JP7356505B2 - Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物 - Google Patents

Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP7356505B2
JP7356505B2 JP2021541051A JP2021541051A JP7356505B2 JP 7356505 B2 JP7356505 B2 JP 7356505B2 JP 2021541051 A JP2021541051 A JP 2021541051A JP 2021541051 A JP2021541051 A JP 2021541051A JP 7356505 B2 JP7356505 B2 JP 7356505B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
stranded oligonucleotide
double
dkk1
group
structural formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021541051A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022518430A (ja
Inventor
ハンオ パク
ソンイル ユン
サンジン ピョン
ピョンオ ユン
サンギュ イ
テリム キム
ヨンホ コ
スンソブ ソン
ウンア コ
ヒョンジン キム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioneer Corp
Original Assignee
Bioneer Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioneer Corp filed Critical Bioneer Corp
Publication of JP2022518430A publication Critical patent/JP2022518430A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7356505B2 publication Critical patent/JP7356505B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/0241—Containing particulates characterized by their shape and/or structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Description

本発明は、ＤＫＫ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体、前記オリゴヌクレオチド又は構造体を含むナノ粒子、及びそれらの脱毛予防又は発毛用途に関し、詳細には、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に伝達するために二本鎖オリゴヌクレオチドの両末端に親水性物質及び疎水性物質が単純共有結合又はリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合された形態の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、水溶液で前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が疎水性相互作用によって自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）して生成され得るナノ粒子、並びに前記オリゴヌクレオチド、構造体及び／又はナノ粒子を含む脱毛予防及び発毛用組成物に関する。
毛髪は、個人の個性とイメージを作るのに重要な役割を担い、このような審美的機能の他にも、紫外線遮断、頭皮保護などの機能がある。脱毛は、正常に存在すべき体毛が減少する疾患であり、これは生命と直接の関連はないが、外観上深刻な精神的苦痛を伴う場合が多いため、脱毛が深刻な場合、生活の質の側面で非常に否定的な影響を及ぼすことがある（Ｐａｓｓｃｈｉｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９７：２１７，１９９８；ＭｃＤｏｎａｇｈ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，Ａ．Ｇ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ．，１４：６６１，１９９６）。最近では、男性たちの遺伝的疾患とされてきた脱毛症が、業務的ストレス、環境汚染、有害環境への露出、誤った食習慣などの外部要素によって、男性の他に女性にも発生し、脱毛予防又は治療剤に対する需要が増加している実情である。脱毛症は、毛嚢が破壊され、線維組織として回復されて永久的な脱毛状態となる瘢痕性脱毛症と、組織が線維化せず、毛嚢もそのまま保存される非瘢痕性脱毛症とに分類され、非瘢痕性脱毛症には、休止期脱毛症、遺伝性アンドロゲン脱毛症、円形脱毛症、生長期脱毛症がある。（Ｊａｎｄ ＩＷ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ｏｐｈｔｈａｌ Ｏｔｏｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１５）。
毛髪は、成長期（Ｇｒｏｗｉｎｇ ｓｔａｇｅ）、衰退期（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔａｇｅ）、休止期（Ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔａｇｅ）、脱落期（Ｅｘｏｇｅｎ ｓｔａｇｅ）などの周期を有し、これを毛周期という。成長期の寿命は通常２～８年と、全体毛髪の約９０％を占め、毛乳頭と接触する毛口の下半部に毛母細胞の分裂が持続して髪の毛が生成される。成長期を経てしばらくの間に成長を止める時期を衰退期といい、これは、毛髪の生成と発育が止まる休止期に移る時期であり、毛髪の根にも変化が起き、毛母細胞と色素細胞の活動が止めながらケラチンが生成されず、毛髪の成長が中断される。休止期には毛口部が収縮し、脱落期になってこそ毛髪が抜けるが、この時期にはタンパク質分解酵素が関与すると知られている。（キム・ウンファ等，大韓皮膚美容学会誌第５巻２号、４５；Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５９：３００～３０５，２００８）。毛髪の成長を調節する因子としては、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、ステロイド、プロラクチン及び成長ホルモンなどが関与すると考えられており、中でもアンドロゲンが最も重要な調節因子として知られている。ホルモンが脱毛に関与するという最も一般的な例は、出産後の一時的な脱毛であり、妊娠をするとエストロゲンが増加し、毛周期が生長期から休止期に進行することを抑制するが、出産後にエストロゲンが急激に減少しながら休止期への進行が加速化し、休止期脱毛が発生する。すなわち、このようにホルモン依存の脱毛症があるが、その他にも脱毛の原因は、遺伝的要因、男性ホルモン、老化、血液循環障害、ストレス、スーパオキシドラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ）などを選ぶことができ、このような原因に従ってその対応策が変わり得る。男性ホルモンが原因である脱毛に対しては、ＤＨＴ抑制剤（ＤＨＴ ｂｌｏｃｋｅｒｓ）を治療剤として使用しており、該抑制剤の基本的な機序は、５－アルファ還元酵素（５－α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）により、テストステロンが活性度の高いジヒドロテストステロン（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ；以下、ＤＨＴ）に転換されることを防ぐ役割を担う。一方、ＤＨＴはテストステロンに比べてアンドロゲン受容体（ＡＲ）との結合能力が５倍以上高いため、毛嚢のタンパク質合成を遅延させてＤＨＴの過剰生成を防ぎ、アンドロゲン受容体への結合を遮断する物質を治療剤として使用している（Ｄａｌｌｏｂ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７９：７０３－７０９，１９９４；Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ，Ｋ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１５：７７４－７８０，１９９５；Ｋａｕｆｍａｎ ＫＤ．，Ｍｏｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９８：８５－５９，２００２）。
現在まで開発された脱毛治療剤は単一化合物が主流であり、ＤＨＴの過剰生成を抑制するために５－アルファ還元酵素（５－α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を標的にするフィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）、血行促進のためのミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）があり、近年、米国ＦＤＡの許可を受けて抗癌剤として販売されているＪＡＫインヒビター（ＪＡＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ，ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）が毛髪成長を促進させる効果を有するものと確認された。しかし、前記物質よりも優れた効果を有する物質を見出すための研究は引き続き行われている。
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ １（ＤＫＫ１）は、アンドロゲン性脱毛において最も上方調節される脱毛遺伝子であり、脱毛の主な原因とされているＤＨＴによって脱毛部位毛乳頭細胞でその発現が誘導される。ＤＫＫ１が強く発現する場合、毛嚢の成長を妨害するだけでなく、毛髪を直接包んで保護し、表皮まで運送する役目を有する外毛根鞘（Ｏｕｔｅｒ ｒｏｏｔ ｓｈｅａｔｈ）の細胞自殺を誘導することによって毛髪の退化期を促進すると知られている（Ｋｗａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３２（６）：１５５４－６０．２０１２）。これは、毛髪成長期を維持する上で重要な役割を担うＷｎｔ／β信号伝達に必要なＬＲＰ（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）－５／６コレセプターを抑制するＤＫＫ１のＷｎｔ拮抗作用によるものであり、このようにＤＫＫ１が毛髪の成長期から退化期に至るまで非常に重要な役目を有するという事実が明らかにされるに伴って、ＤＫＫ１を標的にする脱毛治療への関心も高まっている。
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤開発及び標的検証において重要な道具である。この技術のうち、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）は、その役目が発見されて以来、種々の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）において配列特異的ｍＲＮＡに作用するという事実が明らかにされた（Ｂａｒｉｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８３：７６４－７７３，２００５）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）というエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１～２３個の二本鎖（ｂａｓｅ ｐａｉｒ，ｂｐ）としてプロセシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ。）に変換され、ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合し、ガイド（アンチセンス）鎖がターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程によって、ターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（Ｏｐａｌｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１：５０３－５１４，２００２）。
バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究陣によれば、同じターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べて生体内／外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、当該効果が長く持続する効果を有することが明らかにされた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６：１０００－１００４，２００２）。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベースの医薬品又は化学物質医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）に比べて、適用できる対象が画期的に拡大可能であるという長所を有する（Ｂｅｈｌｋｅ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＹ．１３（４）：６６４－６７０，２００６）。
ｓｉＲＮＡの優れた効果及び様々な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、体内におけるｓｉＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の改善及び細胞伝達効率の改善によってｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達される必要がある（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．１１（１－２）：６７－７３，２００６）。
上記の問題を解決するべく、体内安定性の改善のためにｓｉＲＮＡの一部のヌクレオチド又は骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素抵抗性を有するように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）したり、或いはウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、リポソーム又はナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの伝達体の利用などに関して活発に研究されている。
アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性ベクターを用いた伝達システムは形質移入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。これに対し、ナノ粒子を含む非ウイルス性（ｎｏｎｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウイルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率は低いが、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能であり、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞又は組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）及び内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）させるなどの改善された伝達効果が高いだけでなく、細胞毒性及び免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が殆どないという長所があり、現在は、ウイルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法として評価されている（Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１２）：３６２３－３６３２，２００７）。
前記非ウイルス性伝達システムのうちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を利用する方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用することによってナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわち、ナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する形態を有する。ナノ伝達体を利用する方法の中で主に活用される方法には、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などがあるが、このうち、リポプレックスを用いた方法は、陽イオン性脂質で構成され、細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の陰イオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して細胞内に伝達する役割を担う（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１５；９３（２１）：１１４９３－８，１９９６）。
ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合又はリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を用いて、ｓｉＲＮＡの安定性確保及び効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許第８８３４７１号）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット臓器への伝達が円滑でないという短所が依然としてある。このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡのような二本鎖オリゴＲＮＡに、親水性及び疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）と命名された自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ナノ粒子を形成するが（大韓民国登録特許第１２２４８２８号）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べてサイズが非常に小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を得ることができるという長所を有する。
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例として、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）又はＨＥＧ（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）が使用されるが、ＰＥＧは合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、通常、医薬品、特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加及び薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調節のために用いられる。ＰＥＧは多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質であり、一バッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、異なる個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総和からなって、分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ ｖａｌｕｅ，Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性程度を表現する。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３～５ｋＤａ）のとき、約１．０１の多分散指数を示し、高い分子量（２０ｋＤａ）のとき、約１．２という高い多分散指数を示し、高い分子量であるほど物質の同質性が相対的に低い特徴を示す（Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２：４０５－４１７，２００１）。したがって、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映され、単一物質の検証が容易ではないという短所から、ＰＥＧの合成及び精製過程の改善によって低い多分散指数を有する物質を生産する趨勢であるが、特に、分子量の小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易になされたかどうか確認し難い不具合があるなど、物質の多分散性特徴による問題点があった（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＴＯＤＡＹ １０（２１）：１４５１－１４５８，２００５）。
そのため、最近では、既存の自己集合ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の改良された形態として、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二本鎖ＲＮＡ構造体の親水性物質を一定の分子量を有する均一な１～１５個の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）と必要によってリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位にブロック（ｂｌｏｃｋ）化し、これを必要に応じて適切な個数で使用することによって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さいサイズを有し、また、多分散性が画期的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発された。
一方、全世界の脱毛市場規模は２０２４年には１１８億ドルに達する見込みであると報告（Ｇｒａｎｄ Ｖｉｅｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）され、米国男性の７人中の４人、中国男性の５人中の１人がハゲ頭であり、その原因の９０％以上が男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｏｐｅｃｉａ）であると知られている。しかし、現在まで開発された大部分の脱毛治療剤がＤＨＴと５－アルファ還元酵素（５－α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を標的にしており、男性型脱毛症と関連した重要な脱毛遺伝子であるＤＫＫ１を標的にした脱毛治療剤及び発毛製品に対する開発はないことが確認された。
そこで、本発明者らは、毛髪の成長と直接的な連関性を有するＤＫＫ１を標的にする脱毛予防又は発毛関連製品の開発のために鋭意努力した結果、特定ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドがＤＫＫ１の発現を効果的に阻害でき、これを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれを含む組成物が脱毛予防又は発毛に抜群の効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＤＫＫ１の発現を非常に特異的に且つ高い効率で阻害できる二本鎖オリゴヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態、最も好ましくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態の配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含有する脱毛予防又は発毛促進用医薬組成物又は化粧料組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の脱毛予防又は発毛促進用途を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、脱毛予防又は発毛促進のための薬剤又は化粧料の製造のための前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、脱毛予防又は発毛促進が必要な客体に、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子、又は前記組成物を投与する段階を含む脱毛予防又は発毛促進方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）及びこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、また、下記構造式（１）で表される構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を提供する。
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、単純共有結合又はリンカー媒介共有結合を意味し、Ｒは、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖及びこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
本発明は、また、前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を提供する。
本発明は、また、前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体又は前記ナノ粒子を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用医薬組成物を提供する。
本発明は、また、前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体又は前記ナノ粒子を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用化粧料組成物を提供する。
本発明は、また、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の脱毛予防又は発毛促進用途を提供する。
本発明は、また、脱毛予防又は発毛促進のための薬剤の製造のための前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
本発明は、また、脱毛予防又は発毛促進のための化粧料の製造のための前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
本発明は、また、脱毛予防又は発毛促進が必要な個体に、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子、又は前記組成物を投与する段階を含む脱毛予防又は発毛促進方法を提供する。
ヒトＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド候補配列デザインのために、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ配列に対して１－塩基スライディングウィンドウアルゴリズム（１－ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用して、１９個の塩基で構成された候補配列を選別する過程を示す。
ＤＫＫ１を標的にする３１２個の二本鎖オリゴＲＮＡに対する１次及び２次スクリーニングの結果を示す。
ＤＫＫ１発現阻害効果が最も高い１８個配列に対する１次及び２次スクリーニング結果を示す。
ＤＫＫ１発現阻害効果が最も高い１８個配列をＡ５４９細胞に処理して最終１０個の配列を選別した結果を示す。
ヒト毛乳頭細胞であるＨＦＤＰＣ細胞で最終選別された１０個の配列に対する再現性を実験した結果である。
無作為に選別されたＤＫＫ１特異的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドのナノ粒子サイズ分布を示す。
ＤＫＫ１発現阻害効果が最も高い＃７２配列に対するＳＡＭｉＲＮＡのｍＲＮＡ発現阻害抑制能を確認した結果である。
ＨＦＤＰＣ細胞株にＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２を処理した時、ＤＫＫ１のタンパク質発現程度を確認した結果である。
ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２がヒトの毛根細胞に効率的に伝達されることを示す結果である。
特に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
ＤＫＫ１は、Ｗｎｔの抑制タンパク質であるＤｉｃｋｋｏｐｆの一種で、両棲類の脳形成に関与する重要なタンパク質として初めて知られたが、ＤＫＫ１はＷｎｔ／βカテニン信号伝達経路の抑制剤であって、Ｗｎｔの上位信号伝達過程に関与してＷｎｔ信号伝達を遮断し、これによって癌細胞の成長を抑制する機能を有することが報告された（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３２１、２００１；Ｎｉｉｄａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：２３，２００４）。ＤＫＫ１の機能として、アルツハイマー患者の脳において神経細胞の退化、メラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）の成長及び分化の抑制、幹細胞の細胞周期の調節などに関する研究が報告されており（Ｃａｒｉｃａｓｏｌｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，２００４；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６５，２００４）、脂肪形成、軟骨形成、胃腸上皮の増殖、リウマチと関連した骨損失及び毛嚢プラコート形成に関与することも報告された。
このようなＤＫＫ１遺伝子については、癌と関連した報告が多数であるが、これは、Ｗｎｔ／β信号伝達が上皮細胞の結合及び保持に関与する上皮細胞－間葉細胞変換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を調節でき、癌細胞の転移過程に必要な上皮細胞浸透と細胞分化に影響を与えることができるためである。したがって、Ｗｎｔ／β信号伝達のアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としてのＤＫＫ１は、種々の癌において癌細胞の侵襲（ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）を制限することができる。近年、非小細胞性肺癌細胞株のうち、放射線敏感度による細胞株においてＤＫＫ１の発現量に差異があり、放射線に抵抗性が強い細胞株であるＡ５４９又はＨ１２９９細胞株においてＤＫＫ１発現が増加したことを確認し、ＤＫＫ１に対するｓｉＲＮＡを用いてＡ５４９又はＨ１２９９におけるＤＫＫ１発現を抑制した結果、放射線に対する敏感度が顕著に増加することを確認し、抗癌治療にＤＫＫ１発現又は活性抑制が重要であることが報告されたこともある（大韓民国登録特許第１０－１１６７６７５号）。
また、ＤＫＫ１が毛髪の成長期から退化期に至るまで非常に重要な役目を有するという事実が明らかになるに伴って、ＤＫＫ１を標的にする脱毛治療への関心も高まっている。
現在まで開発された大部分の脱毛治療剤がＤＨＴと５－アルファ還元酵素（５－α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を標的にしており、ＦＤＡ承認を受けた成分であるフィナステリドは、経口用脱毛治療剤であって、男性脱毛にのみ使用される治療薬であるが、男性ホルモン減少による副作用が報告され、使用には制限があり、持続して服用しないと発毛効果が消えるという短所から、ミノキシジルと併用する場合も多い。フィナステリドは薬物の持続時間が２４時間であるため、毎日一定の時間に服用しなければならないという面倒さの他にも、高価であって費用の側面でも不都合である。他の頭皮部分治療剤であるミノキシジルは、男性と女性に対して異なる含量を使用し、血圧強化剤として開発されたため、血圧に悪い影響を与えることもあり得ると知られている。既に男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｏｐｅｃｉａ）と関連してＷｎｔ信号伝達経路を用いた脱毛治療剤を開発し始めたが、Ｗｎｔ信号伝達経路のうち、重要な脱毛関連遺伝子であるＤＫＫ１を標的にした脱毛治療剤及び発毛製品は未だ開発されていない。
本発明では、１－塩基スライディングウィンドウアルゴリズム（１－ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用してＤＫＫ１に対するｓｉＲＮＡ候補配列をデザインし、３１２種を選別した後、これらから、特に効果の高い１０種のｓｉＲＮＡが選別できた。また、前記ｓｉＲＮＡを二本鎖オリゴヌクレオチド構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）及びナノ粒子として製造して細胞内伝達効率を増加させ、脱毛防止及び発毛効果を向上させることができた。
したがって、本発明は、一観点において、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）及びこれに相補的配列を含むアンチセンス鎖からなるＤＫＫ１特異的オリゴヌクレオチドに関する。
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、通常のＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を有する全ての物質を含む概念であり、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドには、ＤＫＫ１特異的ｓｉＲＮＡの他にｓｈＲＮＡなども含まれることは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかである。
また、ＤＫＫ１に対する特異性が維持される限り、前記配列番号１～配列番号３０５からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖又はこれに相補的なアンチセンス鎖において一つ以上の塩基が置換、欠失、又は挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むＤＫＫ１特異的ｓｉＲＮＡも本発明の権利範囲に含まれることは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかである。
前記配列番号１～３０５はヒトＤＫＫ１特異的な配列であり、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ以外の遺伝子には１５塩基配列以下の相同性を有するｓｉＲＮＡセンス鎖配列である（表２参照）。一方、配列番号３０６～３０９は、既存特許（ＫＲ１０－１１６７６７５、ＫＲ１０－２０１０－００５１１９５）に知られたヒトＤＫＫ１特異的ｓｉＲＮＡ配列を表す（表３参照）。
本発明では、既存特許で開示されたＤＫＫ１特異的ｓｉＲＮＡ配列と細胞内の活性を比較した結果、抜群の効率性を有しながらも、ヒトの他のｍＲＮＡと相同性が少ないｓｉＲＮＡ配列が発明できた。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号７２の配列をセンス鎖として含むＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドである。
本発明に係るオリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、１９～３１個のヌクレオチドで構成されることが好ましく、前記配列番号１～３０５から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖及びこれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とし得る。
また、本発明において、前記センス又はアンチセンス鎖はそれぞれ、ＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とし得る。
本発明で提供されるＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドは、当該遺伝子を暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合可能となるように設計された塩基配列を有するので、当該遺伝子の発現を効果的に抑制できることが特徴である。また、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端に１つ又は２つ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）したヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができる。
また、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの生体内安定性の向上を目的に、核酸分解酵素抵抗性の付与及び非特異的免疫反応の減少のための様々な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。例えば、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とし得る。前記二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する第１又は第２オリゴヌクレオチドの修飾は、１つ以上のヌクレオチドにおける糖構造の２’炭素位置で－ＯＨ基が－ＣＨ３（メチル）、－ＯＣＨ３（メトキシ）、－ＮＨ２、－Ｆ（フッ素）、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、－Ｏ－２－メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、－Ｏ－３－アミノプロピル、－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル、－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド又は－Ｏ－ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチドにおける糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置換された修飾；又は、ヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）又はボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メチルホスフェート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への修飾から選ばれた１つ以上の修飾が組み合わされて用いられてよく、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態への修飾；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とし得る（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５，６１－６５２００４；ＵＳ５，６６０，９８５；ＵＳ５，９５８，６９１；ＵＳ６，５３１，５８４；ＵＳ５，８０８，０２３；ＵＳ６，３２６，３５８；ＵＳ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９－１１４３，２００３；ＲＮＡ，９：１０３４－１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９－５９５，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１－５７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）１８２３－１８３２，２０１１）が、これに限定されるものではない。
本発明において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とし得る。
本発明で提供されるＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドは、当該遺伝子の発現を阻害させる他、当該タンパク質の発現も顕著に阻害させる。
本発明では、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの生体内への効率的な伝達及び安定性の向上のために、オリゴヌクレオチドの両末端に親水性物質及び疎水性物質が接合された形態の接合体を製造した。
上記のように、オリゴヌクレオチドに親水性物質及び疎水性物質が結合したｓｉＲＮＡ接合体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己集合ナノ粒子を形成するが（大韓民国特許登録番号第１２２４８２８号）、このようなナノ粒子は、体内への伝達効率及び体内における安定性に極めて優れるだけでなく、粒子サイズの均一性に優れ、品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）がし易いので、薬物としての製造工程が簡単であるという長所がある。
すなわち、本発明では、前記製造されたＤＫＫ１特異的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）及びナノ粒子を製造した。
したがって、本発明は、他の観点において、下記構造式（１）で表される構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体に関する。
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合を意味し、Ｒは、上記のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。一部の態様として、Ｒは、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖及びこれに相補的配列を含むアンチセンス鎖からなるＤＫＫ１特異的オリゴヌクレオチドを意味する。
以下、本発明に係る二本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡを中心に説明されるが、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドと同じ特性を有する他の二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）にも適用可能であることは、当業界における通常の技術者にとって明らかである。
より好ましくは、本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（２）で表される構造を含む。
Figure 0007356505000001
 前記構造式（２）で、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）における定義と同一であり、ＳはＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖、ＡＳはＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を意味する。
より好ましくは、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（３）又は（４）で表される構造を有する。
Figure 0007356505000002
 前記構造式（３）及び構造式（４）で、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）における定義と同一であり、５’及び３’は、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
上記の構造式（１）～構造式（４）における前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が１個～３個結合してよく、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが使用されてもよいことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかである。
前記構造式（１）～構造式（４）における親水性物質は、分子量が２００～１０，０００である高分子物質が好ましく、より好ましくは、１，０００～２，０００である高分子物質である。例えば、親水性高分子物質には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。
特に、構造式（１）～構造式（４）における親水性物質（Ａ）は、下記構造式（５）又は構造式（６）のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）形態で利用可能であるが、このような親水性物質ブロックを必要によって適切な個数（構造式（５）又は構造式（６）におけるｎ）を使用することによって、一般合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題点を大きく改善することができる。
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
前記構造式（５）で、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｊはｍ個の親水性物質単量体間、又はｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカー、ｍは１～１５の整数、ｎは１～１０の整数を意味し、（Ａ’ｍ－Ｊ）又は（Ｊ－Ａ’ｍ）で表される反復単位が、親水性物質ブロックの基本単位に該当する。
前記構造式（５）又は構造式（６）のような親水性物質ブロックを有する場合、本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（７）又は構造式（８）のような構造を有することができる。
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
前記構造式（７）及び構造式（８）で、Ｘ、Ｒ、Ｙ及びＢは、構造式（１）における定義と同一であり、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）及び構造式（６）における定義と同一である。
前記構造式（５）及び構造式（６）で、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体のうち、本発明の目的に符合するものであればいずれも使用可能であり、好ましくは、表１に記載の化合物（１）～化合物（３）から選ばれた単量体、より好ましくは、化合物（１）の単量体が使用されてよく、化合物（１）において、Ｇは、好ましくは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選ばれてよい。
特に、親水性物質単量体の中でも特に化合物（１）で表される単量体は、様々な官能基を導入することができ、生体内親和性が良く、免疫反応を少なく誘導するなど、生体適合性（ｂｉｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れる他にも、構造式（７）又は構造式（８）による構造体内に含まれたオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させ、伝達効率を増加させることができるという長所を有し、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
前記構造式（５）～構造式（８）における親水性物質は、総分子量が１，０００～２，０００の範囲内であることが特に好ましい。したがって、例えば、構造式（７）及び構造式（８）において化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち、ＧがＯで、ｍが６である物質が用いられる場合、ヘキサエチレングリコールスぺーサ（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるから、反復回数（ｎ）は３～５であることが好ましい。特に、本発明は、必要によって前記構造式（５）及び構造式（６）において（Ａ’ｍ－Ｊ）又は（Ｊ－Ａ’ｍ）で表される親水性基の反復単位、すなわち、親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）が、ｎと表される適切な個数で使用されてよいことを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡとリンカーであるＪは、独立して、各親水性物質ブロック間に同一であってもよく、異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが３個用いられる場合（ｎ＝３）、一番目のブロックには化合物（１）による親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）による親水性物質単量体が、三番目ブロックには化合物（３）による親水性物質単量体が用いられるなど、全ての親水性物質ブロック別に異なる親水性物質単量体が用いられてもよく、全ての親水性物質ブロックに化合物（１）～化合物（３）による親水性物質単量体から選ばれたいずれか１つの親水性物質単量体が同一に用いられてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別にいずれも同一のリンカーが用いられてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが用いられてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも、各親水性物質ブロック間に同一であってもよく、異なってもよい。すなわち、一番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が３個連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が５個（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が４個連結（ｍ＝４）されるなど、異なる個数の親水性物質単量体が用いられてもよく、全ての親水性物質ブロックで同一個数の親水性物質単量体が用いられてもよい。また、本発明において、前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３ －、ＳＯ３及びＣＯ２からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されるものではなく、使用される親水性物質の単量体などによって本発明の目的に符合するいかなるリンカーも使用可能であることは、通常の技術者には明らかである。
前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用によって構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）によるオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を担う。前記疎水性物質は、分子量が２５０～１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、トコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）などが用いられてよいが、これに制限されるものではなく、本発明の目的に符合するいかなる疎水性物質も使用可能であるという点は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかである。
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、ギ酸コレステロール、ギ酸コレスタニル及びコレステリルアミンからなる群から選ばれてよく、前記グリセリド誘導体は、モノ－、ジ－及びトリ－グリセリドなどから選ばれてよいが、このとき、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和脂肪酸が好ましい。
特に、前記疎水性物質の中でも飽和又は不飽和炭化水素又はコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができるという長所から好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を含む形態が最も好ましい。
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合し、二本鎖オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれの位置に結合しても構わない。
本発明に係る構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における親水性物質又は疎水性物質とＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドは、単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合（Ｘ又はＹ）によって結合する。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質又は疎水性物質とＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの末端で共有結合し、必要によって特定環境で分解可能な結合を提供する限り、特に限定されるものではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係る二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造過程中にＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド及び／又は親水性物質（又は、疎水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も使用可能である。前記共有結合は、非分解性結合又は分解性結合のいずれであっても構わない。このとき、非分解性結合にはアミド結合又はリン酸結合があり、分解性結合にはジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合又は酵素分解性結合などがあるが、これに限定されるものではない。
また、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）におけるＲ（又は、Ｓ及びＡＳ）で表されるＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＫＫ１のｍＲＮＡに特異的に結合できる特性を有するオリゴヌクレオチドであればいずれも使用可能であり、好ましくは、本発明では、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか１つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖で構成される。
特に、本発明に係る前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）に含まれる二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか１つの配列を含むセンス鎖及びこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖からなるＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明は、また、本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体において、前記構造体内の親水性物質のオリゴヌクレオチドと結合した反対側末端部位にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基がさらに導入されてよい。
これは、本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためのものであり、既に量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためにアミン基の導入とポリヒスチジン基が利用できるという点及びその効果が報告されたことがある。
具体的に、伝達体の末端或いは外側に修飾された１次アミン基は、生体内ｐＨで陽性子化しながら負電荷を帯びる遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成し、細胞内流入後にエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を有する内部３次アミンによってエンドソームの脱出が容易になることによって、リソソーム分解から伝達体を保護できると知られている（高分子ベースのハイブリッド物質を用いた遺伝子伝達及び発現抑制。Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４－２５９）。
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（－Ｒ）にイミダゾリン（ｐＫａ３ ６．０４）を有するので、エンドソームとリソソームにおいて緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があり、リポソームをはじめとする非ウイルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ）においてエンドソーム脱出効率を高めるためにヒスチジン修飾が利用可能であるという点が知られている（Ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１８，ｐｐ２６２－２７０）。
前記アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、１つ以上のリンカーを介して親水性物質又は親水性物質ブロックと連結されてよい。
本発明の構造式（１）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式（９）のような構造を有することができる。
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（９）
前記構造式（９）で、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｘ及びＹは、構造式（１）における定義と同一であり、Ｐは、アミン基又はポリヒスチジン基を意味し、Ｊ１とＪ２はリンカーであって、Ｊ１は及びＪ２は、独立して、単純共有結合、ＰＯ３ －、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２－１２アルキル、アルケニル、アルキニルから選ばれてよいが、これに限定されるものではなく、使用される親水性物質によって本発明の目的に符合するＪ１とＪ２はいかなるリンカーも使用可能であることは、通常の技術者には明らかである。
好ましくは、アミン基が導入された場合には、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３ －、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されない。
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入された場合には、構造式（９）では、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３ －、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
Figure 0007356505000004
また、構造式（９）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質が、構造式（５）又は構造式（６）による親水性物質ブロックであり、これにアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式（１０）又は構造式（１１）のような構造を有することができる。
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１０）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１１）
前記構造式（１０）及び構造式（１１）で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）又は構造式（６）における定義と同一であり、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は、構造式（９）における定義と同一である。
特に、前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、親水性物質は、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の３’末端に結合した形態であることが好ましく、この場合、前記構造式（９）～構造式（１１）は、次の構造式（１２）～構造式（１４）の形態を有することができる。
Figure 0007356505000005
 前記構造式（１２）～構造式（１４）で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は、前記構造式（９）～構造式（１１）における定義と同一であり、５’及び３’は、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
本発明で導入可能なアミン基としては、１次～３次アミン基が用いられてよく、１次アミン基が用いられることが特に好ましい。前記導入されたアミン基は、アミン塩として存在してもよいが、例えば、１次アミン基の塩は、ＮＨ３ ＋の形態で存在してよい。
また、本発明で導入可能なポリヒスチジン基は、３～１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に、好ましくは５～８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含むことができる。さらに、ヒスチジンの他に１つ以上のシステインも含まれてよい。
一方、本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイエティが具備されると、効率的にターゲット細胞への伝達を促進するので、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達され、高いターゲット遺伝子発現調節機能を示すことができ、他の臓器及び細胞への非特異的なＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの伝達を防止することができる。
これによって、本発明は、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による構造体の親水性物質に、リガンド（Ｌ）、特に受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）によりターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）がさらに結合した二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を提供し、例えば、構造式（１）による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体にリガンドが結合した形態は、下記構造式（１５）のような構造を有する。
（Ｌｉ－Ｚ）－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１５）
前記構造式（１５）で、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）における定義と同一であり、Ｌは、受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）によりターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドを意味し、ｉは１～５の整数、好ましくは１～３の整数である。
前記構造式（１５）におけるリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を有するターゲット受容体特異的抗体、アプタマー、ペプチド；又は、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般に、ｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄが交差使用されており、本発明における葉酸は、自然状態又は人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する。）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）などのヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖又は炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）などの化学物質などから選ばれてよいが、これに限定されるものではない。
また、前記構造式（１５）における親水性物質Ａは、構造式（５）及び構造式（６）による親水性物質ブロックの形態で用いられてよい。
本発明は、さらに他の観点において、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子に関する。
上述したように、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、疎水性及び親水性物質の両方を含んでいる両親媒性であり、親水性部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用によって親和力を有しているので外側に向かうようになり、疎水性物質は、その同士間の疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって内側に向かうようになるので、熱力学的に安定したナノ粒子を形成する。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの外側の方向に親水性物質が位置することにより、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子は、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞内伝達及びオリゴヌクレオチド効能を向上させる。
本発明に係るナノ粒子は、同一の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体だけで構成されてもよく、異なる配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合して構成されてもよいことを特徴とするが、本発明における異なる配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、異なるターゲット遺伝子、例えば、ＤＫＫ１特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、同一のターゲット遺伝子特異性を有しながらその配列が異なる場合も含まれると解釈される。
また、ＤＫＫ１特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド以外に他の脱毛関連遺伝子特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が本発明に係るナノ粒子に含まれてもよい。
本発明において、前記ナノ粒子は、凍結乾燥した形態であることを特徴とし得る。
本発明は、前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）及びナノ粒子の脱毛予防又は発毛促進効果を確認した。
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を含む脱毛、特にアンドロゲン性脱毛の予防又は発毛促進用医薬組成物に関する。
前記医薬組成物は、軟膏、ペースト、ゲル、ジェリー、セラム（ｓｅｒｕｍ）、エアゾールスプレー、非エアゾールスプレー、フォーム、クリーム、ローション、溶液又は懸濁液の剤形から選ばれる剤形に用いられることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明は、さらに他の観点において、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を含む脱毛、特にアンドロゲン性脱毛の予防又は発毛用化粧料組成物に関する。
前記組成物は、これに限定されないが、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャークリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘア石鹸、ヘアクレンジングフォーム、ヘアオイル、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアゲル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャーライザー、ヘアムース又はヘアスプレーの剤形から選ばれる剤形に用いられることを特徴とし得る。
本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む組成物は、テストステロンの代謝産物であるＤＨＴによって誘導される脱毛遺伝子であるＤＫＫ１の発現自体を抑制し、本発明のＤＫＫ１特異的オリゴヌクレオチドを含む組成物は脱毛予防又は発毛誘導に効果を奏するものである。
特に、本発明に係る二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含む脱毛疾患予防又は発毛用組成物には、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖及びこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＤＫＫ１特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が含まれてよい。
また、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体以外の他の脱毛疾患関連遺伝子に特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド、又はこれを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が、本発明に係る組成物にさらに含まれてもよい。
本発明に係る組成物は、ＤＫＫ１の上位又は下位信号伝達に関与する遺伝子に関連した脱毛、特に、アンドロゲン性脱毛に適用されてよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物には、前記の有効成分の他に、さらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造できる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分又は２以上の成分を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形に製剤化できる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術の分野に一般に知られている方法が用いられてよく、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。なお、当分野の適正な方法で又はレミングトン薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾病によって又は成分によって好ましく製剤化されてもよい。
本発明の組成物に含まれる有効成分などの含有量及び投与方法は、通常の個人の症候と脱毛の深刻度に基づき、本技術分野における通常の専門家が決定できる。また、散剤、錠剤、注射剤、軟膏剤、機能性化粧品などの様々な形態で製剤化でき、単位投与量又は多回投与量容器、例えば、密封したアンプル及び瓶などで提供されてよい。
本発明は、さら他の観点において、発毛が必要な客体に、本発明に係る二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体、これを含むナノ粒子を投与する段階を含む脱毛予防又は発毛促進方法に関する。本発明は、特に、脱毛疾患特に、アンドロゲン性脱毛、円形脱毛、休止期脱毛の予防及び発毛を促進又は誘導する方法に関する。
本発明は、さらに他の観点において、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の脱毛予防又は発毛促進用途に関する。
本発明は、さらに他の観点において、脱毛予防又は発毛促進のための薬剤の製造のための前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途に関する。
本発明は、さらに他の観点において、脱毛予防又は発毛促進のための化粧料の製造のための前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体、又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途に関する。
本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む構造体、これを含む組成物又はナノ粒子を、機能性化粧品又は皮膚外用剤の製造に用いる場合、機能性化粧品又は皮膚外用剤の剤形は、クリーム、ローション、ゲル、水溶性リキッド及びエッセンスからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明において、脱毛は、アンドロゲン性脱毛、円形脱毛、休止期脱毛のいずれであってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
実施例１：ＤＫＫ１を標的にするｓｉＲＮＡスクリーニングのためのアルゴリズム候補配列選定
ＤＫＫ１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１２２４２．３，１９１３ｂｐ）に結合可能な目標塩基配列（センス鎖）を３１２種デザインした。
より具体的に、ＤＫＫ１に対するｓｉＲＮＡ候補配列に対するデザイン過程は、ヒトＤＫＫ１ ｍＲＮＡのエクソン地図（ｅｘｏｎ ｍａｐ）を確認し、１－塩基スライディングウィンドウアルゴリズム（１－ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用して、１９個の塩基で構成された候補配列をデザインした後、ｓｉＲＮＡ候補配列リストをヒト総参考配列ＲＮＡ（ｈｕｍａｎ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｑ ＲＮＡ）に対するＢＬＡＳＴ ｅ－ｖａｌｕｅ １００以下で行い、他の遺伝子とＲＮＡ配列に対して同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が１５塩基以下である３０５個のｓｉＲＮＡ候補配列を選別した（表２）。このとき、既に公知された先行文献（ＫＲ１０－１１６７６７５、ＫＲ１０－２０１０－００５１１９５）で言及された４個のｓｉＲＮＡ配列（表４）を含めて総３１２個のｓｉＲＮＡ配列を用いてＤＫＫ１阻害程度実験を行った（図１）。
Figure 0007356505000007
Figure 0007356505000008
Figure 0007356505000009
Figure 0007356505000010
Figure 0007356505000011
Figure 0007356505000012
Figure 0007356505000013
Figure 0007356505000014
Figure 0007356505000015
Figure 0007356505000016
Figure 0007356505000017
Figure 0007356505000018
実施例２：ヒトＤＫＫ１遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡスクリーニング
実施例１で合成されたヒトＤＫＫ１配列を標的にする３１２種のｓｉＲＮＡを用いて、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ発現を効果的に抑制する配列の発掘のためのスクリーニングを行った。
２－１：ｈＤＫＫ１ ｓｉＲＮＡの細胞処理方法（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ヒトＤＫＫ１発現を効率的に抑制するｓｉＲＮＡ配列の発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９及びヒト毛乳頭細胞であるＨＦＤＰＣを用いた。Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトアビジン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）が含まれたＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養し、ＨＦＤＰＣ細胞株は、ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれた毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ）（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。Ａ５４９及びＨＦＤＰＣ細胞を１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳ）に４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがってｓｉＲＮＡを２０ｎＭでトランスフェクションさせた。
２－２：ｈＤＫＫ１発現抑制効能分析を用いた３０８種のｓｉＲＮＡの１次及び２次スクリーニング
実施例２－１の方法でＡ５４９細胞に３１２種のｓｉＲＮＡを３回反復してトランスフェクションした。ユニバーサルＲＮＡ抽出キット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて細胞溶解物から総ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型にしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） ＧｒｅｅｎＳｔａｒTMＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがってｈＤＫＫ１及びｈＲＰＬ１３Ａ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）のｍＲＮＡ発現レベルを、対照群サンプル対比でｈＤＫＫ１遺伝子の相対的発現率を分析した。各遺伝子に対するプライマー配列は、下記の通りである（表４）。
Figure 0007356505000019
その結果、図２に示すように、５０％以上ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ抑制効果を示す配列４６個を確認した。同一の方法により、再現性確保のための２次スクリーニングを用いて５０％以上抑制能を示す配列５２個を確認した。１次及び２次の反復スクリーニングにより、５５％以上のＤＫＫ１ ｍＲＮＡ抑制効果を示す共通配列１８種を選別した（図２）。
２－３：選別されたｈＤＫＫ１ ｓｉＲＮＡ候補配列の再現性評価
実施例２－２で選別された１８種のｈＤＫＫ１ ｓｉＲＮＡ配列のうち、抑制能の高い１０個の配列を対象に、再現性評価のために、Ａ５４９細胞に１０種のｓｉＲＮＡを３回反復してトランスフェクションした。その結果、１次及び２次のスクリーニングと同様に、１０種の配列のいずれも５５％以上の阻害能を示し、特に、＃７２配列では７０％以上の高い抑制能を示した（図３及び図４）。
２次再現性評価のために、ヒト毛乳頭細胞であるＨＦＤＰＣ細胞に、同じ方法で１０種の配列を３回反復トランスフェクションして分析した結果、１０種の配列のいずれも高いＤＫＫ１ ｍＲＮＡ抑制能を示し、Ａ５４９細胞と同様に、＃７２配列は約８０％以上の高い抑制能を示した（図５）。
上記の反復及び再現性評価により、ヒトＤＫＫ１遺伝子発現を最も効果的に抑制する配列１種を最終選別したが、当該ＤＫＫ１ｓｉＲＮＡ配列情報は下記表５の通りである。
Figure 0007356505000020
実施例３：選別されたＤＫＫ１配列＃７２に対する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の合成及びＤＫＫ１発現抑制効能評価
３－１：ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２構造体合成
本発明で製造された二本鎖オリゴヌクレオチド構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記構造式のような構造を有する。
Figure 0007356505000021
合成過程は、ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が結合した固形支持体（ＣＰＧ）上から始めて遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）及び酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）からなるサイクルを反復することによって、所望の配列のオリゴヌクレオチド一本鎖を得る。当該一連の二本鎖オリゴヌクレオチドの合成過程には、ＲＮＡ合成器（３８４ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いた。
二本鎖オリゴヌクレオチド構造体のセンス鎖は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）－ＣＰＧを支持体にしてβ－シアノエチルホスホロアミダイトを用いてＤＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法で行って、３’末端部位にポリエチレングリコールが結合したセンス鎖の二本鎖オリゴヌクレオチド－親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているＣ２４を５’末端に結合させた。センス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合も、β－シアノエチルホスホロアミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法を用いて、センス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した後、５’末端にリン酸基を結合させるために化学的リン酸化試薬（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，ＣＰＲ）を用いて、５’末端にリン酸基が結合したアンチセンス鎖を製造した。
合成が完了すると、６０℃の恒温水槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたオリゴヌクレオチド一本鎖及びオリゴヌクレオチド－高分子構造体をＣＰＧから切り離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を用いて保護残基を除去した。保護残基が除去されたオリゴＲＮＡ一本鎖及びオリゴＲＮＡ－高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の比率で処理して２’を除去した。前記反応物から、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）により、オリゴヌクレオチド一本鎖、オリゴヌクレオチド－高分子構造体及びリガンドが結合したオリゴヌクレオチド－高分子構造体を分離し、これをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ－ＭＳ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）で分子量を測定し、合成しようとする塩基配列及びオリゴヌクレオチド－高分子構造体と符合するかどうか確認した。その後、それぞれの二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ酢酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０以上に入れ、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、さらに３７℃で反応させ、目的するＳＡＭｉＲＮＡ、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝１）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝２）、ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝３）及びｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）をそれぞれ製造した。製造された二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、電気泳動を用いてアニーリングを確認した。
３－２：ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２ナノ粒子粒度分析
実施例３－１で合成されたＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２の粒度分析のために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡのサイズ及び多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を測定した結果、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２に対するナノ粒子のサイズ及び多分散指数は下記表６の通りであり、代表的なグラフは、図６のように測定された。
Figure 0007356505000022
３－３：ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２ナノ粒子の細胞処理方法
最終候補物質ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２のＤＫＫ１発現抑制効能を評価するために、ヒト毛乳頭細胞であるＨＦＤＰＣを利用し、ＨＦＤＰＣ細胞株は、ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれた毛乳頭細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。ＨＦＤＰＣ細胞を１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳ）に４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２を１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して細胞に５μＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２の処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で総２回又は４回処理し、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。
３－４：ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２ナノ粒子のＤＫＫ１ ｍＲＮＡ発現抑制効能評価
最終候補物質ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２のＤＫＫ１遺伝子発現抑制効果を評価するために、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳ）に、ＨＦＤＰＣ細胞株を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。翌日、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２を５μＭ濃度で２回、４回処理し、陽性対照群は、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２を２０ｎＭでトランスフェクションした。４８時間培養後、ユニバーサルＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，ＫＲ）を用いて細胞溶解物から総ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型にしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） ＧｒｅｅｎＳｔａｒTMＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，ＫＲ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがってＤＫＫ１及びＲＰＬ１３Ａ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで分析した。
その結果、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２は、約７０％以上のＤＫＫ１ ｍＲＮＡ発現抑制能が観察され、これにより、陽性対照群に比べて高い効率で抑制することを確認した（図７）。
３－５：ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２ナノ粒子のＤＫＫ１タンパク質発現抑制効能評価
最終候補物質ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２を用いてＨＦＤＰＣ細胞株でＤＫＫ１タンパク質の発現抑制効果を確認した。１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳ）にＨＦＤＰＣ細胞株を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養し、翌日、ＳＡＭｉＲＮＡを５μＭ濃度で２回、４回処理した。陽性対照群は、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡを２０ｎＭでトランスフェクションした。４８時間培養後、上澄液を集めてサンプリングし、ヒトＤｋｋ－１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがってＤＫＫ１タンパク質の発現量を定量的に分析した。
ＥＬＩＳＡ分析の結果、最終候補物質ＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２は、実施例３－４のＤＫＫ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果と類似に、約７０％以上のタンパク質抑制効能が観察され、陽性対照群と比較したとき、同等以上のタンパク質抑制効果を示すことを確認した（図８）。
実施例４：ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の毛根（ｈａｉｒ ｒｏｏｔ）内伝達効果確認
最終選別されたＳＡＭｉＲＮＡ－ＤＫＫ１ ＃７２のヒトの毛根内伝達効率を確認するために、ヒトの毛髪を対象に伝達効果を確認した。毛髪は、実験当日に髪の毛の先端部分を取って抜いて採取し、毛根から１ｃｍ程度に切った後、９６ウェルプレートに２００ｕｌ Ｍ１９９培地（１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン）に１時間培養した。その後、ＦＡＭ蛍光物質が標識されたＳＡＭｉＲＮＡ １０ｕＭが含まれているＭ１９９培地２００ｕｌに２４時間培養した。ＳＡＭｉＲＮＡを２４時間処理し、ＤＰＢＳを用いて３回の洗浄後に、最終的に３．７％ホルムアルデヒド、２％ＦＢＳが含まれているＰＢＳで２０分間毛根固定作業を行った。固定の完了した毛根を、ＯＣＴ化合物（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）が入っているベースモールド（ｂａｓｅ ｍｏｌｄ）に植え、あらかじめ凍らせておいたステンレスプレート上に乗せてＯＣＴ化合物を完全に凍らせた。凍らせた組織は－７０℃に保管し、組織切片器で切る前に、組織切片がし易くなるように－２０℃に３０分程度置いた。切片組織は、１０ｕｍ厚でスライドに乗せて１時間乾燥させ、乾燥が終わると、ＤＡＰＩ含有のマウンティングメディアムを用いてマウント過程を行った。
共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＬＳＭ５ ＬＩＶＥ ＣＯＮＦＩＧＵＲＡＴＩＯＮ ＶＡＲＩＯＴＷＯ ＶＲＧＢ））で蛍光を観察した結果、ＳＡＭｉＲＮＡが髪の毛組織中の毛根細胞によく伝達されることが確認された（図９）。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
本発明に係るＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、前記二本鎖オリゴヌクレオチド又は構造体を含むナノ粒子、若しくは、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記構造体又は前記ナノ粒子を有効成分として含む脱毛予防又は発毛用組成物は、副作用無しで高い効率でＤＫＫ１の発現を抑制でき、脱毛予防及び発毛促進に抜群の効果を示すので、脱毛予防及び発毛促進用途に非常に有用に用いることができる。

Claims (24)

  1. ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれる配列からなるセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）及びこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含み、
    前記ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチはＲＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡであり、前記アンチセンスはＲＮＡであり、そしてセンス鎖及びアンチセンス鎖は１９～３１個のヌクレオチドからなる、
    ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 前記センス鎖は配列番号７２、８０、８１、２０９、２１４、２１５、２１６、２１７、２５４及び２５６からなる群から選ばれるＤＮＡ又は前記ＤＮＡに対応するＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド。
  3. 前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. 前記化学的修飾は、ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２’炭素位置において水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、Ｏ－２－メトキシエチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－２－メチルチオエチル基、Ｏ－３－アミノプロピル基、Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基及びＯ－ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選ばれるいずれか一つに置換される修飾；
    ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄に置換される修飾；
    ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスフェート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選ばれるいずれか一つの結合となる修飾；及び
    ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド。
  5. 前記二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に、一つ以上のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とする、請求項１に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 下記構造式（１）で表される構造を含む、ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
    Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
    前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合を意味し、Ｒは、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、
    前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群から選ばれるか、又は下記構造式（５）又は構造式（６）：
    （Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
    （Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
    （前記構造式（５）又は構造式（６）で、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊは、ｍ個の親水性物質単量体間、又はｍ個の親水性物質単量体と二本鎖オリゴヌクレオチドとを互いに連結するリンカーを、ｍは１～１５の整数、ｎは１～１０の整数を意味し、
    親水性物質単量体Ａ’は、下記化合物（１）～化合物（３）から選ばれたいずれか１つの化合物であり、リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ３ －－、－ＳＯ３－及び－ＣＯ２－からなる群から選ばれる；
    前記化合物（１）で、Ｇは、Ｏ、Ｓ及びＮＨからなる群から選ばれる；
    ）で表される構造を有し、前記疎水性物質は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、ギ酸コレステロール、ギ酸コレスタニル及びコレステリルアミンからなる群から選ばれるステロイド誘導体、モノ－グリセリド、ジ－グリセリド及びトリ－グリセリドからなる群から選ばれるグリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）及びトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）からなる群から選ばれる、
    ＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  7. 下記構造式（２）で表される構造を含む、請求項６に記載のＤＫＫ１二本鎖オリゴヌクレオチド構造体；
    前記構造式（２）で、Ｓ及びＡＳはそれぞれ、請求項６に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、請求項６における定義と同一である。
  8. 下記構造式（３）又は構造式（４）で表される構造を含む、請求項７に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体；
    前記構造式（３）及び（４）で、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｓ及びＡＳは、請求項７における定義と同一であり、５’及び３’は、二本鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’及び３’末端を意味する。
  9. 下記構造式（７）又は構造式（８）で表される構造を有することを特徴とする、請求項８に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体：
    （Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
    （Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）。
  10. 前記Ｘ及びＹで表される共有結合は、非分解性結合又は分解性結合であることを特徴とする、請求項６に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  11. 前記非分解性結合は、アミド結合又はリン酸結合であることを特徴とする、請求項１０に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  12. 前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合及び酵素分解性結合からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  13. 前記親水性物質に受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）によってターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）がさらに結合したことを特徴とする、請求項６に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  14. 前記リガンドは、ターゲット受容体特異的抗体、アプタマー、ペプチド、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）及びマンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  15. 前記親水性物質のｓｉＲＮＡと結合した反対側末端部位に、アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基がさらに導入されたことを特徴とする、請求項６に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  16. 前記アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、１つ以上のリンカーを介して親水性物質と連結されたことを特徴とする、請求項１５に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  17. 前記ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、３～１０個のヒスチジンを含むことを特徴とする、請求項１５に記載のＤＫＫ１特異的二本鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  18. 請求項６～１７のいずれか一項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）。
  19. 前記ナノ粒子は、異なる配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合して構成されることを特徴とする、請求項１８に記載のナノ粒子。
  20. 前記ナノ粒子は、凍結乾燥した形態であることを特徴とする、請求項１８に記載のナノ粒子。
  21. 請求項６～１７のいずれか一項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用医薬組成物。
  22. 請求項１８に記載のナノ粒子を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用医薬組成物。
  23. 請求項６～１７のいずれか一項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用化粧料組成物。
  24. 請求項１８に記載のナノ粒子を有効成分として含む脱毛予防又は発毛促進用化粧料組成物。
JP2021541051A 2019-01-15 2020-01-15 Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物 Active JP7356505B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0005277 2019-01-15
KR20190005277 2019-01-15
PCT/KR2020/000750 WO2020149644A1 (ko) 2019-01-15 2020-01-15 Dkk1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022518430A JP2022518430A (ja) 2022-03-15
JP7356505B2 true JP7356505B2 (ja) 2023-10-04

Family

ID=71614288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021541051A Active JP7356505B2 (ja) 2019-01-15 2020-01-15 Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220088051A1 (ja)
EP (1) EP3913055A4 (ja)
JP (1) JP7356505B2 (ja)
KR (1) KR102370637B1 (ja)
CN (1) CN113454223A (ja)
WO (1) WO2020149644A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023039460A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for immune control through dickkopf-1
CN117916377A (zh) * 2021-09-26 2024-04-19 安沛治疗有限公司 针对dkk1的适体及其用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006217844A (ja) 2005-02-09 2006-08-24 Univ Of Tokyo Ｄｋｋ１の遺伝子、蛋白質及び抗体を用いた癌の診断・モニター方法及び治療方法
JP2009517080A (ja) 2005-11-30 2009-04-30 ジュンムン キム 非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド及びその製造方法
CN101643731A (zh) 2009-07-27 2010-02-10 北京大学人民医院 DKK-1特异性siRNA及其在类风湿关节炎治疗中的应用
JP2016525346A (ja) 2013-07-05 2016-08-25 バイオニア コーポレーションＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれを含む呼吸器疾患予防または治療用組成物
JP2017512502A (ja) 2014-04-04 2017-05-25 バイオニア コーポレーションＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 新規の二重らせんオリゴｒｎａおよびこれを含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物
WO2018208108A1 (ko) 2017-05-10 2018-11-15 주식회사 굳티셀 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6175001B1 (en) 1998-10-16 2001-01-16 The Scripps Research Institute Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same
EP2314691A3 (en) * 2002-11-14 2012-01-18 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional siRNA
EP1915449B1 (en) 2005-08-17 2016-03-23 Bioneer Corporation Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof
AR060017A1 (es) * 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
WO2009102427A2 (en) * 2008-02-11 2009-08-20 Rxi Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
KR20100051195A (ko) 2008-11-07 2010-05-17 서울대학교산학협력단 Ｄｋｋ1 또는 ｓＦＲＰ4 억제제를 함유한 비만 예방용 조성물
KR101224828B1 (ko) 2009-05-14 2013-01-22 (주)바이오니아 ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법
KR101167675B1 (ko) 2009-12-04 2012-07-20 한국원자력연구원 Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１(ＤＫＫ１) 유전자의 저발현에 의해 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법
WO2012135230A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
KR101940767B1 (ko) * 2011-11-23 2019-01-22 (주)아모레퍼시픽 Ｄｋｋ1 억제용 조성물
EP2859486A2 (en) * 2012-06-06 2015-04-15 The Procter & Gamble Company Systems and methods for identifying cosmetic agents for hair/scalp care compositions
EP3018208B1 (en) * 2013-07-05 2020-05-27 Bioneer Corporation Improved nanoparticle type oligonucleotide structure having high efficiency and method for preparing same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006217844A (ja) 2005-02-09 2006-08-24 Univ Of Tokyo Ｄｋｋ１の遺伝子、蛋白質及び抗体を用いた癌の診断・モニター方法及び治療方法
JP2009517080A (ja) 2005-11-30 2009-04-30 ジュンムン キム 非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド及びその製造方法
CN101643731A (zh) 2009-07-27 2010-02-10 北京大学人民医院 DKK-1特异性siRNA及其在类风湿关节炎治疗中的应用
JP2016525346A (ja) 2013-07-05 2016-08-25 バイオニア コーポレーションＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれを含む呼吸器疾患予防または治療用組成物
JP2017512502A (ja) 2014-04-04 2017-05-25 バイオニア コーポレーションＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 新規の二重らせんオリゴｒｎａおよびこれを含む線維症または呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物
WO2018208108A1 (ko) 2017-05-10 2018-11-15 주식회사 굳티셀 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mi H. Kwack et al.，Dickkopf 1 Promotes Regression of Hair Follicles，Journal of Investigative Dermatology，2012年，Vol.132，pp.1554-1560

Also Published As

Publication number Publication date
EP3913055A4 (en) 2023-09-27
KR102370637B1 (ko) 2022-03-07
CN113454223A (zh) 2021-09-28
EP3913055A1 (en) 2021-11-24
KR20200088785A (ko) 2020-07-23
JP2022518430A (ja) 2022-03-15
WO2020149644A1 (ko) 2020-07-23
US20220088051A1 (en) 2022-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019219472B2 (en) Peptide nucleic acid complex having endosomal escape capacity, and use thereof
Felber et al. siRNA nanocarriers based on methacrylic acid copolymers
CN105683377B (zh) 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构、含有它们的组合物用于预防或治疗呼吸疾病
JP7027303B2 (ja) メラニン産生を抑制するｒｎａ複合体
JP7356505B2 (ja) Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物
CN112368382A (zh) 用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物
JP2023113845A (ja) アンドロゲン受容体特異的配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、及びこれを含む脱毛予防及び発毛用組成物
Xu et al. Efficient siRNA delivery using PEG-conjugated PAMAM dendrimers targeting vascular endothelial growth factor in a CoCl2-induced neovascularization model in retinal endothelial cells
TW202227136A (zh) 寡核酸共軛物
RU2778086C1 (ru) Двуцепочечные олигонуклеотидные конструкции, содержащие специфичную для андрогеновых рецепторов последовательность, и содержащие их композиции для предотвращения выпадения волос и усиления роста волос
CN116157521A (zh) 双链寡核苷酸和用于治疗covid-19的含有其的组合物
JP2024508742A (ja) 二本鎖ｍｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び／または脱毛の予防または改善用組成物
JP2021533133A (ja) アトピー性疾患の予防または治療用の薬学的組成物
KR102570826B1 (ko) Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물
JP7464709B2 (ja) Ｃｔｇｆ遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物
WO2024078534A1 (zh) 一种抑制黑素亲和素(mlph)基因表达的干扰rna及其应用
KR101722948B1 (ko) 리간드가 결합된 이중나선 올리고 ｒｎａ 구조체 및 그 제조방법
WO2021229479A1 (ko) 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210901

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220726

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221026

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230221

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230511

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230707

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230919

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230922

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7356505

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150