JP2002527523A

JP2002527523A - 機能付与したピリミジン誘導体

Info

Publication number: JP2002527523A
Application number: JP2000577182A
Authority: JP
Inventors: カーロスエフバーバス; サクティヴェルカンダサミ
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2002-08-27
Also published as: US6175001B1; EP1040116A1; CA2315104A1; WO2000023456A1; AU1120000A; EP1040116A4

Abstract

(57)【要約】 C5において誘導体化され、天然アミノ酸残基の性質を模倣する官能基を含ませた修飾ピリミジンヌクレオチドが提供される。前記修飾ヌクレオチドを含むDNA分子も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野本発明の技術分野はヌクレオチド化学である。より詳細には本発明は修飾かつ
機能付与したピリミジン及び前記ヌクレオチドを取り込んだDNA分子に関する。発明の背景核酸ライブラリーは新規なリガンド及び触媒の選択のためのすばらしい機会を
提供する。なぜなら、ポリメラーゼ連鎖反応PCRは10¹⁴を超える異なる分子を含
むライブラリーの合成及び選択を許容するからである。タンパク質及び小分子に
結合し、かつ限定された反応のセットを触媒するように選択された核酸について
多数の例が存在している ( S. E. Osborne, A. D. Ellington, Chem. Rev. (Was
hington, D. C.) 1997, 97, 349-370; M. Famulok, J. W. Szostak, Angew. Che
m. 1992, 104, 1001-11; Angew. Chem.Int. Ed. Engl. 1992, 31, 979-88; L.
Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M. Yarus, Annu. Rev. Biochem. 1995, 64,
763-97; R. R. Breaker, Chem. Rev. (Washington, D. C.) 1997, 97, 371-390
; R. R. Breaker, Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 26-31; J. R. Lorsch,
J. W. Szostak, Acc. Chem. Res. 1996, 29, 103-10; R. R. Breaker, G. F. J
oyce, Chem. Biol. 1994, 1, 223-9; B. Cuenoud, J. W. Szostak, Nature (Lon
don) 1995, 375, 611-14; R. R. Breaker, G. F. Joyce, Chem. Biol. 1995, 2,
655-60; C. R. Geyer, D. Sen, Chem. Biol. 1997, 4, 579-593; S. W. Santo
ro, J. G. F., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997, 94, 4262-4266; P. Bu
rgstaller, M. Famulok, Angew. Chem. 1995, 107, 1303-06; Angew. Chem. Int
. Ed. Engl. 1995, 34, 1189-92; D. Faulhammer, M. Famulok, Angew. Chem. 1
996, 108, 2984-88; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2837-2841; D.
Faulhammer, M. Famulok, J. Mol. Biol. 1997, 269, 188-202; Y. Li, D. Sen,
Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-747; J. Burmeister, G. von Kiedrowski,
A. D. Ellington, Angew. Chem. 1997, 109, 1379-81; Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 1997, 36, 1321-1324; N. Carmi, L. A. Shultz, R. R. Breaker, Chem.
Biol. 1996, 3, 1039-1046; N. Carmi, H. R. Balkhi, R. R. Breaker, Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998, 95, 2233-2237)。核酸の触媒的及び機構的視野は限定されている。なぜなら、天然のヌクレオチ
ドモノマーは、天然の主要触媒性生体高分子であるタンパク質について利用可能
であるレパートリーと比較して最小の機能性を有するからである。この欠点の認
識において、結合及び触媒用の核酸の可能性を増加させる期待を持ってインビト
ロ選択に適した機能付与したヌクレオチドの開発に多数の注目が集まっている(
B. E. Eaton, W. A. Pieken, Annu. Rev. Biochem. 1995, 64, 837-63; B. E. E
aton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 10-16; G. J. Crouch, B. E. Eaton,
Nucleosides Nucleotides 1994, 13 939-44; T. M. Dewey, A. Mundt, G. J. C
rouch, M. C. Zyzniewski, B. E. Eaton, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8474-
5; T. M. Dewey, M. C. Zyzniewski, B. E. Eaton, Nucleosides Nucleotides 1
996, 15, 1611-1617; C. Tu, C. Keane, B. E. Eaton, Nucleosides Nucleotide
s 1995, 14, 1631-8; P. A. Limbach, P. F. Crain, J. A. McCloskey, Nucleic
Acids Res. 1994, 22, 2183-96; H. Aurup, D. M. Williams, F. Eckstein, Bi
ochemistry 1992, 31, 9636-41)。機能化ヌクレオチド三リン酸はRNAポリメラー
ゼの基質であることが示されている ( T. M. Dewey, A. Mundt, G. J. Crouch,
M. C. Zyzniewski, B. E. Eaton, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8474-5; H. A
urup, D. M. Williams, F. Eckstein, Biochemistry 1992, 31, 9636-41)。更に
触媒性 RNAのその活性についての修飾塩基への依存性が選択されている ( T. W.
Wiegand, R. C. Janssen, B. E. Eaton, Chem. Biol. 1997, 4, 675-683; T. M
. Tarasow, S. L. Tarasow, B. E. Eaton, Nature (London) 1997, 389, 54-57)
。RNAと同様に、DNAはタンパク質及び小分子に結合するものが選択され、最近で
は反応を触媒するものが選択されている ( S. E. Osborne, A. D. Ellington, C
hem. Rev. (Washington, D. C.) 1997, 97, 349-370; M. Famulok, J. W. Szost
ak, Angew. Chem. 1992, 104, 1001-11; Angew. Chem.Int. Ed. Engl. 1992, 31
, 979-88; L. Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M. Yarus, Annu. Rev. Bioch
em. 1995, 64, 763-97; R. R. Breaker, Chem. Rev. (Washington, D. C.) 199
7, 97, 371-390; R. R. Breaker, Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 26-31;
J. R. Lorsch, J. W. Szostak, Acc. Chem. Res. 1996, 29, 103-10; R. R. Br
eaker, G. F. Joyce, Chem. Biol. 1994, 1, 223-9; B. Cuenoud, J. W. Szosta
k, Nature (London) 1995, 375, 611-14; R. R. Breaker, G. F. Joyce, Chem.
Biol. 1995, 2, 655-60; C. R. Geyer, D. Sen, Chem. Biol. 1997, 4, 579-59
3; S. W. Santoro, J. G. F., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997, 94, 42
62-4266; P. Burgstaller, 3M. Famulok, Angew. Chem. 1995, 107, 1303-06; A
ngew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 1189-92; D. Faulhammer, M. Famulok,
Angew. Chem. 1996, 108, 2984-88; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35,
2837-2841; D. Faulhammer, M. Famulok, J. Mol. Biol. 1997, 269, 188-202;
Y. Li, D. Sen, Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-747; J. Burmeister, G. v
on Kiedrowski, A. D. Ellington, Angew. Chem. 1997, 109, 1379-81; Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1321-1324; N. Carmi, L. A. Shultz, R. R.
Breaker, Chem. Biol. 1996, 3, 1039-1046; N. Carmi, H. R. Balkhi, R. R.
Breaker, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998, 95, 2233-2237)。

【０００２】 DNAはRNAと比較して増強された安定性を有するが、この分子の増強された安定
性を提供する2'-ヒドロキシル基の欠如は、化学についてこの分子に利用可能な
機能性を更に減少させる。RNAライブラリー用の修飾ヌクレオチド三リン酸の同
定において達成された成功とは対照的に、熱安定性DNAポリメラーゼ用の良好な
基質が実証され、インビトロDNA選択研究において利用されたデオキシヌクレオ
チド三リン酸である5-(1-ペンチニル)-2' デオキシウリジン三リン酸の単一の例
のみが存在する (J. A. Latham, R. Johnson, J. J. Toole, Nucleic Acids Res
. 1994, 22, 2817-22)。実際は、PCRに要求される熱安定性ポリメラーゼ用の修
飾デオキシヌクレオチド三リン酸基質を同定することの困難性が、酵素的増幅な
しのインビトロ選択用の新規な戦略の開発を導いてきた(J. Smith, E. V. Ansly
n, Angew. Chem. 1997, 109, 1956-58; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 3
6, 1879-1881)。これらの著者は、修飾オリゴマーが組み込まれたとき、選択手
順はわずか1ラウンドの増幅後に終了することを述べている。なぜなら、ポリメ
ラーゼはほとんどの修飾モノヌクレオチドを許容しないからである。それゆえ、
新規な機能的に修飾されたDNA触媒及び結合分子を創造する主要な障害は、熱安
定性ポリメラーゼにより受容される基質構造の決定である。本発明は、修飾DNAのインビトロ選択に適したピリミジン誘導体の系統的合成
によるこの問題の解決策を提供する。発明の要約 1つの側面において本発明は、下記の構造式IIを有する修飾ピリミジンヌクレ
オチドを提供する。

【０００３】

【０００４】式中、 X は NH₂ 又は O であり、C:C は炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素
三重結合を示す。好ましい態様において、 C:C は炭素−炭素二重結合である。構造式IIの各Rは独立してカチオン又は、

【０００５】

【０００６】（式中、各R' は独立して、存在しないか又はカチオンであり、 m は 1、 2 又
は 3である。）である。 R 及び R' のカチオンは好ましくは一価のカチオン、
例えば水素又はアルカリ金属、例えばナトリウム (Na)、カリウム (K) 又はリチ
ウム (Li)である。好ましくは、唯一のRはカチオンである。したがって、構造式
IIの化合物は好ましくは 2'-デオキシ-3'- 又は 5'- ホスフェート (モノ-、ジ
- 又はトリ-ホスフェート)である。構造式IIのR₁は、天然アミノ酸残基の構造及び機能を模倣する官能基である。
官能基は好ましくはアミン又はカルボキシル基である。この態様にしたがうと、
R₁は好ましくは、

【０００７】

【０００８】式中、R₂は、

【０００９】

【００１０】であり、 R₃は、(CH₂)_nCOOH又は、

【００１１】

【００１２】であり、 n は 0 〜 6の整数であり、好ましくは n は 0、 1 又は 2である。別の側面において、本発明は構造式IIで示される1以上の化合物を含むDNA分子
を提供する。DNA 分子が1以上の前記化合物を含む場合、各化合物は同一又は異
なっていてもよい。関連する側面において、更に本発明は構造式IIの化合物を含
むDNA分子を製造する方法であって、前記化合物と、その他のヌクレオチドとを
、ポリメラーゼ又は逆転写酵素と共にDNAの形成に十分な条件下で反応させる工
程を含む方法を提供する。 1以上の構造式IIの化合物を含むDNA分子は、天然DNAよりもヌクレアーゼ消化
に対する耐性が高い。したがって、別の側面において本発明はヌクレアーゼ安定
性DNA分子の製造方法であって、本発明の修飾ヌクレオチドをDNA分子に挿入する
工程を含む方法を提供する。発明の詳細な説明Ｉ．本発明本発明は、修飾ピリミジン、前記修飾ピリミジンを含むヌクレオシド及びヌク
レオチド、前記修飾分子を組み込んだDNA分子、前記DNAの使用及び前記ヌクレオ
チド及びDNA分子の製造方法を提供する。II．修飾ピリミジンピリミジン C5-部位で修飾する。より詳細にはC5-部位を誘導体化して側鎖を
含むようにする。C5-部位の側鎖は、アミノ酸残基の化学的及び生物学的性質を
模倣するように設計されかつ作成される。図1は、20の天然アミノ酸残基の構造
を示している。好ましい態様においては、側鎖は極性アミノ酸残基の性質を模倣
している。したがって、ピリミジンの側鎖が塩基に対して陽性又は陰性を与える
ことが好ましい。この態様にしたがい、修飾塩基を含むヌクレオチドは、DNA分子に取り込まれ
たとき、DNAに静電気的電荷を与える。天然核酸の官能基は中性pHから大きく離
れたpK_aを有し、それゆえ、このpH範囲における一般的酸−塩基触媒反応には適
しない。本明細書に記載する修飾ヌクレオチドの使用は、共有結合電位、静電気
電位及び金属イオン触媒反応に対する増強された電位を提供する。この電荷はDN
Aのアプタメリック（aptameric）性（すなわち、DNAがポリペプチド結合し相互
作用する能力）を増強する。アミノ酸残基官能基は、リンカー部分によりピリミ
ジンのC5部位に付加している。リンカー部分は、アミド結合及びケトン基を含む
不飽和炭化水素鎖である。ピリミジンを官能基に結合するのに適するように示さ
れているリンカー部分は下記の構造を有している。

【００１３】

【００１４】式中、Pyrはピリミジンであり、R₁は官能基であり、C:Cは炭素−炭素二重結合
又は炭素−炭素三重結合である。好ましい態様においては、C:Cは炭素−炭素二
重結合である。したがって、本発明の修飾ピリミジンは下記の構造式Ｉを有する
。

【００１５】

【００１６】式中、XはNH₂又はOであり、C:Cは不飽和炭素結合であり、R₁は

【００１７】

【００１８】であり、式中、R₂は、(CH₂)_nCOOH又は、

【００１９】

【００２０】であり、式中、R₃は、

【００２１】

【００２２】であり、 nは0〜6の整数である。好ましくはnは0、1又は2である。II．デオキシウリジンヌクレオシド及びヌクレオチド本発明のヌクレオシド及びヌクレオチドは、前記の構造式Ｉで示される修飾ピ
リミジンを含んでいる。更に、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドはリボース糖
を含んでいる。リボースは2'-においてヒドロキシル化するか又は非ヒドロキシ
ル化することができる。好ましい態様においては、リボースの2'-部位における
ヒドロキシル基が欠けており、糖部分はデオキシリボースである。好ましい態様
にしたがうと、本発明の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドは下記の構造式IIを有
している。

【００２３】

【００２４】（式中、X、C:C及びR₁は構造式Ｉに関して定義したものと同一であり、各Rは独
立してカチオン又は、

【００２５】

【００２６】式中、R'は独立して存在しないか又はカチオンであり、mは1、2又は3である。
）R及びR'のカチオンは好ましくは一価のカチオン、例えば水素又はアルカリ金
属塩、例えばナトリウム（Na）、カリウム（P）又はリチウム（Li）である。本発明の修飾ヌクレオチドは、種々の合成手順を使用して作成することができ
る(スキーム1、図2を参照)。合成過程は、既知の化合物からのC-5(3-アミノプロ
ペニル)- 2'デオキシウリジン三リン酸又はC-5(3-アミノプロペニル)- 2'デオキ
シシトシン三リン酸の合成で開始する。スキーム1、図2は、既知の化合物2から
のC-5(3-アミノプロペニル)- 2'デオキシウリジン三リン酸の合成を示している
。市販の5-ヨードデオキシウリジンから出発するパラジウム触媒経路は、5-クロ
ロ水銀-2' デオキシウリジンから出発するCook et al. (A. F. Cook, E. Vuocol
o, C. L. Brakel, Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4077-95)の初期の合成スキー
ムより好ましいことを見いだした。ただし、両方とも2を同様の収率で提供した
。2の合成の最適化及びKovacs 及び Otvos (T. Kovacs, L. Otvos, Tetrahedron
Lett. 1988, 29, 4525-8.)の方法論を使用した対応の5'-三リン酸への変換、続
くアミンの脱保護により3を得、これを分析用純度で100mgスケールに単離した。
化合物3は以前にデオキシウリジン三リン酸 (dUTP)から合成されていた。しかし
ながら、副生物の混入及び出発材料としてのdUTPの費用の問題が、この合成系路
に対する深刻な障害となっていた(P. R. Langer, A. A. Waldrop, D. C. Ward,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981, 78, 6633-7)。化合物2及び3の合成の
詳述は、実施例に見いだすことができる。次いで化合物 3を、当該技術分野にお
いて周知の標準技術を使用した修飾デオキシウリジンヌクレオチド調製用の出発
物質として使用した。修飾デオキシウリジンヌクレオチドをスキーム2、図3に示
す。多数の修飾ヌクレオチドの調製の詳細は、下記実施例に見いだすことができ
る。

【００２７】IV．修飾ヌクレオチドを含むDNA分子関連する側面において、本発明は前記の修飾ヌクレオチドを含むDNA分子を提
供する。DNA分子は多数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本発明のDNA分
子は1本鎖又は2本鎖であることができる。DNA分子が二本鎖である場合、修飾ヌ
クレオチドは一方又は両方の鎖に含まれることができる。本発明のDNA分子はあらゆる長さであることができる。好ましくはDNA分子は約
2000塩基対未満、より好ましくは約1000未満の塩基を含んでいる。更に好ましく
はDNA分子は約500未満の塩基対を含んでいる。特に好ましい態様においては、DN
A分子は約100未満の塩基対を含んでいる。本発明のDNA分子は多数の用途を有している。DNA分子はゲノムDNA及び特定の
ポリヌクレオチドをコードするRNA分子の直接転写物であることができる。DNA分
子は、特定のポリヌクレオチドの発現を指示する発現ベクター内のcDNA分子であ
ることができる。DNA分子は、相補的DNA分子に結合するハイブリダイゼーション
プローブとして使用することができる。DNA分子は、発現を阻害するための使用
するアンチセンスDNA分子であることができる。更にDNA分子は、その他のDNA分
子の合成を指示するプライマーとして使用することもできる。本発明のDNA分子は、標的ポリヌクレオチド配列とアニールして、核酸二重鎖
を形成するように設計されかつ合成されたハイブリダイゼーションプローブであ
ることができる。当該技術分野において周知のように、ハイブリダイゼーション
を達成するために要求される時間、温度及びpH条件は、ハイブリダイズするプロ
ーブの長さ、プローブと標的の間の相補性の程度、プローブのグアニジン及びシ
トシン含量、望まれるハイブリダイゼーションの厳密性、及び、ハイブリダイゼ
ーションの動力学に影響するハイブリダイゼーション反応混合物中の塩又は追加
の試薬の存在に依存する。与えられたハイブリダイゼーション反応混合物に対す
るハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当該技術分野において周知で
ある。

【００２８】ハイブリダイゼーションは、周知のように均一又は不均一フォーマットで行う
ことができる。均一なハイブリダイゼーション反応はもっぱら溶液中で行われ、
プローブ及びハイブリダイズする核酸配列（標的）は共に溶液中に可溶性形態で
存在する。不均一反応には、プローブ又は標的核酸のいずれかが結合している反
応媒体中で不溶性のマトリックスの使用が含まれる。標的配列を含む核酸が二本
鎖形態の場合、ハイブリダイゼーション反応前に、加熱又はアルカリ処理により
核酸を最初に変性することが好ましい。核酸の変性は、プローブと混合してハイ
ブリダイズする前又は核酸とプローブを混合した後にに行うことができる。ハイブリダイゼーション反応混合物中に存在するプローブの有効量は一般的に
周知であり、典型的にはハイブリダイズするプローブと鋳型のモル比で表現され
る。好ましい比は、標的配列とプローブを等モル量で含むハイブリダイゼーショ
ン反応混合物である。周知の通り、等モル量からの偏りは、低効率であるけれど
もハイブリダイゼーション反応生成物を生じるだろう。したがって、1つの成分
が他方の成分の100倍モル過剰量であることができるけれども、50倍未満の過剰
量、好ましくは10倍未満、より好ましくは2倍未満の過剰量が本発明の実施に好
ましい。プローブは、二重鎖を検出可能にする標識又は指示基を含むことができる。典
型的にはそのような標識には、放射性原子、化学的に修飾されたヌクレオチド塩
基等が含まれる。プローブを標識、すなわち指示手段又は基に操作可能に結合し
て、標的鋳型における特定のヌクレオチド配列の存在の検出に使用することがで
きる。操作可能に結合した又はプローブ（標識オリゴヌクレオチド）の一部として存
在する放射性元素は、二重鎖の検出を促進する有用な手段を提供する。典型的な
放射性元素はβ線を放射するものである。β線を放射する元素、例えば³H、 ¹²C
、 ³²P 及び ³⁵S はβ線放射生成放射性元素標識のクラスを示している。典型的
には、放射性プローブは、キナーゼを使用した放射性標識されたヌクレオチドの
核酸への酵素的取り込みにより調製する。放射性標識オリゴヌクレオチドの代替
は、化学的に修飾され金属錯化剤、ビオチン含有基、蛍光化合物等を含んでいる
オリゴヌクレオチドである。1つの有用な金属錯化剤は、ランタニド及び芳香族
β−ジケトンにより形成されるランタニドキレートである。ランタニドは核酸又
はプローブへキレートを介して結合し、EDTA−類似体等の化合物を形成し、蛍光
ランタニド複合体を形成する。米国特許第 4,374,120号、第 4,569,790号及び公
開された特許出願 EP0139675 及び WO87/02708を参照のこと。ビオチン又はアク
リジンエステル−標識オリゴヌクレオチド及びそれを使用したポリヌクレオチド
の標識が記載されている。米国特許第 4,707,404号、公開された特許出願 EP021
2951 及び欧州特許第0087636号明細書を参照のこと。有用な蛍光マーカー化合物
にはフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Texas Red）、NBD等が含ま
れる。

【００２９】二重鎖に存在する標識プローブは、二重鎖自体を標識し、アッセイするサンプ
ル中に存在するその他の核酸から検出可能にする。典型的には、プローブ中のラ
ベルの存在、これによる二重鎖の存在の検出には、二重鎖にハイブリダイズしな
いすべての標識プローブからの二重鎖の分離が含まれる。一本鎖オリゴヌクレオ
チド、例えば非ハイブリダイズ標識プローブを二重鎖から分離する技術は周知で
あり、典型的にはその化学特性に基づく二本鎖核酸からの一本鎖核酸の分離が含
まれる。よく用いられる分離技術には、不均一ハイブリダイゼーションフォーマ
ットの使用が含まれ、典型的には洗浄によって不溶性マトリックスに結合した二
重鎖から非ハイブリダイズプローブを分離する。例としてはサザンブロット技術
があり、この技術ではマトリックスがニトロセルロースシートであり、標識が³² Pである(Southern, J. Mol. Biol., 98:503, 1975)。更にプローブを、典型的にはその5'末端又はその近くで、固体マトリックス、
すなわち水不溶性固体担体へ有利に結合することができる。有用な固体マトリッ
クスは当該技術分野において周知であり、例えば商品名SEPHADEXでPharmacia Fi
ne Chemicals (Piscataway, NJ)より入手可能な架橋デキストラン、アガロース
、ポリスチレン又は直径約1μm〜約5mmのラテックスビーズ、ポリ塩化ビニル、
ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロンベース
のウェブ、例えばシート、ストリップ、パドル、プレート、マイクロタイタープ
レートウェル等が含まれる。更に「結合」ヌクレオチドをメンバーのプローブの
5'又は3'末端へ追加し、結合プローブをメンバーの固体担体への操作可能な結合
に使用することも可能である。ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイでは、ハイブリダイゼーション
反応混合物を、鋳型中の予め決められた配列に対して相補性を有するプローブが
鋳型に存在する相補的核酸配列にハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション
生成物、すなわちプローブ及び核酸を含む複合体を形成するのに十分な時間、ハ
イブリダイズ条件下、企図した方法で維持する。本発明のプローブは約50未満、好ましくは約25未満のヌクレオチドを含む。プ
ローブは約５より多くのヌクレオチドを含む。好ましい態様においては、プロー
ブは約10より多くの、より好ましくは約15より多くのヌクレオチドを含む。本明細書で使用する用語「プライマー」とは、核酸制限分解物から精製した又
は合成により製造したポリヌクレオチドを意味する。プライマーは、核酸鎖に相
補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド
及びポリメライゼーション用の試薬、例えばDNAポリメラーゼ、逆転写酵素等の
存在下、適切な温度及びpH下に置かれたとき核酸合成の開始点として作用するこ
とができる。プライマーは好ましくは最大効率のために一本鎖であるが、代わり
に二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、最初にプライマーを処理して相補
鎖から分離して、延長反応生成物の調製に使用する。好ましくは、プライマーは
ポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメライゼーション用
の試薬の存在下で延長生成物の合成をプライムするのに十分に長くなければなら
ない。プライマーの正確な長さは、温度及びプライマー源を含む多数の因子に依
存するだろう。例えば、標的配列の複雑性に依存して、ポリヌクレオチドプライ
マーは典型的には15〜25又はそれ以上のヌクレオチドを含んでいる。ただし、少
数のヌクレオチドを含んでいてもよい。一般的に短いプライマー分子は鋳型と十
分に安定なハイブリッド複合体を形成するために低温を要求する。本明細書で使用するプライマーは、合成又は増幅する特定の各配列の異なる鎖
に「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが各鋳型鎖
と非ランダムにハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを
意味する。それゆえ、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映していてもよく
、反映していなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、鎖に実質的
に相補的なプライマー配列の残りの部分でプライマーの5'に結合することができ
る。そのような非相補的断片は典型的にはエンドヌクレアーゼ制限部位をコード
している。合成又は増幅する鎖の配列と十分な相補性を有するプライマーを提供
し、非ランダムにハイブリダイズして、これによりポリヌクレオチド合成条件下
で延長生成物を形成する場合は、代わりに、非相補的塩基又は長い配列をプライ
マーに散在させることができる。

【００３０】本発明のプライマーは、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター配列又はその
相補物（complement）を含んでいてもよい。例えば、Krieg et al., Nucl. Acid
s Res., 12:7057-70 (1984); Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1
986); 及び Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Mania
tis et al., eds., Cold Spring Harbor, NY (1989)を参照のこと。DNA依存性RN
Aポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用するとき、プライマーは増
幅するポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズし、DNA依存性RNAポリメラーゼプロ
モーターの第２のポリヌクレオチド鎖は、誘導試薬、例えばE.coli DNAポリメラ
ーゼＩ、又はE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を使用して完成する。出発
ポリヌクレオチドは、RNAポリヌクレオチド及びDNAポリヌクレオチドの生成を変
化させることにより増幅する。更にプライマーは、RNA指向性（RNA-directed）RNAポリメラーゼに対する鋳型
配列又は複製開始部位を含んでいてもよい。典型的なRNA指向性RNAポリメラーゼ
には、Lizardi et al., Biotechnology, 6:1197-1202 (1988)に記載されるQBレ
プリカーゼが含まれる。RNA指向性RNAポリメラーゼは、鋳型配列又は複製開始部
位を含む少数の鋳型RNA鎖から多数のRNA鎖を生成する。通常、これらのポリメラ
ーゼは、Kramer et al., J. Mol. Biol., 89:719-736 (1974)に記載されるよう
に鋳型鎖の100万倍の増幅を与える。ポリヌクレオチドプライマーは、すべての適切な方法、例えばホスホトリエス
テル又はホスホジエステル法（Narang et al., Meth. Enzymol., 68:90, (1979)
; U.S. Patent No. 4,356,270; and Brown et al., Meth. Enzymol., 68:109, (
1979)）を使用して調製することができる。 PCR増幅法は、米国特許第 4,683,192号、 4,683,202号、 4,800,159号及び 4,
965,188号明細書、並びに "PCR Technology: Principles and Applications fo
r DNA Amplification", H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989) 及
び "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al.,
eds., Academic Press, San Diego, California (1990)を含む少なくともいくつ
かの文献に詳述されている。

【００３１】前記の修飾ヌクレオチドを含むDNA分子は、当該技術分野において周知の標準
手順、例えば固相ホスホラミダイト化学等を使用して作成することができる。必
要とされる全てのものは、合成スキームにおける本発明の修飾ヌクレオチドの使
用である。更に酵素、例えばポリメラーゼ及び逆転写酵素を使用して、本発明の
修飾ヌクレオチドをDNA分子へ取り込ませることができる。DNA分子作成用の反応
混合物は、本発明の1以上の修飾ヌクレオチドをdATP、dGTP、dTTP 及び dCTPと
共に含んでいる。修飾ヌクレオチドを、dTTP及び／又はdCTPに加える又はこれら
を置換することもできる。実施例により、スキーム1、図2の化合物3は、典型的なPCR条件を使用した熱安
定性DNAポリメラーゼに対してデオキシチミジン三リン酸dTTPの代わりに基質と
して作用した。5つの種に由来する市販の熱安定性DNAポリメラーゼ：サーマス・
アクアチカス（Thermus aquaticus）由来のTaq、サーモコッカス・リトラリス（
Thermococcus litoralis）由来のVent、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus
furiosus）由来のPfu及びサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）
由来の rThを研究した。化合物3を用いたPCRアッセイにより、rThポリメラーゼ
を用いたときのみ519塩基対生成物への取り込みが起こったことが示された。3の
いくつかの誘導体はE.coli DNAポリメラーゼに対する基質であり、dTTPを置換し
たときにニックトランスレーション及びランダムプライム合成（random primed
synthesis）に有用であることが示された。PCRにおけるこれらの誘導体の均一取
り込みは、連鎖停止反応のため不可能である。PCRにおける誘導体については11c
：a) M. Shimkus, J. Levy, T. Herman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 198
5, 82, 2593-7; b) B. L. Iverson, P. B. Dervan, J. Am. Chem. Soc. 1987, 1
09, 1241-3. 及び ref. 10; c) H. Yu, J. Chao, D. Patek, R. Mujumdar, A. S
. Waggoner, Nucleic Acids Res. 1994, 22, 3226-32を参照のこと。この鋳型を
用いたPCRの成功は、8つの隣接するチミジンの単一のストレッチを含む246の修
飾塩基の取り込みを要求する。

【００３２】化合物3を、3つの異なるN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて誘導体
化し、化合物4a-c (スキーム2、図 3)を製造した。化合物4a、4-イミダゾールア
クリル酸誘導体は、dTTPを用いて得られたPCR生成物量と同様のPCR生成物を生成
する試験した全てのポリメラーゼに対する優れた基質であることが証明された。
種々のMg⁺² (15 〜 30 mM) 及び類似体の濃度 (200 〜 800 mM) を用いた基質4b
及び 4c の研究では、これらの修飾塩基の取り込みを許容する濃度を定義する
ことができなかった。ポリメラーゼに対する良好な基質として認識されることを
許容する4aの構造的特徴を研究するために、4aの還元した類似体である化合物4d
を合成した。4dを用いたPCRを許容する全てのポリメラーゼを用いて条件を定義
することができなかったことは、4-イミダゾールアクリル酸の強固かつ延長した
a,b-不飽和アームがその活性を提供していることを示唆している。構造−活性の
関係を試験するために、4aに共通のa,b-不飽和リンカーアームを維持する4e-4g
を製造した（スキーム2、図3）。化合物4e-4gは試験した全てのポリメラーゼに
対する基質であった。遊離のアミノ基を有する化合物4gを、化合物4h及び4iの合
成用鋳型として使用した。類似体4hは試験した全ての熱安定性ポリメラーゼに対
する良好な基質であったが、4iはrThポリメラーゼのみに対する基質であった。実際に修飾dUTPがPCR生成物へ取り込まれるという証拠は、修飾塩基と関連す
る質量及びDNA生成物の電荷の増加を示す修飾DNA生成物について得られた実質的
な移動度のシフトにおいて提供される。中性pHにおいて完全な正電荷を有する類
似体4gを取り込んだDNAは、質量の増加及び中性pHにおける陰電荷を有する4hを
と取り込んだDNAよりも移動が遅かった。延長したリンカーアームの役割は、共
に一級アミンを有する4gを用いた3の取り込みの効率を比較することにより明ら
かになる。大きな誘導体4gは延長したリンカーアームを有し、かつ3と比較してP
CRに対して強い基質である。

【００３３】逆転写酵素を、DNA酵素のインビトロ選択スキームにおいてPCRと組み合わせて
利用してもよい。本発明者等は化合物3及び4a-iのSuperscript II 逆転写酵素 (
Gibco/BRL)の基質として作用する能力について試験し、4c及び4hを除く全てが鋳
型指向性（template directed）合成アッセイにおける基質であることを測定し
た（実施例3参照）。この逆転写酵素の特異性は広く、熱安定性ポリメラーゼの
構造的要求の予測を与えなかった。修飾dUTPを使用して得たPCR生成物をクローニングし、配列決定した。製造者
（Invitrogen）から提供されたトポイソメラーゼ活性化ベクターを使用して、修
飾ヌクレオチド類似体を取り込んだPCR生成物をベクターpCR2.1TOPO にクローニ
ングした。修飾dUTPの取り込みの忠実性は、対照反応におけるdTTP取り込みにつ
いて観察された結果と区別不可能であった。インビトロ選択方法論における修飾
dNTPの使用の鍵となる基準は、熱安定性ポリメラーゼに対する基質として役立つ
能力及び得られた生成物がPCR増幅の複数のサイクルに対する鋳型として役立つ
能力である。これらの基準は化合物3、4a及び4e-iに適合していた。類似体4g及び4hは、DNAの静電気的特性を劇的に変化させる、PCRによるカチオ
ン性及びアニオン性ヌクレオチド類似体のDNAへの取り込みの最初の例を提供す
る。4eを除いて、類似体はアミノ酸リジン(3及び4g)、ヒスチジン(4a及び4i)、
チロシン(4f)及びアスパラギン酸及びグルタミン酸(4h)の機能的等価物と考えて
もよいだろう。類似体4iにおけるL-ヒスチジンの取り込みの成功は、その他の天
然アミノ酸及び小ペプチドの取り込みの可能性を支持する。全ての類似体は、タ
ンパク質酵素の折り畳み及びポケット形成並びに官能基のpK_a摂動に必須の疎水
性結合相互作用の新たな可能性を提供する。

【００３４】別の側面において、本発明はDNA分子のヌクレアーゼ消化に対する耐性を増加
させる方法を提供する。本発明の方法は、DNA分子中の1以上のピリミジンヌクレ
オチドを本発明の修飾ヌクレオチドで置換する工程を含んでいる。置換の数が多
い程、得られるDNA分子のヌクレアーゼ消化に対する耐性は大きくなる。それゆ
え、全てのチミジン及びシトシンを修飾デオキシウリジン及びデオキシシトシン
で置換することが好ましい。修飾塩基を取り込んだPCR生成物は、それぞれ配列G
AGCTC 及び TCTAGAを認識し、天然DNA生成物を切断する制限酵素Sac I 及び Xba
I による切断に対して耐性を有することを見いだした。修飾ヌクレオチドによるDNA分子の1以上の塩基の置換は、当該技術分野におい
て周知の多数の標準技術を使用して達成することができる。前述したように、固
相合成手順を使用して、修飾ヌクレオチドを取り込む新規な分子を構築すること
ができる。本発明の修飾ヌクレオチドは種々のポリメラーゼ及び逆転写酵素と適
合するので、定義された配列を有するDNA配列を前記の酵素を使用して調製する
ことができる。 DNA分子における置換は、部位特異的突然変異 (例えば Current Protocols in
Molecular Biology, Ed. By Ausabel et al., John Wiley and Sons, Inc., 19
98; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, Fritsch and Maniat
is, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。この文献の記
載は参照することにより本明細書に組み込まれる。)等の当該技術分野において
周知の技術を使用して達成することができる。前記の突然変異技術を使用して、
DNA分子に置換を作成し、分子の発現生成物を変化させた (例えば米国特許第 5,
543,302号及び第 5,550,042号明細書を参照のこと)。部位特異的突然変異技術
を記載されるようにして用いることができるけれども、その他の突然変異プロト
コル、例えばカセット突然変異及び局在化ランダム突然変異が使用可能である。本発明の好ましい態様を説明する実施例はどんなことがあっても明細書及び請
求の範囲を制限するものでない。

【００３５】実施例1:5-(3-トリフルオロアセチルアミノプロペニル) -2'-デオキシウリジン
(化合物 2)の合成 5-(3-トリフルオロアセチルアミノプロペニル)-2'-デオキシウリジン 2 を、
Cook 等^[8]にしたがい、 5-クロロ水銀-2'-デオキシウリジン 1bから最初に合成
した。本発明者等は、市販の 5-ヨード-2'-デオキシウリジンから、同様の方法
を使用して2を合成した。5-ヨード-2'-デオキシウリジン 1a (3.5 g, 10 mmol)
の酢酸ナトリウム緩衝液 (0.1 M, pH 5.2 ) 中の懸濁液を、トリフルオロアセ
チルアリルアミド (13 g, 88 mmol) 、続いてテトラクロロパラデートナトリウ
ム（sodium tetrachloropalladate） (5 ml 水中の2.5 g)の溶液で処理した。混
合物を18 時間攪拌し、次いでセライト（celite）を通してろ過した。ろ液を濃
縮し、酢酸エチルで数回抽出した。組み合わせた有機層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥した。乾燥するまで溶媒を蒸発させ、溶離剤として酢酸エチルを使用した
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物を精製し、1.7 g (44 %) の
デオキシウリジン誘導体2 を得た。 ¹H-NMR (CD₃OD): 8.11 (s, br, 1H) C-6 H
; 6.45 (m, 1H) 及び 6.16 (m, 2H) ビニルプロトン及び H-1'; 4.32 (m, ¹H)
H-3'; 3.8, (m, 3H) アリル CH₂ 及び H-4'; 3.75- 3.60 (m, 2H) CH₂-5',5'';
2.17 (m, 2H) H-2',2''.

【００３６】実施例2:C-5(3-アミノプロペニル)-2'- デオキシウリジン三リン酸 (化合物 3)
の合成アリルアミン-デオキシウリジン 2 (126 mg, 0.33 mmol) を乾燥トリメチルホ
スフェート ( 0.75 ml) 中、プロトンスポンジ（proton sponge） (100 mg, 0.4
7 mmol) と共に0℃で攪拌した。オキシ塩化リン (99.9% Aldrich, 35 l) を添加
し、混合物を 0〜4℃で攪拌した。2.5 時間後、無水 DMF ( 0.5 M, 3 ml) 及び
n-トリブチルアミン (0.3 ml) 中のトリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェー
ト溶液を、0℃で反応混合物へ急速に添加した。1分後、重炭酸トリエチルアンモ
ニウム水溶液 (0.2 M) を混合物へ注いだ。蒸発後、残渣を水性アンモニア (2 m
l)で処理し、室温下で一晩攪拌した。アンモニアの蒸発後、重炭酸トリエチルア
ンモニウム緩衝液( 0.2-0.5 M, pH 7.5 )を使用したDEAE-Sephadex A-25 カラム
クロマトグラフィーにより残渣を精製した。最終の精製を、50mM重炭酸トリエチ
ルアンモニウム緩衝液中の0〜3%アセトニトリル勾配を使用した30分間の逆相HPL
Cにより達成し、 110 mg (54%) の三リン酸 3 を得た。¹H-NMR (D₂O): 8.17 (
s, br, 1H) C-6 H; 6.58- 6.54 (d, 1H) and 6.48-6.40 (m, 1H) , 6.35 (t, 1H
) ビニルプロトン及び H-1'; 4.66 (m, 1H) H-3'; 4.26-4.2 (m, 3H) 5', 5'
' CH₂ 及び H-4'; 3.70 (d, 2H) アリル CH₂ ; 2.41 (m, 2H) H-2',2''. ¹³C-
NMR (D₂O) : 166.67; 153.35; 141.0 ; 128.74; 124.7; 114.00; 88.27; 87.90
; 72.7; 67.66; 43.60; 41.98 . 31P-NMR (D₂O): -9.42 (d); -10.73 (d);
-21.38 (t). MS (エレクトロスプレー): m/z 589 [M+H⁺]; 611 [M+Na⁺]; 633 [M
+2Na⁺-2H⁺]. C₁₂H₁₆N₃Na₄O₁₄P₃についての分析計算値: C, 23.58; H, 2.64; N,
6.88. 実測値: C, 23.75; H, 2.81; N, 7.00.

【００３７】実施例 3:修飾dUTPs 4a、4d、4e及び4fの一般的合成アリルアミン- dUTP 3 (30 mg, 50 mol) を、0.1 M ホウ酸ナトリウム緩衝液
及び DMF (1:1)中のわずかに過剰量の対応の N-ヒドロキシスクシンイミドエス
テルで室温下 10-20 時間処理した。反応完了後 (アンモニア、水及びイソプロ
パノール 2:1:1を使用したTLCによりモニター)、混合物を乾燥するまで蒸発した
。三リン酸を逆相HPLCにより精製した。¹H 核磁気共鳴(¹H-NMR) スペクトルを、
フーリエ変換 400-MHz, (¹³C-NMRについて100-MHz、³¹P-NMRについて161.9) 分
光計で測定し、百万分率 (ppm)で記録した。全ての修飾 dUTPを分離用 RP-HPLC;
Waters PrepPak 500 カラム, C-18, 300Å 孔径 15 mm 粒径 4.7 x 30 cm, 流
量 80 ml/分で精製した。全ての修飾 dUTPについて、標準手順を使用して、トリ
エチルアンモニウム対イオンをナトリウムイオンに転換した。修飾 dUTP 4a : 26 mg (73 %). ¹H-NMR ( D₂O): ( 7.94 (s, br, 1H) H-6; 7.
86 (s, br, 1H) 及び 7.42 (m, 2H), 6.6 (d, 1H) イミダゾール-H 及びビニ
ルプロトン; 6.44 (m, 1H) 及び 6.35-6.30 (m, 2H) アリルアミンビニルプロ
トン及び H-1'; 4.64 (s, br, 1H) H-3'; 4.20-4.19 (d, br, 3H) 5', 5'' C
H₂ 及び H-4'; 4.01 (d, 2H) アリル CH₂ ; 2.38 (m, 2H) H-2',2''. ¹³C-NMR
(D₂O) : ( 170.75; 166.45; 153.09; 140.25; 133.16; 129.75; 124.52; 114.5
7; 114.50; 87.96; 87.83; 87.75; 73.08; 72.78; 67.88; 44.19; 41.07; 32.70
. ³¹P-NMR (D₂O): ( -0.36 (d); -10.94 (d); -21.43 (t). MS (エレクトロスプ
レー): m/z 709 [M+H⁺]; 731 [M+Na⁺]; 753 [M+2Na⁺-H⁺]; 775 [M+3Na⁺-2H⁺]. C ₁₈ H₂₀N₅Na₄O₁₅P₃についての分析計算値: C, 29.57; H, 2.76; N, 9.58. 実測値:
C, 29.15; H, 2.85; N, 9.42.

【００３８】修飾 dUTP 4d: 24 mg (67%). ¹H-NMR (D₂O): ( 8.3 (s,1H) イミダゾール; 7
.93 (s, br, 1H) H-6; 7.1 (s, 1H) イミダゾール, 6.32 (m, 2H) 及び 6.15 (d
, 1H) ビニルプロトン及び H-1'; 4.64 (s, br, 1H) H-3'; 4.20-4.19 (d, br
, 3H) 5', 5'' CH₂ 及び H-4'; 3.8 (m, 2H) アリル CH₂; 2.99 (t , 2H) 及
び 2.67 (t, 2H) 2 CH₂ ; 2.38 (m, 2H) H-2',2''. ¹³C-NMR (D₂O): ( 182.0; 1
77.54; 176.0; 166.67; 153.35; 140.23 ; 129.93; 124.24; 114.88; 88.15; 88
.06; 87.86; 73.2; 67.79; 51.26; 43.59; 41.35; 37.74. ³¹P-NMR (D₂O): (
-0.45 (d); -11.00 (d); -21.92 (t). MS (エレクトロスプレー) : m/z 711 [
M+H⁺]; 733 [M+Na⁺]; 755 [M+2Na⁺-H⁺]; 777 [M+Na⁺-2H⁺]. C₁₈H₂₂N₅Na₄O₁₅P₃に
ついての分析計算値: C, 29.48; H, 3.02; N, 9.55. 実測値: C, 29.80; H, 3.1
1; N, 9.63. 修飾 dUTP 4e: 24 mg ( 65%). ¹H-NMR (D₂O): ( 8.7 (s, br, 1H), 8.47 (s,
br, 1H), 8.12 (d, 1H) ピリジル; 7.93 (s, br, 1H) H-6; 7.43 (m, 2H) ピリ
ジル及びアクリリル-H, 6.79 (d, 16Hz, 1H) アクリリル-H; 6.48 (m, 1H) 及
び 6.35-6.27 (m , 2H) アリルアミンビニルプロトン及び H-1'; 4.77 (s,
br, 1H) H-3'; 4.22-4.18 (d, br, 3H) 5', 5'' CH₂ 及び H-4'; 4.04 (s, br
, 2H) アリル CH₂ ; 2.35 (m, 2H) H-2',2''. ¹³C-NMR (D₂O) : ( 169.99; 166
.56; 153.14; 140.42 ; 139.44; 138.05; 129.61; 125.02; 124.73; 114.57; 87
.90; 87.91; 87.85; 72.77; 67.73; 44.24; 43.59; 41.11. ³¹P-NMR (D₂O): (
-0.45 (d); -11.00 (d); -21.92 (t). C₁₈H₂₂N₅Na₄O₁₅P₃ H₂Oについての分析
計算値: C, 31.60; H, 3.04; N, 7.37. 実測値: C, 31.95; H, 3.11; N, 7.78.

【００３９】修飾 dUTP 4f: 24 mg (62%). ¹H-NMR ( D₂O): ( 7.92 (s, 1H) H-6; 7.55 (d,
br, 2H) フェニル; 7.46 (d, 16 Hz, 1H) ビニル-H, 6.89 ( d, 1H ) フェニル
; 6.55 (d, 16 Hz, 1H) ビニル-H; 6.5-6.28 (m, 3H) アリルアミンビニルプロ
トン及び H-1'; 4.64 (s, br, 1H) H-3'; 4.20-4.19 (d, br, 3H) 5', 5'' CH₂ 及び H-4'; 4.01 (m, 2H) アリル CH₂ ; 2.38 (m, 2H) H-2',2''. ¹³C-NMR (D₂ O): ( 171.08; 166.44; 166.36; 160.13; 153.06; 143.25; 140.19; 132.35; 12
9.82; 128.96; 124.46; 119.58; 118.43; 114.57; 88.02; 87.82; 87.73; 73.08
; 67.93; 44.22; 40.94. ³¹P-NMR (D₂O): ( -0.45 (d) ; -11.00 (d); -21.92
(t). MS (エレクトロスプレー) : m/z 691 [M+Na⁺]; 667 [M-H⁺]. C₂₁H₂₂N₃Na₄O ₁₆ P₃についての分析計算値: C, 33.31; H, 2.93; N, 5.55. 実測値: C, 33.67;
H, 3.12; N, 5.21. 修飾 dUTP 4b : アリルアミン dUTP 3 (30 mg, 50 (mol) を、0.1 M ホウ酸
ナトリウム緩衝液及び DMF (1:1) のモノメチルテレフタル酸-N-ヒドロキシスク
シンイミドエステル (70 mg, 250 (mol ) 溶液で、室温下、12 時間処理し、得
られたメチルエステルを、1N 水酸化ナトリウムの添加により加水分解して、 dU
TP 4bを生成した。過剰量の水酸化ナトリウムを、1N HClを使用して0℃下でpH7
に中和した。次いで反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣を逆相 HPLC によ
り精製して 22 mg (58 %) の dUTP 4bを得た。 ¹H-NMR ( D₂O): ( 7.90 (d, 2H)
フェニル; 7.76 (s, br, 1H) H-6; 7.67 (d, 2H) フェニル; 6.23- 6.14 (m, 3
H) アリルアミンビニルプロトン及び H-1'; 4.46 (s, br, 1H) H-3'; 4.03
(s, br, 3H) 5', 5'' CH₂ 及び H-4'; 3.95 (s, br, 2H) アリル CH₂ ; 2.2 (
m, 2H) H-2',2''. ³¹P-NMR (D₂O): ( -0.36 (d); -10.94 (d); -21.43 (t). MS
(FT-MALDI): 759.9685; C₂₀H₂₄N₃Na₄O₁₇P₃ (計算値 759.6975) ; 781.9481 [M+
Na⁺ ,計算値 781.9061].

【００４０】修飾 dUTP 4c: アリルアミン-dUTP 3 (30 mg, 50 (mol) と、0.1 M ホウ酸ナ
トリウム緩衝液及び DMF (1:1) 中の無水ビフェニック（biphenic anhydride）
(56 mg, 250 (mol) とを室温下で反応させ、12 時間攪拌した。完了後、反応混
合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣を逆相HPLCにより精製して、 29 mg (71%)
の 4cを得た。 ¹H-NMR (D₂O): ( 7.67 (s, 1H) H-6; 7.5- 7.05 (m, 8H) ビフェ
ニルプロトン; 6.30 (t, 1H) H-1'; 5.9 (d, 1H) 及び 5.8 ( m, 1H) アリルア
ミンビニルプロトン; 4.63 (s, br, 1H) H-3'; 4.21 (s, br, 3H) 5', 5'' CH ₂ 及び H-4'; 3.9 -3.3 (d, br, 2H) アリルアミン CH₂; 2.42 (m, 2H) H-2',
2''. ³¹P-NMR (D₂O): ( -0.36 (d); -10.94 (d); -21.43 (t). MS (FT-MALDI):
836.9997, C₂₆H₂₄N₃Na₄O₁₇P₃ (計算値 834.9989). 修飾 dUTP 4g: アリルアミン-dUTP 3 (30 mg, 50 (mol) と、0.1 M ホウ酸ナ
トリウム緩衝液及び DMF (1:1) 中の 3-トリフルオロアセチルアミノメチル-ト
ランス-ケイ皮酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (100 mg, 250 (mol )
とを、室温下で 24 時間反応させた。得られた反応混合物を乾燥するまで蒸発
させた。残渣を濃縮アンモニア (1 mL) を添加した。反応混合物を乾燥するまで
蒸発させ、残渣を逆相 HPLC により精製して、 23 mg (60%) の 4gを得た。 ¹H-
NMR ( D₂O): ( 8.05 (s, 1H) H-6; 7.53-7.40 (m, 5H) フェニル及びケイ皮酸ビ
ニル- H; 6.98 (d, 16 Hz, 1H ) ケイ皮酸ビニル-H; 6.43-6.32 (m, 3H) アリ
ルアミンビニルプロトン及び H-1'; 4.71 (s, br, 1H) H-3'; 4.32-3.95 (m,
7H) 5', 5'' CH₂ , H-4'', アリル CH₂ , ベンジル CH₂ ; 2.38 (m, 2H) H-2'
,2''. ¹³C-NMR (D₂O): ( 170.49; 167.11; 153.58; 142.39; 140.20; 137.55; 1
32.57; 132.02; 131.66; 129.47; 129.41; 124.59; 123.48; 114.64; 87.96; 87
.87; 87.74; 72.51; 67.62; 45.15; 44.00; 41.22. ³¹P-NMR (D₂O): ( -.5.36
(d) ; -10.9 (d); -21.16 (t). MS (エレクトロスプレー): m/z 683 [MH⁺]; 7
05 [M+Na⁺]; 727 [M+2Na⁺-H⁺]; 749 [M+3Na⁺-2H⁺]; 771 [M+4Na⁺-3H⁺].

【００４１】修飾 dUTP 4h: ベンジルアミン-dUTP 4g (38 mg, 50 (mol) と、0.1 M ホウ酸
ナトリウム緩衝液及び DMF (1:1) 中のグルタル酸無水物 (57 mg , 0.5 mmol)
とを、室温下で12時間反応させた。反応完了後、混合物を乾燥するまで蒸発させ
、残渣を逆相HPLCにより精製して 26 mg (60%) の 4gを得た。¹H-NMR ( D₂O): (
7.90 (s, 1H) H-6; 7.57-7.31 (m, 5H) フェニル及びケイ皮酸ビニル- H; 6.68
(d, 16 Hz, 1H) ケイ皮酸ビニル-H, 6.47-6.28 (m, 3H) アリルアミンビニル
プロトン及び H-1'; 4.67 (s, br, 1H) H-3'; 4.37 (m, 2H), 4.22 (m, 3H)
5', 5'' CH₂ ,H-4'; 4.01 (d, br, 2H) アリル CH₂ ; 2.39 (m, 2H), 2.29 (m,
2H), 2.19 (m, 2H), グルタル酸について1.83 (m, 2H) 3XCH₂ 及びH-2',2''. ¹ ³ C-NMR(D₂O): ( 184.99; 178.82; 170.83; 153.94; 143.27; 141.10; 140.39; 1
37.16; 131.79; 131.23; 129.68; 129.5; 124.79; 122.85; 114.71; 87.95; 87.
86; 87.71; 72.67; 67.69; 51.31; 45.21; 44.23; 40.98; 39.20; 37.91; 24.91
. ³¹P-NMR (D₂O): ( -.5.26 (d) ; -10.5 (d); -21.23 (t). MS (エレクトロス
プレー): m/z 819 [M+Na⁺]; 841 [M+2Na⁺ -H⁺]; 863 [M+3Na⁺-2H⁺]; 885 [M+4Na ⁺ -3H⁺]. C₂₇H₃₁N₄Na₄O₁₈P₃についての分析計算値: C, 36.67; H,3.53; N, 6.3
3. 実測値: C, 36.37; H, 3.81; N, 6.10. 修飾 dUTP 4i: N-アセチルヒスチジンと、 DMF (3 ml)中のN-ヒドロキシスク
シンイミド (38 mg, 0.32 mmol) 及び 1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド (4
9 mg, 0.24 mmol) とを室温下で反応させた。12 時間後、反応混合物をろ過し、
ろ液を 4g (38 mg, 50 (mol)を含むホウ酸ナトリウム及びDMF (1:1) 溶液に添加
した。室温で10時間後、反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣を逆相HPLCに
より精製して、 32 mg (68%) の 4iを得た。¹H-NMR ( D₂O): ( 7.93 (s, bs,1H
) H-6; 7.6-7.32 (m, 5H) フェニル及びケイ皮酸ビニル-H; 7.14 (d, br, 1H)
イミダゾール-H; 6.75, 6.67 (d, br, 2H ) ケイ皮酸ビニル-H 及びイミダゾ
ール-H; 6.42- 6.26 (d, 3H) アリルアミンビニルプロトン及び H-1'; 4.78
(s, br, H) H-3'; 4.23-4.03 (m, 8H) 5', 5'' CH₂ 及び H-4' , ベンジル CH₂ , 及びヒスチジン -H; 3.00 (m, 2H) ヒスチジン -CH₂; 2.19 (m, 2H) H-2',2''
; 2.02 (s, 3H) N-アセチル CH₃. ¹³C-NMR (D₂O): ( 176.54; 175.22; 170.81;
166.80; 153.30; 143.24; 140.83; 140.29; 137.17; 137.08; 131.62; 131.45;
129.79; 129.51; 128.99; 124.58; 122.89; 114.68; 87.96; 87.80; 87.71; 72.
71; 72.39; 67.73; 56.54; 45.05; 44.13; 41.15; 30.82; 24.13. 31P-NMR (D₂O
): ( -5.39 (d); -10.41 (d); -20.82 (t). MS (FT-MALDI): 884.1474, C₃₀H₃ ₈ N₇O₁₇P₃Na⁺ (計算値 884.1435); 906.1301, C₃₀H₃₈N₇O₁₇P₃+2Na⁺-H⁺ (計算値 9
06.1254).

【００４２】実施例 4:逆転写酵素研究逆転写酵素アッセイ: 鋳型特異的延長を、10 pmol 鋳型 DNA 5'-GCT AAA AAA
GCT GCT AAA AAG CTG CTA AAA GCT GCT AAA GCT AAG CTA GCT CCC TTT AGT GAG
GGT TAA TTG C-3' を 10 pmol プライマー DNA 5'-GCA ATT AAC CCT CAC TAA AG
G G-3' に添加し、続いて Superscript II 逆転写酵素 (Gibco, 200 単位(l^-1)
を添加することにより行った。反応物 (25 (l) は、0.2 mM の dATP, dCTP, dGT
P 及び 0.4 mM 類似体を含んでいた。微量の ((-³²P(-dATP を含ませて、延長効
率のモニターを許容した。逆転写酵素を除く全ての成分を組み合わせ、90℃でイ
ンキュベートし、37℃に冷却して、プライマーをアニールした。酵素 (600 単位
) を添加し、反応混合物を 37℃でインキュベートした。DNAをエタノール中で沈
殿させ、尿素を含むゲル−ローディング緩衝液中に溶解し、90℃で3分間加熱し
た。10 % 変性アクリルアミドゲル中で分離した後、サンプルを Phosphorimager
を用いて更に分析した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、20の天然アミノ酸残基の構造を示している。

【図２】図2は、ヌクレオチド三リン酸前駆体製造のための合成スキームを示している
。

【図３】図3は、修飾デオキシウリジン製造のための一般化された合成スキームを示し
ている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カンダサミサクティヴェルアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴデコーロストリート 4158 ナンバー５Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 CA05 HA11 HA12 HA19 4C057 CC03 DD02 LL11 LL19 LL22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構造式IIで示される化合物。（式中、X は NH₂ 又は O であり、 C:C は炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合であり、各Rは独立してカチオン又は、（式中、各R'は独立して、存在しないか又はカチオンであり、 mは 1、 2 又は 3である。）であり、 R₁は、（式中、R₂は、（式中、R₃は、(CH₂)_nCOOH又は、である）である）であり、 nは0〜6の整数である。）
【請求項２】 nが0、1又は2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】少なくとも1つのRがカチオンである、請求項１に記載の化合
物。
【請求項４】カチオンが水素又はアルカリ金属である、請求項３に記載の
化合物。
【請求項５】アルカリ金属がナトリウム又はカリウムである、請求項４に
記載の化合物。
【請求項６】 XがOである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】 R₁がである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】請求項１に記載の化合物の構造を有する少なくとも1つのヌ
クレオチドを含むDNA分子。
【請求項９】請求項６に記載の化合物の構造を有する少なくとも1つのヌ
クレオチドを含むDNA分子。
【請求項１０】約5〜約25のヌクレオチドを含む、請求項７に記載のDNA分
子。
【請求項１１】約10〜約20のヌクレオチドを含む、請求項９に記載のDNA
分子。
【請求項１２】約5〜約15のヌクレオチドを含む、請求項９に記載のDNA分
子。