JP2021528068A - 全lnaオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 8〜15個のロック核酸(=LNA)モノマーからなる第1の一本鎖(=ss−)オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第1のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第1の核酸塩基配列を形成するステップ;
(b) 8〜15個のLNAモノマーからなる第2のss−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第2のss−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第1のss−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの第2の核酸塩基配列を形成し、前記第2の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第1の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び理論的には、前記第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測すること、前記二本鎖は、8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ;
(c)等モル量の第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドを水溶液中で20℃〜40℃の温度、20分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりss−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ;続いて、
(d) ステップ(c)で得られた前記混合物を20℃〜40℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、及び前記分離されたssオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ;続いて、
(e)ステップ(d)で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がss−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ;
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法を提供する。
各オリゴヌクレオチドは、8〜15個のロック核酸(=LNA)モノマーからなり、各モノマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドの第1の核酸塩基配列及び前記第2のオリゴヌクレオチドの第2の核酸塩基配列を形成する前記モノマーの核酸塩基を含み、
前記第1の核酸塩基配列及び前記第2の核酸塩基配列は、前記第1のオリゴヌクレオチド及び前記第2のオリゴヌクレオチドが、20℃〜40℃の温度で8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
及び前記結合対は、本明細書に開示される第1の態様による方法によって得られる組成物を提供する。
(a)8〜15個のロック核酸(=LNA)モノマーからなる第1の一本鎖(=ss−)オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第1のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第1の核酸塩基配列を形成するステップ;
(b)8〜15個のLNAモノマーからなる第2のss−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第2のss−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第1のss−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第2の核酸塩基配列を形成し、前記第2の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第1の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び相補性として、前記第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測すること、前記二本鎖は、8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ;
(c)等モル量の第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドを水溶液中で20℃〜40℃の温度、20分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりss−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ;続いて、
(d)ステップ(c)で得られた前記混合物を20℃〜40℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、存在する場合は、及び前記分離されたssオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ;続いて、
(e)ステップ(d)で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がss−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ;
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法を提供する。
5’gcctgacg3’及び5’cgtcaggc3’、
5’ctgcctgacg3’及び5’cgtcaggcag3’、
5’gactgcctgacg3’及び5’cgtcaggcagtc3’、
5’tgctcctgt3’及び5’acaggagca3’、
5’gtgcgtct3’及び5’agacgcac3’、
5’gttggtgt3’及び5’acaccaac3’、
5’caacacaccaac3’及び5’gttggtgtgttg3’、
5’acacaccaac3’及び5’gttggtgtgt3’、
5’acaccaac3’及び5’gttggtgt3’
LNAオリゴヌクレオチドの合成
すべてのホスホロアミダイトは、DNAグレードのアセトニトリルに0,1Mの濃度で適用された。LNAオリゴヌクレオチドの組み立てには、延長したカップリング時間(180秒)、延長した酸化(45秒)、脱トリチル化時間(85秒)での標準DNAサイクル、及び標準合成試薬と溶媒を使用した。5’−ビオチン化LNAオリゴヌクレオチドは合成されたDMToffであったが、未修飾のLNAオリゴヌクレオチドはDMTonとして合成された。次に、標準的な切断プログラムを適用して、濃縮アンモニアによって、支持体からLNAオリゴヌクレオチドの切断を行った。残留保護基は、濃縮アンモニアでの処理によって切断された(56℃で8時間)。粗LNAオリゴヌクレオチドを蒸発させ、RP HPLC(カラム:PRP−1、7μm、250×21.5mm(Hamilton、part no.79352)又はXBridge BEH C18 OBD、5μm、10x250mm(Waters part no.186008167)で、0,1M酢酸トリエチルアンモニウム pH7/アセトニトリルグラジエントを使用して、精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析(MWCO 1000、SpectraPor 6、part no.132638)によって3日間脱塩し、それによってDMTon精製オリゴヌクレオチドのDMTグループも切断した。最後に、LNAオリゴヌクレオチドを凍結乾燥した。
a)一般的な方法:
LNA1:5’−tgctcctg−3’
LNA2:5’−Bi−Heg−caggagca−3’
Heg=ヘキサエチレングリコール
Bi=ビオチンの吉草酸部分のカルボキシ機能を介して付着したビオチンラベル
結果を図に示す。
LNA3:5’−ctgcctgacg−3’
LNA4:5’−Bi−Heg−cgtcaggcag−3’
結果を図に示す。
Claims (21)
- 結合対を提供する方法であって、前記結合対は、第1の一本鎖LNAオリゴヌクレオチドと第2の一本鎖LNAオリゴヌクレオチドからなり、前記2個のオリゴヌクレオチドは、20℃〜40℃の温度で、8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、
(a)8〜15個のロック核酸(=LNA)モノマーからなる第1の一本鎖(=ss−)オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第1のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第1の核酸塩基配列を形成するステップ;
(b)8〜15個のLNAモノマーからなる第2のss−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第2のss−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第1のss−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、前記第2のss−オリゴヌクレオチドの第2の核酸塩基配列を形成し、前記第2の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第1の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び理論的には、前記第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を示すこと、前記二本鎖は、8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ;
(c)等モル量の第1及び第2のss−オリゴヌクレオチドを水溶液中で20℃〜40℃の温度、20分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりss−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ;続いて、
(d)ステップ(c)で得られた前記混合物を20℃〜40℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、存在する場合は、及び前記分離されたssオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ;続いて、
(e)ステップ(d)で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がss−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ;
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法。 - 前記第1のss−オリゴヌクレオチドが、5〜9個のモノマーからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のss−オリゴヌクレオチドが、6個のモノマーからなる、請求項2に記載の方法。
- 各LNAモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、7−デアザグアニン、及び7−デアザアデニンからなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)において、前記温度が20℃〜37℃である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)の前に、前記第1のss−オリゴヌクレオチド及び前記第2のss−オリゴヌクレオチドが、−80℃〜40℃の温度で、具体的には20℃〜40℃、より具体的には20℃〜37℃の温度で保たれる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)において、前記インキュベーションが、1分以下で行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)において、前記水溶液が、前記溶液のpHをpH6〜pH8に、より具体的にはpH6.5〜pH7.5に維持する緩衝液を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)において、前記水溶液が、10mmol/L〜500mmol/L、より具体的には200mmol/L〜300mmol/の溶解物質の総量を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- ステップ(d)が、ステップ(c)の前記インキュベートされた混合物を、移動相として水性溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーに供することを含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- (a)及び(b)の前記ss−オリゴヌクレオチドが、ベータ−D−LNAモノマーからなる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- (a)及び(b)の前記ss−オリゴヌクレオチドが、ベータ−L−LNAモノマーからなる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 水性溶媒と、第1の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第2の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対とを含む液体組成物であって、
各オリゴヌクレオチドは、8〜15個のロック核酸(=LNA)モノマーからなり、各モノマーは核酸塩基を含み、前記モノマーの核酸塩基は前記第1のオリゴヌクレオチドの第1の核酸塩基配列及び前記第2のオリゴヌクレオチドの第2の核酸塩基配列を形成し、
前記第1の核酸塩基配列及び前記第2の核酸塩基配列は、前記第1のオリゴヌクレオチド及び前記第2のオリゴヌクレオチドが、20℃〜40℃の温度で8〜15個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
及び、前記結合対は、項目1〜12のいずれかに記載の方法によって得ることができる組成物。 - 各オリゴヌクレオチドが、8〜15個のLNAモノマーからなり、
前記第1の核酸塩基配列及び前記第2の核酸塩基配列は、前記第1のオリゴヌクレオチド及び前記第2のオリゴヌクレオチドが、20℃〜40℃の温度で5〜9個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
前記結合対は、項目2〜12のいずれかに記載の方法によって得ることができる、
項目13に記載の組成物。 - 各オリゴヌクレオチドが、9〜15個のLNAモノマーからなり、
前記第1の核酸塩基配列及び前記第2の核酸塩基配列は、前記第1のオリゴヌクレオチド及び前記第2のオリゴヌクレオチドが、20℃〜40℃の温度で9個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
前記結合対は、項目3〜12のいずれかに記載の方法によって得ることができる、
項目14に記載の組成物。 - 各LNAモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び5−メチルシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む、項目13〜15のいずれかに記載の組成物。
- 各ss−オリゴヌクレオチドが、2個または3個の異なる核酸塩基を含む、項目13〜16のいずれかに記載の組成物。
- 各ss−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基の中で、G+C含有量が、75%未満である、項目17に記載の組成物。
- 各ss−オリゴヌクレオチドの核酸塩基のうち、各シトシンが、5−メチルシトシンに置換されている、項目17及び18のいずれかに記載の組成物。
- 分析物特異的受容体及び固相を含む不均一イムノアッセイにおける、結合対を有する組成物の使用であって、前記組成物は、請求項13〜19のいずれかに記載される組成物であり、前記結合対が、固相上に分析物特異的受容体を固定化する使用。
- 分析物を検出するための不均一イムノアッセイを実施するためのキットであって、前記キットは、別個の容器中に、請求項13から19のいずれかに記載の前記結合対の前記第1の一本鎖オリゴヌクレオチドが付着した固相、及び請求項13から19のいずれかに記載の前記結合対の前記第2の一本鎖オリゴヌクレオチドが付着した分析物特異的受容体を含むキット。
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