試験要素の一部である吸収性支持体に化
学共有結合によりまたは吸着により付着させることがで
きる。これらの成分は吸収性支持体に適用後に適用部位
に固定されたままの粒子分散体に結合させることができ
る。例えば、表面に特異受容体を有する細胞の懸濁液、
例えばスタフイロコツカス・オーレウス・コワンＩ（St
aphylococcus aureus Cowan I）菌体、または生物学的
親和性を有する結合パートナーを表面に結合した状態で
担持するラテツクス粒子は、ペーパーマトリツクスに固
定するのにふさわしい。ピペツト操作可能な支持体に結
合された試験用帯状片の成分およびそのデバイスの未結
合成分も風乾によりそのエレメントの吸収性マトリツク
ス上に乾燥することができる。凍結乾燥段階は全く必要
ではない。
いくつかの試験実施例を使用標識から独立したものとし
なすことのできる態様例として説明する。簡潔にするた
めに、診断デバイスによる単一被分析物の検出について
のみ記述する。
なすことのできる態様例として説明する。簡潔にするた
めに、診断デバイスによる単一被分析物の検出について
のみ記述する。
拮抗的免疫検定の原理に基づく次の２つの態様を被分析
物が生物学的親和性を有する結合部位をただ１つしかも
たないかまたは、生物学的親和性を有するいくつかの結
合部位のうちただ１つの結合部位しか利用されない場合
について説明する。
物が生物学的親和性を有する結合部位をただ１つしかも
たないかまたは、生物学的親和性を有するいくつかの結
合部位のうちただ１つの結合部位しか利用されない場合
について説明する。
固相結合パートナーは固相作用領域の支持材料に共有結
合によりまたは吸着により結合する。被分析物の溶液
は、診断剤中に含まれる所定量の標識を移動性にする。
それら２成分は固相結合パートナーを含む作用セクター
中に移行しそしてその固相結合パートナーとの結合を求
めて拮抗する。被分析物の割合が標識被分析物に比べて
高いと、標識被分析物はほどんど結合されなくなる。そ
れが低いと、多量の標識被分析物が結合されることにな
る。
合によりまたは吸着により結合する。被分析物の溶液
は、診断剤中に含まれる所定量の標識を移動性にする。
それら２成分は固相結合パートナーを含む作用セクター
中に移行しそしてその固相結合パートナーとの結合を求
めて拮抗する。被分析物の割合が標識被分析物に比べて
高いと、標識被分析物はほどんど結合されなくなる。そ
れが低いと、多量の標識被分析物が結合されることにな
る。
固相結合パートナーは未結合成分として作用領域中、固
相作用領域の前方に収納する。接近してくる溶媒先端に
よりそれは固相作用領域に運ばれ、そこで結合されるよ
うになる。この固相結合は被分析物の結合系から独立し
た生物学的親和性を有する結合系により作られる。ビオ
チンと接合した結合パートナーは支持体に結合したアジ
ピンに結合する。結合パートナーとしての免疫グロブリ
ン例えはIgGは、そのFc成分を介して支持体に結合した
S.オーレウスのプロテインＡに固定されるか、または非
イデイオタイプ的に当該免疫グロブリンに向けられた別
の種の固相抗体により結合される。
相作用領域の前方に収納する。接近してくる溶媒先端に
よりそれは固相作用領域に運ばれ、そこで結合されるよ
うになる。この固相結合は被分析物の結合系から独立し
た生物学的親和性を有する結合系により作られる。ビオ
チンと接合した結合パートナーは支持体に結合したアジ
ピンに結合する。結合パートナーとしての免疫グロブリ
ン例えはIgGは、そのFc成分を介して支持体に結合した
S.オーレウスのプロテインＡに固定されるか、または非
イデイオタイプ的に当該免疫グロブリンに向けられた別
の種の固相抗体により結合される。
前述の如く、被分析物と標識被分析物とは診断剤の成分
として、処理時間中固相結合パートナーへの結合を求め
て拮抗する。この拮抗反応は一部は、溶存固相結合パー
トナーに対して、そして一部は、固相に結合済みの固相
結合パートナーに対して生起する。
として、処理時間中固相結合パートナーへの結合を求め
て拮抗する。この拮抗反応は一部は、溶存固相結合パー
トナーに対して、そして一部は、固相に結合済みの固相
結合パートナーに対して生起する。
特異性の異なる２つの結合点が被分析物中に存在する場
合には、サンドイツチ式免疫検定の原理に基づく、診断
剤のいくつかの態様が考えられる。これらのうち２例に
ついて以下に説明する。
合には、サンドイツチ式免疫検定の原理に基づく、診断
剤のいくつかの態様が考えられる。これらのうち２例に
ついて以下に説明する。
固相結合パートナーを固相作用領域の支持材料に共有結
合によりまたは吸着により結合する場合、被結合と標識
結合パートナーとで形成される二成分複合体は溶媒と共
に固相作用領域中に移行しそしてそこで固相結合パート
ナーと反応して固相に結合した三成分複合体と形成する
が、これは最初の結合パートナーの標識を通じて検出す
ることができる。過剰の標識結合パートナーは溶媒によ
り、次の作用領域中に除去される。
合によりまたは吸着により結合する場合、被結合と標識
結合パートナーとで形成される二成分複合体は溶媒と共
に固相作用領域中に移行しそしてそこで固相結合パート
ナーと反応して固相に結合した三成分複合体と形成する
が、これは最初の結合パートナーの標識を通じて検出す
ることができる。過剰の標識結合パートナーは溶媒によ
り、次の作用領域中に除去される。
固相結合パートナーが診断剤中で未結合の形で存在して
いて溶媒により移動性となる場合には、生物学的親和性
を有する分析物の２反応成分は、被分析物が同時にある
いは順次に両反応成分と反応しそして生成三成分複合体
が次に固相作用領域（そこでは前述の如く、それは被分
析物のそれから独立した生物学的親和性を有する第２の
系を介して固相に結合されるようになる）に移行するよ
うに作用領域に収納される。
いて溶媒により移動性となる場合には、生物学的親和性
を有する分析物の２反応成分は、被分析物が同時にある
いは順次に両反応成分と反応しそして生成三成分複合体
が次に固相作用領域（そこでは前述の如く、それは被分
析物のそれから独立した生物学的親和性を有する第２の
系を介して固相に結合されるようになる）に移行するよ
うに作用領域に収納される。
前述の態様、および免疫測定（immunometric）試験原
理、間接的抗体検出の原理または免疫検定のELA（酵素
標識抗原）原理に基づく別な態様を説明するために総括
表Ｉは、作用領域中の剤の成分の分布、および反応完了
後の固相複合体の組成（その量は試料中の被分析物の濃
度の尺度である）を例示的に説明している。
理、間接的抗体検出の原理または免疫検定のELA（酵素
標識抗原）原理に基づく別な態様を説明するために総括
表Ｉは、作用領域中の剤の成分の分布、および反応完了
後の固相複合体の組成（その量は試料中の被分析物の濃
度の尺度である）を例示的に説明している。
固相検出による不均質免疫検定の原理に従つて働く完全
に一体化された試験帯状片は、原理的に実施可能である
ばかりでなく、更に、１時間以内の時間内に評価でき、
通常のRIAやELISAの定量化および感度が達成されること
を見出した。10-12モル／リツトル程度の微量成分の検
出は室温で30分以下の反応時間で可能となり、また試料
の必要量は例えば約1pgに相当する10-16モルである。し
かしながら、前述の配置はより低い感度要件の試験をも
可能にする。評価をSanoquell反射計（Quelle製）を用
いて行つた場合に20〜30についての標準曲線を得た。完
全な呈色を含む試験要素に対するクロマトグラフイ時間
は16分間を超えない。評価はまた肉眼的に行うことがで
きる。HCGを被分析物として用いた場合、固相に結合し
たグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ標識
を用いた例における測定範囲の始点は0.3ng/ml（3U/
に相当する）であつた。
に一体化された試験帯状片は、原理的に実施可能である
ばかりでなく、更に、１時間以内の時間内に評価でき、
通常のRIAやELISAの定量化および感度が達成されること
を見出した。10-12モル／リツトル程度の微量成分の検
出は室温で30分以下の反応時間で可能となり、また試料
の必要量は例えば約1pgに相当する10-16モルである。し
かしながら、前述の配置はより低い感度要件の試験をも
可能にする。評価をSanoquell反射計（Quelle製）を用
いて行つた場合に20〜30についての標準曲線を得た。完
全な呈色を含む試験要素に対するクロマトグラフイ時間
は16分間を超えない。評価はまた肉眼的に行うことがで
きる。HCGを被分析物として用いた場合、固相に結合し
たグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ標識
を用いた例における測定範囲の始点は0.3ng/ml（3U/
に相当する）であつた。
次の実施例において、拮抗的二重抗体試験の原理の応用
を具体例として示す。この試験配置では、四成分を測定
反応および分解段階のために順次に反応させる必要があ
り、そして反応時間および反応成分の濃度は臨界値であ
る。この実施例は本発明を限定するものと考えられるべ
きものでは全くなく、本発明を更に説明するために用い
るにすぎない。
を具体例として示す。この試験配置では、四成分を測定
反応および分解段階のために順次に反応させる必要があ
り、そして反応時間および反応成分の濃度は臨界値であ
る。この実施例は本発明を限定するものと考えられるべ
きものでは全くなく、本発明を更に説明するために用い
るにすぎない。
実施例 組込まれた色素原基質系によるHCG検出のための完全に
一体化された酵素−免疫化学的デバイス。
一体化された酵素−免疫化学的デバイス。
1.1.試 薬 1.1.1. HCG−ペルオキシダーゼ接合体 約3000U/mgの比活性を有するHCGをOrganon社から得た。
西洋ワサビからのペルオキシダーゼをBoehringer Mannh
eim社（カタログ番号413,470）より得た。ヘテロ−二官
能性試薬Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイ
ミド（GMBS）をBehring Diagnostics社から得、そしてT
animoriらが1983年に「J.Imm.Meth.62,123〜131に記載
したようなHCGと反応させた。２−イミノチオラン塩酸
塩（Sigma、カタログ番号I6256）を、Kingらが1978年に
「Biochemistry」17,1499〜1509に記載した方法により
ペルオキシダーゼと反応させた。Tanimoriらによつて記
載された方法でGMBS−HCGとイミノチオラン−ペルオキ
シダーゼから接合体を調製した。粗製接合体をUltrogel
ACA44（LKB）でのゲルクロマトグラフイにより精製し
た。HCG1分子あたり約１〜２個のペルオキシダーゼ分子
が結合した画分を試験に用いた。その接合体をBehringw
erke社製（注問番号OS D）のEnzygnost IgEインキユベ
ーシヨン媒質（以下において単にインキユベーシヨン媒
質と称される）で希釈した。
西洋ワサビからのペルオキシダーゼをBoehringer Mannh
eim社（カタログ番号413,470）より得た。ヘテロ−二官
能性試薬Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイ
ミド（GMBS）をBehring Diagnostics社から得、そしてT
animoriらが1983年に「J.Imm.Meth.62,123〜131に記載
したようなHCGと反応させた。２−イミノチオラン塩酸
塩（Sigma、カタログ番号I6256）を、Kingらが1978年に
「Biochemistry」17,1499〜1509に記載した方法により
ペルオキシダーゼと反応させた。Tanimoriらによつて記
載された方法でGMBS−HCGとイミノチオラン−ペルオキ
シダーゼから接合体を調製した。粗製接合体をUltrogel
ACA44（LKB）でのゲルクロマトグラフイにより精製し
た。HCG1分子あたり約１〜２個のペルオキシダーゼ分子
が結合した画分を試験に用いた。その接合体をBehringw
erke社製（注問番号OS D）のEnzygnost IgEインキユベ
ーシヨン媒質（以下において単にインキユベーシヨン媒
質と称される）で希釈した。
1.1.2. 抗 体 HCGに対する抗体を、家兎を免疫することにより得、そ
して家兎−IgGに対する抗体をヤギを免疫することによ
り得た。IgG画分を硫酸アンモニウム沈殿および陰イオ
ン交換クロマトグラフイにより血清から単離し、そして
免疫吸着により更に精製した。使用した方法は、「Immu
nologische Arbeitsmethoden（免疫学研究法）」（198
4）、Helmut Friemel,編に記載されている。抗−HCG抗
体は最終的に前述の接合体希釈緩衝液で希釈した。
して家兎−IgGに対する抗体をヤギを免疫することによ
り得た。IgG画分を硫酸アンモニウム沈殿および陰イオ
ン交換クロマトグラフイにより血清から単離し、そして
免疫吸着により更に精製した。使用した方法は、「Immu
nologische Arbeitsmethoden（免疫学研究法）」（198
4）、Helmut Friemel,編に記載されている。抗−HCG抗
体は最終的に前述の接合体希釈緩衝液で希釈した。
1.1.3. グルコールオキシダーゼ アスパージラス・ニガー（Aspergillus niger）からの
グルコースオキシダーゼを300U/mg含有溶液（Serva、カ
タログ番号22,737）として得た。グルコースオキシダー
ゼを最終的にインキユベーシヨン媒質で希釈した。
グルコースオキシダーゼを300U/mg含有溶液（Serva、カ
タログ番号22,737）として得た。グルコースオキシダー
ゼを最終的にインキユベーシヨン媒質で希釈した。
1.1.4. グルコースおよびテトラメチルベンジン α−Ｄ−グルコースとテトラメチルベンジン塩酸塩をSe
rva社（それぞれカタログ番号22,720および35,926）か
ら得た。
rva社（それぞれカタログ番号22,720および35,926）か
ら得た。
1.2.デバイスの調製 シート状作用領域を次のように調製した： 移動相適用ゾーンはKalle社製スポンジ布帛を20×6mmの
寸法に切断することにより調製した。これは乾燥状態で
圧縮された再生セルロースの合成スポンジである。それ
を水1mlあたりグルコース50mgおよびテトラメチルベン
ジジン塩酸塩0.75mgで含浸し、そして空気流中で乾燥し
た。
寸法に切断することにより調製した。これは乾燥状態で
圧縮された再生セルロースの合成スポンジである。それ
を水1mlあたりグルコース50mgおよびテトラメチルベン
ジジン塩酸塩0.75mgで含浸し、そして空気流中で乾燥し
た。
前記接合体、抗−HCG抗体およびグルコースオキシダー
ゼ（それぞれ25μ/ml、100μ/mlおよび0.1mg/ml濃
度のもの各５μ）を均一の距離で、45×5mmMN1番紙
（Macherey＆Nagel）片に相前後して適用し、そして風
乾した。
ゼ（それぞれ25μ/ml、100μ/mlおよび0.1mg/ml濃
度のもの各５μ）を均一の距離で、45×5mmMN1番紙
（Macherey＆Nagel）片に相前後して適用し、そして風
乾した。
５×5mmの寸法のSchleicher＆Schll597番紙片を常法
により、固相ゾーンとしての抗−家兎IgG−抗体で被覆
した。これは臭化シアンで活性化した紙に抗体を結合さ
せることにより行つた（Clarkeほか、「Meth.Enzymolog
y」（1979）,68巻、441〜442参照）。
により、固相ゾーンとしての抗−家兎IgG−抗体で被覆
した。これは臭化シアンで活性化した紙に抗体を結合さ
せることにより行つた（Clarkeほか、「Meth.Enzymolog
y」（1979）,68巻、441〜442参照）。
20×5mmのSchleicher＆Schll2668/8番紙片を吸収ゾー
ンとして用いた。
ンとして用いた。
それら４つの紙片を相前後して、0.5〜1mmオーバーラツ
プさせながら両側粘着テープ（Beiersdorf社製“Tesaba
nd"）によりプラスチツクリボンに固定して幅5mmの試験
用帯状片を形成した。
プさせながら両側粘着テープ（Beiersdorf社製“Tesaba
nd"）によりプラスチツクリボンに固定して幅5mmの試験
用帯状片を形成した。
1.3. 試験の実施 各例について試験はインキユベーシヨン媒質中のHCG希
釈液200μを布帛に適用することにより行つた。
釈液200μを布帛に適用することにより行つた。
1.4 結 果 試験要素のクロマト展開および自動適呈色は室温で15分
後に完了し、そして評価は肉眼的に、あるいは反射計に
より行うことができた。
後に完了し、そして評価は肉眼的に、あるいは反射計に
より行うことができた。
固相ゾーン（597番紙）をQuelle社製のSanoquell血中グ
ルコース評価装置で評価したところ、次の値を得た。
ルコース評価装置で評価したところ、次の値を得た。
Behringwerke社製Rapimat尿試験用帯状片評価装置を用
いたところ同じ試験用帯状片に対しての次の値が得られ
た。
いたところ同じ試験用帯状片に対しての次の値が得られ
た。
ここに示された試験用帯状片アセンブリはグルコースオ
キシダーゼと抗−HCG抗体が同じゾーンに位置していて
も達成することができる。それだけ短くした試験用帯状
片は約10分後に結果を与える。
キシダーゼと抗−HCG抗体が同じゾーンに位置していて
も達成することができる。それだけ短くした試験用帯状
片は約10分後に結果を与える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス‐エルヴイン・パウリ ドイツ連邦共和国デー‐3563 ダウトフエ タール ２．フインケンシユトラーセ １ (72)発明者 ヘルムート・コール ドイツ連邦共和国デー‐3552 ヴエター. ゲーテシユトラーセ 32 (72)発明者 クラウス・ハーベンシユタイン ドイツ連邦共和国デー‐3552 ヴエター. イム・ケツアーグルント 33 (72)発明者 ヨーゼフ・シユテルク ドイツ連邦共和国デー‐3557 エーブスド ルフアー グルント ８．イム・ヴインケ ル ２ (56)参考文献 特開 昭53−47894（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】液体中に存在する免疫学的な結合特性を有
する一対の組み合わせの一方の成分（以下被分析物とい
う）を検出または測定するための分析デバイスであっ
て、該デバイスは、相前後して配置されかつそれらの縁
を介して相互に吸収可能な接触状態にある１個またはそ
れ以上の細片からなるシート状ゾーンと固体支持体とか
ら形成されたシート状のクロマトグラフィー分析デバイ
スであり、該デバイスの一方の端に移動相適用ゾーン
（MPAZ）、他方の端に吸収ゾーン（AZ）、そしてその中
間にさらに吸収姓のゾーンを含み、該吸収姓のゾーンで
は被分析物と免疫学的な相互作用をなしうる複数の反応
成分が相互に空間的に分離して配置されており、１つの
反応成分は共有結合または吸着によりMPAZとAZとの間に
位置しそしてAZと接触して存在する固相ゾーン（SPZ）
に固定されており、そして標識反応成分がMPAZまたはMP
AZとSPZとの間のゾーンで未結合状態で位置している分
析デバイスにおいて、該デバイスは全ての反応成分およ
び反応試薬を脱水状態で含み、そして試料は該デバイス
のMPAZに適用され、MPAZが後続ゾーンに毛細管力により
制御される液体がAZの端部に達するのに少なくとも充分
な液体を放出するものであることを特徴とする前記分析
デバイス。 - 【請求項２】SPZに固定された反応成分が、共有結合ま
たは吸着もしくは生物学的親和性の相互作用によりSPZ
に固定されたさらなる反応試薬を介して該デバイス上で
生じる反応で結合することを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の分析デバイス。 - 【請求項３】支持体に結合しそして特定の被分析物に対
し特異的な結合パートナーを備えた空間的に分離された
固相ゾーンを被分析毎に含み、複数の被分析物が個別的
に検出されるようにしてなる、各々生物学的親和性を有
する結合部位を１つまたはそれ以上有する２種類または
それ以上の被分析物を検出するための特許請求の範囲第
１項記載のデバイス。 - 【請求項４】MPAZが計量要素の機能を有しそして後続ゾ
ーンに、毛細管力により制御される液体がAZの端部に達
するのに少なくとも充分な液体を放出する特許請求の範
囲第１項ないし第３項のいずれかの項に記載のデバイ
ス。 - 【請求項５】MAPZが親水性ポリマーから構成されそして
所望により試験に必要な薬品、緩衝物質またはその他の
物質を含有しうる微粒子層、またはプラスチックスポン
ジである特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか
の項に記載のデバイス。 - 【請求項６】試料適用ゾーンが血液細胞を保持する特許
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかの項に記載の
デバイス。 - 【請求項７】試料適用ゾーンがデバイスのクロマトグラ
フィセクションのシート状ゾーンの１つの上に積層され
そしてこのゾーンと吸収的に接触している特許請求の範
囲第１項ないし第６項のいずれかの項に記載のデバイ
ス。 - 【請求項８】標識の検出に必要な試薬の全部または一部
がデバイスのシート状ゾーンの１つまたはそれ以上に存
在するか、または、デバイスのクロマトグラフィセクシ
ョンのシート状ゾーンの１つの上に積層されそしてこの
ゾーンと吸収的に接触しているゾーンに存在する特許請
求の範囲第１項ないし第７項のいずれかの項に記載のデ
バイス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3445816.6 | 1984-12-15 | ||
| DE3445816A DE3445816C1 (de) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | Flaechenfoermiges diagnostisches Mittel |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6068634A Division JP2504923B2 (ja) | 1984-12-15 | 1994-04-06 | 免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61145459A JPS61145459A (ja) | 1986-07-03 |
| JPH0778503B2 true JPH0778503B2 (ja) | 1995-08-23 |
Family
ID=6252876
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60279418A Expired - Lifetime JPH0778503B2 (ja) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | シート状診断デバイス |
| JP6068634A Expired - Lifetime JP2504923B2 (ja) | 1984-12-15 | 1994-04-06 | 免疫学的測定方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6068634A Expired - Lifetime JP2504923B2 (ja) | 1984-12-15 | 1994-04-06 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4861711A (ja) |
| EP (1) | EP0186799B2 (ja) |
| JP (2) | JPH0778503B2 (ja) |
| AT (1) | ATE50457T1 (ja) |
| AU (1) | AU600657B2 (ja) |
| CA (1) | CA1267083A (ja) |
| DE (2) | DE3445816C1 (ja) |
| ES (1) | ES8607556A1 (ja) |
| MX (1) | MX173718B (ja) |
| YU (1) | YU45751B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010021372A1 (ja) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | デンカ生研株式会社 | 対照表示部を備えたメンブレンアッセイによる試験装置 |
Families Citing this family (281)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3445816C1 (de) | 1984-12-15 | 1986-06-12 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Flaechenfoermiges diagnostisches Mittel |
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