JPH10253632A

JPH10253632A - 分析方法、キット及び装置

Info

Publication number: JPH10253632A
Application number: JP9072649A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Oku; 裕一奥; Yoshiki Tanaka; 良樹田中; Yoko Otsuka; 洋子大塚
Original assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 1998-09-25
Also published as: US6448001B2; EP0905517A4; EP0905517A1; EP0905517B1; US20010006775A1; DE69824099T2; CA2252912A1; WO1998040740A1; DE69824099D1; CA2252912C

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】１種類以上の生物学的物質を一つの分析装置
において、より高感度に、同時にその有無の判定、或い
はその量の測定を可能にする分析方法、そのキット及び
装置を提供する。【解決手段】１種類以上のマーカー標識化配位子と、
１種類以上の核酸標識化配位子を含む試薬と、１種類以
上の分析物を含む液体試料を接触させて１種類以上の複
合体を形成させ、形成された１種類以上の複合体を、シ
ート状の展開要素１１中に毛管現象により展開させ、検
出ゾーン１４に固定化された核酸からなる１種類以上の
種類毎に検出ゾーン１５，１６，１７が形成された抗結
合子に対して、核酸の相補的結合により捕獲し、前記抗
結合子−結合子間の相補的結合により分析物の種類毎に
複合体を捕獲して各々独立した帯を形成させ、検出部位
の量又はその存在を検定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的物質を分
析の対象とした分析物の量の測定、あるいは有無を検定
するための簡易臨床診断に有用な分析方法、該方法に使
用するキット及び装置に関し、特に、液体試料に含まれ
る一種類以上の分析物の量或いは有無を一度に膨大な組
合せが実現できる分析方法、該方法に使用するキット及
び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査において患者の罹患している疾
病を決定する際には、数種の検査結果を総合して判断す
ることが行われている。患者は的確な診断と治療を受け
るために数種類の検査を受けることが一般的である。し
かしながら、従来の技術では１種類の臨床診断試薬で１
種類の項目しか測定、あるいは検出することができない
場合がほとんどであるために、検査数に比例して患者か
ら採取される検体量は増加し、患者の身体的な負担の一
つとなっている。

【０００３】一方、従来の免疫学的な検査を行う場合、
通常、自動装置などを用いて検査を行う必要があるため
に、採取された患者の検体は自動分析装置のある施設に
運搬され、そこで検査が行われ、得られた結果が医師に
伝えられ、そのようにして結果と患者の臨床的な症状に
より診断が行われている。そのため、医師がすぐに診断
を下すことができずに治療のタイミングを逸する原因の
一つとなっていた。

【０００４】近年、こうした問題を解決できるように、
免疫反応とクロマトグラフィーを組み合わせた方法（以
下、イムノクロマト法と略記する。）が開発された。従
来のイムノクロマト法の標準的な原理を次に説明する。

【０００５】従来のイムノクロマト法に使用される分析
装置は、ニトロセルロース膜などの多孔質性でシート状
の展開要素の一端に、分析物を含む液体試料を適用する
ための適用ゾーンが設けられ、他方端に展開要素を毛管
現象により移動してきた液体を受入れるための吸水ゾー
ンが設けられ、それらの間で適用ゾーンに近い側にマー
カー標識化免疫物質が含まれている封入ゾーンが配置さ
れ、適用ゾーンに遠い側に、分析物と標識化物からなる
複合体を結合するための免疫物質が固定された検出ゾー
ンが配置されたものである。

【０００６】このような分析装置を用いた分析方法は、
まず測定すべき分析物を含む液体試料が、適用ゾーンに
適用されると、液体試料は毛管現象により、マーカー標
識化免疫物質が含まれる封入ゾーンに移動する。該封入
ゾーンにおいて、マーカー標識化免疫物質と分析物が免
疫学的親和性により結合し、マーカー標識化免疫複合体
が形成される。該マーカー標識化免疫複合体は、毛管現
象及び／又は拡散により、展開要素を展開移動して検出
ゾーンに達し、該検出ゾーンに固定化されている免疫物
質によって捕獲される。該検出ゾーンで捕獲されたマー
カー標識化免疫複合体中のマーカーについて測定あるい
は検出することによって、液体試料中に含まれている分
析物の量の測定あるいはその存在を検定することができ
る。

【０００７】この方法は、免疫化学的活性物質の測定検
出のひとつである酵素免疫測定法などに比べ、測定途中
で洗浄操作が不要で、また目視により検定が可能である
のでマーカーを検出するための測定装置も特に必須では
なく、さらに分析装置に含まれる試薬が乾燥状態で保た
れるために室温で長期保存が可能という点に特徴を有す
る。このような従来のイムノクロマト法によれば、医師
が採取した検体を直ちに医師自身が検査することができ
るので、患者の臨床的な症状と免疫学的な検査結果を総
合して医師が短時間で診断をくだすことができ、そのた
め、治療のタイミングを逸してしまうことは少なくなる
という利点がある。

【０００８】イムノクロマト法に関してはいくつかの特
許が公開されている。例えば、特公平７−１３６４０号
公報に記載のイムノクロマト法は、前述の従来のイムノ
クロマト法と基本的に同一であり、不溶性小胞マーカー
に結合したリガンドを使用し、且つ該不溶性小胞マーカ
ーが、着色リポソーム、着色重合体ビーズ、金属又は重
合体染料粒子である点に特徴を有する。しかしながら、
該公報には同時に１種以上の抗原あるいは抗体等の生物
学的物質の定量あるいは検出については何も示唆されて
いない。

【０００９】また、特許第２５０４９２３号明細書に記
載のイムノクロマト法は、前述の従来のイムノクロマト
法と基本的に同一であり、検出ゾーンで捕獲される複合
体がマーカー標識化受容体−分析物−受容体からなる、
いわゆるサンドイッチアッセイ法による分析や、生物学
的親和特性の異なる第１被分析物と第２被分析物の同時
検出の示唆がなされている。しかしながら、該公報に
は、マーカー標識化免疫複合体が核酸塩基の相補的な結
合により検出ゾーンにおいて捕獲されることについて、
また被分析物の種類が２個よりも多い場合の適用性及び
その場合の測定感度については何も示唆されていない。

【００１０】一方、免疫学的分析法において、多くの免
疫化学的活性物質を固相化できる方が、より高感度化が
図れ、おなじ量の免疫化学的活性物質を短時間で検出で
きる。そのために、イムノクロマト法においてもより高
感度な分析技術の出現が望まれてきた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、１種類以上の生物学的物質を一つの分析装置におい
て、より高感度に、同時にその有無の判定、或いはその
量の測定を簡易な手段で可能にする臨床診断に有用な分
析方法、その分析に使用されるキット及び装置を提供す
ることである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の分析方法の一つ
の態様は試薬と分析装置が別体となっているキットを使
用する分析方法である。該分析方法は、液体試料中に存
在する１種類以上の分析物の量を測定あるいは有無を検
定する分析方法であって、（１）第一配位子にマーカー
が結合されてなる１種類以上のマーカー標識化配位子を
含み、且つ第二配位子に分析物の種類に応じて予め決定
された塩基配列を有する核酸である結合子が結合されて
なる１種類以上の結合子標識化配位子を含む試薬と、１
種類以上の分析物を含む液体試料を接触させて、特定の
種類の分析物、該分析物に対して特異的に結合する特定
の種類のマーカー標識化配位子、及び該分析物に対して
特異的に結合する特定の種類の結合子標識化配位子から
なる特定の種類の複合体を１種類以上形成させること、
（２）形成された１種類以上の複合体を、シート状の展
開要素中に毛管現象により展開させること、（３）前記
複合体中の結合子に対して相補的な塩基配列を有する核
酸からなる抗結合子が種類毎に独立して前記展開要素上
に固定されてなる検出ゾーンにおいて、前記結合子と前
記抗結合子間の相補的結合により分析物の種類毎に複合
体を捕獲して各々独立した帯を形成させること、（４）
前記検出ゾーンで形成された帯に含まれるマーカーを測
定又は検定することを含むことからなる。

【００１３】本発明の分析方法の別の態様は試薬が一体
となって含まれている分析装置を使用する方法である。
該分析方法は、液体試料中に存在する１種類以上の分析
物の量を測定あるいは有無を検定する分析方法であっ
て、（１）１種類以上の分析物を含む液体試料をシート
状の展開要素に適用して、展開要素中を毛管現象により
展開させること、（２）分析物の特定の種類に対して特
異的に反応することができる第一配位子にマーカーが結
合されてなる１種類以上のマーカー標識化配位子、及び
分析物の特定の種類に対して特異的に反応することがで
きる第二配位子に分析物の種類に応じて予め決定された
塩基配列を有する核酸である結合子が結合されてなる１
種類以上の結合子標識化配位子を含む試薬成分が封入さ
れている封入ゾーンに前記液体試料を移動させ接触させ
ること、（３）前記試薬と液体試料との接触により形成
された、特定の種類の分析物、該分析物に対して特異的
に結合する特定の種類のマーカー標識化配位子、及び該
分析物に対して特異的に結合する特定の種類の結合子標
識化配位子からなる特定の種類の複合体の１種類以上、
或いは形成されつつある反応物を毛管現象により該展開
要素中に展開させること、（４）前記複合体中の結合子
に対して相補的な塩基配列を有する核酸からなる抗結合
子が種類毎に独立して前記展開要素上に固定されてなる
検出ゾーンにおいて、前記結合子と前記抗結合子間の相
補的結合により分析物の種類毎に複合体を捕獲して各々
独立した帯を形成させること、（５）前記検出ゾーンで
形成された帯に含まれるマーカーを測定又は検定するこ
とを含むことからなる。

【００１４】また、本発明の分析キットは、試料中に存
在する１種類以上の分析物の量の測定或いは有無を検定
するための分析キットであって、該分析キットは、下記
の試薬、及び該試薬とは別体の分析装置から構成され
る。即ち、本発明の分析キットにおいて、試薬は、分析
物の特定の種類に対して特異的に反応することができる
第一配位子にマーカーが結合されてなる１種類以上のマ
ーカー標識化配位子、及び分析物の特定の種類に対して
特異的に反応することができる第二配位子に分析物の種
類に応じて予め決定された塩基配列を有する核酸からな
る結合子が結合されてなる１種類以上の結合子標識化配
位子を含む試薬である。前記分析装置は、シート状の展
開要素を有し、該展開要素は毛管現象により、分析物、
試薬、及び分析物と試薬の結合物を展開でき、前記別体
の試薬に含まれる結合子に対して相補的な塩基配列を有
する核酸からなる１種類以上の抗結合子が、種類毎に独
立して該展開要素の検出ゾーンに固定されてなるもので
あり、分析物が含まれる液体試料と前記試料との混合物
が適用された場合、検出ゾーンにおいて、結合子と抗結
合子間の相補的結合により分析物の種類毎に複合体を捕
獲して各々独立した帯を形成させることができる。

【００１５】また、本発明の分析装置は、前記分析キッ
トに含まれる、分析装置であることを特徴とする。

【００１６】また、本発明の分析装置は、試料中に存在
する１種類以上の分析物の量の測定或いは有無を検定す
るための分析装置であって、該分析装置は、（１）毛管
現象により、分析物、試薬、及び分析物と試薬の結合物
を展開できるシート状の展開要素、（２）前記シート状
の展開要素の一端に位置し、液体試料を外部から受入れ
可能で、受入れた液体試料を他方端に達するのに充分な
供給能力を持ち、後記する試薬が封入された封入ゾーン
に対して分析すべき液体試料を供給することが可能で、
該液体試料を外部から受け入れるための適用ゾーン、
（３）分析物の特定の種類に対して特異的に反応するこ
とができる第一配位子にマーカーが結合されてなる１種
類以上のマーカー標識化配位子、及び分析物の特定の種
類に対して特異的に反応することができる第二配位子に
分析物の種類に応じて予め決定された塩基配列を有する
核酸からなる結合子が結合されてなる１種類以上の結合
子標識化配位子を含む試薬が含まれている前記展開要素
の前記適用ゾーンに近い位置に配置された封入ゾーン、
（４）前記展開要素中を拡散してきた分析物、試薬、及
び分析物と試薬の結合物を受け入れることができ、且つ
前記適用ゾーンとは離れた位置に配置された吸水ゾー
ン、（５）前記封入ゾーンと前記吸水ゾーンとの間に位
置し、前記結合子に対して相補的な塩基配列を有する抗
結合子が１種類以上独立して固定されており、分析物の
種類毎にマーカー標識化配位子、分析物、及び結合子標
識化配位子から形成された複合体を捕捉して検出できる
検出ゾーンを含むことを特徴とする。

【００１７】本発明によれば、１種類以上の分析物の分
析が単一のキット或いは装置で、高感度に測定すること
が可能となる。

【００１８】本発明において「配位子」とは、分析物に
対して生物学的親和性を有し、分析物の特定の種類に対
して特異的に反応することができ、結合してペアを形成
することができる一方の分子である。本発明において
「第一配位子」及び「第二配位子」とは、同一の性質を
有するものであっても、異なってもよい。また、分析物
が抗原である場合、第一配位子、第二の配位子は抗体と
することができ、分析物が抗体である場合は、第一配位
子、第二の配位子は抗原とすることができる。また、分
析物と配位子との組合せの他の例には、受容体とこれに
結合するリガンドとの組合せ、核酸とこれに結合する相
補的な核酸との組合せ、レクチンとこれに結合する特異
的な糖との組合せも包含される。

【００１９】本発明において「結合子」とは、分析物と
は結合せず、配位子とは異なる反応性を有する核酸であ
る。本発明において「抗結合子」とは、「結合子」の塩
基配列に少なくとも部分的に相補的な塩基配列を有する
核酸であり、結合子と相補的に結合する。「結合子」と
「抗結合子」との結合の組合せは、結合子及び抗結合子
を構成する核酸分子の塩基配列によって無限といえる程
の膨大な組合せが可能となる。結合子と抗結合子の相補
的結合の観点から、各々の塩基配列が部分的に相補的に
対応しているものでもよく、また互いの相補的塩基配列
が完全に一致しているものでも良い。結合子、抗結合子
となる核酸には、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチドが使用でき、好ましくは
10mer 以上100mer以下の長さのオリゴヌクレオチドが好
ましい。

【００２０】検出ゾーンにおいて抗結合子は展開要素に
直接的或いは他の物質を介して間接的に結合して固定さ
れている。例えば、核酸の５’又は３’末端、或いは核
酸を構成する塩基に導入された官能基を介して、展開要
素として不溶性支持体に含まれる官能基と、抗結合子で
ある核酸を共有結合させることにより展開要素に直接的
に固定することができる。抗結合子は分析すべき１種類
以上の分析物の種類に応じてそれぞれ異なる塩基配列が
予め決定されており、展開要素の検出ゾーンに種類毎に
独立してゾーンをなして固定されている。

【００２１】核酸の５’又は３’末端基に導入されたビ
オチン、或いは核酸を構成する塩基に導入されたビオチ
ンを介して、展開要素として不溶性支持体に予め結合さ
せたアビジン或いはストレプトアビジンと結合させるこ
とにより、抗結合子である核酸を展開要素に間接的に固
定することができる。また、核酸の５’又は３’末端、
或いは核酸を構成する塩基に導入された官能基を介し
て、核酸をタンパク質に結合させ、この核酸結合タンパ
ク質を展開要素としての不溶性支持体に結合させること
により、抗結合子である核酸を間接的に展開要素に固定
することができる。

【００２２】本発明において使用される試薬成分には、
第一配位子にマーカーが結合されてなる「マーカー標識
化配位子」、及び第二配位子に分析物の種類に応じて予
め決定された塩基配列を有する核酸である結合子が結合
されてなる「結合子標識化配位子」が使用される。試薬
成分は、展開要素と別体となって、展開要素と組合せ使
用されるべきキットを構成することができる。また、試
薬成分は、展開要素の封入ゾーンに乾燥した状態で保持
されていてもよい。

【００２３】マーカー標識化配位子に含まれるマーカー
には、具体的には酵素学的に活性な分子、ジゴキシゲニ
ン、金属コロイド、着色ラテックス、着色リポソーム、
核酸、ビオチン、アビジン、蛍光物質、発光物質、放射
性同位元素などを使用することができる。なお、着色と
は肉眼的に識別できる色を付着させることに限らず、蛍
光物質、発光物質を付着させることも包含する。

【００２４】本発明において「展開要素」は、シート状
をなしており、毛管現象により、分析物、試薬、及び分
析物と試薬の結合物をクロマトグラフ的に展開できる。
好適な展開要素には、多孔質不溶性支持体が使用でき、
具体的にはプラスチック製多孔質支持体、セルロース系
多孔質支持体、無機系多孔質支持体が使用でき、さらに
具体的には、多孔質の、セルロース、ニトロセルロー
ス、酢酸セルロース、ナイロン、シリカ、またはこれら
の誘導体などが挙げられ、展開要素に形成された複数の
ゾーン毎に材料を変えたり、組み合わせて使用すること
ができる。場合によっては、複数のゾーンは一方の面
を、同一の素材あるいは異なる素材によって補強されて
いる場合もある。また、これらのゾーンは、分析が行な
われないときは通常、乾燥して存在する。

【００２５】

【発明の実施の形態】図１は、分析物が１種類以上を対
象とした本発明の分析キットの構成要素の一方である試
薬の一例を模式的に示し、目的とする分析物が３種類の
抗原、即ち、抗原Ａ、抗原Ｂ、抗原Ｃの場合である。図
１において、枠で囲ってある部分は全て一つの試薬中に
含まれる成分であり、該試薬は乾燥状態でも、液体中に
存在していてもよい。図１中、αＡ、αＢ、αＣは、各
々抗原Ａ、抗原Ｂ、抗原Ｃに対する抗体を示す。この抗
体αＡ、抗体αＢ、抗体αＣには各々マーカーが結合さ
れて、マーカー標識化抗体となっている。各抗体に導入
されるマーカーは同一のものであっても、異なるもので
あってもよい。この試薬中には、さらに抗体αＡ、抗体
αＢ、抗体αＣに各々異なる配列の、オリゴヌクレオチ
ドＯＮ1 、オリゴヌクレオチドＯＮ2 、オリゴヌクレオ
チドＯＮ3 が結合された３種類の抗体−オリゴヌクレオ
チド結合体が前記３種類のマーカー標識化抗体と同時に
含まれている。分析キットを構成する試薬は液状であっ
ても、乾燥状態であってもよい。

【００２６】図２は、本発明の分析キットの構成要素の
他方である分析装置の一例を模式的に示し、図１の試薬
と組み合わせて使用される。図２において、１は多孔質
シートの帯片からなる展開要素、２は該展開要素１の一
端に設けられ、適用される液体試料と試薬混合物を吸収
し、展開要素１へ供給するための適用ゾーン、３は展開
要素中を移動拡散してきた、分析物、試薬、及び分析物
と試薬の結合物を受け入れることができる吸収ゾーンで
ある。前記適用ゾーン２と吸収ゾーン３との間に、検出
ゾーン４が設けられ、オリゴヌクレオチドＯＮ1 に相補
的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＯＮ1'が固定さ
れた第１検出ゾーン５、オリゴヌクレオチドＯＮ2 に相
補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＯＮ2'が固定
された第２検出ゾーン６、オリゴヌクレオチドＯＮ3 に
相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＯＮ3'が固
定された第３検出ゾーン７が種類毎に各々独立して縞状
となっている。

【００２７】図１の試薬と図２の展開要素との組合せか
らなる分析キットを用いた簡易臨床診断方法を次に示
す。分析物として抗原Ａ、抗原Ｂ、抗原Ｃが含まれる液
体試料を用い、容器中にて試薬と混合し、免疫学的親和
性反応を行わせる。得られた反応液を展開要素１の適用
ゾーン２へ適用する。この反応液の適用は、適用ゾーン
２を反応液中に浸漬してもよいし、反応液を適用ゾーン
２へ滴下、或いは塗布等により与えてもよい。反応液に
は、分析物、試薬、及び分析物と試薬とが複合化したマ
ーカー標識化免疫複合体が含まれる。該反応液は、展開
要素１中を毛管現象により移動又は拡散して、検出ゾー
ン４に移動し、ここで、マーカー標識化免疫複合体は、
分析物の種類毎に塩基配列が予め定められた固定された
オリゴヌクレオチドと、マーカー標識化免疫複合体中に
含まれるオリゴヌクレオチドとの相補的結合によりマー
カー標識化免疫複合体が捕獲される。図３に、図１及び
図２に示されるキットを用いた簡易臨床診断方法によ
り、マーカー標識化免疫複合体が分析物の種類毎に捕獲
された様子を模式的に示す。

【００２８】本発明の試薬成分のマーカー標識化配位子
に含まれる第一配位子と、核酸標識化配位子に含まれる
第二配位子は、同一の反応性を有するものであっても、
また異なる反応性を有するものであってもよい。また、
第一配位子と第二配位子との組合せは、同一の抗原に対
するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組合
せ、ポリクローナル抗体相互の組合せ、結合部位の異な
るモノクローナル抗体相互の組合せであってもよい。

【００２９】液体試料中に含まれる分析対象となる分析
物が、同種のカテゴリーに属さない化合物の混合体に対
しても本発明は分析が可能である。例えば、抗原、抗
体、核酸の同時分析も行うことができる。また、上記の
サンドイッチ方式に限定されず、種々のパターンの拮抗
的、或いは非拮抗的な分析手法が適用可能である。

【００３０】核酸を構成する塩基配列は無限に近い膨大
な種類が入手可能であるので、検出ゾーンで検出可能な
分析物の種類数は幾らでも可能である。

【００３１】図４は、本発明の分析装置の別の態様を示
し、試薬が装置の中に乾燥状態で一体となって含まれて
いる分析装置である。図４の分析装置において、１１は
帯状の多孔質シートの帯片シートを主たる構成部材とし
必要に応じて補強シートが貼着された展開要素、１２は
該展開要素１１の一端に設けられ、適用される液体試料
を吸収し、試薬を含んでいる封入ゾーン１８及び展開要
素１１へ液体試料を供給するための適用ゾーン、１３は
展開要素１１中を移動拡散してきた、分析物、試薬、及
び分析物と試薬の結合物を受け入れることができる吸収
ゾーンである。前記図２に示す分析装置との差異は、図
４には、展開要素１１と適用ゾーン１２の間に、試薬を
含ませた封入ゾーン１８が設けられており、適用ゾーン
１２から封入ゾーン１８へ供給される液体試料が展開要
素１１に移動できるように両者に緊密に接触している。

【００３２】封入ゾーン１８と吸収ゾーン１３との間の
展開要素１１には、検出ゾーン１４が設けられ、試薬の
構成要素として含まれるオリゴヌクレオチドＯＮ1 に対
して相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＯＮ1'
が固定された抗原Ａ分析用の第１検出ゾーン１５、オリ
ゴヌクレオチドＯＮ2 に相補的塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドＯＮ2'が固定された抗原Ｂ分析用の第２検
出ゾーン１６、オリゴヌクレオチドＯＮ3 に相補的塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドＯＮ3'が固定された抗
体Ｃ分析用の第３検出ゾーン１７が種類毎に各々独立し
て縞状となっている。

【００３３】図４の分析装置の使用例として、目的とす
る分析物を抗原Ａ、抗原Ｂ、抗体Ｃとし、分析すべき液
体試料中に実際に抗原Ａと抗体Ｃのみが含まれていた場
合について次に説明する。図５は、その場合に分析装置
の封入ゾーン１８に乾燥状態で含まれている試薬の構成
を示す。本態様の試薬構成は、図１の試薬構成と比較し
て、マーカー標識化抗体αＣがマーカー標識化抗原Ｃ
に、またオリゴヌクレオチドＯＮ3 標識化抗体αＣがオ
リゴヌクレオチドＯＮ3 標識化抗原Ｃに変更されている
のみである。

【００３４】まず分析物として抗原Ａ及び抗体Ｃを含む
液体試料が適用ゾーン１２に適用されると、これらの分
析物は毛管現象により、試薬成分と共に移動しながら、
抗原Ａはマーカー標識化抗体αＡ及びオリゴヌクレオチ
ドＯＮ1 標識化抗体αＡとサンドイッチ免疫複合体を形
成し、抗原Ａ分析用の第１検出ゾーン１５に達し、そこ
でオリゴヌクレオチドの互いの相補的な塩基配列により
捕獲される。また抗体Ｃはマーカー標識化抗原Ｃ及びオ
リゴヌクレオチドＯＮ3 標識化抗原Ｃとサンドイッチ免
疫複合体を形成し、抗体Ｃ分析用の第３検出ゾーン１７
に達し、そこでオリゴヌクレオチドの互いの相補的な塩
基配列により捕獲される。しかし、液体試料中に抗原Ｂ
は存在していないため、サンドイッチ免疫複合体は形成
されず、抗原Ｂ分析用の第２検出ゾーン１６では、オリ
ゴヌクレオチドＯＮ2 標識化抗体αＢが捕獲される。こ
のようにして各検出ゾーン１５、１６、１７において捕
獲されたサンドイッチ免疫複合体に含まれるマーカーに
ついて、抗原Ａ及び抗体Ｃの量の測定又は存在の検出が
行なわれ、抗原Ｂは存在しないことが分かる。図６に、
図４に示される分析装置を用いた簡易臨床診断方法によ
り、マーカー標識化免疫複合体が分析物の種類毎に捕獲
された様子を模式的に示す。

【００３５】図７は分析物が核酸である場合において、
本発明に従って、検出ゾーンで核酸が捕獲される原理を
示す。図７において、分析物４３はオリゴヌクレオチド
ＯＮ3 とオリゴヌクレオチドＯＮ2 をその配列中に含む
核酸である。なお、分析物は一重鎖の核酸であっても、
二重鎖の核酸であっても適用可能である。検出ゾーン４
０に固定化されている抗結合子４１はオリゴヌクレオチ
ドＯＮ1 を含む核酸である。試薬成分としては、マーカ
ー標識化配位子４４と核酸標識化配位子４２からなり、
該マーカー標識化配位子４４は、分析物４３中のオリゴ
ヌクレオチドＯＮ3 に相補的な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドＯＮ3'を有する核酸とマーカーが結合され
たものであり、該核酸標識化配位子４２は分析物４３中
のオリゴヌクレオチドＯＮ2 に相補的な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドＯＮ2'と検出ゾーン４０に固定化
されている抗結合子４１のオリゴヌクレオチドＯＮ1 に
相補的な塩基配列を有する結合子としてのオリゴヌクレ
オチドＯＮ1'をその配列中に含む核酸である。

【００３６】これらの試薬を含む本発明の分析キット又
は分析装置を用いて目的とする核酸分析物の捕獲された
結合モデルが図７に示される。試薬及び液体試料が本発
明の分析装置中の展開要素に展開中に、分析物、試薬及
び固定化抗結合子との相互反応により、抗結合子４１の
オリゴヌクレオチドＯＮ1 と核酸標識化配位子４２のオ
リゴヌクレオチドＯＮ1'との相補的結合、核酸標識化配
位子４２のオリゴヌクレオチドＯＮ2'と分析物４３のオ
リゴヌクレオチドＯＮ2 との相補的結合、分析物４３の
オリゴヌクレオチドＯＮ3 とマーカー標識化配位子４４
のオリゴヌクレオチドＯＮ3'との相補的結合が生じ、マ
ーカー及び分析物４３を含んだ複合体が抗結合子４１に
捕獲される。

【００３７】本発明による分析方法によれば、免疫複合
体等の生物学的親和性物質複合体の生成が、分析装置の
適用前或いは適用後の早期に完了する。本発明の分析装
置によれば、該生物学的親和性物質複合体の捕獲に適用
される結合子及び抗結合子としての核酸の相補的結合
は、一致率が高く、安定性の高い反応であり、免疫反応
よりも強力に行えるために、生物学的親和性物質複合体
は効率よく固相に結合させることができる。したがって
従来のイムノクロマト法よりも高感度化が実現できる。

【００３８】逆に、核酸とこれに相補的な一致率が低い
核酸との組合せを選択した場合は、安定性の低い核酸の
反応は免疫反応よりも弱いために、強い力価の抗体を用
いた場合に遭遇する、感度が高すぎるために抗体量を減
少させるといったことを行わなくても、核酸の配列によ
って検出感度のコントロールを行うことができる。こう
したことは、従来のイムノクロマト法では実現できなか
ったが、本発明により初めて実現できる特徴である。と
くに、同時に複数項目を判定する必要がある場合は、そ
れぞれの項目の正常域、異常域が異なっており、抗体の
濃度、量を変化させるといったことが必要とされるケー
スがあるが、本発明の方法によればこの調整が大幅に簡
略化される。

【００３９】本発明における展開要素の検出ゾーン上に
固定される抗結合子としての核酸の固定化手段には種々
の方法が適用できる。抗結合子である核酸の５′末端ま
たは３′末端において、あるいは核酸の末端以外の任意
の官能基の位置において、検出ゾーンの水不溶性担体に
直接または導入された官能基を介してその核酸が共有結
合されていてもよい。また核酸に積極的に官能基を導入
したものと、検出ゾーンの水不溶性担体に直接または導
入された官能基を介してその核酸が共有結合されていて
もよい。

【００４０】核酸の検出ゾーンへの別の固定化手段とし
て、他の物質を介在させて結合を行ってもよい。例え
ば、物理吸着により検出ゾーンに固定化されることがで
きる物質に核酸を生物学的親和性結合、共有結合等によ
って結合させておいて、得られた結合物を物理吸着によ
り検出ゾーンへ固定化してもよい。例えば、ヌクレオチ
ドの５′末端または３′末端において、あるいはヌクレ
オチドの任意の位置に導入された官能基の位置におい
て、検出ゾーンに物理吸着可能な他の物質と、官能基を
介して共有結合したものを、検出ゾーンに吸着させるこ
とにより行うことができる。例えば、タンパク質は不溶
性担体に物理吸着可能な物質であり、該タンパク質のア
ミノ基にＳＨ基を導入し、該ＳＨ基とオリゴヌクレオチ
ドの５’末端に導入したマレイミド基を反応させてなる
共有結合されたタンパク質を、物理吸着により検出ゾー
ンに固定化することができる。

【００４１】他の物質と核酸の結合は、上記のような共
有結合以外に、生物学的親和性によるものでもよい。こ
のような他の物質には、例えば、タンパク質が挙げられ
る。該タンパク質の例には、アビジン、牛血清アルブミ
ン、免疫グロブリン等が挙げられる。なお、免疫グロブ
リンが、分析物に対して免疫学的親和性を有するときに
は、分析物との免疫学的結合を利用することにより、さ
らに分析感度のアップが望める。

【００４２】図８は、分析物が抗原であり、抗原を検出
するための分析装置として、検出ゾーン１４において、
ＩｇＧ抗体に抗結合子として核酸２０が導入された核酸
標識化ＩｇＧ抗体１９が不溶性担体に固定されている場
合を示す。免疫化学的活性を有する核酸標識化ＩｇＧ抗
体１９には核酸２０，２０が２個導入されており、この
ような核酸標識化ＩｇＧ抗体１９が検出ゾーン１４に吸
着されており、ＩｇＧ抗体を介して核酸２０が固定化さ
れた状態となっている。

【００４３】図８に示す検出ゾーン１４において、サン
ドイッチ免疫複合体が捕獲された状態を図９に示す。図
９において、核酸標識化ＩｇＧ抗体１９に捕獲される物
質は、２種類の免疫複合体が捕獲される。その一つは、
分析物としての抗原２２、核酸標識化抗体２１及びマー
カー標識化抗体２３により形成されたサンドイッチ免疫
複合体であり、そして他の一つは、マーカー標識化抗体
２３と抗原２２により形成された免疫複合体である。

【００４４】即ち、図９によれば、核酸２０が導入され
た核酸標識化ＩｇＧ抗体１９を検出ゾーン１４に固定化
することにより、抗原２２の検出は、試薬成分としての
核酸標識化抗体２１中の核酸２４と、検出ゾーン１４に
固定されている核酸標識化ＩｇＧ抗体１９中の核酸２０
の相補的結合により抗原が検出されるだけではなく、さ
らに加えてＩｇＧ抗体自体の免疫化学的活性作用により
結合された抗原２２についても検出される。

【００４５】従来法によれば、固定化された免疫化学的
活性物質１分子に対して、２分子の分析対象物しか結合
できないが、本発明の該実施態様によれば、従来法によ
る分析よりも多くの分析対象物としての抗原が結合で
き、この結果、多くの標識マーカーが結合できる。その
ために、従来の分析法よりも、本発明の分析法による方
が検出感度が高くなる。

【００４６】図１０は、アビジン２５を物理吸着により
検出ゾーン１４に固相化してなるア固相化アビジンに対
して、核酸２７にビオチン２６を導入してなるビオチン
化核酸を結合させることにより、核酸２７をビオチン−
アビジンの反応により固相化したものである。

【００４７】図１１は、図１０に示すビオチン−アビ
ジンの反応により固相化した核酸とは別の態様の固相化
核酸を示し、図１０に示す核酸−ビオチン−アビジン複
合体にさらに、核酸−ビオチン−アビジン複合体を核酸
の相補的結合により結合させて核酸を固相化したもので
ある。即ち、図１０に示す手法により得られた核酸−ビ
オチン−アビジン複合体を検出ゾーンに結合させてお
き、次いで、先に固定した核酸２７とは相補的な塩基配
列の核酸２８にビオチン２６を導入したビオチン化核酸
とアビジン２５からなる複合体を形成し、先の核酸−ビ
オチン−アビジン複合体中の核酸２７との相補的結合に
より、核酸２８を有する複合体を結合させて、核酸２８
を固相化させたものである。

【００４８】図１１に示す手段により得られた核酸固相
化検出ゾーンは、検出ゾーン上において３次元的に成長
しており、図１０に示す態様の核酸固定化手段よりも多
くの抗結合子としての核酸を含ませることができるの
で、より多くの免疫複合体の捕獲が可能となり、検出感
度が高くなる。

【００４９】上記２種の態様に用いたアビジンの代わり
にストレプトアビジンを用いることによっても同様に、
核酸結合不溶性支持体を調製することが可能である。上
記のようにして、本発明の分析装置を得る。

【００５０】本発明の分析装置はテストストリップ単独
として使用することができ、また、該テストストリップ
をケースに入れて使用することもできる。一般的に、患
者から採取された血液、血清、血漿などは、感染性の微
生物が混入している可能性も高いために、本発明の分析
装置をテストストリップ単独として使用するには、感染
の可能性の問題も考慮する必要がある。この感染の問題
点を軽減し、手で直接テストストリップを触れることな
く扱うことのできる方法として、テストストリップをプ
ラスチック製ケース等の保護ケースにに入れて取り扱う
ことは好ましい態様である。

【００５１】テストストリップをケースに収容する手段
には、例えば、図１２に示す手段が使用できる。即ち、
２つの穴のあるプラスチック製ケース２９の中にテスト
ストリップを封入しておき、一方の穴は、テストストリ
ップの適用ゾーンに対応した試料適用口３０であり、他
方の孔は、テストストリップの捕捉用核酸が結合してい
る検出ゾーン１４において、分析物が捕獲された様子が
観察できるような検出窓３１となっている。このプラス
チック製ケース２９に入れたテストストリップにより、
微生物による検査を行っている人への検体による感染の
可能性を大幅に軽減することが可能となる。該プラスチ
ック製ケース２９の材料として好適なプラスチックの例
には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、
アクリル樹脂、エチレン塩化ビニル、フッ化ポリビニデ
ン等が挙げられる。

【００５２】

【実施例】次に、実施例に基づき本発明をさらに詳しく
説明する。

【００５３】〔実施例１〕工程１：ビオチン化オリゴヌクレオチドの調製５’末端にアミノ基を有する以下のようなオリゴヌクレ
オチドをパーキンエルマー社製ＤＮＡ合成装置３９１Ａ
を用いて、それぞれ合成した。アミノ基−ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣ
ＣＧＴＣＧ（以下、ペア１＋）アミノ基−ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ
ＡＡＴＴＣ（以下、ペア１−）アミノ基−ＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＡＡＴＣＡ
ＧＧＡＧＧ（以下、ペア８＋）アミノ基−ＣＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＧＡＴＴ
ＣＣＧＴＴ（以下、ペア８−）これらのオリゴヌクレオチド３００ｎｍｏｌをそれぞれ
１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ
７．０に溶解した溶液中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド−ビオチン（ピアス社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）３
０μｍｏｌをＮ’，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（以
下、ＤＭＦ）に溶解した溶液をそれぞれ加え、３７℃１
時間反応させた。反応後、エタノール沈澱法によりビオ
チン化したオリゴヌクレオチドを分離した。この操作に
より、いずれの配列もほぼ８０〜９０％のビオチン化し
たオリゴヌクレオチドが回収できた。

【００５４】工程２：抗ＨＢｓ抗体及び抗ＣＲＰ抗体の
調製Ｂ型肝炎表面抗原（以下ＨＢｓ）に対する抗体は、明治
乳業（株）より購入したＨＢｓを定法通り、ウサギある
いはマウスに免疫し、ウサギからはポリクローン抗体を
マウスからはクローニングを行いモノクローン抗体を調
製した。また、Ｃ反応性タンパク質（以下ＣＲＰ）に対
する抗体は、札幌臨床検査センターより購入したＣＲＰ
を定法通り、ウサギあるいはマウスに免疫し、ウサギか
らはポリクローン抗体をマウスからはクローニングを行
いモノクローン抗体を調製した。それぞれの抗体はＩｇ
Ｇまで精製し、以下の実験に供した。

【００５５】工程３：金コロイド標識化抗ＨＢｓ抗体及
び金コロイド標識化抗ＣＲＰ抗体の調製前記工程２で得られたウサギポリクローン抗ＨＢｓ抗体
を金コロイドにより標識した。すなわち、ザイメッド社
製粒径１０ｎｍの金コロイドを、ソフトサイエンス社刊
横田ら編イムノゴールド法（１９９２）に従って、
金コロイド標識ウサギポリクローン抗ＨＢｓ抗体を調製
した。また、同様に前記工程で得られたマウスモノクロ
ーン抗ＣＲＰ抗体を金コロイドにより標識した。

【００５６】工程４：オリゴヌクレオチド標識化抗体
（ペア８＋標識化抗ＣＲＰ−ＩｇＧ、ペア１−標識化Ｂ
ＳＡ、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧ）の調製前記工程２で得られたウサギポリクローン抗ＨＢｓ−Ｉ
ｇＧ１０ｍｇを０．２Ｍほう酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
８．５２．３ｍｌに溶解し、ここに無水Ｓ−アセチル
メルカプトコハク酸１．３３ｍｇを溶解させたＤＭＦ
０．２５ｍｌを添加し、３７℃１時間反応させた。反応
後、１ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と１Ｍ
ヒドロキシルアミン（ｐＨ７．０）をそれぞれ０．５ｍ
ｌづつ添加し、３７℃３０分間反応させた。

【００５７】この後、ファルマシア製Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇー２５を充填し、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化した直径
１ｃｍ長さ４５ｃｍのカラムに適用し、スルフヒドリル
基導入抗ＨＢｓ−ＩｇＧ９．７４ｍｇを得た。Y. Oku
らの方法（ Microbiol. Immunol., 32, 807-816, 1988
) の方法に従いスルフヒドリル基を定量したところ、
ＩｇＧ１分子あたり２．８４分子のスルフヒドリル基
が導入されていることが確認できた。

【００５８】一方、ペア１−３０３ｎｍｏｌを含む０．
１Ｍ３−モルホリノプロパンスルフォニックアシド
（以下、ＭＯＰＳ）緩衝液ｐＨ７．００．８ｍｌに、
N-( ε−マレイミド−カプロイルオキシ）スクシンイミ
ド（以下、ＥＭＣＳ）１０ｍｇを溶解した３００μｌの
ＤＭＦを添加し、３７℃３０分反応させた。反応後、エ
タノール沈澱法によりマレイミド基導入オリゴヌクレオ
チドを精製した。２２５ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチド
が回収され、マレイミド基を定量したところ、オリゴヌ
クレオチド１分子あたり１．２分子のマレイミド基が導
入されていることが確認できた。

【００５９】次に、得られたスルフヒドリル基導入抗Ｈ
Ｂｓ−ＩｇＧとマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを
混合し、３７℃１時間反応させ、５ｍＭＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡
化した直径１．５ｃｍ長さ４５ｃｍのカラムに適用し
た。分画したフラクションについて２８０ｎｍと２６０
ｎｍにおける吸光度を測定しオリゴヌクレオチド標識抗
ＨＢｓ−ＩｇＧに相当するフラクションを収集し、アミ
コン社製限外濾過膜ＹＭ−３０により濃縮した。

【００６０】この収集した分画についてピアス社のＢＣ
Ａプロテインアッセイキットを用いてタンパク定量を行
い、濃度が２．１２ｍｇ／ｍｌであることがわかった。
以下この複合体を「ペア１−標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧ」
と略記する。

【００６１】これと同様の方法により、前記工程２で得
られたマウスモノクローン抗ＣＲＰ−ＩｇＧにペア８＋
を導入してなるペア８＋標識化抗ＣＲＰ−ＩｇＧ、牛血
清アルブミン（以下ＢＳＡ）にペア１−を導入してなる
ペア１−標識化ＢＳＡ、及び抗ＨＢｓ−ＩｇＧにＰａｉ
ｒ１＋を導入してなるペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧ
を調製した。

【００６２】工程５：オリゴヌクレオチド標識化抗ＨＢ
ｓ−Ｆａｂ’の調製前記工程２で得られたウサギポリクローン抗ＨＢｓ−Ｉ
ｇＧ１２．７２ｍｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ４．５に溶解した。ここに０．２５ｍｇのペプシ
ン（ベーリンガーマンハイム社製）を添加して３７℃１
５時間反応させた。反応後、５ｍＭＥＤＴＡを含む
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化
した直径１．５ｃｍ長さ４５ｃｍのIBF biotechniqes社
製ＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ４４樹脂を充填したカラム
に適用した。Ｆ（ａｂ’）²に相当する画分を収集し、
これを濃縮した。ここで得たＦ（ａｂ’）² の内４．
９４ｍｇに終濃度が１０ｍＭになるようにメルカプトエ
チルアミンを添加し、３７℃９０分間反応させた。反応
後、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化した直径１ｃｍ長さ４５ｃ
ｍのＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を充填したカラムに適用
した。ヒンジ部スルフヒドリル基が露出したＦａｂ’に
相当する画分を収集し、ＹＭ−３０により濃縮してスル
フヒドリル基導入Ｆａｂ’を得た。３．３ｍｇのＦａ
ｂ’が回収された。また、スルフヒドリル基の定量を行
ったところ、１分子のＦａｂ’に対して１．１２分子の
スルフヒドリル基が導入されていることがわかった。

【００６３】一方、ペア１＋のオリゴヌクレオチド２
５０ｎｍｏｌを１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯ
ＰＳ緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、これに７．７ｍｇのＥ
ＭＣＳを含むＤＭＦを添加し、３７℃１時間反応させ
た。エタノール沈澱によりマレイミド基導入オリゴヌク
レオチドを精製し、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に溶解した。回収さ
れたマレイミド基導入オリゴヌクレオチドは２３１ｎｍ
ｏｌで、１分子のオリゴヌクレオチドに０．７３分子の
マレイミド基が導入されていることがわかった。

【００６４】得られたスルフヒドリル基導入Ｆａｂ’と
マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを混合し、３７℃
１時間反応させ、反応後、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化した直
径１．５ｃｍ長さ４５ｃｍのＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ
４４を充填したカラムに適用した。分画したフラクショ
ンについて２８０ｎｍと２６０ｎｍにおける吸光度を測
定し、オリゴヌクレオチド標識化抗ＨＢｓ−Ｆａｂ’に
相当するフラクションを収集し、限外濾過膜（アミコン
社製ＹＭ−３０）により濃縮した。この収集した分画に
ついてプロテインアッセイキット（ピアス社製ＢＣＡプ
ロテインアッセイキット）を用いてタンパク定量を行
い、濃度が５．７２ｍｇ／ｍｌであることがわかった。

【００６５】工程６：固相化アビジンの調製リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬（株）製ＰＢＳ
（−））２０ｍｌに１０ｍｇのアビジンを溶解し、５×
１０ｃｍに切断したメンブレン（ミリポア社製ＳＰＨ
Ｆメンブレン）を室温でこの溶液中に１時間浸し、その
後蒸留水でメンブレンを洗浄した。洗浄後、風乾し、前
記工程１で調製した２５８ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度のビオ
チン標識ペア１−をソフトペン（プラチナ万年筆（株）
製）に染み込ませて、５ｃｍの辺に対して２等分するよ
うに直角に線を引き、ビオチン標識ペア１−をアビジン
結合ＳＰＨＦメンブレンに結合させた。風乾後、ブロッ
キング剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）によりブ
ロッキングを室温で３０分行い、蒸留水でメンブレンを
洗浄し、その後風乾してペア１−結合メンブレンを得
た。次いで、ペーパーカッターにより幅０．５ｃｍ縦５
ｃｍになるように切断し、一端にグラスフィルター（ワ
ットマン社製、以下、ＧＦ）をホッチキスにより固定し
乾燥条件下保存した。

【００６６】工程７：サンドイッチ免疫複合体のメンブ
レンへの捕獲リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬（株）製ＰＢＳ
（−））に０．１％ＢＳＡ、０．３５Ｍ塩化ナトリウ
ムを添加した溶液（以下、ＭＰＢＳ）を用いて、前記工
程４において調製した、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−Ｉｇ
Ｇを終濃度１．５４μｇ／ｍｌになるように、また、前
記工程３において調製した金コロイド（金コロイド標識
化抗ＨＢｓ抗体）は５２０ｎｍにおける吸光度が０．５
になるように調製した。ここにＨＢｓ抗原がそれぞれ終
濃度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは０ｎ
ｇ／ｍｌになるように加え、このうち１００μｌを試験
管に分注した。前記工程６において調製したペア１−結
合メンブレンを、ＧＦが上になるように速やかに投入
し、反応性を確認した。その結果、ＨＢｓ終濃度１００
ｎｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌにおいて反応性が確認され
た。対象としたＨＢｓを含まない溶液（０ｎｇ／ｍｌ）
では反応性は確認されなかった。この結果は、ペア１＋
標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧとＨＢｓ抗原と金コロイド標識
化抗ＨＢｓ抗体とから、サンドイッチ免疫複合体が形成
され、該サンドイッチ免疫複合体中のペア１＋と、ペア
１−結合メンブレンのペア−とが相補的に結合され、該
サンドイッチ免疫複合体がメンブレンに捕獲されたこと
を示す。

【００６７】〔実施例２〕工程１：ペア１＋標識化アビジン及びペア１−標識化ア
ビジンの調製前記実施例１の工程１において調製したビオチン標識ペ
ア１＋１１２ｎｍｏｌとアビジン１．５２ｍｇをＭＰ
ＢＳ０．７ｍｌ中で３７℃３時間反応させ、その後、Ｐ
ＢＳで平衡化したIBF biotechniqes社製Ｕｌｔｒｏｇｅ
ｌＡｃＡ４４樹脂に適用し、ペア１＋標識化アビジン
を得た。また、同様の方法により、ペア１−標識化アビ
ジンを得た。

【００６８】工程２：オリゴヌクレオチド−アビジンマ
トリクス結合メンブレンの調製リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬製ＰＢＳ（−））２０
ｍｌに１０ｍｇのアビジンを溶解し、５×１０ｃｍに切
断したメンブレン（ミリポア社製ＳＰＨＦメンブレ
ン）を室温で１時間この溶液中に浸し、その後蒸留水で
メンブレンを洗浄した。洗浄後、風乾し、実施例１で調
製した２５８ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度のビオチン標識化ペ
ア１−をソフトペン（プラチナ万年筆（株）製）に染み
込ませて、５ｃｍの辺に対して２等分するように直角に
線を引き、ビオチン標識化ペア１−をアビジン結合ＳＰ
ＨＦメンブレンに結合させた。風乾後、ブロッキング剤
（雪印乳業（株）製ブロックエース）によりブロッキン
グを室温で３０分間行い、蒸留水でメンブレンを洗浄
し、ペア１−結合ＳＰＨＦメンブレンを調製した。本実
施例２の前記工程１で調製したペア１＋標識化アビジン
１μｇ／ｍｌとペア１−標識アビジン２μｇ／ｍｌを含
むＭＰＢＳにペア１−結合ＳＰＨＦメンブレンを室温下
１時間反応させ、オリゴヌクレオチド−アビジンマトリ
クス結合メンブレンを調製した。メンブレンを蒸留水で
洗浄後、風乾した。その後、ペーパーカッターにより幅
０．５ｃｍ縦５ｃｍになるように切断し、一端にＧＦを
ホッチキスにより固定し乾燥条件下保存した。

【００６９】工程３：サンドイッチ免疫複合体のメンブ
レンへの捕獲ＭＰＢＳを用いて、前記実施例１の工程４において調製
した、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧを終濃度１．５
４μｇ／ｍｌになるように、また、前記実施例１の工程
３において調製した金コロイド標識化抗ＨＢｓ抗体は５
２０ｎｍにおける吸光度が０．５になるように調製し
た。ここにＨＢｓ抗原がそれぞれ終濃度１００ｎｇ／ｍ
ｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍ
ｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、あるいは０ｎｇ／ｍｌになるよう
に加え、このうち１００μｌを試験管に分注した。本実
施例２の前記工程２において調製したオリゴヌクレオチ
ド−アビジンマトリクス結合メンブレンを、ＧＦが上に
なるように速やかに投入し、反応性を確認した。その結
果、ＨＢｓ終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、
６０ｎｇ／ｍｌにおいて反応性が確認された。４０ｎｇ
／ｍｌ以下の濃度では反応性は確認されなかった。

【００７０】〔実施例３〕工程１：ペア１−結合ＳＰＨＦメンブレンの調製前記実施例１の工程４で調製した２ｍｇ／ｍｌの濃度の
ペア１−標識化ＢＳＡをソフトペン（プラチナ万年筆
（株）製）に染み込ませて、５×１０ｃｍに切断したメ
ンブレン（ミリポア社製ＳＰＨＦメンブレン）の５ｃ
ｍの辺に対して２等分するように直角に線を引き、物理
吸着によりメンブレンに結合させた。風乾後、ブロッキ
ング剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）によりブロ
ッキングを室温で３０分間行い、蒸留水でメンブレンを
洗浄し、ペア１−結合ＳＰＨＦメンブレンを調製した。
風乾後、ペーパーカッターにより幅０．５ｃｍ縦５ｃｍ
になるように切断し、一端にＧＦをホッチキスにより固
定し乾燥条件下保存した。

【００７１】工程２：サンドイッチ免疫複合体のメンブ
レンへの捕獲ＭＰＢＳを用いて、前記実施例１の工程４において調製
した、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧを終濃度１．５
４μｇ／ｍｌになるように、また、前記実施例１の工程
３において調製した金コロイド（金コロイド標識化抗Ｈ
Ｂｓ抗体）は５２０ｎｍにおける吸光度が０．５になる
ように調製した。ここにＨＢｓ抗原がそれぞれ終濃度１
００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１
０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌあるいは０ｎｇ／ｍｌにな
るように加え、このうち１００μｌを試験管に分注し
た。本実施例３の前記工程１において調製したペア１−
結合ＳＰＨＦメンブレンを、ＧＦが上になるように速や
かに投入し、反応性を確認した。その結果、ＨＢｓ終濃
度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍ
ｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌにおいて反応性が確
認された。０ｎｇ／ｍｌの濃度では反応性は確認されな
かった。

【００７２】〔実施例４〕工程１：（ペア１−）＋（抗ＨＢｓ−ＩｇＧ）結合ＳＰ
ＨＦメンブレンの調製前記実施例１の工程４で調製した０．５ｍｇ／ｍｌの濃
度のペア１−標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧをソフトペン（プ
ラチナ万年筆（株）製）に染み込ませて、５×１０ｃｍ
に切断したメンブレン（ミリポア社製ＳＰＨＦメンブ
レン）の５ｃｍの辺に対して２等分するように直角に線
を引き、物理吸着により該メンブレンに結合させた。風
乾後、ブロッキング剤（雪印乳業（株）製ブロックエー
ス）によりブロッキングを室温で３０分間行い、蒸留水
でメンブレンを洗浄し、（ペア１−）＋（抗ＨＢｓ−Ｉ
ｇＧ）結合ＳＰＨＦメンブレンを調製した。風乾後、ペ
ーパーカッターにより幅０．５ｃｍ縦５ｃｍになるよう
に切断し、一端にＧＦをホッチキスにより固定し乾燥条
件下保存した。

【００７３】工程２：サンドイッチ免疫複合体のメンブ
レンへの捕獲ＭＰＢＳを用いて、前記実施例１の工程５において調製
した、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−Ｆａｂ’を終濃度１．
５４μｇ／ｍｌになるように、また、前記実施例１の工
程３において調製した金コロイドは５２０ｎｍにおける
吸光度が０．５になるように調製した。ここにＨＢｓ抗
原がそれぞれ終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍ
ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、
２．５ｎｇ／ｍｌあるいは０ｎｇ／ｍｌになるように加
え、このうち１００μｌを試験管に分注した。前記実施
例４において調製した（ペア１−）＋（抗ＨＢｓ−Ｉｇ
Ｇ）結合ＳＰＨＦメンブレンを、ＧＦが上になるように
速やかに投入し、反応性を確認した。その結果、ＨＢｓ
終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／
ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍ
ｌにおいて反応性が確認された。０ｎｇ／ｍｌの濃度で
は反応性は確認されなかった。

【００７４】〔実施例５〕分析装置の調製図１３は本実施例５で使用したストリップ状の分析装置
である。図１３のストリップにおいて、１０９はハイラ
ンド社製オーバーヘッドプロジェクター用フィルムであ
り、本実施例５の分析装置の補強用支持フィルムとして
用いた。該支持フィルム１０９上に、両面テープ（ニチ
バン社製）１０７を介して、該両面テープ１０７の両端
の部位を除いた全面に、ストリップ状のＳＰＨＦメンブ
レン１０２を貼着して展開要素を構成した。該ＳＰＨＦ
メンブレン１０２は前記実施例１の工程６と同様の処理
により調製したもので中間あたりの検出ゾーン１０６の
位置にペア１−を結合させたものである。

【００７５】該展開要素の一端に、ブロッキング剤（雪
印乳業（株）製ブロックエース）により予めブロッキ
ング処理を施した濾紙（アドバンテック社製）からなる
適用ゾーン１０１を設け、さらに該適用ゾーン１０１と
展開要素との間に試薬を含ませた封入ゾーン１０５を両
者に緊密に接触させて、適用された液体試料が移動可能
なように配置した。該封入ゾーン１０５は、ブロッキン
グ剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）により予め
ブロッキング処理を施したグラスペーパーシート（ミリ
ポア社製）で製造されており、該封入ゾーン１０５には
金コロイド標識化ウサギ抗ＨＢｓ−ＩｇＧ１０３が０．
１５μｇ、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧ１０４が一
定量含まれている。該金コロイド標識化ウサギ抗ＨＢｓ
−ＩｇＧ１０３は前記実施例１の工程３により調製した
ものであり、該ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧ１０４
は前記実施例１の工程４において調製したものである。
該展開要素の他端には、ＧＦからなる吸収ゾーン１０８
を配置した。このようにして得られたＨＢｓ抗原検出の
ための分析装置のストリップの幅は５ｍｍで、長さ６０
ｍｍであり、これを乾燥条件下保存した。

【００７６】分析例本実施例５の前記工程で得られたＨＢｓ抗原検出用の分
析装置の適用ゾーン１０１に、ＨＢｓ抗原１００ｎｇ／
ｍｌになるように調製したＭＰＢＳ１００μｌを添加
し、一方、別に用意した同じＨＢｓ抗原検出用の分析装
置の適用ゾーン１０１に、何も含まないＭＰＢＳ１００
μｌを添加した。それぞれの分析装置において３０分後
反応性を確認した。ＨＢｓ抗原１００ｎｇ／ｍｌを添加
したストリップは、検出ゾーン１０６に金コロイドの着
色が認められたが、ＭＰＢＳのみを添加したストリップ
については着色は認められなかった。

【００７７】〔実施例６〕分析装置の調製ナイロンメンブレン（ポール社製のバイオダインＣ）を
５ｘ１０ｃｍに切断し、２０％ＥＤＣ溶液中に１５分
間浸漬し、蒸留水で洗浄後、風乾し、活性化バイオダイ
ンＣを調製した。この活性化バイオダインＣに、前記実
施例１の工程１で調製した２０μｇ／ｍｌの濃度のアミ
ノ基−ペア１−をソフトペン（プラチナ万年筆（株）
製）に染み込ませて、５ｃｍの辺に対して２等分するよ
うに直角に線を引き、ペア１−をバイオダインＣに結合
させた。このバイオダインＣを蒸留水で洗浄した後、ブ
ロッキング剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）で
１時間ブロッキングを行い、再び蒸留水で洗浄後、風乾
させた。風乾後、ペーパーカッターにより、幅０．５ｃ
ｍ縦５ｃｍになるように切断し、一端にＧＦをホッチキ
スにより固定し、乾燥条件下で保存した。

【００７８】このうようにして得られたＨＢｓ抗原検出
のための分析装置に対して、ＭＰＢＳを用いて、前記実
施例１の工程４において調製した、ペア１＋標識化抗Ｈ
Ｂｓ−ＩｇＧを終濃度１．５４μｇ／ｍｌになるよう
に、また、前記実施例１の工程３において調製した金コ
ロイドは５２０ｎｍにおける吸光度が０．５になるよう
に調製した。

【００７９】分析例本実施例６の前記工程で得られたＨＢｓ抗原検出用の分
析装置の適用ゾーンに、ＨＢｓ抗原がそれぞれ終濃度２
０μｇ／ｍｌ、あるいは０ｎｇ／ｍｌになるように加
え、このうち１００μｌを試験管に分注した。本実施例
６の前記工程で調製したペア１−結合バイオダインＣ
を、ＧＦが上になるように速やかに投入し、反応性を確
認した。その結果、ＨＢｓ終濃度２０μｇ／ｍｌにおい
て反応性が確認された。０濃度では反応性は確認されな
かった。

【００８０】〔実施例７〕分析装置の調製リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬製ＰＢＳ（−））２０
ｍｌに１０ｍｇのアビジンを溶解し、５×１０ｃｍに切
断したＳＰＨＦメンブレンを室温で１時間浸し、蒸留水
で該メンブレンを洗浄した。洗浄後、風乾し、前記実施
例１の工程１で調製した２５８ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度の
ビオチン標識化ペア１−をソフトペン（プラチナ万年筆
（株）製）に染み込ませて、５ｃｍの辺に対して一端か
ら２ｃｍのところに直角に線を引き、ビオチン標識化ペ
ア１−をアビジン結合ＳＰＨＦメンブレンに結合させ
た。同様に、ビオチン標識化ペア８−をソフトペン（プ
ラチナ万年筆（株）製）に染み込ませて、５ｃｍの辺に
対して別の一端から２ｃｍのところに直角に線を引き、
ビオチン標識化ペア８−をアビジン結合ＳＰＨＦメンブ
レンに結合させた。ビオチン−アビジン結合により得ら
れたペア８−固相化ＳＰＨＦメンブレンを風乾した後、
ブロッキング剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）
によりブロッキングを室温にて３０分行い、蒸留水でメ
ンブレンを洗浄し、その後風乾した。風乾後、ペーパー
カッターにより幅０．５ｃｍ縦５ｃｍになるように切断
し、一端にワットマン社製グラスフィルター（以下Ｇ
Ｆ）をホッチキスにより固定し乾燥条件下保存して、本
実施例７で使用する分析装置とした。

【００８１】分析例リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬（株）製ＰＢＳ
（−））に０．１％ＢＳＡ、０．３５Ｍ塩化ナトリウ
ムを添加したＭＰＢＳを用いて、前記実施例１の工程４
において調製した、ペア１＋標識化抗ＨＢｓ−ＩｇＧお
よびペア８＋標識化抗ＣＲＰ−ＩｇＧがそれぞれ終濃度
１．５４μｇ／ｍｌになるように、また、前記実施例１
の工程３において調製した金コロイド標識化抗ＨＢｓ−
ＩｇＧおよび金コロイド標識化抗ＣＲＰ−ＩｇＧは、５
２０ｎｍにおける吸光度がそれぞれ０．５になるように
試験液溶液を調製した。

【００８２】本実施例７の前記工程で得られた試験溶液
に、ＨＢｓ抗原、ＣＲＰ抗原両方とも終濃度が１００ｎ
ｇ／ｍｌになるように加えたもの、ＨＢｓ抗原のみ終濃
度が１００ｎｇ／ｍｌになるように加えたもの、ＣＲＰ
抗原のみ終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように加えた
もの、両方の抗原とも含まないものの４種類の異なる検
体を準備し、このうち１００μｌをそれぞれ別の試験管
に分注した。本実施例７の前記工程で調製したペア８−
固相化ＳＰＨＦメンブレンからなる分析装置を、ＧＦが
上になるように速やかに投入し、反応性を確認した。そ
の結果、両者を含む検体はペア１−、ペア８−両方の結
合領域が着色した。ＨＢｓ抗原のみを含む検体は、ペア
１−結合領域のみが着色した。ＣＲＰ抗原のみを含む検
体は、ペア８−結合領域のみが着色した。また、両者と
も含まない検体は、ペア１−、ペア８−両方の結合領域
とも着色しなかった。

【００８３】〔実施例８〕分析装置の調製図１４〜図１６は本実施例８に使用した分析装置を示
し、図１４はその分析装置の長手方向切断面、図１５は
側面図、図１６は上面図を示す。図１４〜図１６におい
て２０１はプラスチック製のケースであり、上部ケース
２０２と、下部ケース２０３に分解できる。下部ケース
２０３に前記実施例５において調製したストリップ状の
分析装置を設置し、上部ケース２０３を被せて一体化さ
せた。

【００８４】さらに、該ストリップ状の分析装置の適用
ゾーンと検出ゾーンの位置に対応する上部ケース２０２
の部位には、それぞれ試料適用口２０４及び検出窓２０
５が空いている。該ケース２０１中に前記実施例５で調
製したストリップ状の分析装置が配設することによって
本実施例８のＨＢｓ抗原検出用分析装置を得た。このデ
バイスは乾燥条件下保存した。

【００８５】分析例本実施例８の前記工程で調製したＨＢｓ抗原検出用分析
装置の、試料適用口２０４にＨＢｓ抗原１００ｎｇ／ｍ
ｌになるように調製したＭＰＢＳ１００μｌを添加し、
および別に用意した同じＨＢｓ抗原検出用分析装置に対
して、何も含まないＭＰＢＳ１００μｌを添加し、それ
ぞれ３０分後に検出窓２０５から観察できるペア１−を
結合させた検出ゾーン１０６の反応性を確認した。ＨＢ
ｓ抗原１００ｎｇ／ｍｌを添加した分析装置の方は、金
コロイドの着色が認められたが、ＭＰＢＳのみを添加し
た分析装置については着色は認められなかった。

【００８６】〔比較例１〕本比較例１は抗体を結合子と
して検出ゾーンに固定化した従来法による検出感度と本
発明による検出感度の比較のためのものである。

【００８７】分析装置の調製０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗ＨＢｓ−ＩｇＧをソ
フトペン（プラチナ万年筆（株）製）に染み込ませて、
５×１０ｃｍに切断したメンブレン（ミリポア社製Ｓ
ＰＨＦメンブレン）の５ｃｍの辺に対して２等分するよ
うに直角に線を引き、物理吸着によりウサギ抗ＨＢｓ−
ＩｇＧをＳＰＨＦメンブレンに結合させた。風乾後、ブ
ロッキング剤（雪印乳業（株）製ブロックエース）によ
りブロッキングを室温で３０分間行い、蒸留水でメンブ
レンを洗浄し、ウサギ抗ＨＢｓ−ＩｇＧ結合ＳＰＨＦメ
ンブレンを調製した。風乾後、ペーパーカッターにより
幅０．５ｃｍ縦５ｃｍになるように切断し、一端にＧＦ
をホッチキスにより固定し乾燥条件下保存して本比較例
１の分析装置とした。なお、０．２ｍｇ／ｍｌを越える
濃度のウサギ抗ＨＢｓ−ＩｇＧを用いた場合は、非特異
反応が高くなるために、０．２ｍｇ／ｍｌのウサギ抗Ｈ
Ｂｓ−ＩｇＧを用いた。

【００８８】分析例従来法による検出感度は以下のような実験により評価し
た。すなわち、前記実施例１の工程３において調製した
金コロイドは５２０ｎｍにおける吸光度が０．５になる
ように試薬溶液を調製した。得られた試薬溶液に、ＨＢ
ｓ抗原がそれぞれ終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／
ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍ
ｌ、２．５ｎｇ／ｍｌあるいは０ｎｇ／ｍｌになるよう
に加えた。

【００８９】得られた各試薬−抗原混合液について１０
０μｌを各試験管に分注した。本比較例１の前記工程に
おいて調製した抗ＨＢｓ−ＩｇＧ結合ＳＰＨＦメンブレ
ンからなる本比較例１の分析装置を、ＧＦが上になるよ
うに、本比較例１の前記工程で調製した抗原溶液と試薬
混合溶液が収容されている試験管中に速やかに投入し、
反応性を確認した。その結果、ＨＢｓ終濃度１００ｎｇ
／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／
ｍｌにおいて反応性が確認された。１０ｎｇ／ｍｌ未満
の濃度では反応性は確認されなかった。

【００９０】一方、本発明による方法の検出感度は以下
のような実験により評価した。すなわち、ＭＰＢＳを用
いて、前記実施例１の工程５において調製した、ペア１
＋標識抗ＨＢｓ−Ｆａｂ’を終濃度１．５４μｇ／ｍｌ
になるように、また、前記実施例１の工程３において調
製した金コロイドは５２０ｎｍにおける吸光度が０．５
になるように試薬溶液を調製した。得られた試薬溶液に
ＨＢｓ抗原がそれぞれ終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎ
ｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／
ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌあるいは０ｎｇ／ｍｌになるよ
うに加えた。

【００９１】得られた各試薬−抗原混合溶液について１
００μｌを各試験管に分注した。前記実施例４において
調製した（ペア１−）＋（抗ＨＢｓ−ＩｇＧ）結合ＳＰ
ＨＦメンブレンを、ＧＦが上になるように速やかに投入
し、反応性を確認した。その結果、ＨＢｓ終濃度１００
ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎ
ｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌにおいて反
応性が確認された。０ｎｇ／ｍｌの濃度では反応性は確
認されなかった。

【００９２】以上の結果より、本発明による核酸を結合
子及び抗結合子とした分析装置による場合、従来の免疫
化学的活性物質を結合子及び抗結合子としたものよりも
４倍検出感度が高いことがわかった。

【００９３】

【発明の効果】本発明によれば、固相化された抗結合子
としての核酸と、生成された複合体に含まれる結合子と
しての核酸との相補的結合は、一致率が高く、安定性の
高い反応であり、免疫反応よりも強力に行えるために、
分析物を含む生物学的親和性物質複合体は効率よく固相
に結合させることができる。また、抗結合子としての核
酸の固相化において、他の物質、例えば、タンパク質等
の高分子等を介して核酸を結合させた場合、タンパク質
に比べて、小さい分子の核酸をタンパク質に結合するこ
とができ、しかも、タンパク質分子よりも多くの数の核
酸分子（抗結合子）を結合させることができる。したが
って、分析物を含む生物学的親和性物質複合体をより多
く捕獲することが可能となり、従来のイムノクロマト法
よりも高感度化が実現できる。

【００９４】本発明によれば、マーカー標識化第一配位
子と核酸標識化配位子と分析物との反応によって生成さ
れる複合体を、クロマト的に移動させて、検出ゾーンに
おいて捕獲してその量を測定或いはその存在を検出する
のに、固相化された核酸と、生成された複合体に含まれ
る核酸との相補的結合により捕獲しているので、１種類
以上乃至無限に近い数までの分析物を分析物の種類毎に
ゾーンを形成して測定或いは検出することができる。

【００９５】本発明の簡易臨床診断方法によれば、固相
化された核酸と、生成された複合体に含まれる核酸との
相補的結合において、相互の核酸の相補的塩基の一致率
を変化させることにより、分析物を測定又は検定すると
きの検出感度のコントロールの調整を簡略に行うことが
できる。このような特徴は、同時に複数項目を判定する
必要がある場合は、それぞれの項目の正常域、異常域が
異なっており、抗体の濃度、量を変化させるといったこ
とが必要とされるケースに特に有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】分析物が１種類以上を対象とした本発明の分析
キットの構成要素の一方である試薬の一例を模式的に示
す。

【図２】本発明の分析キットの構成要素の他方である分
析装置の一例を模式的に示す。

【図３】図１及び図２に示される分析キットを用いた簡
易臨床診断方法により、マーカー標識化免疫複合体が分
析物の種類毎に捕獲された様子を模式的に示す。

【図４】本発明の分析装置の別の態様を示し、試薬が装
置の中に乾燥状態で一体となって含まれている分析装置
である。

【図５】図４の分析装置の使用例として、目的とする分
析物を抗原Ａ、抗原Ｂ、抗体Ｃとする場合に、分析装置
の封入ゾーン１８に乾燥状態で含まれている試薬の構成
を示す。

【図６】図４に示される分析装置を用いた簡易臨床診断
方法により、マーカー標識化免疫複合体が分析物の種類
毎に捕獲された様子を模式的に示す。

【図７】分析物が核酸である場合において、本発明に従
って、検出ゾーンで核酸が捕獲される原理を示し、分析
物はオリゴヌクレオチドＯＮ3 とオリゴヌクレオチドＯ
Ｎ2 をその配列中に含む核酸である。

【図８】分析物が抗原であり、抗原を検出するための分
析装置として、検出ゾーンにおいて、ＩｇＧ抗体に抗結
合子として核酸が導入された核酸標識化ＩｇＧ抗体が不
溶性担体に固定されている場合を示す。

【図９】図８に示す検出ゾーンにおいて、サンドイッチ
免疫複合体が捕獲された状態を示す。

【図１０】アビジンを物理吸着により検出ゾーンに固相
化してなるア固相化アビジンに対して、核酸にビオチン
を導入してなるビオチン化核酸を結合させることによ
り、核酸をビオチン−アビジンの反応により固相化した
ものである。

【図１１】図１０に示すビオチン−アビジンの反応によ
り固相化した核酸とは別の態様の固相化核酸を示し、図
１０に示す核酸−ビオチン−アビジン複合体にさらに、
核酸−ビオチン−アビジン複合体を核酸の相補的結合に
より結合させて核酸を固相化したものである。

【図１２】本発明の分析装置としてのテストストリップ
をケースに収容する手段を示す。

【図１３】実施例５で使用したストリップ状の分析装置
を示す。

【図１４】実施例８に使用した分析装置を示し、その分
析装置の長手方向切断面である。

【図１５】実施例８に使用した分析装置を示し、その分
析装置の側面面である。

【図１６】実施例８に使用した分析装置を示し、その分
析装置の上面図である。

【符号の説明】

１，１１展開要素２，１２適用ゾーン３，１３吸収ゾーン４，１４検出ゾーン５，１５第１検出ゾーン６，１６第２検出ゾーン７，１７第３検出ゾーン１８封入ゾーン１９ＩｇＧ抗体２０，２４，２７，２８核酸２１核酸標識化抗体２２抗原２３マーカー標識化抗体２５アビジン２６ビオチン２９ケース３０試料適用口３１検出窓４１抗結合子４２核酸標識化配位子４３分析物４４マーカー標識化配位子１０１適用ゾーン１０２ＳＰＨＦメンブレン１０３金コロイド標識化ウサギ抗ＨＢｓ−ＩｇＧ１０４ペア＋標識化抗ＨＢｓＩｇＧ１０５封入ゾーン１０６検出ゾーン１０７両面テープ１０８吸収ゾーン１０９支持フィルム２０１ケース２０２上部ケース２０３下部ケース２０４試料適用口２０５検出窓

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年９月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ 33/547 33/547

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体試料中に存在する１種類以上の分析
物の量を測定あるいは有無を検定する分析方法であっ
て、（１）第一配位子にマーカーが結合されてなる１種類以
上のマーカー標識化配位子を含み、且つ第二配位子に分
析物の種類に応じて予め決定された塩基配列を有する核
酸である結合子が結合されてなる１種類以上の結合子標
識化配位子を含む試薬と、１種類以上の分析物を含む液体試料を接触させて、特定
の種類の分析物、該分析物に対して特異的に結合する特
定の種類のマーカー標識化配位子、及び該分析物に対し
て特異的に結合する特定の種類の結合子標識化配位子か
らなる特定の種類の複合体を１種類以上形成させるこ
と、（２）形成された１種類以上の複合体を、シート状の展
開要素中に毛管現象により展開させること、（３）前記複合体中の結合子に対して相補的な塩基配列
を有する核酸からなる抗結合子が種類毎に独立して前記
展開要素上に固定されてなる検出ゾーンにおいて、前記
結合子と前記抗結合子間の相補的結合により分析物の種
類毎に前記複合体を捕獲して各々独立した帯を形成させ
ること、（４）前記検出ゾーンで形成された帯に含まれるマーカ
ーを測定又は検定することを含むこと、からなる分析方
法。
【請求項２】液体試料中に存在する１種類以上の分析
物の量を測定あるいは有無を検定する分析方法であっ
て、（１）１種類以上の分析物を含む液体試料をシート状の
展開要素に適用して、展開要素中を毛管現象により展開
させること、（２）分析物の特定の種類に対して特異的に反応するこ
とができる第一配位子にマーカーが結合されてなる１種
類以上のマーカー標識化配位子、及び分析物の特定の種
類に対して特異的に反応することができる第二配位子に
分析物の種類に応じて予め決定された塩基配列を有する
核酸である結合子が結合されてなる１種類以上の結合子
標識化配位子を含む試薬成分が封入されている封入ゾー
ンに前記液体試料を移動させ接触させること、（３）前記試薬と液体試料との接触により形成された、
特定の種類の分析物、該分析物に対して特異的に結合す
る特定の種類のマーカー標識化配位子、及び該分析物に
対して特異的に結合する特定の種類の結合子標識化配位
子からなる特定の種類の複合体の１種類以上、或いは形
成されつつある反応物を毛管現象により該展開要素中に
展開させること、（４）前記複合体中の結合子に対して相補的な塩基配列
を有する核酸からなる抗結合子が種類毎に独立して前記
展開要素上に固定されてなる検出ゾーンにおいて、前記
結合子と前記抗結合子間の相補的結合により分析物の種
類毎に形成された前記複合体を捕獲して各々独立した帯
を形成させること、（５）前記検出ゾーンで形成された帯に含まれるマーカ
ーを測定又は検定することを含むこと、からなる分析方
法。
【請求項３】分析物を測定又は検定するときの検出感
度のコントロールは結合子と抗結合子を構成する互いの
核酸の塩基配列の相補的な一致率をコントロールするこ
とによって行う請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項４】前記第一配位子及び第二配位子が免疫化
学的活性物質である請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項５】前記第一配位子と第二配位子が同一の反
応性を有する物質である請求項１又は２記載の分析方
法。
【請求項６】前記第一配位子と第二配位子が異なる反
応性を有する物質である請求項１又は２記載の分析方
法。
【請求項７】前記第一配位子及び第二配位子が核酸で
あり、該第一配位子が分析物としての核酸と少なくとも相補的
に結合できる塩基配列を有し、該第二配位子が分析物としての核酸と少なくとも相補的
に結合できる塩基配列を有することを特徴とする請求項
１又は２記載の分析方法。
【請求項８】前記展開要素上に固定されている抗結合
子の固定手段は、抗結合子の５’末端、３’末端又は該
抗結合子を構成する核酸の塩基に導入された官能基を介
して、展開要素としての不溶性支持体の官能基と共有結
合させたものである請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項９】前記展開要素上に固定されている抗結合
子の固定手段は、抗結合子の５’末端或いは３’末端に
導入されたビオチン又は該抗結合子を構成する核酸の塩
基に導入されたビオチンを介して、展開要素としての不
溶性支持体に予め固定させたアビジン又はストレプトア
ビジンと結合させたものである請求項１又は２記載の分
析方法。
【請求項１０】前記展開要素上に固定されている抗結
合子の固定手段は、抗結合子の５’末端、３’末端又は
該抗結合子を構成する核酸の塩基に導入された官能基を
介してタンパク質と結合されてなる核酸結合タンパク質
を、展開要素としての不溶性支持体に結合させたもので
ある請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項１１】前記核酸結合タンパク質は、核酸を牛
血清アルブミンに結合させたものである請求項１０記載
の分析方法。
【請求項１２】前記核酸結合タンパク質は、核酸を免
疫グロブリンに結合させたものである請求項１０記載の
分析方法。
【請求項１３】前記タンパク質は、分析物に対して免
疫化学的活性を有するものである請求項１０又は１２記
載の分析方法。
【請求項１４】前記マーカーが金属コロイド、着色ラ
テックス及び着色リポソームから選ばれたものである請
求項１又は２記載の分析方法。
【請求項１５】試料中に存在する１種類以上の分析物
の量の測定或いは有無を検定するための分析キットであ
って、該キットは、試薬、及び該試薬とは別体の分析装
置から構成され、前記試薬は、分析物の特定の種類に対して特異的に反応
することができる第一配位子にマーカーが結合されてな
る１種類以上のマーカー標識化配位子、及び分析物の特
定の種類に対して特異的に反応することができる第二配
位子に分析物の種類に応じて予め決定された塩基配列を
有する核酸からなる結合子が結合されてなる１種類以上
の結合子標識化配位子を含む試薬であり、前記分析装置は、シート状の展開要素を有し、該展開要
素は毛管現象により、分析物、試薬、及び分析物と試薬
の結合物を展開でき、前記別体の試薬に含まれる結合子
に対して相補的な塩基配列を有する核酸からなる１種類
以上の抗結合子が、種類毎に独立して該展開要素の検出
ゾーンに固定されてなるものであり、該検出ゾーンにお
いて、該結合子との核酸の相補的結合により分析物の種
類毎に複合体を捕獲して各々独立した帯を形成させるこ
とができる分析キット。
【請求項１６】請求項１５記載の診断キットに使用さ
れる分析装置。
【請求項１７】試料中に存在する１種類以上の分析物
の量の測定或いは有無を検定するための分析装置であっ
て、該装置は、（１）毛管現象により、分析物、試薬、及び分析物と試
薬の結合物を展開できるシート状の展開要素、（２）前記シート状の展開要素の一端に位置し、液体試
料を外部から受入れ可能で、受入れた液体試料を他方端
に達するのに充分な供給能力を持ち、後記する試薬が封
入された封入ゾーンに対して分析すべき液体試料を供給
することが可能で、該液体試料を外部から受け入れるた
めの適用ゾーン、（３）分析物の特定の種類に対して特異的に反応するこ
とができる第一配位子にマーカーが結合されてなる１種
類以上のマーカー標識化配位子、及び分析物の特定の種
類に対して特異的に反応することができる第二配位子に
分析物の種類に応じて予め決定された塩基配列を有する
核酸からなる結合子が結合されてなる１種類以上の結合
子標識化配位子を含む試薬が含まれている前記展開要素
の前記適用ゾーンに近い位置に配置された封入ゾーン、（４）前記展開要素中を拡散してきた分析物、試薬、及
び分析物と試薬の結合物を受け入れることができ、且つ
前記適用ゾーンとは離れた位置に配置された吸水ゾー
ン、（５）前記封入ゾーンと前記吸水ゾーンとの間に位置
し、前記結合子に対して相補的な塩基配列を有する抗結
合子が１種類以上独立して固定されており、分析物の種
類毎にマーカー標識化配位子、分析物、及び結合子標識
化配位子から形成された複合体を捕捉して検出できる検
出ゾーン、を含む分析装置。
【請求項１８】前記第一配位子及び第二配位子が免疫
化学的活性物質である請求項１６又は１７記載の分析装
置。
【請求項１９】前記第一配位子及び第二配位子が同一
の反応性を有する物質である請求項１６又は１７記載の
分析装置。
【請求項２０】前記第一配位子及び第二配位子が異な
る反応性を有する物質である請求項１６又は１７記載の
分析装置。
【請求項２１】前記第一配位子及び第二配位子が核酸
であり、該第一配位子が分析物としての核酸と少なくとも相補的
に結合できる塩基配列を有し、該第二配位子が分析物としての核酸と少なくとも相補的
に結合できる塩基配列を有することを特徴とする請求項
１６又は１７記載の分析装置。
【請求項２２】前記展開要素上に固定されている抗結
合子の固定手段は、抗結合子の５’末端、３’末端又は
該抗結合子を構成する核酸の塩基に導入された官能基を
介して、展開要素としての不溶性支持体の官能基と共有
結合させたものである請求項１６又は１７記載の分析装
置。
【請求項２３】前記展開要素上に固定されている抗結
合子の固定手段は、抗結合子の５’末端或いは３’末端
に導入されたビオチン又は該抗結合子を構成する核酸の
塩基に導入されたビオチンを介して、展開要素としての
不溶性支持体に予め固定させたアビジン又はストレプト
アビジンと結合させたものである請求項１６又は１７記
載の分析装置。
【請求項２４】前記展開要素上に固定されている抗結
合子の固定手段は、抗結合子の５’末端、３’末端又は
該抗結合子を構成する核酸の塩基に導入された官能基を
介してタンパク質と結合されてなる核酸結合タンパク質
を、展開要素としての不溶性支持体に結合させたもので
ある請求項１６又は１７記載の分析装置。
【請求項２５】前記核酸結合タンパク質は、核酸を牛
血清アルブミンに結合させたものである請求項２４記載
の分析装置。
【請求項２６】前記核酸結合タンパク質は、核酸を免
疫グロブリンに結合させたものである請求項２４記載の
分析装置。
【請求項２７】前記タンパク質は、分析物に対して免
疫化学的活性を有するものである請求項２４又は２６記
載の分析装置。
【請求項２８】前記マーカーが金属コロイド、着色ラ
テックス及び着色リポソームから選ばれたものである請
求項１６又は１７記載の分析装置。
【請求項２９】請求項１６又は１７記載の分析装置が
不透湿性固体材料からなるケース中に配置されている分
析装置。