KR20210013133A - 전부-lna 올리고뉴클레오티드 혼성화 - Google Patents

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Abstract

본 보고서는 잠금 핵산 (LNA) 단량체로 전적으로 구성되는 단일 가닥 (ss-) 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 것에 관계한다. 본 문서는 소정의 시간 간격 내에 이중나선을 형성하는데 실패하는 전적으로 상보성 ss-올리고뉴클레오티드의 쌍으로 혼성화 실험을 보여준다. 본 보고서는 이런 양립할 수 없는 올리고뉴클레오티드 쌍을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 다른 양상에서, 본 보고서는 이중나선을 신속하게 형성할 수 있는 상보성 ss-올리고뉴클레오티드의 쌍을 제공한다. 본 보고서는 또한, 양립성 올리고뉴클레오티드 쌍을 확인하고 선별하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서 본 보고서는 결합 검정, 예를 들면, 면역검정에서 결합 파트너로서 양립성 올리고뉴클레오티드 쌍의 용도를 제공한다.

Description

전부-LNA 올리고뉴클레오티드 혼성화
본 보고서는 잠금 핵산 (LNA) 단량체로 전적으로 구성되는 단일 가닥 (ss-) 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 것에 관계한다. 본 문서는 예상치 않게, 소정의 시간 간격 내에 이중나선을 형성하는데 실패하는 전적으로 상보성 ss-올리고뉴클레오티드의 쌍으로 혼성화 실험을 보여준다. 본 보고서는 이런 양립할 수 없는 올리고뉴클레오티드 쌍을 확인하기 위한 효율적인 방법을 제공한다. 다른 양상에서, 본 보고서는 놀랍게도, 사전 변성의 부재에서 이중나선을 신속하게 형성할 수 있는 잠금 핵산 (LNA) 단량체로 전적으로 구성되는 상보성 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 쌍을 제공한다. 본 보고서는 또한, 이런 양립성 전부-LNA ss 올리고뉴클레오티드 쌍을 확인하고 선별하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서 본 보고서는 생화학적 검정, 예를 들면, 결합 검정, 면역검정에서 결합 파트너로서 양립성 올리고뉴클레오티드 쌍의 용도를 제공한다. 표본 내에 피분석물을 검출하거나 또는 결정하기 위한 검정에서, 양립성 LNA 올리고뉴클레오티드 쌍이 상이한 표적 분자, 예를 들면, 피분석물-특이적 포획 분자를 고정시키는 데 이용되는 특정한 구체예가 논의된다.
발명의 배경
특정 초점은 결합 쌍의 두 파트너의 특이적 상호작용 및 이들의 궁극적인 상호 결합이 기능적 역할을 갖는 일반적인 생화학적 적용에 관계한다. 매우 빈번하게는, 이질성 면역검정에서 비오틴:(스트렙트)아비딘 결합 쌍이 피분석물-특이적 포획 수용체를 고체상에 고정시키는 데 이용된다. 본 보고서는 다른 적용 중에서 특히, 면역검정에 적합한 대안적 결합 쌍을 개념화하고, 설명하고, 예증한다. 구체적으로, 혼성화에 의하여 이중나선을 형성할 수 있는 2개의 단일 가닥 전부-LNA 올리고뉴클레오티드로 만들어진 대안적 결합 쌍은 비오틴:(스트렙트)아비딘 결합 쌍에 대한 기술적인 대안을 제공한다.
본원 발명의 핵심 초점은 면역검정의 코스에서 포획 수용체가 고체상 위에 정착되는 수단이다. 특히, 본원 발명은 피분석물을 내포하는 표본의 존재에서 포획 수용체의 고정을 가능하게 하고 및/또는 복합체가 형성된 후 검출 복합체를 정착시킬 수 있는 결합 쌍에 주력한다. 면역검정에서 결합 쌍은 특이적인 특질을 갖도록 기술적으로 요구된다. 따라서, 이들 두 결합 파트너의 상호작용은 특이적이어야 한다. 게다가, 결합 형성의 동역학, 다시 말하면 결합 쌍의 이들 별개의 두 파트너가 상호작용하고 궁극적으로 연관하는, 다시 말하면, 서로 결합하는 속도는 높아지는 것이 요망된다. 이에 더하여, 이들 두 결합 파트너의 결합은 일단 형성되면, 안정되는 것이 요망된다. 게다가, 이들 결합 파트너는 면역검정에서 그들의 적용을 위해, 다른 분자, 예컨대 피분석물-특이적 수용체 및 고체상 표면과의 화학적 접합에 순응해야 한다. 면역검정에서 수용체, 그리고 전형적으로, 검출되는 피분석물 또한 특이적으로 고려 중에 있는 특정 수용체 또는 피분석물에 따라서 상이할 수 있는 일정한 조건 하에서만 그들의 입체형태와 기능을 유지한다는 것을 인지하는 것이 중요하다; 따라서, 수용체 분자 또는 피분석물은 이들 조건으로부터 단지 제한된 편차만을 용인할 수 있다. 이런 조건은 몇 가지만 예로 들자면, 20℃ 내지 40℃의 범위 안에 미리 선별된 온도에서, 약 pH 6 내지 약 pH 8의 범위에서 pH를 갖는 완충된 수성 용액, 한 가지 또는 그 이상의 용해된 염, 한 가지 또는 그 이상의 보조 물질, 약 250 내지 약 400 mosm/kg의 용질의 총량을 포함할 수 있다 (하지만 이들에 한정되지 않는다).
결합 쌍의 별개의 파트너는 서로 특이적으로 상종하고 결합하는 능력을 상실하지 않으면서, 접합, 구체적으로 포획 분자, 다시 말하면, 수용체와의 접합, 그리고 고체상 표면과의 접합에 순응하는 것이 필요하다. 면역검정에서 접합체에 대하여, 대안적 결합 쌍의 각 별개의 결합 파트너는 검정 조건 하에 기능적이어야 한다. 동일한 추론이 결합 파트너와의 접합을 위한 모든 다른 원하는 물질, 예컨대 하지만 제한 없이, 피분석물, 운반체 물질, 고체상, 그리고 검정의 코스 동안 존재할 수 있는 다른 물질 또는 화합물에 적용된다.
상보성 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 다시 말하면, 혼성화에 의하여 이중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 거대분자를 연결하거나, 또는 분자를 고체상에 부착하기 위한 결합 쌍 수단으로서 이전에 제안되었다. EP 0488152는 피분석물-특이적 포획 항체가 이러한 항체 및 고체상을 연결하는 핵산 이중나선에 의해 고정되는 고체상을 이용한 이질성 면역검정을 개시한다. 하나의 혼성화된 올리고뉴클레오티드가 항체에 부착되고 상보성 올리고뉴클레오티드가 고체상에 부착되고, 따라서 연결 이중나선이 형성되는 구체예가 제시된다. EP 0698792, WO 1995/024649, WO 1998/029736 및 EP 0905517 문서에서 유사한 개시가 제공된다. WO 2013/188756은 유세포분석의 방법, 그리고 첫 번째 올리고뉴클레오티드에 접합된 항체, 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 서열과 동일한 서열을 갖는 두 번째 올리고뉴클레오티드에 접합된 올리고스피어, 그리고 표지 및 첫 번째와 두 번째 올리고뉴클레오티드에 상보적인 세 번째 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 조성물을 개시한다. 특정한 구체예에서 올리고스피어는 자성이다. 상기 문서는 표준화 절차에서 참고문헌으로서 올리고스피어의 특이적인 용도를 보고한다.
변형된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA) 및 잠금 핵산 (LNA)은 생리학적 적용에 대해 탐구되었다. LNA는 리보오스 모이어티의 2'-산소 및 4'-탄소 사이에 메틸렌 링커를 소유하고, 이것이 상기 당을 C3-엔도 입체형태로 결과적으로 잠그는데, 이런 이유로 "잠금 핵산"으로 명명된다. 이러한 화학적 변형은 혼성화에 의한 이중나선 형성을 수반하는 기술적인 적용에서 뉴클레아제 저항성뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드 표적에 대한 더욱 높은 친화성 및 더욱 큰 특이성을 부여한다. WO 1998/39352는 잠금 핵산 (LNA) 구조를 개시한다. WO 2000/056746은 LNA의 일정한 입체이성질체에 대한 중간 산물을 포함하는 LNA 단량체의 합성을 개시한다. 화학적 합성에 의하여, LNA 뉴클레오시드 유사 단량체로만 구성되는 단일 가닥 ("전부-LNA")이 합성될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 잠금 핵산 (LNA) 단량체는 리보오스 고리에 부가된 추가의 2'-O,4'-C-메틸렌 브리지를 갖는 입체형태적으로 한정된 뉴클레오티드 유사체이다. LNA 단량체는 2'-O,4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오시드 단량체로서 제공된다 (Singh S.K. et al. Chem. Commun. 4 (1998) 455-456; Koskin A.A. et al. Tetrahedron 54 (1998) 3607-3630; Wengel J. Acc. Chem. Res. 32 (1999) 301-310). WO2000/066604 및 WO2000/056746은 LNA 뉴클레오시드 단량체의 일정한 입체이성질체를 개시한다. DNA와 LNA 단량체를 내포하는 혼합된 DNA-LNA 올리고뉴클레오티드는 상보성 DNA와 RNA에 혼성화될 때 3'-외부핵산분해를 향한 안정성 및 크게 증강된 열 안정성을 보여주었다. 실제로, 합성된 다른 높은 친화성 핵산 모방체, 예를 들면, 펩티드 핵산 (PNAs), 헥시톨 핵산 (HNAs) 및 2'-플루오로 N3'-포스포라미데이트와 비교하여, LNA는 이례적인 결합 친화성을 전시한다. "믹스머"로서 또한 알려져 있는 LNA-DNA 혼합된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 동역학은 Christensen U. et al. (Biochem J 354 (2001) 481-484)에 의해 보고되었다. 각각 7개의 LNA 단량체로 구성되는 2개의 상보성 ss-올리고뉴클레오티드로부터 이중나선의 결정 구조는 Eichert A. et al. (Nucleic Acids Research 38 (2010) 6729-6736)에 의해 보고되었다.
WO 1999/14226은 관심되는 분자 및 고체 지지체에 부착을 위한 친화성 쌍의 작제에서 LNA의 이용을 제안한다. 하지만, 상보성 전부-LNA 단일 가닥의 혼성화는 기술적인 문제를 야기하는 것으로 당해 분야에 또한 알려져 있다. 전부-LNA 혼성화의 열역학적 분석은 거의 경험적이고, 그리고 사전 변성 단계 (예를 들면, 혼성화에 앞서 가열) 없이 단량체 혼성화의 서열 예측은 지금까지, 가능한 것으로 여겨지지 않는다.
대부분의 경우에, 지금까지는 혼합된 LNA-DNA 올리고뉴클레오티드 ("믹스머 단일 가닥" 또는 "믹스머"로서 또한 지칭됨)가 분석되었다. LNA 단량체로부터 배타적으로 만들어진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (다시 말하면, "전부-LNA" 단일 가닥 올리고뉴클레오티드) 혼성화의 특징화에 관한 극소수의 보고서가 지금까지, 특히 Koshkin A.A. et al. (J Am Chem Soc 120 (1998) 13252-13253) 및 M
Figure pct00001
hrle B.P. et al. (Analyst 130 (2005) 1634-1638)에 의해 공개되었다. Eze N.A. et al. (Biomacromolecules 18 (2017) 1086-1096)은 DNA-LNA 믹스머 및 DNA 프로브로부터 연관률이 105 M-1 s-1 미만이라고 보고한다. 이들 저자에 따르면, 용해 상태에서 혼성화 동역학은 단량체 중에서 1/3이 치환에 이용가능하다는 것을 고려하면, 하나 또는 그 이상의 DNA 단량체를 LNA 단량체로 치환하는 것에 의해 영향을 받는 것으로 보이지 않는다.
LNA-내포 올리고뉴클레오티드의 열역학적 거동에 관련된 예측은 Tolstrup N et al. (Nucleic Acids Research 31 (2003) 3758-3762)에 의해 언급된 전용 컴퓨터 프로그램에 의해 보조된다. 하지만, 이 보고서에서는 실험 데이터의 결여보다는, LNA 올리고뉴클레오티드의 더욱 복잡한 성질로 인한 이들 올리고뉴클레오티드에 대한 더욱 높은 예측 오차를 명시적으로 언급한다. 구체적으로, 상기 보고서는 8개 또는 그 이상의 LNA 단량체로 구성되는 상보성 ss-올리고뉴클레오티드는 왓슨 크릭 염기 대합으로 이중나선 분자를 형성하는 그들의 능력에 대하여 예측될 수 없다는 것을 보여준다.
본 보고서의 일반적인 목적은 이런 이유로, 혼성화하고, 따라서 왓슨 크릭 염기 대합으로 이중나선 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 전부-LNA 올리고뉴클레오티드의 결합 쌍의 확인과 제공이다. 더욱 구체적으로, 비-변성 조건 하에, 더욱 특정하게는 피분석물 검출 검정 (예컨대 하지만 제한 없이, 면역검정)에서 피분석물-특이적 수용체의 기능과 양립하는 조건 하에 이중나선을 형성할 수 있는 결합 쌍이 모색된다. 중요하게는, 상보성 올리고뉴클레오티드의 혼성화 비적합성을 유발할 수 있었던 임의의 분자내 이차 구조를 제거하기 위한 간헐적 가열 단계 없이, 주위 온도, 예컨대 하지만 제한 없이, 실온에서 수성 용액에서 저장되고 서로 혼성화될 수 있는 단일 가닥 전부-LNA 올리고뉴클레오티드가 모색된다.
발명의 요약
본원 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 모든 다른 양상과 구체예에 관련된 첫 번째 양상에서, 결합 쌍을 제공하되, 상기 결합 쌍이 첫 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 이들 2개의 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되는 첫 번째 단일 가닥 (= ss-) 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 첫 번째 핵염기 서열을 형성하는 단계;
(b) 8 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되는 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드가 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드와 적어도 동일한 숫자의 단량체로 구성되고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 상기 두 번째 핵염기 서열이 역평행 방향으로 첫 번째 핵염기 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되고, 그리고 서로 이중나선을 형성하는 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 능력을 이론적으로 예측하되, 상기 이중나선이 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍으로 구성되는 단계;
(c) 수성 용액에서 20℃ 내지 40℃의 온도에서 20 분 또는 그 이하의 시간 간격 동안 동등한 몰량의 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 혼합하고 항온처리하고, 따라서 ss-올리고뉴클레오티드의 혼합물 또는 이중나선-내포 혼합물을 획득하는 단계; 그 이후에
(d) 20℃ 내지 40℃의 온도에서 (c) 단계에서 획득된 혼합물을 분리하고, 그 이후에 분리된 이중나선을 검출하고 정량하고, 그리고 분리된 ss-올리고뉴클레오티드를 검출하고 정량하는 단계; 그 이후에
(e) 만약 (d) 단계에서 이중나선이 검출가능하게 존재하면, 그리고 만약 이중나선의 몰량이 ss-올리고뉴클레오티드의 몰량보다 높으면, 결합 쌍을 선별하고;
따라서 결합 쌍을 제공하는 단계.
본원 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 모든 다른 양상과 구체예에 관련된 두 번째 양상에서, 수성 용매, 그리고 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되는 결합 쌍을 포함하는 액체 조성물을 제공하고,
여기서 각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되고, 각 단량체는 핵염기를 포함하고, 이들 단량체의 핵염기는 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고,
여기서 상기 첫 번째 핵염기 서열 및 상기 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고,
그리고 여기서 상기 결합 쌍은 본원에서 개시된 바와 같은 첫 번째 양상에 따른 방법에 의해 획득가능하다.
발명의 상세한 설명
결합 쌍은 비-변성 조건 하에, 특이적 비공유 분자간 결합을 서로 형성할 수 있는 2개의 상이한 결합 파트너의 한 세트인 것으로 이해된다. 본원 발명의 맥락에서, 비-변성 조건에 관한 가장 넓은 이해는 표적 물질을 분자적으로 중첩풀림하고, 따라서 이의 이차 또는 고차 구조를 파괴하기 위한 임의의 외부적으로 적용된 영향, 예컨대 가열 또는 일정량의 변성 화합물의 첨가의 부재를 나타낸다. 이점에 관하여, 가열은 원하는 기간 동안 온도를 40℃, 50℃, 60℃ 또는 훨씬 높은 온도를 실제적으로 초과하여 올리는 것에 의해 예시되고, 그리고 변성 화합물은 세정제, 카오트로프, 또는 핵산 이중나선의 용융 온도를 낮출 수 있는 화합물, 예컨대 포름아미드에 의해 예시될 수 있다.
중요하게는, 각각의 첫 번째와 두 번째 결합 파트너는 동일한 종류의 파트너와 특이적 결합을 형성하지 않는다. 다시 말하면, 2개의 첫 번째 파트너 또는 2개의 두 번째 파트너 사이에는 특이적 분자내 결합이 발생하지 않는다. 이와 동시에, 비-변성 조건 하에 각각의 별개의 파트너는 다른 파트너에 결합할 수 있는 그 자신을 제시한다. 구체적으로, 비-변성 조건 하에 별개의 파트너는 다른 종류의 파트너와의 결합을 형성할 수 없게 만들 어떤 분자내 결합도 형성하지 않는다. 예를 들면, 분자내 접힘은 비-변성 조건 하에, 2가지 상이한 종류의 결합 파트너의 원하는 분자간 결합을 저해하거나 또는 예방할 만큼 안정될 이차 구조를 야기할 수 있었다.
하지만, 어느 한쪽 또는 양쪽 결합 파트너에게 영향을 주는 분자내 접힘이 이들 2가지 상이한 종류의 원하는 분자간 결합을 반드시 완전하게 저해하는 것은 아닐 수도 있다; 분자간 결합의 동역학이 분자내 접힘이 없는 방해받지 않는 결합 파트너와 비교하여 더욱 느려질 것으로 예상된다. 특히, 표준화된 고처리량 검정 셋업, 예컨대 (하지만 제한 없이) 자동화된 면역검정을 고려하면, 이런 세팅은 전형적으로, 이전에 별개의 결합 파트너로부터 결합 쌍의 분자간 연결된 형태의 신속한 형성을 필요로 한다. 따라서, 각 결합 파트너에서 분자내 접힘의 부재 또는 거의 최소화가 원하는 기술적인 특질이다.
본원 발명의 맥락에서, 그리고 특히 면역검정 및 수용체와 이의 표적 물질 (피분석물)의 상호작용에 관하여, 비-변성 조건은 더욱 특정하게는, 수용체 (예를 들면, 항체)와 이의 표적 물질 (피분석물)의 상호작용과 결합을 가능하게 하는 입체형태를 수용체가 획득하고 및/또는 유지하는 데 허용적인 환경의 집합적인 특질로서 이해된다. 이와 동시에, 비-변성 조건에 의해 제공된 환경은 표적 물질이 수용체에 의해 결합되고 및/또는 결합된 상태로 남아있도록 하는 입체형태를 표적 물질이 획득하고 및/또는 유지하는 데 허용적이다.
특히 전부-LNA 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 가용한 현재의 도구에 의해 신뢰성 있게 예측될 수 없는 특질을 갖는다. 실질적인 이유로, 본 연구는 15개까지의 LNA 단량체로 구성되는 ss-올리고뉴클레오티드에 한정되었다.
따라서, 본원 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 모든 다른 양상과 구체예에 관련된 첫 번째 양상에서, 결합 쌍을 제공하되, 상기 결합 쌍이 첫 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 이들 2개의 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되는 첫 번째 단일 가닥 (= ss-) 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 첫 번째 핵염기 서열을 형성하는 단계;
(b) 8 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되는 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드가 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드와 적어도 동일한 숫자의 단량체로 구성되고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 상기 두 번째 핵염기 서열이 역평행 방향으로 첫 번째 핵염기 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되고, 그리고 상보성에 의하여, 서로 이중나선을 형성하는 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 능력을 예측하되, 상기 이중나선이 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍으로 구성되는 단계;
(c) 수성 용액에서 20℃ 내지 40℃의 온도에서 20 분 또는 그 이하의 시간 간격 동안 동등한 몰량의 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 혼합하고 항온처리하고, 따라서 ss-올리고뉴클레오티드의 혼합물 또는 이중나선-내포 혼합물을 획득하는 단계; 그 이후에
(d) 20℃ 내지 40℃의 온도에서 (c) 단계에서 획득된 혼합물을 분리하고, 그 이후에 분리된 이중나선 (존재하면)을 검출하고 정량하고, 그리고 분리된 ss-올리고뉴클레오티드를 검출하고 정량하는 단계; 그 이후에
(e) 만약 (d) 단계에서 이중나선이 검출가능하게 존재하면, 그리고 만약 이중나선의 몰량이 ss-올리고뉴클레오티드의 몰량보다 높으면, 결합 쌍을 선별하고;
따라서 결합 쌍을 제공하는 단계.
본원에서 특정된 바와 같은 전부-LNA ss-올리고뉴클레오티드는 다수의 단량체를 내포할 수 있고, 이들의 숫자는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15개로 구성된 군에서 선택된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 8 내지 12개의 단량체 (다시 말하면, 8, 9, 10, 11 및 12개의 단량체에서 선택되는 숫자)로 구성되고, 그리고 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 더욱 특정한 구체예에서, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 8개의 단량체로 구성된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 8 내지 10개의 단량체 (다시 말하면, 8, 9 및 10개의 단량체에서 선택되는 숫자)로 구성되고, 그리고 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 더욱 특정한 구체예에서, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 9개의 단량체로 구성된다. 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 동등한 크기일 필요가 없다, 다시 말하면, 동등한 숫자의 단량체로 구성될 필요가 없다. 하지만, 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 구성하는 동등한 숫자의 단량체는 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예이다.
2개의 올리고뉴클레오티드는 만약 그들이 서로 평형하지만 반대의 정렬로 작동한다면 역평행이다. 특정한 실례는 핵산 이중나선의 2개의 상보성 가닥인데, 이들은 서로 나란히 반대의 방향으로 작동한다. 결과로서, 이중나선의 각 단부는 반대의 두 번째 가닥의 3'단부의 바로 옆에/이와 함께 정렬된 첫 번째 가닥의 5' 단부를 포함한다. DNA 및 RNA와 유사하게, LNA는 왓슨 크릭 염기 대합을 전시한다 (Koshkin, A. A.et al. J Am Chem Soc 120 (1998) 13252-13260). 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 각 LNA 단량체는 아데닌, 티민, 우라실, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌으로 구성된 군에서 선택되는 핵염기를 포함한다. 상보성 반대 가닥 상에서 이들 염기를 수반하는 특이적 왓슨 크릭 염기 대합은 당업자에게 널리 알려져 있고 당해 분야에서 폭넓게 공개된 용인된 특질이다. 열거된 핵염기와는 별개로, 전부-LNA ss-올리고뉴클레오티드에 통합될 수 있는 다른 것들 역시 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, 이들은 C-5 원자에서 유도체화된 피리미딘을 포함한다.
중요하게는, 2개의 상이한 (다시 말하면, 첫 번째와 두 번째) ss-올리고뉴클레오티드를 접촉시킨 후, 상기 방법의 (c) 단계는 20 분 또는 그 이하의 시간 간격 동안 항온처리를 명시한다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서, 시간 간격은 1 초 내지 20 분, 1 초 내지 15 분, 1 초 내지 10 분, 1 초 내지 5 분, 1 초 내지 1 분, 1 초 내지 30 초, 1 초 내지 20 초, 1 초 내지 10 초, 그리고 1 초 내지 5 초로 구성된 군에서 선택된다. 매우 유리한 시간 간격은 1 초 내지 10 초, 그리고 1 초 내지 5 초에서 선택된다.
(c) 단계에서 온도는 (d) 단계에서 온도에서 독립적으로 선택되고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서, (c) 및 (d) 단계에서 온도는 5℃ 이상 차이가 나지지 않는다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서 (c) 단계에서 및/또는 (d) 단계에서 온도는 20℃ 내지 25℃이다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서 (c) 단계에서 및/또는 (d) 단계에서 온도는 25℃ 내지 37℃이다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 특정한 구체예에서, (c) 단계에 앞서 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드 및 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 -80℃ 내지 40℃, 특정하게는 20℃ 내지 40℃, 더욱 특정하게는 20℃ 내지 25℃, 훨씬 특정하게는 25℃ 내지 37℃의 온도에서 유지된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, (c) 단계에서 수성 용액은 용액의 pH를 pH 6 내지 pH 8, 더욱 특정하게는 pH 6.5 내지 pH 7.5로 유지하는 완충액을 내포한다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, (c) 단계에서 수성 용액은 염을 내포한다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, (c) 단계에서 수성 용액은 10 mmol/L 내지 500 mmol/L, 더욱 특정하게는 200 mmol/L 내지 300 mmol/L, 더욱 특정하게는 10 mmol/L 내지 150 mmol/L, 더욱 특정하게는 50 mmol/L 내지 200 mmol/L의 용해성 물질의 총량을 내포한다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, (d) 단계는 (c) 단계의 항온처리된 혼합물을, 수성 용매를 이동상으로서 포함하는 칼럼 크로마토그래피에 종속시키는 것을 포함한다. 따라서, 칼럼 크로마토그래피가 ss-올리고뉴클레오티드로부터 이중나선 분자를 분리하는 데 이용된다. 적합한 크로마토그래피 방법, 예컨대 HPLC는 이점에 관하여 당업자에게 널리 알려져 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, (a) 및 (b)의 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-D-LNA 단량체로 구성된다. 다시 말하면, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-D-LNA 단량체로 전적으로 구성되고, 그리고 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-D-LNA 단량체로 전적으로 구성된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 또 다른 구체예에서, (a) 및 (b)의 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-L-LNA 단량체로 구성된다. 다시 말하면, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-L-LNA 단량체로 전적으로 구성되고, 그리고 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-L-LNA 단량체로 전적으로 구성된다.
본원에서 개시된 바와 같은 방법에 의하여, 그리고 또한, 이의 임의의 구체예에 의하여, 본원 발명은 25℃ 내지 40℃의 미리 선별된 온도에서, 각각 8 내지 15개의 LNA 단량체를 포함하는, 상보성 단일 가닥 전부-LNA 소중합체의 비-변성된 쌍으로부터 형성된 전부-LNA 이중나선을 제공한다.
본원 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 모든 다른 양상과 구체예에 관련된 두 번째 양상에서, 수성 용매, 그리고 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되는 결합 쌍을 포함하는 액체 조성물을 제공하고, 여기서 각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되고, 각 단량체는 핵염기를 포함하고, 이들 단량체의 핵염기는 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 여기서 상기 첫 번째 핵염기 서열 및 상기 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고, 그리고 여기서 상기 결합 쌍은 본원에서 개시된 바와 같은 첫 번째 양상에 따른 방법에 의해 획득가능하다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서, 수성 용매, 그리고 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되는 결합 쌍을 포함하는 액체 조성물이 제공되고, 여기서 각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되고, 각 단량체는 핵염기를 포함하고, 이들 단량체의 핵염기는 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 여기서 상기 첫 번째 핵염기 서열 및 상기 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고, 그리고 여기서 상기 결합 쌍은 본원에서 개시된 바와 같은 첫 번째 양상에 따른 방법에 의해 획득가능하다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 특정한 구체예에서, 수성 용매, 그리고 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되는 결합 쌍을 포함하는 액체 조성물이 제공되고, 여기서 각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되고, 각 단량체는 핵염기를 포함하고, 이들 단량체의 핵염기는 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 여기서 상기 첫 번째 핵염기 서열 및 상기 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고, 그리고 여기서 상기 결합 쌍은 본원에서 개시된 바와 같은 첫 번째 양상에 따른 방법에 의해 획득가능하다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 각 올리고뉴클레오티드는 9 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되고, 여기서 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 9개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고, 그리고 여기서 결합 쌍은 첫 번째 양상의 방법 및 이의 구체예에 따른 방법에 의해 획득가능하거나 또는 획득된다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 각 ss-올리고뉴클레오티드는 2개 또는 3개의 상이한 핵염기를 내포한다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 각 ss-올리고뉴클레오티드에서 핵염기는 G+C (G 및 C의 유사체 포함) 함량이 75%보다 낮다. 특정한 구체예에서, G+C 함량은 74%, 73%, 72%, 71% 및 70%에서 선택되는 값보다 낮다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 또 다른 구체예에서, 결합 쌍에서 각 LNA 단량체는 아데닌, 티민, 우라실, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌으로 구성된 군에서 선택되는 핵염기를 포함한다. 더욱 특정한 구체예에서, 각 ss-올리고뉴클레오티드에서 핵염기 사이에서 각 시토신은 5-메틸시토신에 의해 대체된다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 2개의 별개의 양립성 결합 파트너의 결합 쌍은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 한 쌍의 전부-LNA ss-올리고뉴클레오티드이다:
5' tgctcctg 3' 및 5' caggagca 3',
5' gcctgacg 3' 및 5' cgtcaggc 3',
5' ctgcctgacg 3' 및 5' cgtcaggcag 3',
5' gactgcctgacg 3' 및 5' cgtcaggcagtc 3',
5' tgctcctgt 3' 및 5' acaggagca 3',
5' gtgcgtct 3' 및 5' agacgcac 3',
5' gttggtgt 3' 및 5' acaccaac 3',
5' caacacaccaac 3' 및 5' gttggtgtgttg 3',
5' acacaccaac 3' 및 5' gttggtgtgt 3',
5' acaccaac 3' 및 5' gttggtgt 3'
특정한 구체예에서, 앞서 말한 군의 임의의 선별된 쌍에서 ss-올리고뉴클레오티드의 단량체는 베타-D-LNA 단량체이다. 또 다른 특정한 구체예에서, 앞서 말한 군의 임의의 선별된 쌍에서 ss-올리고뉴클레오티드의 단량체는 베타-L-LNA 단량체이다.
본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 한 구체예에서, 결합 쌍의 한쪽 ss-올리고뉴클레오티드는 자성 비드, 상자성 비드, 합성 유기 중합체 (라텍스) 비드, 다당류 비드, 시험관, 마이크로웰 평판 공동, 큐벳, 막, 골격 분자, 석영 결정, 필름, 필터지, 디스크 및 칩으로 구성된 군에서 선택되는 고체상에 부착된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 다른 구체예에서, 결합 쌍의 한쪽 ss-올리고뉴클레오티드는 펩티드, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 당, 글리칸, 합텐 및 염료로 구성된 군에서 선택되는 분자에 연결된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 또 다른 구체예에서, ss-올리고뉴클레오티드는 링커에 공유 부착된다. 본원에서 개시된 바와 같은 모든 양상과 구체예의 또 다른 구체예에서, ss-올리고뉴클레오티드는 수용체-기초된 피분석물 검출 검정, 예컨대 하지만 제한 없이, 면역검정에서 유용한 피분석물-특이적 수용체에 공유 부착된다.
가장 넓은 의미에서 및 생화학에서 일반적으로 용인되는 이해와 일관하게, 수용체는 전체로서 특이적 표적 분자에 대한 친화성, 또는 표적 분자의 특이적 분자 영역 및/또는 3차원 양상에 대한 친화성을 갖는 구조이다. 본원 발명의 목적으로, 수용체는 표적 분자와 상호작용하고 이것에 결합하는 것으로 이해된다. 생화학적 검정에서 수용체는 표적을 복합 혼합물로부터 분리하기 위해 표적 분자를 포획하고, 그리고 표적 분자를 피분석물로서 결정하는 데 이용될 수 있다. 실례로서, 면역검정은 전형적으로, 항체 또는 항체-유래된 분자를 수용체로서 이용한다. 포획 수용체는 고정된 형태로 (다시 말하면, 고체상에 부착됨), 또는 바람직하게는, 고정될 수 있는 형태로 제공되는 수용체이다. 고정은 고체상 및 수용체를 연결하거나 또는 연결할 수 있는 결합 쌍의 수단에 의해 달성될 수 있다.
매우 일반적인 용어에서, 면역검정은 표적 피분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 수용체를 제공한다. 이런 수용체는 피분석물-특이적 면역글로불린에 의해 예시될 수 있고; 따라서 면역검정으로 명명된다. 하지만, 본원 발명의 목적으로, 임의의 다른 유형의 피분석물-특이적 수용체 역시 고려된다. 따라서, 더욱 일반적인 용어 수용체-기초된 피분석물 검출 검정이 적합하다.
전형적으로, 표적 피분석물은 표본 내에 포함되고, 여기서 표본은 상이한 분자의 복합 혼합물이다. 본원 발명의 목적으로, 액체 표본이 고려된다. 액체 표본은 액체상, 다시 말하면, 통상적으로 수성 용매인 액체 용매를 포함한다. 수성 용매에서 복수의 분자가 용해된 상태로 존재한다. 따라서, 특정한 구체예에서 표본은 응집의 액체 상태에 있고, 그리고 이것은 단상의 균질성 혼합물이다. 특정한 구체예에서 피분석물은 용해된 형태에서 혼합물 내에 포함되고, 그리고 이에 더하여 한 가지 또는 그 이상의 추가 분자가 용해된 형태로 혼합물 내에 존재한다.
첫 번째 필수적인 단계에서, 수용체-기초된 피분석물 검출 검정에 의하여, 액체 표본 내에 존재하거나, 또는 그 안에 존재하는 것으로 의심되는 표적 피분석물의 검출에 대하여, 피분석물은 특이적으로 결합된다. 특이적 결합은 수용체가 존재하거나 또는 존재하게 된다는 것을 암시하는데, 여기서 상기 수용체는 표적 피분석물에 대해 높고, 그리고 표본 내에 또한 존재하는 추가 분자에 대해 낮거나 또는 부재하는, 피분석물에 대한 결합 친화성 및 결합 특이성을 갖는다. 특정한 구체예 (및 예시된 다수의 기존 검정)에서, 피분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 포함하는 화합물이 표본에 첨가된다. 중요하게는, 표본 및 수용체를 포함하는 화합물의 혼합물은 표본 내에 수용체 및 표적 피분석물의 특이적 상호작용에 허용적인 조건을 제공해야 한다. 이것은 상기 혼합물에서 조건이 수용체에 의한 피분석물의 실제 결합에 허용적이어야 한다는 것을 포함하고, 그리고 이들 조건은 결합된 표적 피분석물을 갖는 수용체를 안정시키는 것이 요망된다. 이와 동시에, 표본 및 화합물의 혼합물은 수용체에, 또는 전체로서 수용체를 포함하는 화합물에 추가 분자의 불특정 결합에 우호적이거나 또는 이를 안정시키지 않도록 하는 것이 요망된다.
차후에, 피분석물은 고정된다. 고정은 검출 과정에서 중요한 단계인데, 그 이유는 이것이 주변 복합 혼합물로부터, 구체적으로 표본의 추가 분자로부터 피분석물을 분리하는 것을 가능하게 하기 때문이다. 고정은 표적 피분석물이 부착하게 되는 고체상을 필요로 한다. 일단 고정되면, 피분석물은 상 분리에 의하여 혼합물로부터 분리될 수 있다. 혼합물로부터 분리된 (다시 말하면, 정제된) 피분석물은 이후, 검출된다.
수용체-기초된 피분석물 검출 검정 및 고정 단계를 고려하면, 고체상을 제공하고, 그리고 고체상 및 표적 피분석물 사이에 연결을 구축하는 것이 요구된다. 이러한 결합은 자가조립 과정에서 빌드업하는 것이 바람직하다.
면역검정은 충분히 확립된 생물분석 방법인데, 여기서 피분석물의 검출 또는 정량은 피분석물 및 적어도 하나의 피분석물-특이적 수용체의 반응, 따라서 피분석물:수용체 복합체 형성에 의존한다. 무제한적 실례는 각각, 항원 및 항체 사이에 반응이다. "샌드위치" 면역검정의 특정한 구체예가 하나 이상의 인식 에피토프를 소유하는 피분석물에 이용될 수 있다. 따라서, 샌드위치 검정은 피분석물 상에서 비중복 에피토프에 부착하는 적어도 2개의 수용체를 필요로 한다. "이질성 샌드위치 면역검정"에서 이들 수용체 중에서 하나는 피분석물-특이적 포획 수용체의 기능적 역할을 갖는다; 이러한 수용체는 고체상 위에 고정되거나 또는 (검정의 코스 동안) 고정되게 된다. 두 번째 피분석물-특이적 수용체가 액체상에서 용해된 형태로 공급된다. 일단 개별 피분석물이 첫 번째와 두 번째 수용체에 의해 결합되면, 샌드위치-유사 복합체가 형성된다 (수용체-1:피분석물:수용체-2). 샌드위치-유사 복합체는 "검출 복합체"로서 또한 지칭된다. 검출 복합체 내에서 피분석물은 수용체 사이에 끼인다, 다시 말하면, 이런 복합체에서 피분석물은 첫 번째 수용체 및 두 번째 수용체 사이에 연결 요소를 나타낸다.
용어 "이질성" ("균질성"과는 대조적으로)은 검정 절차에서 2가지 필수적인 별개의 단계를 나타낸다. 첫 번째 단계에서 검출 복합체 내포 표지가 형성되고 고정되지만, 결합되지 않은 표지가 복합체를 여전히 둘러싼다. 표지-의존성 신호의 결정에 앞서, 결합되지 않은 표지가 고정된 검출 복합체로부터 씻겨 나가고, 따라서 두 번째 단계를 나타낸다. 대조적으로, 균질성 검정은 단일-단계 항온처리에 의하여 피분석물-의존성 검출가능 신호를 발생시키고 세척 단계를 필요로 하지 않는다.
이질성 검정에서 고체상은 피분석물과 접촉되기 전, 자신의 표면에 기능적 포획 수용체 (첫 번째 수용체)를 결합시킬 수 있도록 기능화되거나; 또는 고체상의 표면은 첫 번째 수용체가 피분석물과 반응한 후, 이것을 정착시킬 수 있도록 하기 위해 기능화된다. 후자 경우에 정착 과정은 피분석물을 특이적으로 포획하고 이것에 결합하는 수용체의 능력을 간섭하지 않아야 한다. 액체상 내에 존재하는 두 번째 수용체가 결합된 피분석물의 검출에 이용된다. 따라서, 이질성 면역검정에서 피분석물은 첫 번째 (포획)와 두 번째 (검출기) 수용체에 결합하도록 허용된다. 따라서 "검출 복합체"가 형성되는데, 여기서 피분석물은 포획 수용체 및 검출기 수용체 사이에 끼인다. 전형적인 구체예에서 검출기 수용체는 피분석물과 접촉되기 전 표지화된다; 대안으로, 피분석물 결합 후 표지가 검출기 수용체에 특이적으로 부착된다. 검출 복합체가 고체상 위에 고정되면, 고체상에서 검출가능한 표지의 양은 끼인 피분석물의 양에 상응한다. 세척 단계로 결합되지 않은 표지의 제거 후, 피분석물의 존재와 양을 지시하는 고정된 표지가 검출될 수 있다.
다른 널리 알려진 구체예는 경쟁 이질성 면역검정인데, 이것은 가장 단순한 형태에서, 두 번째 검출기 수용체의 결여에 의해 샌드위치-유형 형식과 상이하다. 대조적으로, 피분석물을 갖는 표본은 피분석물-특이적 수용체와 교차반응할 수 있는 인위적으로 생산된 표지화된 아날로공과 혼합된다. 상기 검정에서 피분석물 및 아날로공은 고정되거나 또는 고정되게 되는 포획 수용체에 결합에 대해 경쟁한다. 결합 단계 이후에, 고정된 표지의 양이 더욱 많을수록, 포획 수용체에 대해 경쟁할 수 있는 비표지화된 피분석물의 양이 더욱 적었다. 세척 단계 후, 고정된 표지가 결정된다. 따라서 고체상에서 검출가능한 표지의 양은 표본 내에 초기에 존재했던 피분석물의 양에 역으로 상응한다.
이질성 면역검정에서 필요한 임의의 세척 단계(들)는 첫 번째 결합 파트너 및 두 번째 결합 파트너의 비공유 결합이 충분히 안정되도록 하는 것을 필요로 한다. 하지만, 결합의 필요한 안정성의 정도는 적용되는 세척 단계(들)의 강도에 의존한다. 중요하게는 및 예상치 않게, 본원에서 예시된 바와 같은 결합 쌍은 면역검정에서 고정 단계를 가능하게 하는데 이례적으로 적합하다. 다시 말하면, 면역검정에서 예를 들면, 고체상에 부착된 결합 쌍의 첫 번째 결합 파트너, 그리고 피분석물-특이적 (포획) 수용체에 부착된 결합 쌍의 두 번째 결합 파트너는 고체상에서 수용체의 고정을 가능하게 하는 데 충분히 적합하다.
하기의 실시예 및 도면은 본원 발명에 관한 이해를 보조하기 위해 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 진술된다. 본원 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서, 진술된 절차에서 변형이 만들어질 수 있는 것으로 이해된다.
도면에 관한 설명
도 1 단일 가닥 LNA 1의 HPLC 분석 (실시예 2)
도 2 단일 가닥 LNA 2의 HPLC 분석 (실시예 2)
도 3 혼합된 LNA 1 및 LNA 2, HPLC 시스템 내로 즉시 주입의 HPLC 분석 (실시예 2)
도 4 주입에 앞서 열 변성 후 혼합된 LNA 1 및 LNA 2의 HPLC 분석 (실시예 2) 양성 대조: 이중나선 형성
도 5 단일 가닥 LNA 3의 HPLC 분석 (실시예 2)
도 6 단일 가닥 LNA 4의 HPLC 분석 (실시예 2)
도 7 혼합된 LNA 3 및 LNA 4, HPLC 시스템 내로 즉시 주입의 HPLC 분석 (실시예 2) 느린 이중나선 형성 (비율 < 0.05)
도 8 혼합된 LNA 3 및 LNA 4, 50 분 후 주입의 HPLC 분석 (실시예 2) 느린 이중나선 형성 (비율 = 0.05)
도 9 주입에 앞서 열 변성 후 혼합된 LNA 3 및 LNA 4의 HPLC 분석 (실시예 2) 양성 대조: 이중나선 형성
실시예 1
LNA 올리고뉴클레오티드의 합성
LNA 올리고뉴클레오티드는 표준 자동화된 고체상 DNA 합성 절차를 이용하고 포스포라미디트 화학을 적용하여 ABI 394 DNA 합성장치에서 1 μmole 규모 합성에서 합성되었다. Glen UnySupport PS (Glen Research 카탈로그 번호 26-5040) 및 LNA 포스포라미디트 (Qiagen/Exiqon 카탈로그 번호 33970 (LNA-A(Bz), 339702 (LNA-T), 339705 (LNA-mC(Bz) 및 339706 (LNA-G(dmf); β-L-LNA 유사체가 A.A. Koshkin et al., J.Org. Chem 2001, 66, 8504-8512에 따라서 L-글루코오스 (Carbosynth, 카탈로그 번호 MG05247)로부터 시작하여 D-β-LNA 포스포라미디트와 유사하게 합성되었다)뿐만 아니라 스페이서 포스포라미디트 18 (Glen Research 카탈로그 번호 10-1918) 및 5'-비오틴 포스포라미디트 (Glen Research 카탈로그 번호 10-5950)가 빌딩 블록으로서 이용되었다. 모든 포스포라미디트는 DNA 등급 아세토니트릴에서 0,1 M의 농도에서 적용되었다. 연장된 연계 시간 (180 초), 연장된 산화 (45 초) 및 탈트리틸화 시간 (85 초), 그리고 표준 합성 시약과 용매를 포함하는 표준 DNA 주기가 LNA 올리고뉴클레오티드의 어셈블리에 이용되었다. 5'-비오틴화된 LNA 올리고뉴클레오티드는 합성된 DMToff이었고, 반면 변형되지 않은 LNA 올리고뉴클레오티드는 DMTon으로서 합성되었다. 이후, 표준 개열 프로그램이 농축된 암모니아에 의한 지지체로부터 LNA 올리고뉴클레오티드의 개열에 적용되었다. 잔여 보호 기는 농축된 암모니아로 처리 (56 ℃에서 8 시간)에 의해 개열되었다. 미가공 LNA 올리고뉴클레오티드는 증발되고, 그리고 0,1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배를 이용하여 RP HPLC (칼럼: PRP-1, 7 μm, 250 x 21.5 mm (Hamilton, 부품 번호 79352) 또는 XBridge BEH C18 OBD, 5 μm, 10 x 250 mm (Waters 부품 번호 186008167)에 의해 정제되었다. 산물 분획물은 조합되고, 그리고 3 일 동안 물에 대해 투석 (MWCO 1000, SpectraPor 6, 부품 번호 132638)에 의해 탈염되고, 따라서 DMTon 정제된 올리고뉴클레오티드의 DMT 기가 또한 개열되었다. 최종적으로, LNA 올리고뉴클레오티드는 동결 건조되었다.
수율은 85 내지 360 나노몰의 범위에서 변하였다.
LNA 올리고뉴클레오티드는 0,1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배를 이용하여 RP18 HPLC (Chromolith RP18e, Merck 부품 번호 1.02129.0001)에 의해 분석되었다. 전형적인 순도는 > 90%이었다. LNA 올리고뉴클레오티드의 정체는 LC-MS 분석에 의해 확증되었다.
실시예 2
RP-HPLC 분석을 적용하여, 사전 변성 없이 이중나선을 형성할 수 있는 LNA 올리고뉴클레오티드 서열의 확인
a) 일반적인 방법:
실시예 1로부터 LNA 올리고뉴클레오티드는 완충액 (0.01 M Hepes pH 7.4, 0.15 M NaCl)에서 용해되고, 그리고 0.1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배 (10 분 동안 8-24% 아세토니트릴; 260 nm에서 검출)를 이용하여 RP18 HPLC (Chromolith RP18e, Merck 부품 번호 1.02129.0001)에서 분석되었다.
가닥 및 상응하는 반대가닥 LNA 올리고뉴클레오티드는 실온에서 동몰 농도로 혼합되고, 그리고 0.1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배 (10 분 동안 8-24% B; 260 nm에서 검출)를 이용하여 RP18 HPLC (Chromolith RP18e, Merck 부품 번호 1.02129.0001)에서 즉시 분석되었다.
첫 번째 대조 실험에서 가닥 및 상응하는 반대가닥 LNA 올리고뉴클레오티드는 실온에서 동몰 농도로 혼합되고, 실온에서 1 시간 항온처리되고, 그리고 그 후에 0.1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배 (10 분 동안 8-25% 아세토니트릴; 260 nm에서 검출)를 이용하여 RP18 HPLC (Chromolith RP18e, Merck 부품 번호 1.02129.0001)에서 분석되었다.
이중나선 형성을 보여주기 위한 두 번째 대조 실험 (양성 대조)에서 가닥 및 상응하는 반대가닥 LNA 올리고뉴클레오티드는 실온에서 동몰 농도로 혼합되고, 95 ℃ (10 분)에서 열에 의해 변성되고, 그리고 다시 한 번 실온에 도달한 후, 0.1 M 트리에틸암모늄 아세트산염 pH 7 / 아세토니트릴 구배 (10 분 동안 8-24% 아세토니트릴; 260 nm에서 검출)를 이용하여 RP18 HPLC (Chromolith RP18e, Merck 부품 번호 1.02129.0001)에서 분석되었다.
만약 개별 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교하여 상이한 체류 시간에서 새로운 피크가 형성되면, 이중나선 형성이 검출될 수 있다. 양성 대조에서 혼합된 가닥 및 반대가닥은 주입에 앞서 열에 의해 변성되어 이중나선이 산출된다. 사전 변성 없이 가닥 및 반대가닥 LNA를 실온에서 혼합한 후 시간 의존성 주입에 의해, 이중나선 형성의 동역학이 모니터링될 수 있다.
만약 형성된 이중나선 및 양쪽 단일 가닥 LNA 중에서 한 가지의 HPLC% 비율 (흡광 계수에 의해 교정됨; 양쪽 가닥이 정확하게 동몰이 아닌 경우에는 더욱 높은 비율 값이 고려된다)이 사전 변성 없이 실온에서 5-60 분 동안 템퍼링 후 > 0.9 (흡광 계수에 의해 교정된 HPLC%; 이중나선의 흡광증가는 고려되지 않음)이면, LNA 서열은 이중나선을 신속하게 형성할 수 있는 것으로 결정된다.
b) 이중나선을 빠르게 형성하는 서열의 확인
LNA 1: 5'-tgctcctg-3'
LNA 2: 5'-Bi-Heg-caggagca-3'
Heg = 헥사에틸렌글리콜
Bi = 비오틴의 발레르산 모이어티의 카르복시 기능기를 통해 부착된 비오틴 표지
결과는 도면에서 전시된다.
c) 이중나선을 느리게 형성하는 서열의 확인
LNA 3: 5'-ctgcctgacg-3'
LNA 4: 5'-Bi-Heg-cgtcaggcag-3'
결과는 도면에서 전시된다.
비율의 계산:
Figure pct00002
HPLC% * ε -1*1000 (LNA 3/LNA 4 이중 가닥) / HPLC% * ε -1*1000 (LNA 3 단일 가닥) = 0.023/0.456 = 0.05
HPLC% * ε -1*1000 (LNA 3/LNA 4 이중 가닥) / HPLC% * ε -1*1000 (LNA 4 단일 가닥) = 0.023/0.457 = 0.05
<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH <120> Hybridizing all-LNA oligonucleotides <130> P34851-WO (MI) <150> EP18178946.2 <151> 2018-06-21 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 1 tgctcctg 8 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 2 caggagca 8 <210> 3 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 3 gcctgacg 8 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 4 cgtcaggc 8 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 5 ctgcctgacg 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 6 cgtcaggcag 10 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 7 gactgcctga cg 12 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 8 cgtcaggcag tc 12 <210> 9 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 9 tgctcctgt 9 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 10 acaggagca 9 <210> 11 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 11 gtgcgtct 8 <210> 12 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 12 agacgcac 8 <210> 13 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 13 gttggtgt 8 <210> 14 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 14 acaccaac 8 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 15 caacacacca ac 12 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 16 gttggtgtgt tg 12 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 17 acacaccaac 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 18 gttggtgtgt 10 <210> 19 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 19 acaccaac 8 <210> 20 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> all-LNA oligo <400> 20 gttggtgt 8

Claims (21)

  1. 결합 쌍을 제공하되, 상기 결합 쌍이 첫 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 LNA 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 이들 2개의 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있는 방법에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되는 첫 번째 단일 가닥 (= ss-) 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 첫 번째 핵염기 서열을 형성하는 단계;
    (b) 8 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되는 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드가 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드와 적어도 동일한 숫자의 단량체로 구성되고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 각 단량체가 핵염기를 포함하고, 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 핵염기가 상기 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고, 상기 두 번째 핵염기 서열이 역평행 방향으로 첫 번째 핵염기 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되고, 그리고 서로 이중나선을 형성하는 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드의 능력을 이론적으로 제안하되, 상기 이중나선이 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍으로 구성되는 단계;
    (c) 수성 용액에서 20℃ 내지 40℃의 온도에서 20 분 또는 그 이하의 시간 간격 동안 동등한 몰량의 첫 번째와 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드를 혼합하고 항온처리하고, 따라서 ss-올리고뉴클레오티드의 혼합물 또는 이중나선-내포 혼합물을 획득하는 단계; 그 이후에
    (d) 20℃ 내지 40℃의 온도에서 (c) 단계에서 획득된 혼합물을 분리하고, 그 이후에 분리된 이중나선 (존재하면)을 검출하고 정량하고, 그리고 분리된 ss-올리고뉴클레오티드를 검출하고 정량하는 단계; 그 이후에
    (e) 만약 (d) 단계에서 이중나선이 검출가능하게 존재하면, 그리고 만약 이중나선의 몰량이 ss-올리고뉴클레오티드의 몰량보다 높으면, 결합 쌍을 선별하고;
    따라서 결합 쌍을 제공하는 단계.
  2. 청구항 제 1항에 있어서 1, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 5 내지 9개의 단량체로 구성되는, 방법.
  3. 청구항 제 2항에 있어서, 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 6개의 단량체로 구성되는, 방법.
  4. 청구항 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 LNA 단량체는 아데닌, 티민, 우라실, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌으로 구성된 군에서 선택되는 핵염기를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계에서 온도는 20℃ 내지 37℃인, 방법.
  6. 청구항 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계에 앞서 첫 번째 ss-올리고뉴클레오티드 및 두 번째 ss-올리고뉴클레오티드는 -80℃ 내지 40℃, 특정하게는 20℃ 내지 40℃, 더욱 특정하게는 20℃ 내지 37℃의 온도에서 유지되는, 방법.
  7. 청구항 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계에서 항온처리는 1 분 또는 그 이하 동안 수행되는, 방법.
  8. 청구항 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계에서 수성 용액은 상기 용액의 pH를 pH 6 내지 pH 8, 더욱 특정하게는 pH 6.5 내지 pH 7.5에서 유지하는 완충액을 내포하는, 방법.
  9. 청구항 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계에서 수성 용액은 10 mmol/L 내지 500 mmol/L, 더욱 특정하게는 200 mmol/L 내지 300 mmol/L의 용해성 물질의 총량을 내포하는, 방법.
  10. 청구항 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 단계는 (c) 단계의 항온처리된 혼합물을, 수성 용매를 이동상으로서 포함하는 칼럼 크로마토그래피에 종속시키는 것을 포함하는, 방법.
  11. 청구항 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)의 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-D-LNA 단량체로 구성되는, 방법.
  12. 청구항 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)의 ss-올리고뉴클레오티드는 베타-L-LNA 단량체로 구성되는, 방법.
  13. 수성 용매, 그리고 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되는 결합 쌍을 포함하는 액체 조성물에 있어서,
    각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 잠금 핵산 (= LNA) 단량체로 구성되고, 각 단량체는 핵염기를 포함하고, 이들 단량체의 핵염기는 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 올리고뉴클레오티드의 두 번째 핵염기 서열을 형성하고,
    상기 첫 번째 핵염기 서열 및 상기 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 8 내지 15개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고,
    그리고 상기 결합 쌍은 청구항 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한, 액체 조성물.
  14. 청구항 제 13항에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되고,
    여기서 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 5 내지 9개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고,
    그리고 여기서 결합 쌍은 청구항 제 2항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한, 조성물.
  15. 청구항 제 14항에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드는 9 내지 15개의 LNA 단량체로 구성되고,
    여기서 첫 번째 핵염기 서열 및 두 번째 핵염기 서열은 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드가 20℃ 내지 40℃의 온도에서 9개의 연속 왓슨 크릭 염기쌍의 역평행 이중나선을 형성할 수 있도록 선별되고,
    그리고 여기서 결합 쌍은 청구항 제 3항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한, 조성물.
  16. 청구항 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 각 LNA 단량체는 아데닌, 티민, 우라실, 구아닌, 시토신 및 5-메틸시토신으로 구성된 군에서 선택되는 핵염기를 포함하는, 조성물.
  17. 청구항 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 각 ss-올리고뉴클레오티드는 2개 또는 3개의 상이한 핵염기를 내포하는, 조성물.
  18. 청구항 제 17항에 있어서, 각 ss-올리고뉴클레오티드에서 핵염기 사이에서 G+C 함량은 75%보다 낮은, 조성물.
  19. 청구항 제 17항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 각 ss-올리고뉴클레오티드에서 핵염기 사이에서 각 시토신은 5-메틸시토신에 의해 대체되는, 조성물.
  20. 피분석물-특이적 수용체 및 고체상을 포함하는 이질성 면역검정에서, 결합 쌍을 포함하는 청구항 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도에 있어서, 상기 결합 쌍은 피분석물-특이적 수용체를 고체상 위에 고정시키는, 용도.
  21. 피분석물을 검출하기 위한 이질성 면역검정을 수행하기 위한 키트에 있어서, 청구항 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 결합 쌍의 첫 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 자신에게 부착된 고체상, 그리고 청구항 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 결합 쌍의 두 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 자신에게 부착된 피분석물-특이적 수용체를 별개의 용기에 내포하는, 키트.
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