BR112020026073A2 - método para fornecer um par de ligação, composição líquida, uso de uma composição e kit para realizar um imunoensaio heterogêneo - Google Patents

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Abstract

O presente relatório refere-se à hibridização de oligonucleotídeos de fita simples (ss-) que consistem inteiramente em monômeros de ácido nucleico bloqueado (LNA). O presente documento mostra experiências de hibridização com pares de ss-oligonucleotídeos totalmente complementares que não formam um duplex dentro de um determinado intervalo de tempo. O presente relatório fornece métodos para identificar esses pares de oligonucleotídeos incompatíveis. Em outro aspecto, o presente relatório fornece pares de ss-oligonucleotídeos complementares que são capazes de rápida formação de duplex. O presente relatório também fornece métodos para identificar e selecionar pares de oligonucleotídeos compatíveis. Em ainda outro aspecto, o presente relatório fornece o uso de pares de oligonucleotídeos compatíveis como parceiros de ligação em ensaios de ligação, por exemplo, imunoensaios.

Description

“MÉTODO PARA FORNECER UM PAR DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO LÍQUIDA, USO DE UMA COMPOSIÇÃO E KIT PARA REALIZAR UM IMUNOENSAIO HETEROGÊNEO”
[0001] O presente relatório refere-se à hibridização de oligonucleotídeos de fita simples (ss-) que consistem inteiramente em monômeros de ácido nucleico bloqueado (LNA). O presente documento mostra experimentos de hibridização com pares de ss-oligonucleotídeos totalmente complementares que, inesperadamente, falham em formar um duplex dentro de um determinado intervalo de tempo. O presente relatório fornece métodos eficientes para identificar esses pares de oligonucleotídeos incompatíveis. Em outro aspecto, o presente relatório fornece pares de oligonucleotídeos de fita simples complementares que consistem inteiramente em monômeros de ácido nucleico bloqueado (LNA) que são capazes de rápida formação de duplex, surpreendentemente na ausência de desnaturação prévia. O presente relatório também fornece métodos para identificar e selecionar esses pares de oligonucleotídeos inteiramente de LNA compatíveis. Em ainda outro aspecto, o presente relatório fornece o uso de pares de oligonucleotídeos compatíveis como parceiros de ligação em ensaios bioquímicos, por exemplo, ensaios de ligação, imunoensaios. Modalidades específicas são discutidas em quais pares de oligonucleotídeos de LNA compatíveis são empregados para imobilizar diferentes moléculas alvo, por exemplo, uma molécula de captura específica de analito, em um ensaio para detectar ou determinar um analito em uma amostra.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] O foco particular é direcionado para aplicações bioquímicas gerais nas quais a interação específica dos dois parceiros de um par de ligação e sua eventual conexão um com o outro tem um papel funcional. Muito frequentemente, em imunoensaios heterogêneos, o par de ligação biotina: (estrept)avidina é usada para imobilizar um receptor de captura específico do analito em uma fase sólida. O presente relatório conceitua, explica e demonstra pares de ligação alternativos que são adequados para imunoensaios, entre outras aplicações. Especificamente, um par de ligação alternativo, feito de dois oligonucleotídeos de fita simples inteiramente de LNA capazes de formar um duplex por meio de hibridização, fornece uma alternativa técnica para a biotina: par de ligação de (estrept)avidina.
[0003] Um foco principal da presente divulgação são os meios com os quais, no decurso de um imunoensaio, o receptor de captura é ancorado na fase sólida. Em particular, a presente divulgação se concentra em um par de ligação que facilita a imobilização de um receptor de captura na presença de uma amostra contendo o analito e/ou que é capaz de ancorar um complexo de detecção após o complexo ter se formado. Um par de ligação em um imunoensaio é tecnicamente necessário para ter características específicas. Assim, a interação dos dois parceiros de ligação deve ser específica. Além disso, deseja-se que a cinética de formação da conexão, ou seja, a velocidade com que os dois parceiros separados do par de ligação interagem e eventualmente se associam, isto é, ligam-se um ao outro, seja alta.
Além disso, deseja-se que a conexão dos dois parceiros de ligação seja estável, uma vez formada. Além disso, os parceiros de ligação devem ser passíveis de conjugação química com outras moléculas, como receptores específicos de analito e superfícies de fase sólida, para sua aplicação em imunoensaios. É importante observar que em receptores de imunoensaios e tipicamente também os analitos a serem detectados retêm sua conformação e função apenas sob certas condições que podem diferir dependendo do receptor ou analito particular que está sob consideração específica; assim, uma molécula receptora ou um analito pode tolerar apenas um desvio limitado dessas condições. Tais condições podem compreender (mas não estão limitadas a) uma solução aquosa tamponada com um pH na faixa de cerca de pH 6 a cerca de pH 8, um ou mais sais dissolvidos, uma ou mais substâncias auxiliares, uma quantidade total de solutos de cerca de 250 a cerca de 400 mosm/kg, a uma temperatura pré-selecionada na faixa de 20°C a 40°C, para citar apenas alguns.
[0004] Os parceiros separados de um par de ligação devem ser passíveis de conjugação, especificamente conjugação com moléculas de captura, isto é, receptores, e conjugação com superfícies de fase sólida, sem perder sua capacidade de se associarem e se ligarem uns aos outros, especificamente. No que diz respeito aos conjugados em imunoensaios, cada parceiro de ligação separado do par de ligação alternativo deve ser funcional sob as condições do ensaio. O mesmo raciocínio se aplica a todos os outros materiais desejados para conjugação com um parceiro de ligação, tais como, mas não se limitando a, um analito, um material transportador, uma fase sólida e outras substâncias ou compostos que podem estar presentes durante o curso de um ensaio.
[0005] Oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares, isto é, oligonucleotídeos capazes de formar um duplex por meio de hibridização, foram propostos anteriormente como meios de par de ligação para conectar macromoléculas ou para anexar moléculas a uma fase sólida. EP 0488152 divulga um imunoensaio heterogêneo com uma fase sólida em que um anticorpo de captura específico do analito é imobilizado por um duplex de ácido nucleico que conecta o anticorpo e a fase sólida. Uma modalidade é mostrada onde um oligonucleotídeo hibridizado é ligado ao anticorpo e o oligonucleotídeo complementar é ligado à fase sólida, formando assim um duplex de conexão. Descrições semelhantes são fornecidas nos documentos EP 0698792, WO 1995/024649, WO 1998/029736 e EP 0905517. WO 2013/188756 divulga métodos de citometria de fluxo e uma composição compreendendo um anticorpo conjugado a um primeiro oligonucleotídeo, uma oligosfera conjugada a um segundo oligonucleotídeo tendo uma sequência idêntica àquela do primeiro oligonucleotídeo e uma sonda de oligonucleotídeo com um marcador e uma terceira sequência que é complementar ao primeiro e ao segundo oligonucleotídeos. Em uma modalidade específica, a oligosfera é magnética. O documento relata usos específicos de oligosferas como referências em procedimentos de padronização.
[0006] Oligonucleotídeos modificados, tais como ácido nucleico de peptídeo (PNA) e ácido nucleico bloqueado (LNA), foram explorados para aplicações fisiológicas. O LNA possui um ligante de metileno entre o 2'-oxigênio e o 4'-carbono da porção ribose que, consequentemente, bloqueia o açúcar em uma conformação C3-endo, por isso o nome “ácido nucleico bloqueado”. Esta modificação química confere resistência à nuclease, bem como maior afinidade e maior especificidade para alvos de oligonucleotídeo em aplicações técnicas envolvendo formação de duplex por hibridização. WO 1998/39352 divulga estruturas de ácido nucleico bloqueado (LNA). WO 2000/056746 divulga a síntese de monômeros de LNA incluindo produtos intermediários para certos estereoisômeros de LNA. Por meio de síntese química, fitas simples que consistem apenas em monômeros análogos de nucleosídeo de LNA ("inteiramente de LNA") podem ser sintetizadas.
[0007] Como mencionado acima, o monômero de ácido nucleico bloqueado (LNA) é um análogo de nucleotídeo conformacionalmente restrito com uma ponte 2'-O,4'-C- metileno extra adicionada ao anel de ribose. Os monômeros de LNA são fornecidos como monômeros de nucleosídeo 2'-O,4'- C-metileno-(D-ribofuranosil) (Singh SK et al. Chem. Commun. 4 (1998) 455- 456; Koskin AA et al. Tetrahedron 54 ( 1998) 3607-3630; Wengel J. Acc. Chem.
Res. 32 (1999) 301-310). WO2000/066604 e WO2000/056746 revelam certos estereoisômeros de monômeros de nucleosídeo de LNA. Os oligonucleotídeos mistos de DNA-LNA que contêm monômeros de DNA e LNA mostraram estabilidade em relação à degradação 3'-exonucleolítica e estabilidade térmica bastante aumentada quando hibridizados com DNA e RNA complementares.
Na verdade, em comparação com outros imitadores de ácido nucleico de alta afinidade que foram sintetizados, por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs), ácidos nucleicos de hexitol (HNAs) e 2'-fluoro N3'-fosforamidatos, LNA exibe afinidades de ligação excepcionais. A cinética de hibridização de oligonucleotídeos mistos de LNA-DNA, também conhecidos como "misturadores", foi relatada por Christensen U. et al. (Biochem J 354 (2001) 481-484). Uma estrutura cristalina de um duplex de dois ss-oligonucleotídeos complementares, cada um consistindo em 7 monômeros de LNA, foi relatada por Eichert A. et al. (Nucleic Acids Research 38 (2010) 6729–6736).
[0008] WO 1999/14226 sugere a utilização de LNA na construção de pares de afinidade para ligação a moléculas de interesse e suportes sólidos. No entanto, também é conhecido na técnica que a hibridização de fitas simples complementares inteiramente de LNA causa problemas técnicos. A análise termodinâmica da hibridização inteiramente de LNA é amplamente empírica e a previsão da sequência de monômeros de hibridização sem uma etapa de desnaturação anterior (por exemplo, aquecimento antes da hibridização) não parece ser possível, até agora.
[0009] Para a maior parte, os oligonucleotídeos mistos de LNA- DNA (também chamados de "fitas simples misturadoras" ou "misturadores") foram analisados até agora. Poucos relatórios da caracterização de oligonucleotídeos de fita simples hibridantes feitos exclusivamente de monômeros de LNA (ou seja, oligonucleotídeos de fita simples "inteiramente de LNA") foram publicados, até agora, particularmente por Koshkin AA et al. (J Am Chem Soc 120 (1998) 13252-13253) e Möhrle B.P. et al. (Analyst 130 (2005) 1634–1638). Eze N.A. et al. (Biomacromolecules 18 (2017) 1086−1096) relatam taxas de associação de misturadores DNA-LNA e sondas de DNA abaixo de
105 M-1 s-1. Segundo esses autores, a cinética de hibridização em solução não parece ser afetada pela substituição de um ou mais monômeros de DNA por monômeros de LNA, considerando um terço dos monômeros disponíveis para substituição.
[00010] As previsões relativas ao comportamento termodinâmico de oligonucleotídeos contendo LNA são auxiliados por programas de computador dedicados referidos por Tolstrup N et al. (Nucleic Acids Research 31 (2003) 3758-3762). No entanto, este relatório menciona explicitamente um maior erro de previsão para os oligonucleotídeos de LNA devido às propriedades mais complexas desses oligonucleotídeos, ao invés da falta de dados experimentais. Especificamente, o presente relatório demonstra que os ss-oligonucleotídeos complementares consistindo em 8 ou mais monômeros de LNA são imprevisíveis no que diz respeito à sua capacidade de formar moléculas duplex com emparelhamento de bases Watson-Crick.
[00011] Um objetivo geral do presente relatório é, portanto, a identificação e fornecimento de pares de ligação de oligonucleotídeos de fita simples inteiramente de LNA que são capazes de hibridizar, formando assim moléculas duplex com emparelhamento de bases Watson-Crick. Mais especificamente, procuram-se pares de ligação que sejam capazes de formação de duplex em condições não desnaturantes, mais especificamente sob condições que são compatíveis com a função de receptores específicos de analito em um ensaio de detecção de analito (tal como, mas não limitado a, um imunoensaio) É importante ressaltar que procuram-se oligonucleotídeos de fita simples inteiramente de LNA que possam ser armazenados e hibridizados uns com os outros em solução aquosa à temperatura ambiente, tal como, mas não se limitando a, temperatura ambiente, sem uma etapa de aquecimento intermitente para remover quaisquer estruturas secundárias intramoleculares que poderiam causar incompatibilidade de hibridização dos oligonucleotídeos complementares.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[00012] A presente divulgação, em um primeiro aspecto sendo relacionado a todos os outros aspectos e modalidades como aqui divulgados, fornece um método para fornecer um par de ligação, o par de ligação consistindo em um primeiro oligonucleotídeo de LNA de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de LNA de fita simples, sendo os dois oligonucleotídeos capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, o método compreendendo as etapas de: (a) fornecer um primeiro oligonucleotídeo de fita simples (= ss-) consistindo em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases do primeiro ss- oligonucleotídeo formando uma primeira sequência de nucleobase; (b) fornecer um segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em 8 a 15 monômeros de LNA, o segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em pelo menos o número de monômeros do primeiro ss-oligonucleotídeo, cada monômero do segundo ss- oligonucleotídeo compreendendo uma nucleobase, as nucleobases do segundo ss-oligonucleotídeo formando uma segunda sequência de nucleobase do segundo ss-oligonucleotídeo, a segunda sequência de nucleobase compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleobase complementar à primeira sequência de nucleobase na orientação antiparalela e teoricamente prediz a capacidade do primeiro e segundo ss-oligonucleotídeos para formar um duplex um com o outro, o duplex consistindo em 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos; (c) misturar e incubar, por um intervalo de tempo de 20 minutos ou menos, em uma solução aquosa a uma temperatura de 20°C a 40°C em quantidades molares iguais do primeiro e do segundo ss-oligonucleotídeos, obtendo assim uma mistura de ss-oligonucleotídeos ou uma mistura contendo duplex; seguido por (d) separar em uma temperatura de 20°C a 40°C a mistura obtida na etapa (c), seguida pela detecção e quantificação do duplex separado e detecção e quantificação dos ss-oligonucleotídeos separados; seguido por (e) selecionar o par de ligação se, na etapa (d), o duplex estiver presente de forma detectável, e se a quantidade molar do duplex for maior do que a quantidade molar dos ss-oligonucleotídeos; e - fornecendo assim o par de ligação.
[00013] A presente divulgação, em um segundo aspecto sendo relacionado a todos os outros aspectos e modalidades como aqui divulgados, fornece uma composição líquida compreendendo um solvente aquoso e um par de ligação que consiste em um primeiro oligonucleotídeo de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de fita simples, em que cada oligonucleotídeo consiste em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases dos monômeros formando uma primeira sequência de nucleobase do primeiro oligonucleotídeo e uma segunda sequência de nucleobase do segundo oligonucleotídeo, em que a primeira sequência de nucleobases e a segunda sequência de nucleobases são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação é obtido por um método de acordo com o primeiro aspecto, conforme divulgado neste documento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00014] Um par de ligação é entendido como sendo um conjunto de dois parceiros de ligação diferentes que, sob condições não desnaturantes,
são capazes de formar um com o outro uma ligação intermolecular não covalente específica. No contexto da presente divulgação, a compreensão mais ampla das condições não desnaturantes denota a ausência de qualquer influência aplicada externamente, como aquecimento ou a adição de uma quantidade de um composto desnaturante, para desdobrar molecularmente a substância alvo, interrompendo assim seu ou estrutura de ordem superior. A este respeito, o aquecimento é exemplificado pelo aumento da temperatura substancialmente acima de 40°C, 50°C, 60°C ou uma temperatura ainda mais alta por um período de tempo desejado, e um composto desnaturante pode ser exemplificado por um detergente, um agente caotrópico ou um composto capaz de diminuir a temperatura de fusão de um duplex de ácido nucleico, como formamida.
[00015] É importante ressaltar que cada primeiro e segundo parceiro de ligação não forma uma ligação específica com um parceiro da mesma espécie. Ou seja, um vínculo intramolecular específico entre dois primeiros parceiros ou dois segundos parceiros não ocorre. Ao mesmo tempo, em condições não desnaturantes, cada parceiro separado se apresenta capaz de ligar o outro parceiro. Especificamente, sob condições não desnaturantes, o parceiro separado não forma qualquer vínculo intramolecular que o tornaria incapaz de formar um vínculo com um parceiro da outra espécie. Por exemplo, o dobramento intramolecular poderia levar a estruturas secundárias que, sob condições não desnaturantes, seriam estáveis o suficiente para inibir ou prevenir a ligação intermolecular desejada das duas espécies diferentes de parceiros de ligação.
[00016] No entanto, o dobramento intramolecular que afeta um ou ambos os parceiros de ligação pode não necessariamente inibir de forma completa a ligação intermolecular desejada das duas espécies diferentes; espera-se que a cinética da ligação intermolecular se torne mais lenta em comparação com os parceiros de ligação desimpedidos sem dobramento intramolecular. Considerando particularmente uma configuração de ensaio de alto rendimento padronizado, tal como (mas não limitado a) um imunoensaio automatizado, tal configuração normalmente requer a formação rápida da forma conectada intermolecularmente do par de ligação dos parceiros de ligação previamente separados. Assim, a ausência de dobramento intramolecular ou ampla minimização em cada parceiro de ligação é uma característica técnica desejada.
[00017] No contexto da presente divulgação, e com relação específica aos imunoensaios e à interação de um receptor e sua substância alvo (analito), as condições não desnaturantes são mais especificamente entendidas como as características coletivas de um ambiente que é permissivo para o receptor (por exemplo, anticorpo) em atingir e/ou manter a conformação que permite a interação do receptor com e a ligação de sua substância alvo (analito). Ao mesmo tempo, o ambiente dado por condições não desnaturantes é permissivo para a substância alvo em atingir e/ou manter a conformação que permite que ela se torne e/ou permaneça ligada ao receptor.
[00018] Particularmente, os oligonucleotídeos inteiramente de LNA têm características que não podem ser previstas com segurança pelas presentes ferramentas que estão disponíveis para o técnico no assunto. Por razões práticas, o presente estudo foi limitado a ss-oligonucleotídeos consistindo em até 15 monômeros de LNA.
[00019] Assim, a presente divulgação, em um primeiro aspecto sendo relacionado a todos os outros aspectos e modalidades como aqui divulgados, fornece um método para fornecer um par de ligação, o par de ligação consistindo em um primeiro oligonucleotídeo de LNA de fita simples e um segundo LNA de fita simples oligonucleotídeo, sendo os dois oligonucleotídeos capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, o método compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um primeiro oligonucleotídeo de fita simples (= ss-) consistindo em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA),
cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases do primeiro ss-oligonucleotídeo formando uma primeira sequência de nucleobase;
(b) fornecer um segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em
8 a 15 monômeros de LNA, o segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em pelo menos o número de monômeros como o primeiro ss-oligonucleotídeo, cada monômero do segundo ss-oligonucleotídeo compreendendo uma nucleobase,
as nucleobases do segundo ss-oligonucleotídeo formando uma segunda sequência de nucleobase, a segunda sequência de nucleobase compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleobase complementar à primeira sequência de nucleobase na orientação antiparalela e, a título de complementaridade, prevendo a capacidade do primeiro e segundo ss-oligonucleotídeos para formar um duplex um com o outro, o duplex consistindo em 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos;
(c) misturar e incubar, por um intervalo de tempo de 20 minutos ou menos, em uma solução aquosa a uma temperatura de 20°C a
40°C, quantidades molares iguais do primeiro e do segundo ss-
oligonucleotídeos, obtendo assim uma mistura de ss-oligonucleotídeos ou uma mistura contendo duplex; seguido por
(d) separar, a uma temperatura de 20°C a 40°C, a mistura obtida na etapa (c), seguido por detectar e quantificar o duplex separado, se presente, e por detectar e quantificar os ss-oligonucleotídeos separados;
seguido por (e) selecionar o par de ligação se, na etapa (d), o duplex estiver presente de forma detectável, e se a quantidade molar do duplex for maior do que a quantidade molar dos ss-oligonucleotídeos; e - fornecendo assim o par de ligação.
[00020] Um ss-oligonucleotídeo inteiramente de LNA, conforme especificado aqui, pode conter uma série de monômeros, o número selecionado a partir do grupo que consiste em 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15. Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, o primeiro ss-oligonucleotídeo consiste em 8 a 12 monômeros (ou seja, um número selecionado de 8, 9, 10, 11 e 12 monômeros), e em uma modalidade mais específica de todos aspectos e modalidades como aqui divulgados, o primeiro ss-oligonucleotídeo consiste em 8 monômeros. Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, o primeiro ss- oligonucleotídeo consiste em 8 a 10 monômeros (ou seja, um número selecionado de 8, 9 e 10 monômeros) e em uma modalidade mais específica de todos os aspectos e modalidades como aqui divulgado, o primeiro ss- oligonucleotídeo consiste em 9 monômeros. O primeiro e o segundo ss- oligonucleotídeo não precisam ter o mesmo tamanho, ou seja, não precisam consistir em um número igual de monômeros. No entanto, um número igual de monômeros que constituem o primeiro e o segundo ss-oligonucleotídeo é uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades, conforme divulgado neste documento.
[00021] Dois oligonucleotídeos são antiparalelos se correrem paralelos um ao outro, mas com alinhamentos opostos. Um exemplo específico são as duas fitas complementares de um duplex de ácido nucleico, que correm em direções opostas uma ao lado da outra. Como consequência, cada extremidade do duplex compreende a extremidade 5' da primeira fita próxima a/alinhada com a extremidade 3' da segunda fita oposta. Semelhante ao DNA e RNA, o LNA exibe o emparelhamento de bases Watson-Crick (Koshkin, AAet al. J Am Chem Soc 120 (1998) 13252-13260). Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, cada monômero de LNA compreende uma nucleobase selecionada a partir do grupo que consiste em adenina, timina, uracila, guanina, citosina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 7- desazaguanina e 7-deazaadenina. O emparelhamento de bases Watson-Crick específico envolvendo essas bases em cadeias opostas complementares é uma característica aceita, bem conhecida do técnico no assunto e amplamente publicada na técnica. Para além das nucleobases listadas, outras são conhecidas pelo técnico no assunto que também podem ser incorporadas em todos os ss-oligonucleótidos inteiramente de LNA. Geralmente, estes incluem pirimidinas derivatizadas no átomo C-5.
[00022] É importante ressaltar que depois de contatar os dois diferentes (isto é, primeiro e segundo) ss-oligonucleotídeos, a etapa (c) do método especifica a incubação por um intervalo de tempo de 20 minutos ou menos. Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, o intervalo de tempo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1 segundo a 20 minutos, 1 segundo a 15 minutos, 1 segundo a 10 minutos, 1 segundo a 5 minutos, 1 segundo a 1 minuto, 1 segundo a 30 segundos, 1 segundo a 20 segundos, 1 segundo a 10 segundos e 1 segundo a 5 segundos. Um intervalo de tempo muito vantajoso é selecionado de 1 segundo a 10 segundos, e 1 segundo a 5 segundos.
[00023] Na etapa (c), a temperatura é selecionada independentemente da temperatura na etapa (d) e vice-versa. Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades, conforme divulgado neste documento, as temperaturas nas etapas (c) e (d) não diferem em mais de 5°C. Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades, conforme divulgados neste documento na etapa (c) e/ou na etapa (d), a temperatura é de 20°C a 25°C. Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades, conforme divulgados neste documento na etapa
(c) e/ou na etapa (d), a temperatura é de 25°C a 37°C. Em outra modalidade específica de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, antes da etapa (c), o primeiro ss-oligonucleotídeo e o segundo ss-oligonucleotídeo são mantidos a uma temperatura de -80°C a 40°C, especificamente de 20°C a 40°C, mais especificamente de 20°C a 25°C, ainda mais especificamente de 25°C a 37°C. Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, na etapa (c) a solução aquosa contém um tampão mantendo o pH da solução de pH 6 a pH 8, mais especificamente de pH 6,5 a pH 7,5. Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, na etapa (c), a solução aquosa contém um sal. Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, na etapa (c) a solução aquosa contém uma quantidade agregada de substâncias dissolvidas de 10 mmol/l a 500 mmol/l, mais especificamente de 200 mmol/l a 300 mmol/l, mais especificamente de 10 mmol/l a 150 mmol/l, mais especificamente de 50 mmol/l a 200 mmol/l.
[00024] Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, a etapa (d) compreende submeter a mistura incubada da etapa (c) a cromatografia em coluna com um solvente aquoso como fase móvel. Assim, a cromatografia em coluna é usada para separar moléculas duplex de ss-oligonucleotídeos. Os métodos de cromatografia adequados, tais como CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), são bem conhecidos pelo técnico no assunto a este respeito.
[00025] Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, os ss-oligonucleotídeos de (a) e (b) consistem em monômeros beta-D-LNA. Ou seja, o primeiro ss-oligonucleotídeo consiste inteiramente em monômeros beta-D-LNA e o segundo ss-oligonucleotídeo consiste inteiramente em monômeros beta-D-LNA. Em ainda outra modalidade de todos os aspectos e modalidades conforme divulgado neste documento, os ss-oligonucleotídeos de (a) e (b) consistem em monômeros beta-L-LNA. Ou seja, o primeiro ss-oligonucleotídeo consiste inteiramente em monômeros beta- L-LNA e o segundo ss-oligonucleotídeo consiste inteiramente em monômeros beta-L-LNA.
[00026] Por meio do método como divulgado lá, e também por meio de qualquer uma de suas modalidades, a presente divulgação fornece um duplex inteiramente de LNA formado a uma temperatura pré-selecionada de 25°C a 40°C a partir de um par não desnaturado de oligômeros inteiramente de LNA de fita simples complementares, cada um compreendendo de 8 a 15 monômeros de LNA.
[00027] A presente divulgação, em um segundo aspecto sendo relacionado a todos os outros aspectos e modalidades como aqui divulgados, fornece uma composição líquida compreendendo um solvente aquoso e um par de ligação que consiste em um primeiro oligonucleotídeo de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de fita simples, em que cada oligonucleotídeo consiste em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases dos monômeros formando uma primeira sequência de nucleobase do primeiro oligonucleotídeo e uma segunda sequência de nucleobase do segundo oligonucleotídeo, em que a primeira sequência de nucleobase e a segunda sequência de nucleobase são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método de acordo com o primeiro aspecto, conforme divulgado neste documento.
[00028] Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, é fornecida uma composição líquida compreendendo um solvente aquoso e um par de ligação que consiste em um primeiro oligonucleotídeo de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de fita simples, em que cada oligonucleotídeo consiste em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases dos monômeros formando uma primeira sequência de nucleobase do primeiro oligonucleotídeo e uma segunda sequência de nucleobase do segundo oligonucleotídeo, em que a primeira sequência de nucleobase e a segunda sequência de nucleobase são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método de acordo com o primeiro aspecto, conforme divulgado neste documento.
[00029] Em uma modalidade específica de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, é fornecida uma composição líquida compreendendo um solvente aquoso e um par de ligação que consiste em um primeiro oligonucleotídeo de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de fita simples, em que cada oligonucleotídeo consiste em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases dos monômeros formando uma primeira sequência de nucleobase do primeiro oligonucleotídeo e uma segunda sequência de nucleobase do segundo oligonucleotídeo, em que a primeira sequência de nucleobase e a segunda sequência de nucleobase são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo são capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método de acordo com o primeiro aspecto, conforme divulgado neste documento.
[00030] Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, cada oligonucleotídeo consiste em 9 a 15 monômeros de LNA,
em que a primeira sequência de nucleobase e a segunda sequência de nucleobase são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 9 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação é obtido ou possa ser obtido por um método de acordo com um método do primeiro aspecto e uma modalidade do mesmo.
[00031] Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades conforme divulgado neste documento, cada ss-oligonucleotídeo contém duas ou três nucleobases diferentes. Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades, conforme divulgado neste documento, as nucleobases em cada ss-oligonucleotídeo com o teor de G+C (incluindo análogos de G e C) é inferior a 75%. Em uma modalidade específica, o conteúdo de G+C é inferior a um valor selecionado de 74%, 73%, 72%, 71% e 70%. Em ainda outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, cada monômero de LNA no par de ligação compreende uma nucleobase selecionada a partir do grupo que consiste em adenina, timina, uracila, guanina, citosina, 5-metilcitosina, 5- hidroximetilcitosina, 7-desazaguanina e 7-deazaadenina. Em uma modalidade mais específica, entre as nucleobases em cada ss-oligonucleotídeo, cada citosina é substituída por uma 5-metilcitosina.
[00032] Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, um par de ligação de dois parceiros de ligação compatíveis separados é um par de ss-oligonucleotídeos inteiramente de LNA selecionados a partir do grupo que consiste em: 5’ tgctcctg 3’ e 5’ caggagca 3’, 5’ gcctgacg 3’ e 5’ cgtcaggc 3’, 5’ ctgcctgacg 3’ e 5’ cgtcaggcag 3’, 5’ gactgcctgacg 3’ e 5’ cgtcaggcagtc 3’, 5’ tgctcctgt 3’ e 5’ acaggagca 3’,
5’ gtgcgtct 3’ e 5’ agacgcac 3’, 5’ gttggtgt 3’ e 5’ acaccaac 3’, 5’ caacacaccaac 3’ e 5’ gttggtgtgttg 3’, 5’ acacaccaac 3’ e 5’ gttggtgtgt 3’, 5’ acaccaac 3’ e 5’ gttggtgt 3’
[00033] Em uma modalidade específica, os monômeros dos ss- oligonucleotídeos em qualquer par selecionado a partir do grupo anterior são monômeros beta-D-LNA. Em ainda outra modalidade específica, os monômeros dos ss-oligonucleotídeos em qualquer par selecionado a partir do grupo anterior são monômeros beta-L-LNA.
[00034] Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, um ss-oligonucleotídeo do par de ligação é anexado a uma fase sólida selecionada a partir do grupo que consiste em grânulo magnético, grânulo paramagnético, grânulo de polímero orgânico sintético (látex), grânulo de polissacarídeo, tubo de ensaio, cavidade de placa de titulação, cubeta, membrana, molécula de andaime, cristal de quartzo, filme, papel de filtro, disco e chip. Em outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, um ss-oligonucleotídeo do par de ligação é conectado a uma molécula selecionada a partir do grupo que consiste em peptídeo, polipeptídeo, oligonucleotídeo, polinucleotídeo, açúcar, glicano, hapteno e corante. Em ainda outra modalidade de todos os aspectos e modalidades conforme divulgado neste documento, um ss-oligonucleotídeo é anexado covalentemente a um ligante. Em ainda outra modalidade de todos os aspectos e modalidades aqui divulgados, um ss-oligonucleotídeo é ligado covalentemente a um receptor específico de analito útil em um ensaio de detecção de analito baseado em receptor, tal como, mas não limitado a, um imunoensaio.
[00035] Em seu sentido mais amplo e de acordo com o entendimento geralmente aceito em bioquímica, um receptor é uma estrutura que tem uma afinidade por uma molécula alvo específica como um todo, ou uma afinidade por uma região molecular específica e/ou aspecto tridimensional do molécula alvo. Para o propósito da presente divulgação, entende-se que um receptor interage com e se liga a uma molécula alvo. Em ensaios bioquímicos, um receptor pode ser usado para capturar sua molécula alvo para separar o alvo de uma mistura complexa e para determinar a molécula alvo como um analito. A título de exemplo, os imunoensaios normalmente usam anticorpos ou moléculas derivadas de anticorpos como receptores. Um receptor de captura é um receptor que é fornecido na forma imobilizada (isto é, ligado a uma fase sólida) ou, de preferência, numa forma que é capaz de ser imobilizada. A imobilização pode ser efetuada por meio de um par de ligação conectando, ou capaz de conectar, a fase sólida e o receptor.
[00036] Em termos muito gerais, um imunoensaio fornece um ou mais receptores que são capazes de se ligar especificamente a um analito alvo. Esses receptores podem ser exemplificados por imunoglobulinas específicas do analito; por isso o nome imunoensaio. No entanto, para o propósito da presente divulgação, qualquer outro tipo de receptor específico do analito também é considerado. Assim, o termo mais geral ensaio de detecção de analito baseado em receptor é apropriado.
[00037] Normalmente, o analito alvo é compreendido em uma amostra, em que a amostra é uma mistura complexa de diferentes moléculas.
Para os fins da presente divulgação, uma amostra de líquido é considerada. A amostra líquida compreende uma fase líquida, isto é, um solvente líquido que geralmente é um solvente aquoso. No solvente aquoso, uma pluralidade de moléculas está presente no estado dissolvido. Assim, em uma modalidade específica, a amostra está em um estado líquido de agregação e é uma mistura homogênea monofásica. Em uma modalidade específica, o analito está compreendido na mistura na forma dissolvida e, além disso, uma ou mais moléculas adicionais estão presentes na mistura na forma dissolvida.
[00038] No que diz respeito à detecção, por meio de ensaio de detecção de analito baseado em receptor, de um analito alvo que está presente na amostra líquida, ou que se suspeita estar presente nela, em uma primeira etapa essencial, o analito é especificamente ligado. A ligação específica implica que um receptor está ou se torna presente, em que o receptor tem uma afinidade de ligação e especificidade de ligação para o analito que são altas para o analito alvo e baixas ou ausentes para as moléculas adicionais que também estão presentes na amostra. Em uma modalidade específica (e exemplificando um grande número de ensaios existentes), um composto que compreende um receptor capaz de se ligar especificamente ao analito é adicionado à amostra. É importante notar que a mistura da amostra e do composto que compreende o receptor deve fornecer condições que sejam permissivas à interação específica do receptor e o analito alvo na amostra. Isto inclui que na mistura as condições devem ser permissivas à ligação real do analito pelo receptor, e são desejadas estabilizar o receptor com o analito alvo ligado. Ao mesmo tempo, a mistura da amostra e do composto é desejada para não favorecer ou estabilizar a ligação inespecífica de outras moléculas ao receptor, ou ao composto que compreende o receptor como um todo.
[00039] Posteriormente, o analito é imobilizado. A imobilização é uma etapa importante no processo de detecção, pois permite separar o analito da mistura complexa circundante, especificamente das demais moléculas da amostra. A imobilização requer uma fase sólida à qual o analito alvo se liga.
Uma vez imobilizado, o analito pode ser separado da mistura por meio de separação de fases. Separado da mistura (isto é, purificado), o analito é então detectado.
[00040] Considerando um ensaio de detecção de analito baseado em receptor e a etapa de imobilização, há a necessidade de fornecer uma fase sólida e de construir uma conexão entre a fase sólida e o analito alvo. É desejável que a conexão seja construída em um processo de automontagem.
[00041] Os imunoensaios são métodos bioanalíticos bem estabelecidos nos quais a detecção ou quantificação de um analito depende da reação do analito e de pelo menos um receptor específico do analito, formando assim um complexo analito: receptor. Um exemplo não limitante é a reação entre um antígeno e um anticorpo, respectivamente. A modalidade específica de um imunoensaio "sanduíche" pode ser usada para analitos que possuem mais de um epítopo de reconhecimento. Assim, um ensaio sanduíche requer pelo menos dois receptores que se ligam a epítopos não sobrepostos no analito. Em um “imunoensaio sanduíche heterogêneo”, um dos receptores tem o papel funcional de um receptor de captura específico do analito; este receptor é ou (no decurso do ensaio) fica imobilizado numa fase sólida. Um segundo receptor específico do analito é fornecido na forma dissolvida na fase líquida.
Um complexo tipo sanduíche é formado quando o analito respectivo é ligado por um primeiro e um segundo receptor (receptor-1:analito:receptor-2). O complexo tipo sanduíche também é conhecido como “complexo de detecção”.
Dentro do complexo de detecção, o analito é ensanduichado entre os receptores, ou seja, em tal complexo o analito representa um elemento de conexão entre o primeiro receptor e um segundo receptor.
[00042] O termo "heterogêneo" (em oposição a "homogêneo") denota duas etapas essenciais e separadas no procedimento de ensaio. Na primeira etapa, um complexo de detecção contendo marcador é formado e imobilizado, porém com marcador não ligado ainda envolvendo os complexos.
Antes da determinação de um sinal dependente do marcador, o marcador não ligado é lavado do complexo de detecção imobilizado, representando assim a segunda etapa. Em contraste, um ensaio homogêneo produz um sinal detectável dependente do analito por meio de incubação de etapa única e não requer uma etapa de lavagem.
[00043] Num ensaio heterogéneo, a fase sólida é funcionalizada de modo que possa ter ligado à sua superfície o receptor de captura funcional (o primeiro receptor), antes de ser contactado com o analito; ou a superfície da fase sólida é funcionalizada para ser capaz de ancorar um primeiro receptor, após ter reagido com o analito. No último caso, o processo de ancoragem não deve interferir com a capacidade do receptor de capturar e ligar especificamente o analito. Um segundo receptor presente na fase líquida é usado para a detecção do analito ligado. Assim, em um imunoensaio heterogêneo, o analito pode se ligar ao primeiro (captura) e ao segundo (detector) receptores. Desse modo, um "complexo de detecção" é formado em que o analito é ensanduichado entre o receptor de captura e o receptor detector. Numa forma de realização típica, o receptor detector é marcado antes de ser contactado com o analito; alternativamente, um marcador é especificamente anexado ao receptor do detector após a ligação do analito.
Com os complexos de detecção sendo imobilizados na fase sólida, a quantidade de marcador detectável na fase sólida corresponde à quantidade de analito ensanduichado. Após a remoção do marcador não ligado com uma etapa de lavagem, o marcador imobilizado indicando a presença e quantidade de analito pode ser detectado.
[00044] Outra modalidade bem conhecida é um imunoensaio heterogêneo competitivo que em sua forma mais simples difere do formato do tipo sanduíche pela falta de um segundo receptor detector. Em contraste, a amostra com o analito é misturada com um análogo marcado produzido artificialmente que é capaz de reação cruzada com o receptor específico do analito. No ensaio, o analito e o análogo competem pela ligação a um receptor de captura que está ou fica imobilizado. Após a etapa de ligação, quanto maior a quantidade de marcador imobilizado, menor a quantidade de analito não marcado que era capaz de competir pelo receptor de captura. O marcador imobilizado é determinado após uma etapa de lavagem. Portanto, a quantidade de marcador detectável na fase sólida corresponde inversamente à quantidade de analito que estava inicialmente presente na amostra.
[00045] Qualquer(quaisquer) etapa(s) de lavagem necessária(s) em um imunoensaio heterogêneo requer(em) a conexão não covalente do primeiro parceiro de ligação e do segundo parceiro de ligação para ser suficientemente estável. No entanto, a extensão da estabilidade necessária da conexão depende da força da(s) etapa(s) de lavagem a ser(em) aplicada(s).
Importante e inesperadamente, um par de ligação como demonstrado aqui é excepcionalmente bem adequado para facilitar a etapa de imobilização em um imunoensaio. Ou seja, em um imunoensaio, por exemplo, um primeiro parceiro de ligação do par de ligação ligado a uma fase sólida e um segundo parceiro de ligação do par de ligação ligado a um receptor específico de analito (captura) são bem adequados para facilitar a imobilização do receptor na fase sólida.
[00046] Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo da qual é estabelecido nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00047] Figura 1 Análise de CLAE de LNA 1 de fita simples (Exemplo 2).
[00048] Figura 2 Análise de CLAE de LNA 2 de fita simples (Exemplo 2).
[00049] Figura 3 Análise de CLAE de LNA 1 e LNA 2 mistos, injeção imediata no sistema de CLAE (Exemplo 2).
[00050] Figura 4 Análise de CLAE de LNA 1 e LNA 2 mistos após desnaturação térmica antes da injeção (Exemplo 2) controle positivo: formação de duplex.
[00051] Figura 5 Análise de CLAE de LNA 3 de fita simples (Exemplo 2).
[00052] Figura 6 Análise de CLAE de LNA 4 de fita simples (Exemplo 2).
[00053] Figura 7 Análise de CLAE de LNA 3 e LNA 4 mistos, injeção imediata no sistema de CLAE (Exemplo 2) formação duplex lenta (proporção < 0,05).
[00054] Figura 8 Análise de CLAE de LNA 3 e LNA 4 mistos, injeção após 50 minutos (Exemplo 2) formação de duplex lento (proporção = 0,05).
[00055] Figura 9 Análise de CLAE de LNA 3 e LNA 4 mistos após desnaturação térmica antes da injeção (Exemplo 2) controle positivo: formação de duplex.
EXEMPLO 1
SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE LNA
[00056] Os oligonucleotídeos de LNA foram sintetizados em uma síntese em escala de 1 µmole em um sintetizador de DNA ABI 394 usando o procedimento de síntese de DNA em fase sólida automatizado padrão e aplicando química de fosforamidito. Glen UnySupport PS (Glen Research cat nº 26-5040) e fosforamiditos de LNA (Qiagen / Exiqon cat. Nº 33970 (LNA-A (Bz), 339702 (LNA- T), 339705 (LNA-mC(Bz) e 339706 (LNA-G(dmf); análogos de ß-L-LNA foram sintetizados analogamente a fosforamiditos de D-ß-LNA a partir de L-glicose (Carbosynth, cat. Nº MG05247) de acordo com A.A. Koshkin et al., J.Org. Chem 2001, 66, 8504-8512), bem como o espaçador fosforamidito 18 (Glen Research cat. Nº 10-1918) e 5'-Biotin fosforamidito (Glen Research cat. Nº 10-5950) foram usados como blocos de construção. Todos os fosforamiditos foram aplicados na concentração de 0,1 M em acetonitrila grau DNA. Ciclos de DNA padrão com tempo de acoplamento estendido (180 segundos), oxidação estendida (45 segundos) e tempo de destritilação (85 segundos) e reagentes de síntese padrão e solventes foram usados para a montagem dos oligonucleotídeos de LNA. Os oligonucleotídeos de LNA 5'-biotinilados foram sintetizados como DMToff, enquanto os oligonucleotídeos de LNA não modificados foram sintetizados como DMTon. Em seguida, um programa de clivagem padrão foi aplicado para a clivagem dos oligonucleotídeos de LNA do suporte por conc. amônia. Os grupos de proteção residuais foram clivados por tratamento com conc. amônia (8h a 56°C). Os oligonucleotídeos de LNA em bruto foram evaporados e purificados por CLAE FR (Fase Reversa) (coluna: PRP-1, 7 µm, 250 x 21,5 mm (Hamilton, parte nº 79352) ou XBridge BEH C18 OBD, 5 µm, 10 x 250 mm (Waters parte nº 186008167) usando um acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / gradiente de acetonitrila. As frações do produto foram combinadas e dessalinizadas por diálise (MWCO 1000, SpectraPor 6, parte nº 132638) contra água por 3 dias, assim também clivando o grupo DMT de oligonucleotídeos purificados por DMTon. Finalmente, os oligonucleotídeos de LNA foram liofilizados.
[00057] Os rendimentos variaram de 85 a 360 nmoles.
[00058] Os oligonucleotídeos de LNA foram analisados por RP18 CLAE (Chromolith RP18e, Merck parte nº 1.02129.0001) usando um gradiente de acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / acetonitrila. As purezas típicas eram > 90%. A identidade dos oligonucleotídeos de LNA foi confirmada por análise de LC-MS.
EXEMPLO 2
IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE LNA CAPAZES DE FORMAR DUPLEX SEM DESNATURAÇÃO PRÉVIA APLICANDO ANÁLISE DE CLAE-FR A) MÉTODO GERAL:
[00059] Os oligonucleotídeos de LNA do exemplo 1 foram dissolvidos em tampão (0,01 M de Hepes pH 7,4, 0,15 M de NaCl) e analisados em RP18 CLAE (Chromolith RP18e, Merck parte nº 1.02129.0001) usando um gradiente de acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / acetonitrila (8-24% de acetonitrila em 10 minutos; detecção a 260 nm).
[00060] A fita e os oligonucleotídeos de LNA de contra-fita correspondentes foram misturados na concentração equimolar à t.a.
(temperatura ambiente) e imediatamente analisado em RP18 CLAE (Chromolith RP18e, Merck parte nº 1.02129.0001) usando um gradiente de acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / acetonitrila (8-24% B em 10 minutos; detecção a 260 nm).
[00061] Em um primeiro experimento de controle, a fita e os oligonucleotídeos de LNA da contra-fita correspondentes foram misturados na concentração equimolar à temperatura ambiente, incubados por 1 hora à temperatura ambiente e, posteriormente, analisados em CLAE RP18 (Chromolith RP18e, Merck parte nº 1.02129.0001) usando um gradiente de acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / acetonitrila (8-25% de acetonitrila em 10 minutos; detecção a 260 nm).
[00062] Em um segundo experimento de controle para mostrar a formação de duplex (controle positivo), a fita e os oligonucleotídeos de LNA da contra-fita correspondentes foram misturados na concentração equimolar à temperatura ambiente, desnaturados termicamente a 95°C (10 minutos) e, após ter atingido a temperatura ambiente, novamente analisados em CLAE RP18 (cromólito RP18e, Merck parte nº 1.02129.0001) usando um gradiente de acetato de trietilamônio 0,1 M pH 7 / acetonitrila (8-24% de acetonitrila em 10 minutos; detecção a 260 nm).
[00063] A formação de duplex pode ser detectada se for formado novo pico em tempos de retenção diferentes em comparação com os oligonucleotídeos de LNA de fita simples individuais. No controle positivo, a fita mista e a contra-fita são desnaturadas termicamente antes da injeção,
resultando em duplex. Por injeção dependente do tempo após a mistura da fita e da contra-fita de LNA à temperatura ambiente sem a cinética de desnaturação prévia da formação do duplex pode ser monitorada.
[00064] As sequências de LNA são determinadas como sendo capazes de formar duplex rapidamente se a razão da porcentagem de CLAE do duplex formado e um de ambos LNA de fita simples (corrigido pelo coeficiente de extinção; no caso de ambas as fitas não serem exatamente equimolares, o valor de razão mais alto é considerado) for > 0,9 após revenido 5-60 minutos à temperatura ambiente sem desnaturação prévia (a porcentagem CLAE corrigida pelos coeficientes de extinção; hipercromia do duplex não considerada).
B) IDENTIFICAÇÃO DA SEQUÊNCIA QUE FORMA DUPLEX RÁPIDO
[00065] LNA 1: 5’-tgctcctg-3’.
[00066] LNA 2: 5’-Bi-Heg-caggagca-3’.
[00067] Heg = hexaetilenoglicol.
[00068] Bi = marcador de biotina ligado através da função carboxi da fração de ácido valérico da biotina.
[00069] Os resultados são mostrados nas Figuras.
C) IDENTIFICAÇÃO DA SEQUÊNCIA QUE FORMA DUPLEX LENTAMENTE
[00070] LNA 3: 5’-ctgcctgacg-3’.
[00071] LNA 4: 5’-Bi-Heg-cgtcaggcag-3’.
[00072] Os resultados são mostrados nas Figuras.
[00073] cálculo da razão: LNA tempo de % de CLAE coeficiente de % de CLAE retenção extinção (ɛ) * ɛ-1 * 1000 [min] [l*mol-1*cm-1] fita simples LNA 3 3,365 45,14 98900 0,456 fita simples LNA 4 7,148 49,98 109300 0,457 LNA 3/LNA 4 6,871 4,88 208200 0,023 fita dupla % de CLAE * ɛ-1 * 1000 (LNA 3/LNA 4 fita dupla) / % de CLAE * ɛ-1 *
1000 (LNA 3 fita simples) = 0,023/0,456 = 0,05.
% de CLAE * ɛ-1 * 1000 (LNA 3/LNA 4 fita dupla) / % de CLAE * ɛ-1 * 1000 (LNA 4 fita simples) = 0,023/0,457 = 0,05.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. MÉTODO PARA FORNECER UM PAR DE LIGAÇÃO, o par de ligação consistindo em um primeiro oligonucleotídeo LNA de fita simples e um segundo oligonucleotídeo LNA de fita simples, sendo os dois oligonucleotídeos capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer um primeiro oligonucleotídeo de fita simples (= ss-) consistindo em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases do primeiro ss-oligonucleotídeo formando uma primeira sequência de nucleobase; (b) fornecer um segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em 8 a 15 monômeros LNA, o segundo ss-oligonucleotídeo consistindo em pelo menos o número de monômeros como o primeiro ss-oligonucleotídeo, cada monômero do segundo ss-oligonucleotídeo compreendendo uma nucleobase, as nucleobases do segundo ss-oligonucleotídeo formando uma segunda sequência de nucleobase do segundo ss-oligonucleotídeo, a segunda sequência de nucleobase compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleobase complementar à primeira sequência de nucleobase em orientação antiparalela e teoricamente sugerindo a capacidade do primeiro e segundo ss-oligonucleotídeos para formar um duplex um com o outro, o duplex consistindo em 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos; (c) misturar e incubar, por um intervalo de tempo de 20 minutos ou menos, em uma solução aquosa a uma temperatura de 20°C a 40°C, quantidades molares iguais do primeiro e do segundo ss- oligonucleotídeos, obtendo assim uma mistura de ss-oligonucleotídeos ou uma mistura contendo duplex; seguido por (d) separar, a uma temperatura de 20°C a 40°C, a mistura obtida na etapa (c), seguido por detectar e quantificar o duplex separado, se presente, e por detectar e quantificar os ss-oligonucleotídeos separados; seguido por (e) selecionar o par de ligação se, na etapa (d), o duplex estiver presente de forma detectável, e se a quantidade molar do duplex for maior do que a quantidade molar de ss-oligonucleotídeos; e - fornecendo assim o par de ligação.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro ss-oligonucleotídeo consistir em 5 a 9 monômeros.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo primeiro ss-oligonucleotídeo consistir em 6 monômeros.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por cada monômero de LNA compreender uma nucleobase selecionada a partir do grupo que consiste em adenina, timina, uracila, guanina, citosina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 7- deazaguanina e 7-deazaadenina.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, na etapa (c), a temperatura ser de 20°C a 37°C.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, antes da etapa (c), o primeiro ss- oligonucleotídeo e o segundo ss-oligonucleotídeo serem mantidos a uma temperatura de -80°C a 40°C, especificamente de 20°C a 40°C, mais especificamente de 20°C a 37°C.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, na etapa (c), a incubação ser realizada por 1 minuto ou menos.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por, na etapa (c), a solução aquosa conter um tampão que mantém o pH da solução de pH 6 a pH 8, mais especificamente de pH 6,5 a pH 7,5.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por, na etapa (c), a solução aquosa conter uma quantidade agregada de substâncias dissolvidas de 10 mmol/l a 500 mmol/l, mais especificamente de 200 mmol/l a 300 mmol/l.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela etapa (d) compreender submeter a mistura incubada da etapa (c) à cromatografia em coluna com um solvente aquoso como fase móvel.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelos ss-oligonucleotídeos de (a) e (b) consistirem em monômeros beta-D-LNA.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelos ss-oligonucleotídeos de (a) e (b) consistirem em monômeros beta-L-LNA.
13. COMPOSIÇÃO LÍQUIDA, caracterizada por compreender um solvente aquoso e um par de ligação que consiste em um primeiro oligonucleotídeo de fita simples e um segundo oligonucleotídeo de fita simples, em que cada oligonucleotídeo consiste em 8 a 15 monômeros de ácido nucleico bloqueado (= LNA), cada monômero compreendendo uma nucleobase, as nucleobases dos monômeros formando uma primeira sequência de nucleobase do primeiro oligonucleotídeo e uma segunda sequência de nucleobase do segundo oligonucleotídeo, em que a primeira sequência de nucleobases e a segunda sequência de nucleobases são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 8 a 15 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por cada oligonucleotídeo consistir em 8 a 15 monômeros de LNA, em que a primeira sequência de nucleobases e a segunda sequência de nucleobases são selecionadas de modo que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 5 a 9 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 12.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por cada oligonucleotídeo consistir em 9 a 15 monômeros LNA, em que a primeira sequência de nucleobases e a segunda sequência de nucleobases são selecionadas para que o primeiro oligonucleotídeo e o segundo oligonucleotídeo sejam capazes de formar um duplex antiparalelo de 9 pares de bases Watson-Crick consecutivos a uma temperatura de 20°C a 40°C, e em que o par de ligação pode ser obtido por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 12.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada por cada monômero de LNA compreender uma nucleobase selecionada a partir do grupo que consiste em adenina, timina, uracila, guanina, citosina e 5-metilcitosina.
17. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada por cada ss-oligonucleotídeo conter duas ou três nucleobases diferentes.
18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por, entre as nucleobases em cada ss-oligonucleotídeo, o teor de G+C ser inferior a 75%.
19. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizada por, entre as nucleobases em cada ss- oligonucleotídeo, cada citosina ser substituída por uma 5-metilcitosina.
20. USO DE UMA COMPOSIÇÃO com um par de ligação, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado por ser em um imunoensaio heterogêneo compreendendo um receptor específico do analito e uma fase sólida, em que o par de ligação imobiliza um receptor específico do analito em uma fase sólida.
21. KIT PARA REALIZAR UM IMUNOENSAIO HETEROGÊNEO para detectar um analito, caracterizado por conter, em recipientes separados, uma fase sólida tendo a ela anexada o primeiro oligonucleotídeo de fita simples do par de ligação, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 19, e um receptor específico do analito tendo a ele anexado o segundo oligonucleotídeo de fita simples do par de ligação, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 19.
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