KR20200088785A - Dkk1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물 - Google Patents

Dkk1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위하여 이중나선 올리고뉴클레오티드의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 형태의 구조를 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 수용액에서 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체들이 소수성 상호작용에 의해 자가조립되어 생성될 수 있는 나노입자, 및 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 또는 나노입자를 포함하는 탈모 예방 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물은 부작용 없이 높은 효율로 DKK1의 발현을 억제하여 탈모 예방 및 발모 촉진에 탁월한 효과를 나타내므로, 탈모 예방 및 발모 촉진용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

DKK1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물 {Double-stranded oligonucleotide targeting DKK1, oligonucleotide structure comprising the same and composition comprising the same for preventing hair loss and promoting hair growth}
본 발명은 DKK1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 구조체 포함하는 나노입자, 및 이들의 탈모 예방 또는 발모 용도에 관한 것으로, 상세하게는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위하여 이중나선 올리고뉴클레오티드의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질이 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합된 형태의 구조를 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 수용액에서 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체들이 소수성 상호작용에 의해 자가조립되어 생성될 수 있는 나노입자, 그리고 상기 올리고뉴클레오티드, 구조체 및/또는 나노입자를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물에 관한 것이다.
모발은 개인의 개성과 이미지를 형성하는데 중요한 역할을 하며 이러한 심미적 기능 외에도 자외선 차단, 두피 보호 등의 기능이 있다. 탈모는 정상적으로 존재해야 할 체모가 감소하는 질환으로, 이는 생명과 직접적으로 관련하지는 않으나, 외관상 심각한 정신적 고통을 동반하는 경우가 많아 탈모가 심한 경우 삶의 질 측면에서 매우 부정적인 영향을 미칠 수 있다 (Passchier J. et al., Dermatology, 197:217, 1998; McDonagh, A.J. and Messenger, A.G., Dermatol Clin ., 14:661, 1996). 최근에는 남성들의 유전적 질환으로 여겨지던 탈모증이 업무적 스트레스, 환경 오염, 유해 환경에의 노출, 잘못된 식습관 등의 외적인 요소들로 인하여 남성뿐만 아니라 여성에게도 나타나 탈모 예방 또는 치료제에 대한 수요가 증가하고 있는 실정이다. 탈모증은 모낭이 파괴되고 섬유조직으로 회복되어 영구적인 탈모상태가 유지되는 반흔성 탈모증과 조직이 섬유화되지 않고 모낭도 그대로 보존되는 비반흔성 탈모증으로 분류되며 비반흔성 탈모증은 휴지기 탈모증, 유전성 안드로젠 탈모증, 원형 탈모증, 생장기 탈모증이 있다 (Jand IW et al., J Korean Med Ophthal Otol Dermatol. 2015).
모발은 성장기 (Growing stage), 쇠퇴기 (Degenerating stage), 휴지기 (Resting stage), 탈락기 (Exogen stage) 등의 주기를 지니며, 이를 모주기라고 한다. 성장기의 수명은 보통 2~8년으로 전체 모발의 ~90%를 차지하며 모유두와 접촉하는 모구의 하반부에 모모세포의 분열이 지속되어 머리카락이 생성된다. 성장기가 지나게 되면서 잠시 성장을 멈추는 시기를 쇠퇴기라고 하며, 이는 모발의 생성과 발육이 멈춰지는 휴지기로 넘어가는 시기로 모발의 뿌리에도 변화가 오며 모모세포와 색소세포의 활동이 멈추면서 케라틴이 생성되지 않아 모발의 성장이 중단된다. 휴지기에는 모구부가 수축하고 탈락기가 되어서야 모발이 탈락하게 되며 이 시기에는 단백질 분해효소가 관여하는 것으로 알려져 있다 (김은화 et al., 대한피부미용학회지 제5권2호, 45; Naito et al., Br. J. Dermatol . 159:300~305, 2008). 모발의 성장을 조절하는 인자로는 안드로젠, 에스트로겐, 갑상선 호르몬, 스테로이드, 프로락틴 그리고 성장 호르몬 등이 관여할 것으로 생각되고 있으며 이 중 안드로젠이 가장 중요한 조절인자로 알려져 있다. 호르몬이 탈모에 관여한다는 가장 일반적인 예는 출산 후 일시적인 탈모이며, 임신을 하게 되면 에스트로겐이 증가하여 모주기가 생장기에서 휴지기로 진행되는 것을 억제하다가 출산 후 에스트로겐이 급격히 감소하며 휴지기로의 진행이 가속화되어 휴지기 탈모가 발생한다. 즉 이처럼 호르몬에 의존적인 탈모증이 있으나 이 밖에도 탈모의 원인은 유전적 요인과 남성 호르몬, 노화, 혈액 순환 장애, 스트레스, superoxide radical 등을 꼽을 수 있으며 이러한 원인에 따라 그 대응책이 달라질 수 있다. 남성 호르몬이 원인인 탈모에 대해서는 DHT 억제제 (DHT blockers)를 치료제로 사용하고 있으며, 상기 억제제의 기본적인 기작은 5-α-reductase에 의해 테스토스테론이 활성도가 높은 디하이드로테스토스테론 (Dihydrotestosterone, 이하 DHT)로 전환되는 것을 막아주는 작용을 한다. 한편, DHT는 테스토스테론보다 안드로젠 수용체 (AR)와 결합 능력이 5배 이상 높아, 모낭의 단백질 합성을 지연시켜 DHT의 과잉 생성을 막아 안드로젠 수용체로의 결합을 차단하는 물질을 치료제로 사용하고 있다 (Dallob AL et al., J. Clin.Endocrinol. Metab. 79:703-709, 1994; Ellsworth, K and Harris G., Biochem. Biophys . Res. Commun . 215:774-780, 1995; Kaufman KD., Mol and Cell Endocrinology. 198:85-59, 2002).
현재까지 개발된 탈모 치료제는 주로 단일 화합물 위주로, DHT의 과다 생성을 억제하기 위해 5-알파 환원효소 (5-α-reductase)를 표적으로 하는 finasteride, 혈행 촉진을 위한 minoxidil이 있으며, 최근 미국 FDA의 허가를 받아 항암제로 판매되고 있는 JAK inhibitor (ruxolitnib, tofacitinib)가 모발 성장을 촉진시키는 효과를 가진 것으로 확인되었다. 그러나 상기 물질보다 효과가 우수한 물질을 찾기 위한 연구는 지속적으로 진행되고 있다.
Dickkopf 1(DKK1)은 안드로젠성 탈모에서 가장 많이 상향 조절되는 탈모 유전자로, 탈모의 주된 원인으로 알려진 DHT에 의해 탈모부위 모유두세포에서 그 발현이 유도된다. DKK1이 강하게 발현될 경우 모낭의 성장을 방해할 뿐만 아니라, 모발을 직접 감싸 보호하고 표피까지 운송하는 역할을 하는 외모근초 (Outer root sheath)의 세포자살을 유도함으로써 모발의 퇴화기를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Kwack et al., J Invest Dermatol . 132(6):1554-60. 2012). 이는 모발 성장기를 유지하는 데 중요한 역할을 하는 Wnt/ßsignaling에 필요한 low-density lipoprotein receptor-related protein(LRP)-5/6 co-receptor를 억제하는 DKK1의 Wnt 길항 작용에 의한 것으로, 이처럼 DKK1이 모발의 성장기부터 퇴화기까지 이르는데 매우 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지면서 DKK1을 표적으로 하는 탈모 치료에 대한 관심이 높아지고 있다.
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 이 기술 중, 간섭 RNA (RNA interference; RNAi)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포 (mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Barik, J Mol Med 83:764-773, 2005). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제 (endonuclease)에 의하여 21 내지 23개의 이중가닥 (base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA)로 변환되며, siRNA는 RISC (RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스)가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (Opalinska et al., Nature Reviews Drug Discovery. 1:503-514, 2002).
베르트랑 (Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA 가 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다 (Biochem . Biophys . Res. Commun . 296:1000-1004, 2002). 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 의약품 (small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다 (Behlke , MOLECULAR THERAPY. 13(4):664-670, 2006).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다 (Xie et al., Drug Discov Today. 11(1-2):67-73, 2006).
상기 문제를 해결하기 위하여, 체내 안정성 개선을 위하여 siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격 (backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형 (modification)하거나 바이러스성 벡터 (viral vector), 리포좀 또는 나노입자 (nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율 (transfection efficacy)이 높지만, 면역원성 (immunogenicity) 및 발암성 (oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성 (nonviral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내 (in vivo)에서의 안정성 (stability)이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수 (uptake) 및 내재화 (internalization) 등의 개선된 전달 효과가 높을 뿐 아니라, 세포독성 및 면역 유발 (immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Akhtar et al., J Clin Invest. 117(12):3623-3632, 2007).
비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체 (nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자 (nanoparticle), 즉 나노전달체 (nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 형태를 가진다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자 (polymeric nanoparticle), 고분자 미셀 (polymer micelle), 리포플렉스 (lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀 (endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다 (Proc . Natl . Acad . Sci . 15; 93(21):11493-8, 1996).
siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개 (linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다 (대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것 (PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNATM (self assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데 (대한민국 등록특허 제1224828호), SAMiRNATM 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
SAMiRNATM 기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG (polyethyleneglycol) 또는 HEG (Hexaethylenglycol)가 사용되는데, PEG는 합성폴리머 (synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성 (solubility) 증가 및 약물동태학 (pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 다분산계 (polydisperse) 물질로, 한 배치 (batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체 (monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스곡선 형태를 나타내며, 다분산지수 (polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량 (3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량 (20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다 (F. M. Veronese. Biomaterials 22:405-417, 2001). 따라서, PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 쉽지 않다는 단점이 있어 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 확인이 용이하지 않은 불편한 점이 있는 등 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점 들이 존재한다. (Francesco M. DRUG DISCOVERY TODAY 10(21):1451-1458, 2005).
이에 따라 최근에는 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNATM 기술의 개량된 형태로, SAMiRNATM를 구성하는 이중나선 RNA 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 1~15 개의 단량체 (monomer)와 필요에 따라 링커 (linker)를 포함하는 기본단위를 블록 (block)화 하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용함으로써, 기존의 SAMiRNATM에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선된 새로운 형태의 전달체 기술이 개발되었다.
한편, 세계 탈모 시장은 2024년까지 118억 달러에 이를 것이라는 보고 (Grand Wiew Research, Inc)가 있으며, 미국 남성의 7명 중에 4명, 중국 남성의 5명 중에 한 명이 대머리이고, 그 원인의 90% 이상이 Androgenetic alopecia로 알려져 있다. 그러나 현재까지 개발된 대부분의 탈모 치료제가 DHT와 5-알파 환원효소 (5-α-reductase)를 표적으로 하고 있으며, Androgenetic alopecia와 관련된 중요한 탈모 유전자인 DKK1을 표적으로 한 탈모 치료제 및 발모 제품에 대한 개발은 없는 것으로 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 모발의 성장과 직접적인 연관성을 갖는 DKK1을 표적으로 하는 탈모 예방 또는 발모 관련 제품 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 특정 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드가 DKK1의 발현을 효과적으로 저해할 수 있고, 이를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이를 포함하는 조성물이 탈모 예방 또는 발모에 탁월한 효과를 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제883471호 대한민국 등록특허 제1224828호
Passchier J. et al., Dermatology, 197:217, 1998; McDonagh, A.J. and Messenger, A.G., Dermatol Clin., 14:661, 1996 Jand IW et al., J Korean Med Ophthal Otol Dermatol. 2015 김은화 et al., 대한피부미용학회지 제5권2호, 45; Naito et al., Br. J. Dermatol. 159:300~305, 2008 Dallob AL et al., J. Clin.Endocrinol. Metab. 79:703-709, 1994 Ellsworth, K and Harris G., Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:774-780, 1995 Kaufman KD., Mol and Cell Endocrinology. 198:85-59, 2002 Kwack et al., J Invest Dermatol. 132(6):1554-60. 2012 Barik, J Mol Med 83:764-773, 2005 Opalinska et al., Nature Reviews Drug Discovery. 1:503-514, 2002 Bertrand JR et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 296:1000-1004, 2002 Behlke, MOLECULAR THERAPY. 13(4):664-670, 2006 Xie et al., Drug Discov Today. 11(1-2):67-73, 2006 Akhtar et al., J Clin Invest. 117(12):3623-3632, 2007 Zelphati O et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93(21):11493-8, 1996 F. M. Veronese, Biomaterials 22:405-417, 2001 Francesco M. DRUG DISCOVERY TODAY 10(21):1451-1458, 2005
본 발명의 목적은 DKK1의 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 RNA/RNA, DNA/DNA, 또는 DNA/RNA hybrid 형태, 가장 바람직하게는 DNA/RNA hybrid 형태의 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 탈모 예방 또는 발모 촉진 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 탈모 예방 또는 발모 촉진을 위한 약제 또는 화장료의 제조를 위한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 탈모 예방 또는 발모 촉진이 필요한 객체에 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자, 또는 상기 조성물를 투여하는 단계를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 (sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 제공한다.
A-X-R-Y-B 구조식 (1)
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스가닥을 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명은 또한, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자(nanoparticle)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 또는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 또는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 탈모 예방 또는 발모 촉진 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 탈모 예방 또는 발모 촉진을 위한 약제의 제조를 위한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 탈모 예방 또는 발모 촉진을 위한 화장료의 제조를 위한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 탈모 예방 또는 발모 촉진이 필요한 개체에 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자, 또는 상기 조성물를 투여하는 단계를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 구조체를 포함하는 나노입자, 또는, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 구조체 또는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물은 부작용 없이 높은 효율로 DKK1의 발현을 억제할 수 있어, 탈모 예방 및 발모 촉진에 탁월한 효과를 나타내므로 탈모 예방 및 발모 촉진 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 후보 서열 디자인을 위하여 DKK1 mRNA 서열에 대해 1-염기 슬라이딩 윈도우 알고리즘(1-base sliding window algorithm)을 적용하여 19개의 염기로 구성된 후보 서열을 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 DKK1을 표적으로 하는 312개의 이중나선 올리고 RNA에 대한 1, 2차 스크리닝의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DKK1 발현 저해 효과가 가장 높은 18개 서열에 대한 1, 2차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 DKK1 발현 저해 효과가 가장 높은 18개 서열을 A549 세포에 처리하여 최종 10개의 서열을 선별한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 모유두세포인 HFDPC 세포에서 최종 선별된 10개의 서열에 대한 재현성을 실험한 결과이다.
도 6은 무작위로 선별된 DKK1 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드의 나노입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 7은 DKK1 발현 저해 효과가 가장 높은 #72 서열에 대한 SAMiRNA의 mRNA 발현저해 억제능을 확인한 것이다.
도 8은 HFDPC 세포주에 SAMiRNA-DKK1 #72를 처리하였을 때, DKK1의 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 9는 SAMiRNA-DKK1 #72가 인간의 모근 세포로 효율적으로 전달됨을 보여주는 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
DKK1은 Wnt의 억제 단백질인 Dickkopf의 일종으로, 양서류의 머리 형성에 관여하는 중요한 단백질로 처음 알려졌으며, DKK1은 Wnt/β카테닌 신호 전달 경로의 억제제로 Wnt의 상위 신호전달 과정에 관여하여 Wnt 신호전달을 차단하고 이를 통해 암세포의 성장을 억제하는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Mao et al., Nature 411:321, 2001; Niida A et al., Oncogene 4:23, 2004). DKK1의 기능으로 알츠하이머 환자의 뇌에서 신경세포의 퇴화, 멜라노사이트 (melanocyte)의 성장 및 분화 억제, 줄기세포의 세포주기 조절 등에 대한 연구가 보고되어 있으며(Caricasole A et al., J Neurosci 24, 2004; Yamaguchi Y et al., J. Cell Biol. 165, 2004), 지방 형성, 연골 형성, 위장 상피의 증식, 류마티즘과 관련된 골 손실 및 모낭 기원판 형성에 관여하는 것으로도 보고되었다.
이러한 DKK1 유전자에 대해서는 암과 관련된 보고가 다수인데 이는 Wnt/β 신호전달이 상피세포의 결합과 유지에 관여하는 상피세포-간엽세포 변환 (epithelial-mesenchymal transition)을 조절할 수 있어 암 세포가 전이하는 과정에 필요한 상피세포 침투와 세포 분화에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 따라서 Wnt/β신호 전달의 antagonist로서의 DKK1은 다양한 암에서 암세포의 침습(invasiveness)을 제한할 수 있다. 최근 비소세포성 폐암 세포주 중 방사선 민감도에 따른 세포주에서 DKK1의 발현량에 차이가 있었고, 방사선에 저항성이 강한 세포주인 A549 또는 H1299 세포주에서 DKK1 발현이 증가되었음을 확인하여 DKK1에 대한 siRNA를 이용하여 A549 또는 H1299에서의 DKK1 발현을 억제한 결과 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하여 항암치료에 DKK1 발현 또는 활성 억제가 중요할 수 있음이 보고되기도 하였다 (대한민국 등록특허 제10-1167675호).
또한, DKK1이 모발의 성장기부터 퇴화기까지 이르는데 매우 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지면서 DKK1을 표적으로 하는 탈모 치료에 대한 관심이 높아지고 있다.
현재까지 개발된 대부분의 탈모 치료제가 DHT와 5-알파 환원효소(5-α-reductase)를 표적으로 하고 있으며, FDA 승인을 받은 성분인 피나스테라이드는 경구용 탈모 치료제로 남성 탈모에만 사용되는 치료약으로 남성 호르몬 감소로 인한 부작용이 보고되어 사용에 제한이 있으며 지속적으로 복용하지 않는 경우 발모 효과가 사라지는 단점이 있어, 이에 따라 미녹시딜과 병행하여 사용하는 경우도 많다. 피나스테라이드는 약물의 지속시간이 24시간이라 매일 일정한 시간에 복용해야 하는 번거로움과 함께 고가라 비용적인 측면에서 단점이 있다. 또 다른 두피 부분 치료제인 미녹시딜은 남성과 여성에 따라 그 함량을 다르게 사용하며 혈압강화제로 개발이 되었기 때문에 혈압에 부정적인 영향을 줄 수 있는 것으로 알려졌다. 이미 Androgenetic alopecia와 관련하여 Wnt 신호전달 경로를 이용한 탈모치료제 개발이 시작되었으나, Wnt 신호전달 경로 중 중요한 탈모 관련 유전자인 DKK1을 표적으로 한 탈모 치료제 및 발모 제품에 대한 개발은 아직 없다.
본 발명에서는 1-염기 슬라이딩 윈도우 알고리즘 (1-base sliding window algorithm)을 적용하여 DKK1에 대한 siRNA 후보 서열을 디자인하고 312 종을 선별한 다음, 이중 특히 효과가 좋은 10종의 siRNA를 선별할 수 있었다. 또한, 상기 siRNA를 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체(SAMiRNA) 및 나노입자로 제조하여 세포내 전달 효율을 증가시켜 탈모 방지 및 발모 효과를 향상시킬 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 (sense strand)과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스가닥으로 이루어진 DKK1 특이적 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서의 올리고뉴클레오티드는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념으로, 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드에는 DKK1 특이적 siRNA 뿐만 아니라 shRNA 등도 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
또한 DKK1에 대한 특이성이 유지되는 한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 305로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥에서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 또는 삽입된 서열을 포함하는 센스가닥 및 안티센스가닥을 포함하는 DKK1 특이적 siRNA도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 서열번호 1 내지 305는 인간 DKK1 특이적인 서열로 DKK1 mRNA 외 다른 유전자에는 15 염기서열 이하의 상동성을 가지는 siRNA 센스가닥 서열이다 (표 2 참조). 한편, 서열번호 306 내지 309번은 기존 특허 (KR 10-1167675, KR 10-2010-0051195)에서 알려진 인간 DKK1 특이적 siRNA 서열을 나타낸다 (표 3 참조).
본 발명에서는 기존 특허에서 개시된 DKK1 특이적 siRNA 서열과 세포내의 활성을 비교해 본 결과 월등한 효율성을 가지면서도 인간의 다른 mRNA와 상동성이 적은 siRNA 서열을 발명할 수 있었다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 72의 서열을 센스가닥으로 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 구성되는 것이 바람직하며, 상기 서열번호 1 내지 305에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오타이드는 해당 유전자를 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된 염기서열을 가지므로, 해당 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 것이 특징이다. 또한, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 하나 또는 두 개 이상의 비결합(unpaired)된 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
또한, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상을 위해, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 구성하는 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; DNA-RNA hybrid 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg . Med . Chem . Lett . 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-5773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5) 1823-1832, 2011), 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드는 해당 유전자의 발현을 저해시킬 뿐만 아니라, 해당 단백질의 발현을 현저하게 저해시킨다.
본 발명에서는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 생체 내로의 효율적인 전달 및 안정성 향상을 위하여 올리고뉴클레오티드의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성물질이 접합된 형태의 접합체를 제조하였다.
상기와 같이 올리고뉴클레오티드에 친수성 물질 및 소수성 물질이 결합된 siRNA 접합체의 경우 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 특허 등록번호 제1224828 호), 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐 아니라, 입자 크기의 균일성이 우수하여 품질 관리(Quality control)가 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.
즉, 본 발명에서는 상기 제조된 DKK1 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체(SAMiRNA) 및 나노입자를 제조하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 하기 구조식 (1)의 구조를 갖는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체에 관한 것이다.
A-X-R-Y-B 구조식 (1)
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기한 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 일부 양태로서, R은 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스가닥으로 이루어진 DKK1 특이적 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA를 중심으로 설명되나, 본 발명의 이중가닥 올리고뉴클레오티드와 동일한 특성을 가지는 다른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA/RNA 하이브리드)에도 적용될 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 포함한다.
Figure pat00001
구조식 (2)
상기 구조식 (2)에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 센스가닥, AS는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 의미한다.
보다 바람직하게는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 (4)의 구조를 가진다.
Figure pat00002
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 A, B, S, AS, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 센스가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다.
상기, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 안티센스 가닥의 5´말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으며, siRNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 (5) 또는 구조식(6)에서의 n)를 사용함으로써 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인한 문제점을 크게 개선할 수 있다.
Figure pat00003
구조식 (5)
Figure pat00004
구조식 (6)
상기 구조식 (5)에서 A'은 친수성 물질 단량체(monomer), J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A'm-J) 또는 (J-A'm)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.
상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 친수성 물질 블록을 가질 경우, 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)과 같은 구조를 가질 수 있다.
(A' m -J) n -X-R-Y-B 구조식 (7)
(J-A' m ) n -X-R-Y-B 구조식 (8)
상기 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서, X, R, Y 및 B는 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, A', J, m 및 n은 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 정의와 동일하다.
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 친수성 물질 단량체(A')는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (7) 또는 구조식 (8) 따른 구조체 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
본 발명에서의 친수성 물질 단량체 구조
화합물 (1) 화합물 (2) 화합물 (3)
Figure pat00005
G는 O, S 또는 NH
Figure pat00006
Figure pat00007
상기 구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol) , 즉 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다. 특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 (A'm-J)으로 또는 (J-A'm)n 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A와 링커인 J은 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다. 또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8) 에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol), 토코트라이에 놀(tocotrienol) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데, 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C24 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 형태가 가장 바람직하다.
상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 DKK1 수용체 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 제조과정 중 DKK1 수용체 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드는 DKK1의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 올리고뉴클레오티드라면 모두 제한 없이 사용가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 구성된다.
특히 본 발명에 따른 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 포함되는 이중나선 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 이루어진 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체에 있어서, 상기 구조체 내의 친수성 물질의 올리고뉴클레오티드와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입될 수 있다.
이는 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위한 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용할 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.
구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해 짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),
비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용될 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).
상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 물질 블록과 연결될 수 있다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (7)과 같은 구조를 가질 수 있다.
P-J1-J2-A-X-R-Y-B 구조식 (9)
상기 구조식 (9)에서 A, B, R, X 는 Y 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며, J1과 J2는 링커로서, J1은 및 J2는 독립적으로 단순 공유결합, PO3 -, SO3, CO2, C2-12 알킬, 알케닐, 알키닐에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J1과 J2는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
바람직하게는 아민기가 도입된 경우에는, J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (9)에서는 J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 화합물 (4)가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
Figure pat00008
화합물 (4)
또한, 구조식 (9)에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질이 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록이고, 이에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (10) 또는 구조식 (11)과 같은 구조를 가질 수 있다.
P-J1-J2- (A'm-J)n-X-R-Y-B 구조식 (10)
P-J1-J2- (J-A'm)n-X-R-Y-B 구조식 (11)
상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에서, X, R, Y, B, A', J, m 및 n은 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 정의와 동일하며, P, J1 및 J2는 구조식 (9)에서의 정의와 동일하다.
특히, 상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에 있어서, 친수성 물질은 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 센스가닥의 3' 말단에 결합된 형태인 것이 바람직하며, 이 경우 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)은 다음 구조식 (12) 내지 구조식 (14)의 형태를 가질 수 있다.
Figure pat00009
구조식 (12)
Figure pat00010
구조식 (13)
Figure pat00011
구조식 (14)
상기 구조식 (12) 내지 구조식 (14)에서 X, R, Y, B, A, A' J, m, n. P, J1 및 J2는 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 센스가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다.
본 발명에서 도입될 수 있는 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH3 + 의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도입될 수 있는 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 전달을 방지할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 구조체의 친수성 물질에 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 이중나선 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 예를 들어 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체에 리간드가 결합된 형태는 하기 구조식 (15)과 같은 구조를 가진다.
(Li-Z)-A-X-R-Y-B 구조식 (15)
상기 구조식 (15)에서, A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드를 의미하며, i는 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
상기 구조식 (15)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟 세포 특이적으로 세포내재화 (internalization)를 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산 (Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (15)에서의 친수성 물질 A는 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
앞서 설명한 바와 같이 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다. 이렇게 형성된 나노입자는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드의 세포 내 전달 향상 및 올리고뉴클레오티드 효능을 향상시킨다.
본 발명에 따른 나노입자는 동일한 서열을 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체만으로 형성될 수도 있고, 서로 다른 서열을 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성될 수도 있음을 특징으로 하는데, 본 발명에서의 서로 다른 서열을 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드는 다른 타겟 유전자, 예를 들어 DKK1 특이적인 이중나선 올리고뉴클레오티드 일수도 있고, 동일한 타겟 유전자 특이성을 가지면서 그 서열이 다른 경우도 포함되는 것으로 해석된다.
또한, DKK1 특이적인 이중나선 올리고뉴클레오티드 이외에 다른 탈모 연관 유전자 특이적인 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 본 발명에 따른 나노입자에 포함될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 나노입자는 동결건조된 형태인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체(SAMiRNA) 및 나노입자의 탈모 예방 또는 발모 촉진 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 포함하는 탈모, 특히 안드로젠성 탈모의 예방 또는 발모 촉진용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 약제학적 조성물은 연고, 페이스트, 젤, 젤리, 세럼(serum), 에어로졸 스프레이, 비-에어로졸 스프레이, 폼, 크림, 로션, 용액 또는 현탁액의 제형 중에서 선택되는 제형에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 포함하는 탈모, 특히 안드로젠성 탈모의 예방 또는 발모용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 이에 한정되지는 않으나, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션,헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형 중에서 선택되는 제형에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 테스토스테론의 대사 산물인 DHT에 의해 유도되는 탈모 유전자인 DKK1의 발현 자체를 억제하여 본 발명의 DKK1 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 탈모 예방 또는 발모 유도에 효과를 나타내는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 탈모 질환 예방 또는 발모용 조성물에는 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 DKK1 특이적인 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 포함될 수 있다.
또한, 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체 이외의 다른 탈모 질환 연관 유전자에 특이적인 이중나선 올리고뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 본 발명에 따른 조성물에 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 DKK1의 상위 또는 하위 신호 전달에 관여하는 유전자와 관련된 탈모, 특히 안드로젠성 탈모에 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에는 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 개인의 증후와 탈모의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 주사제, 연고제, 기능성 화장품 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 발모가 필요한 객체에 본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 이를 포함하는 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 탈모 질환 특히, 안드로젠성 탈모, 원형 탈모, 휴지기 탈모의 예방 및 발모를 촉진하거나 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 탈모 예방 또는 발모 촉진 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 탈모 예방 또는 발모 촉진을 위한 약제의 제조를 위한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 탈모 예방 또는 발모 촉진을 위한 화장료의 제조를 위한 상기 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 이를 포함하는 조성물 또는 나노입자를 기능성 화장품 또는 피부 외용제의 제조에 이용하는 경우, 기능성 화장품 또는 피부 외용제의 제형은 크림, 로션, 겔, 수용성 리퀴드 및 에센스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 탈모는 안드로젠성 탈모, 원형 탈모, 휴지기 탈모를 모두 포함한다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: DKK1을 표적으로 하는 siRNA 스크리닝을 위한 알고리즘 후보 서열 선정
DKK1 (Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_012242.3, 1913bp) 에 결합할 수 있는 목표 염기서열(센스가닥)을 312종을 디자인하였다.
보다 구체적으로, DKK1에 대한 siRNA 후보 서열에 대한 디자인 과정은 인간 DKK1 mRNA의 엑손 지도 (exon map)를 확인하여 1-염기 슬라이딩 윈도우 알고리즘 (1-base sliding window algorithm)을 적용하여 19개의 염기로 구성된 후보 서열을 디자인한 다음, siRNA 후보서열 리스트를 인간 총 참고 서열 RNA (human total reference req RNA)에 대한 BLAST e-value 100 이하로 수행하여 다른 유전자와 RNA 서열에 대해 동일성 (identity)이 15 염기 이하인 305개의 siRNA 후보 서열을 선별하였다 (표 2). 이때, 이미 공지된 선행문헌 (KR 10-1167675, KR 10-2010-0051195)에서 언급된 4개의 siRNA 서열 (표 4)을 포함하여 총 312개의 siRNA 서열을 이용하여 DKK1 저해 정도 실험을 수행하였다 (도 1).
1-염기 슬라이딩 윈도우 스크리닝 (1-base sliding window screening)을 이용하여 선별된 305종의 DKK1 특이적 siRNA 후보 서열
서열번호 Accession No. Code Name 센스가닥 서열
1 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#001 TCAGGACTCTGGGACCGCA
2 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#002 CAGGACTCTGGGACCGCAG
3 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#003 AGGACTCTGGGACCGCAGG
4 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#004 GGACTCTGGGACCGCAGGG
5 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#005 CTGCAGCCGAACCGGCACG
6 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#006 TGCAGCCGAACCGGCACGG
7 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#007 GCAGCCGAACCGGCACGGT
8 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#008 CAGCCGAACCGGCACGGTT
9 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#009 AGCCGAACCGGCACGGTTT
10 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#010 GCCGAACCGGCACGGTTTC
11 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#011 CCGAACCGGCACGGTTTCG
12 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#012 CGAACCGGCACGGTTTCGT
13 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#013 GAACCGGCACGGTTTCGTG
14 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#014 AACCGGCACGGTTTCGTGG
15 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#015 ACCGGCACGGTTTCGTGGG
16 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#016 CCGGCACGGTTTCGTGGGG
17 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#017 CGGCACGGTTTCGTGGGGA
18 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#018 GGCACGGTTTCGTGGGGAC
19 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#019 AGGCTTGCAAAGTGACGGT
20 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#020 GGCTTGCAAAGTGACGGTC
21 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#021 GCTTGCAAAGTGACGGTCA
22 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#022 GCGCAGCGGGAGCTACCCG
23 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#023 CGCAGCGGGAGCTACCCGG
24 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#024 GAGCTACCCGGGTCTTTGT
25 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#025 AGCTACCCGGGTCTTTGTC
26 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#026 GCTACCCGGGTCTTTGTCG
27 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#027 CTACCCGGGTCTTTGTCGC
28 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#028 TACCCGGGTCTTTGTCGCG
29 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#029 ACCCGGGTCTTTGTCGCGA
30 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#030 CCCGGGTCTTTGTCGCGAT
31 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#031 CCGGGTCTTTGTCGCGATG
32 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#032 CGGGTCTTTGTCGCGATGG
33 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#033 GGGTCTTTGTCGCGATGGT
34 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#034 GGTCTTTGTCGCGATGGTA
35 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#035 GTCTTTGTCGCGATGGTAG
36 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#036 TCTTTGTCGCGATGGTAGC
37 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#037 CTTTGTCGCGATGGTAGCG
38 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#038 TTTGTCGCGATGGTAGCGG
39 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#039 TTGTCGCGATGGTAGCGGC
40 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#040 TGTCGCGATGGTAGCGGCG
41 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#041 GGAGTGAGCGCCACCTTGA
42 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#042 CCACCTTGAACTCGGTTCT
43 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#043 CACCTTGAACTCGGTTCTC
44 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#044 ACCTTGAACTCGGTTCTCA
45 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#045 CCTTGAACTCGGTTCTCAA
46 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#046 CTTGAACTCGGTTCTCAAT
47 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#047 ACTCGGTTCTCAATTCCAA
48 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#048 GTTCTCAATTCCAACGCTA
49 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#049 ATTCCAACGCTATCAAGAA
50 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#050 TTCCAACGCTATCAAGAAC
51 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#051 AAGAACCTGCCCCCACCGC
52 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#052 AGAACCTGCCCCCACCGCT
53 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#053 GCGCCGGGAATCCTGTACC
54 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#054 CGCCGGGAATCCTGTACCC
55 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#055 GCCGGGAATCCTGTACCCG
56 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#056 ATCCTGTACCCGGGCGGGA
57 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#057 TCCTGTACCCGGGCGGGAA
58 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#058 CCTGTACCCGGGCGGGAAT
59 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#059 CTGTACCCGGGCGGGAATA
60 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#060 TGTACCCGGGCGGGAATAA
61 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#061 GTACCCGGGCGGGAATAAG
62 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#062 CCGGGCGGGAATAAGTACC
63 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#063 CGGGCGGGAATAAGTACCA
64 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#064 GGGCGGGAATAAGTACCAG
65 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#065 GGCGGGAATAAGTACCAGA
66 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#066 GCGGGAATAAGTACCAGAC
67 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#067 CGGGAATAAGTACCAGACC
68 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#068 GGGAATAAGTACCAGACCA
69 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#069 GGAATAAGTACCAGACCAT
70 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#070 GAATAAGTACCAGACCATT
71 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#071 AATAAGTACCAGACCATTG
72 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#072 ATAAGTACCAGACCATTGA
73 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#073 TAAGTACCAGACCATTGAC
74 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#074 AAGTACCAGACCATTGACA
75 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#075 AGTACCAGACCATTGACAA
76 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#076 CCAGACCATTGACAACTAC
77 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#077 CAGACCATTGACAACTACC
78 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#078 AGACCATTGACAACTACCA
79 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#079 CATTGACAACTACCAGCCG
80 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#080 ATTGACAACTACCAGCCGT
81 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#081 TTGACAACTACCAGCCGTA
82 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#082 TGACAACTACCAGCCGTAC
83 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#083 GACAACTACCAGCCGTACC
84 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#084 ACAACTACCAGCCGTACCC
85 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#085 CAACTACCAGCCGTACCCG
86 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#086 AACTACCAGCCGTACCCGT
87 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#087 AGCCGTACCCGTGCGCAGA
88 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#088 GCCGTACCCGTGCGCAGAG
89 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#089 CCGTACCCGTGCGCAGAGG
90 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#090 CGTACCCGTGCGCAGAGGA
91 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#091 GTACCCGTGCGCAGAGGAC
92 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#092 TACCCGTGCGCAGAGGACG
93 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#093 GACGAGGAGTGCGGCACTG
94 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#094 ACGAGGAGTGCGGCACTGA
95 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#095 CGAGGAGTGCGGCACTGAT
96 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#096 GAGGAGTGCGGCACTGATG
97 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#097 AGGAGTGCGGCACTGATGA
98 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#098 GGAGTGCGGCACTGATGAG
99 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#099 GAGTGCGGCACTGATGAGT
100 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#100 AGTGCGGCACTGATGAGTA
101 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#101 GTGCGGCACTGATGAGTAC
102 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#102 TGCGGCACTGATGAGTACT
103 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#103 GCGGCACTGATGAGTACTG
104 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#104 CACTGATGAGTACTGCGCT
105 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#105 GATGAGTACTGCGCTAGTC
106 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#106 AGTACTGCGCTAGTCCCAC
107 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#107 CTGCGCTAGTCCCACCCGC
108 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#108 TGCGCTAGTCCCACCCGCG
109 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#109 GCGCTAGTCCCACCCGCGG
110 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#110 CGCTAGTCCCACCCGCGGA
111 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#111 AGGGGACGCAGGCGTGCAA
112 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#112 GGGGACGCAGGCGTGCAAA
113 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#113 GGGACGCAGGCGTGCAAAT
114 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#114 GGACGCAGGCGTGCAAATC
115 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#115 GACGCAGGCGTGCAAATCT
116 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#116 ACGCAGGCGTGCAAATCTG
117 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#117 CGCAGGCGTGCAAATCTGT
118 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#118 GCAAATCTGTCTCGCCTGC
119 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#119 CAAATCTGTCTCGCCTGCA
120 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#120 AAATCTGTCTCGCCTGCAG
121 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#121 GGAAGCGCCGAAAACGCTG
122 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#122 GAAGCGCCGAAAACGCTGC
123 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#123 AAGCGCCGAAAACGCTGCA
124 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#124 AGCGCCGAAAACGCTGCAT
125 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#125 GCGCCGAAAACGCTGCATG
126 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#126 CGCCGAAAACGCTGCATGC
127 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#127 GCCGAAAACGCTGCATGCG
128 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#128 CCGAAAACGCTGCATGCGT
129 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#129 AAACGCTGCATGCGTCACG
130 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#130 AACGCTGCATGCGTCACGC
131 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#131 ACGCTGCATGCGTCACGCT
132 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#132 CGCTGCATGCGTCACGCTA
133 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#133 GCTGCATGCGTCACGCTAT
134 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#134 CTGCATGCGTCACGCTATG
135 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#135 TGCATGCGTCACGCTATGT
136 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#136 GCATGCGTCACGCTATGTG
137 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#137 CATGCGTCACGCTATGTGC
138 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#138 ATGCGTCACGCTATGTGCT
139 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#139 TGCGTCACGCTATGTGCTG
140 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#140 GCGTCACGCTATGTGCTGC
141 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#141 CGTCACGCTATGTGCTGCC
142 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#142 GTCACGCTATGTGCTGCCC
143 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#143 TCACGCTATGTGCTGCCCC
144 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#144 CACGCTATGTGCTGCCCCG
145 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#145 ACGCTATGTGCTGCCCCGG
146 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#146 CGCTATGTGCTGCCCCGGG
147 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#147 GCTATGTGCTGCCCCGGGA
148 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#148 GTGCTGCCCCGGGAATTAC
149 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#149 TGCTGCCCCGGGAATTACT
150 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#150 GCTGCCCCGGGAATTACTG
151 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#151 CTGCCCCGGGAATTACTGC
152 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#152 TGCCCCGGGAATTACTGCA
153 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#153 GCCCCGGGAATTACTGCAA
154 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#154 CCCCGGGAATTACTGCAAA
155 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#155 GGAATATGTGTGTCTTCTG
156 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#156 CTTTGGTAATGATCATAGC
157 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#157 TTTGGTAATGATCATAGCA
158 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#158 TTGGTAATGATCATAGCAC
159 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#159 TGGTAATGATCATAGCACC
160 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#160 TGATCATAGCACCTTGGAT
161 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#161 GATCATAGCACCTTGGATG
162 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#162 ATCATAGCACCTTGGATGG
163 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#163 TCATAGCACCTTGGATGGG
164 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#164 CATAGCACCTTGGATGGGT
165 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#165 GCACCTTGGATGGGTATTC
166 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#166 CACCTTGGATGGGTATTCC
167 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#167 ACCTTGGATGGGTATTCCA
168 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#168 TGGATGGGTATTCCAGAAG
169 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#169 GGATGGGTATTCCAGAAGA
170 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#170 CAAAGGACAAGAAGGTTCT
171 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#171 TCTGTTTGTCTCCGGTCAT
172 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#172 CTGTTTGTCTCCGGTCATC
173 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#173 TGTTTGTCTCCGGTCATCA
174 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#174 TCCGGTCATCAGACTGTGC
175 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#175 GATTGTGTTGTGCTAGACA
176 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#176 ATTGTGTTGTGCTAGACAC
177 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#177 TTGTGTTGTGCTAGACACT
178 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#178 TGTGTTGTGCTAGACACTT
179 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#179 GTGTTGTGCTAGACACTTC
180 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#180 TGTTGTGCTAGACACTTCT
181 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#181 GTTGTGCTAGACACTTCTG
182 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#182 TTGTGCTAGACACTTCTGG
183 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#183 AGACACTTCTGGTCCAAGA
184 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#184 GACACTTCTGGTCCAAGAT
185 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#185 GGTCCAAGATCTGTAAACC
186 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#186 GTCCAAGATCTGTAAACCT
187 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#187 TCCAAGATCTGTAAACCTG
188 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#188 GCATAGGAGAAAAGGCTCT
189 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#189 AGCGTTGTTACTGTGGAGA
190 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#190 GGAGAAGGTCTGTCTTGCC
191 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#191 GAGAAGGTCTGTCTTGCCG
192 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#192 AGAAGGTCTGTCTTGCCGG
193 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#193 GAAGGTCTGTCTTGCCGGA
194 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#194 AAGGTCTGTCTTGCCGGAT
195 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#195 TCTGTCTTGCCGGATACAG
196 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#196 CTGTCTTGCCGGATACAGA
197 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#197 TGTCTTGCCGGATACAGAA
198 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#198 GTCTTGCCGGATACAGAAA
199 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#199 TCTTGCCGGATACAGAAAG
200 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#200 CTTGCCGGATACAGAAAGA
201 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#201 TTGCCGGATACAGAAAGAT
202 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#202 TGCCGGATACAGAAAGATC
203 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#203 GCCGGATACAGAAAGATCA
204 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#204 CAGAAAGATCACCATCAAG
205 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#205 CCAGTAATTCTTCTAGGCT
206 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#206 CAGTAATTCTTCTAGGCTT
207 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#207 ATTCTTCTAGGCTTCACAC
208 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#208 AGACACTAAACCAGCTATC
209 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#209 GCAGTGAACTCCTTTTATA
210 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#210 CAGTGAACTCCTTTTATAT
211 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#211 CCTTCATCAACTCAATCCT
212 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#212 CTTCATCAACTCAATCCTA
213 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#213 ATCAACTCAATCCTAAGGA
214 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#214 TCAACTCAATCCTAAGGAT
215 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#215 CAACTCAATCCTAAGGATA
216 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#216 AACTCAATCCTAAGGATAT
217 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#217 ACTCAATCCTAAGGATATA
218 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#218 CTCAATCCTAAGGATATAC
219 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#219 GATATACAAGTTCTGTGGT
220 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#220 GCATTCCAATAACACCTTC
221 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#221 CATTCCAATAACACCTTCC
222 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#222 GGAGTGTAAGAGCTTTGTT
223 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#223 GAGTGTAAGAGCTTTGTTT
224 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#224 TTTATGGAACTCCCCTGTG
225 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#225 TTATGGAACTCCCCTGTGA
226 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#226 GTGATTGCAGTAAATTACT
227 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#227 TGATTGCAGTAAATTACTG
228 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#228 GATTGCAGTAAATTACTGT
229 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#229 ATTGCAGTAAATTACTGTA
230 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#230 GTAAATTCTCAGTGTGGCA
231 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#231 TAAATTCTCAGTGTGGCAC
232 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#232 AAATTCTCAGTGTGGCACT
233 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#233 TGGCACTTACCTGTAAATG
234 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#234 GGCACTTACCTGTAAATGC
235 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#235 GCACTTACCTGTAAATGCA
236 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#236 CACTTACCTGTAAATGCAA
237 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#237 GGTGCTGCACTGCCTATTT
238 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#238 GTGCTGCACTGCCTATTTT
239 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#239 TGTACACATTGATTGTTAT
240 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#240 GTACACATTGATTGTTATC
241 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#241 TACACATTGATTGTTATCT
242 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#242 CATTGATTGTTATCTTGAC
243 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#243 ATTGTTATCTTGACTGACA
244 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#244 TATCTTGACTGACAAATAT
245 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#245 CATTTCAGCTTATAGTTCT
246 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#246 AAGCATAACCCTTTACCCC
247 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#247 AGCATAACCCTTTACCCCA
248 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#248 GCATAACCCTTTACCCCAT
249 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#249 CATAACCCTTTACCCCATT
250 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#250 ACCCTTTACCCCATTTAAT
251 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#251 CCATTTAATTCTAGAGTCT
252 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#252 CATTTAATTCTAGAGTCTA
253 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#253 ATTTAATTCTAGAGTCTAG
254 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#254 TTCTAGAGTCTAGAACGCA
255 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#255 TCTAGAGTCTAGAACGCAA
256 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#256 CTAGAGTCTAGAACGCAAG
257 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#257 TAGAGTCTAGAACGCAAGG
258 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#258 AGAGTCTAGAACGCAAGGA
259 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#259 GAGTCTAGAACGCAAGGAT
260 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#260 CAAGGATCTCTTGGAATGA
261 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#261 TGGAATGACAAATGATAGG
262 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#262 TAGGTACCTAAAATGTAAC
263 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#263 AGGTACCTAAAATGTAACA
264 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#264 GGTACCTAAAATGTAACAT
265 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#265 AATACTAGCTTATTTTCTG
266 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#266 ATACTAGCTTATTTTCTGA
267 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#267 CTGAAATGTACTATCTTAA
268 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#268 AATGTACTATCTTAATGCT
269 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#269 ATGTACTATCTTAATGCTT
270 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#270 TGTACTATCTTAATGCTTA
271 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#271 TTAGGCTGTGATAGTTTTT
272 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#272 TAGGCTGTGATAGTTTTTG
273 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#273 AAATGTTATAAGTAGACAT
274 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#274 AATGTTATAAGTAGACATA
275 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#275 ATGTTATAAGTAGACATAC
276 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#276 TGTGATCTTAGAGGTTTGT
277 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#277 GTGATCTTAGAGGTTTGTG
278 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#278 TGATCTTAGAGGTTTGTGT
279 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#279 GATCTTAGAGGTTTGTGTG
280 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#280 GTGTGTTCTACAAGAACGG
281 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#281 TGTGTTCTACAAGAACGGA
282 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#282 TTCTACAAGAACGGAAGTG
283 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#283 TCTACAAGAACGGAAGTGT
284 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#284 AACGGAAGTGTGATATGTT
285 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#285 ACGGAAGTGTGATATGTTT
286 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#286 CAGTGTCTAAATATAAGAC
287 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#287 ATAAGACAATATTGATCAG
288 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#288 TAAGACAATATTGATCAGC
289 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#289 AAGACAATATTGATCAGCT
290 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#290 ATTGATCAGCTCTAGAATA
291 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#291 TTGATCAGCTCTAGAATAA
292 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#292 TGATCAGCTCTAGAATAAC
293 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#293 AGCTCTAGAATAACTTTAA
294 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#294 TCTGCATTGATAAACTCAA
295 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#295 CTGCATTGATAAACTCAAA
296 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#296 TGCATTGATAAACTCAAAT
297 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#297 AAACTCAAATGATCATGGC
298 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#298 AACTCAAATGATCATGGCA
299 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#299 ATGAGAGTGAATCTTACAT
300 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#300 TGAGAGTGAATCTTACATT
301 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#301 GAGAGTGAATCTTACATTA
302 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#302 AGAGTGAATCTTACATTAC
303 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#303 GAGTGAATCTTACATTACT
304 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#304 TCTTACATTACTACTTTCA
305 NM_012242.3 SAMi-hDKK1#305 CTTACATTACTACTTTCAA
선행문헌(KR 10-1167675, KR 10-2010-0051195)에 기재된 DKK1 특이적 siRNA 서열
서열번호 선행특허 Code Name 센스가닥 서열
306 KR 10-1167675 SAMi-DKK1 patent#1 CACTAAACCAGCTATCCAA
307 KR 10-1167675 SAMi-DKK1 patent#2 GGTAATGATCATAGCACCT
308 KR 10-1167675 SAMi-DKK1 patent#3 GAATAAGTACCAGACCATT
309 KR 10-2010-0051195 SAMi-DKK1 patent#4 AGGTCTGTCTTGCCGGATA
실시예 2: 인간 DKK1 유전자를 표적으로 하는 siRNA 스크리닝
실시예 1에서 합성된 인간 DKK1 서열을 표적으로 하는 312종의 siRNA를 이용하여 DKK1 mRNA 발현을 효과적으로 억제하는 서열 발굴을 위한 스크리닝을 진행하였다.
2-1: hDKK1 siRNA의 세포 처리 방법(Transfection)
인간 DKK1 발현을 효율적으로 억제하는 siRNA 서열 발굴을 위하여 인간 유래 페암 세포주인 A549 및 인간 모유두세포인 HFDPC를 이용하였다. A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US)가 포함된 RPMI 배지 (Hyclone, US)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였고, HFDPC 세포주는 SupplementMix (Promo cell, Germany)가 포함된 Follicle Dermal Papilla Cell Growth Media (Promo cell, Germany)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. A549 및 HFDPC 세포를 12 well plate (Falcon, US)에 4X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, US)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 siRNA를 20 nM로 transfection시켰다.
2-2: hDKK1 발현 억제 효능 분석을 통한 308 종의 siRNA 1,2 차 스크리닝
실시예 2-1의 방법으로 A549 세포에 312종의 siRNA를 3회 반복하여 transfection을 진행하였다. Universal RNA extraction kit(Bioneer)을 이용하여 세포 용해물로부터 총 RNA를 추출하고, 이 RNA를 주형으로 AccuPower ® GreenStar™Master Mix (Bioneer)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 hDKK1 및 hRPL13A(internal control)의 mRNA 발현 수준을 대조군 샘플 대비로 hDKK1 유전자의 상대적 발현율을 분석하였다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기와 같다 (표 4).
hDKK1 및 RPL13A(internal control) 프라이머 서열
서열번호 310 DKK1-forward 5'-TGACAACTACCAGCCGTACC-3'
서열번호 311 DKK1-reverse 5'-CAGGCGAGACAGATTTGCAC-3'
서열번호 312 RPL13A-forward 5'-GTGTTTGACGGCATCCCACC-3'
서열번호 313 RPL13A-reverse 5'-TAGGCTTCAGACGCACGACC -3'
그 결과, 도 2에 나타낸 것처럼 50% 이상 DKK1 mRNA 억제효과를 보이는 서열 46개를 확인하였다. 동일한 방법으로 재현성 확보를 위한 2차 스크리닝을 통해 50% 이상 억제능을 보이는 서열 52개를 확인하였다. 1, 2차 반복 스크리닝을 통해 55% 이상의 DKK1 mRNA 억제효과를 보이는 공통 서열 18종을 선별하였다 (도 2).
2-3: 선별된 hDKK1 siRNA 후보 서열의 재현성 평가
실시예 2-2에서 선별된 18종의 hDKK1 siRNA 서열 중에서 억제능이 높은 10개의 서열을 대상으로 재현성 평가를 위해 A549 세포에 10종의 siRNA를 3회 반복하여 transfection을 진행하였다. 그 결과, 1, 2차 스크리닝과 동일하게 10종의 서열 모두 55% 이상의 저해능을 보였고, 특히 #72 서열의 경우 70% 이상의 높은 억제능을 보였다 (도 3 및 도 4).
2차 재현성 평가를 위해 인간 모유두세포인 HFDPC세포에 동일한 방법으로 10종의 서열을 3회 반복 trasnfection하여 분석한 결과, 10종 서열 모두 높은 DKK1 mRNA 억제능을 보였고, A549 세포와 마찬가지로 #72 서열은 약 80% 이상의 높은 억제능을 보였다 (도 5).
상기의 반복 및 재현성 평가를 통해 인간 DKK1 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 서열 1종을 최종 선별하였으며, 해당 DKK1 siRNA 서열 정보는 하기 표 5와 같다.
hDKK1 유전자 발현을 효과적으로 억제하는 siRNA 서열
서열번호 Code Name 위치 센스가닥 서열
72 SAMi-DKK1 #72 369-387 ATAAGTACCAGACCATTGA
실시예 3: 선별된 DKK1 서열 #72에 대한 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 합성 및 DKK1 발현 억제 효능 평가
3-1: SAMiRNA - DKK1 #72 구조체 합성
본 발명에서 제조된 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체(SAMiRNA)는 하기 구조식과 같은 구조를 갖는다.
Figure pat00012
합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 결합된 고형지지체(CPG) 상으로부터 시작하여 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클을 반복함으로써, 원하는 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 얻게 된다. 해당 일련의 이중나선 올리고뉴클레오티드의 합성과정은 RNA합성기(384 synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하였다.
이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체의 센스가닥은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)-CPG를 지지체로 하여 β시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 DNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법으로 수행하여 3' 말단 부위에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 센스가닥의 이중나선 올리고뉴클레오티드-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어 있는 C24를 5' 말단에 결합하였다. 센스가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우 또한 β시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조한 뒤에 5' 말단에 인산기를 결합하기 위해 화학적 인산화 시약(Chemical Phosphorylation reagent, CPR)을 이용하여 5' 말단에 인산기가 결합된 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥 및 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 올리고 RNA 단일가닥 및 올리고 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2´를 제거하였다. 상기 반응물들로부터 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 올리고뉴클레오티드 단일가닥, 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 리간드가 결합된 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체와 부합하는지 확인하였다. 그 후, 각각의 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0에 넣고, 90 ℃항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 SAMiRNA, monoSAMiRNA(n=1), monoSAMiRNA(n=2), monoSAMiRNA(n=3) 및 monoSAMiRNA(n=4)을 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체들은 전기영동을 통해 어닐링을 확인하였다.
3-2: SAMiRNA-DKK1 #72 나노입자 입도 분석
실시예 3-1에서 합성된 SAMiRNA-DKK1 #72의 입도분석을 위해 Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK)를 이용하여 SAMiRNA의 크기 및 다분산지수(polydispersity index)를 측정한 결과, SAMiRNA-DKK1 #72에 대한 나노입자의 크기 및 다분산지수는 하기 표 6과 같고, 대표적 그래프는 도 6과 같이 측정되었다.
SAMiRNA-DKK1#72 나노입자 크기 및 다분산지수
서열번호 Code Name Size PDI
72 SAMi-DKK1 #72 11.43 0.403
3-3: SAMiRNA - DKK1 #72 나노입자의 세포 처리 방법
최종 후보 물질 SAMiRNA-DKK1 #72의 DKK1 발현 억제 효능을 평가하기 위하여 인간 모유두세포인 HFDPC를 이용하였으며, HFDPC 세포주는 SupplementMix (Promo cell, Germany)가 포함된 Follicle Dermal Papilla Cell Growth Media (Promo cell, Germany)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. HFDPC 세포를 12 well plate (Falcon, US)에 4X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 SAMiRNA-DKK1 #72를 1X DPBS로 희석하여 세포에 5 μM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA-DKK1 #72의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 2회 또는 4회 처리하며 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
3-4: SAMiRNA-DKK1 #72 나노입자의 DKK1 mRNA 발현 억제 효능 평가
최종 후보 물질 SAMiRNA-DKK1 #72의 DKK1 유전자 발현 억제효과를 평가하기 위하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 12 well plate (Falcon, US)에 HFDPC 세포주를 4X104 cells/well로 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 다음날 SAMiRNA-DKK1 #72를 5 μM 농도로 2회, 4회 처리하였고 양성대조군은 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, US)를 이용하여 SAMiRNA-DKK1 #72를 20 nM로 transfection하였다. 48시간 배양 후 Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR)을 이용하여 세포 용해물로부터 총 RNA를 추출하고, 이 RNA를 주형으로 AccuPower ® GreenStar™ Master Mix (Bioneer, KR)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 DKK1 및 RPL13A(internal control)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하였다.
그 결과, SAMiRNA-DKK1 #72는 약 70% 이상의 DKK1 mRNA 발현 억제능을 관찰하였고, 이는 양성대조군에 비해 높은 효율로 억제하는 것을 확인하였다 (도 7).
3-5: SAMiRNA-DKK1 #72 나노입자의 DKK1 단백질 발현 억제 효능 평가
최종 후보 물질 SAMiRNA-DKK1 #72를 이용하여 HFDPC 세포주에서 DKK1 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 12 well plate (Falcon, US)에 HFDPC 세포주를 4X104 cells/well로 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하고 다음날 SAMiRNA를 5 μM 농도로 2회, 4회 처리하였다. 양성대조군은 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, US)를 이용하여 SAMiRNA를 20 nM로 transfection하였다. 48시간 배양 후 상층액을 모아서 샘플링하고 Human Dkk-1 Quantikine ELISA Kit (R&D systems, US)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 DKK1 단백질의 발현량을 정량적으로 분석하였다.
ELISA 분석 결과, 최종 후보 물질 SAMiRNA-DKK1 #72은 실시예 3-4의 DKK1 mRNA 발현 억제 효과와 유사하게 약 70% 이상의 단백질 억제 효능을 관찰하였고, 양성대조군과 비교하였을 때 동등 이상의 단백질 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다 (도 8).
실시예 4: SAMiRNA 나노입자의 모근(hair root) 내 전달 효과 확인
최종 선별된 SAMiRNA-DKK1 #72의 사람의 모근 내 전달 효율을 확인하기 위하여 사람의 모발을 대상으로 전달 효과를 확인하였다. 모발은 실험 당일 머리카락의 가장 끝 부분을 잡고 뽑아 채취하였으며, 모근에서부터 1cm 정도로 자른 뒤에 96well plate에 200 ul M199배지(10% FBS+1% 페니실린)에 1시간 동안 배양하였다. 그 후 FAM 형광물질이 표지된 SAMiRNA 10 uM이 함유되어 있는 M199 배지 200 ul에 24시간 동안 배양하였다. SAMiRNA 24시간 처리 후, DPBS를 이용하여 3번의 세척 후, 3.7% formaldehyde, 2% FBS가 함유되어 있는 PBS에서 20분 동안 모근 고정 작업을 진행하였다. 고정이 완료된 모근을 OCT compound가 담겨있는 base mold에 심고, 미리 얼려 놓은 스테인레스 플레이트 위에 올려 OCT compound를 완전히 얼려주었다. 얼린 조직은 -70℃에 보관하며, 조직 절편기로 자르기 전에 조직 절편이 용이하도록 -20℃에 30분 정도 두었다. 절편 조직은 10 um 두께로 슬라이드에 올려 1시간 동안 건조시키고, 건조가 끝나면 DAPI가 포함된 마운팅 용액을 이용하여 마운팅 과정을 진행하였다.
공초점 레이저 스캔 현미경(Confocal Laser Scan Microscope(LSM5 LIVE CONFIGURATION VARIOTWO VRGB))으로 형광을 관찰한 결과, SAMiRNA가 머리카락 조직의 모근 내 세포에 잘 전달됨이 확인되었다 (도 9).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIONEER CORPORATION <120> Double-stranded oligonucleotide targeting DKK1, oligonucleotide structure comprising the same and composition comprising the same for preventing hair loss and promoting hair growth <130> P19-B369 <150> KR 10-2019-0005277 <151> 2019-01-15 <160> 313 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#001 <400> 1 tcaggactct gggaccgca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#002 <400> 2 caggactctg ggaccgcag 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#003 <400> 3 aggactctgg gaccgcagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#004 <400> 4 ggactctggg accgcaggg 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#005 <400> 5 ctgcagccga accggcacg 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-hDKK1#006 <400> 6 tgcagccgaa ccggcacgg 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA 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Claims (33)

  1. 서열번호 72, 80, 81, 209, 214, 215, 216, 217, 254 및 256으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학적 변형은,
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(-OH)가 메틸기(-CH3), 메톡시기(-OCH3), 아민기(-NH2), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필 기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메 틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이중나선 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  8. 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체:
    [구조식 (1)]
    Figure pat00013

    상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
  9. 제8항에 있어서, 하기 구조식 (2)의 구조를 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체:
    [구조식 (2)]
    Figure pat00014

    상기 구조식 (2)에서, S 및 AS는 각각 제8항에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제8항에서의 정의와 동일하다.
  10. 제9항에 있어서, 하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 포함하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체:
    Figure pat00015
    ;
    상기 구조식 (3) 및 (4)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제9항에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3'은 이중나선 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 및 3' 말단을 의미한다.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택되는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체:
    Figure pat00016

    상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서 A′는 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
    친수성 물질 단량체 A'는 하기 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 -PO3 --, -SO3- 및 - CO2-로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (1)
    Figure pat00017

    상기 화합물 (1)에서 G는 O, S 및 NH로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (2)
    Figure pat00018
    ;
    화합물 (3)
    Figure pat00019
    .
  13. 제12항에 있어서, 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)의 구조를 갖는 것을 특 징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체:
    (A'm-J)n -X-R-Y-B 구조식 (7)
    (J-A'm)n-X-R-Y-B 구조식 (8).
  14. 제8항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000임을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  15. 제8항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드 유도체, 글리세라이드 유도체, 글리세롤 에테르, 폴리프로필렌 글리콜, C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산, 인지질, 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol) 및 토코트라이에 놀(tocotrienol)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 스테로이드 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  18. 제16항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-글리세라이드, 디-글리세라이드 및 트리-글리세라이드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  19. 제8항에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유 결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  21. 제19항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테 르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  22. 제8항에 있어서, 상기 친수성 물질에 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 리간드는 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드, 엽산(folate), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG), 포도당(glucose) 및 만노스(mannose)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  24. 제8항에 있어서, 상기 친수성 물질의 siRNA와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입된 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 블록과 연결된 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  26. 제24항에 있어서, 상기 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 DKK1 특이적 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체.
  27. 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자(nanoparticle).
  28. 제27항에 있어서, 상기 나노입자는 서로 다른 서열을 가지는 이중나선 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  29. 제27항에 있어서, 상기 나노입자는 동결건조된 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  30. 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 약제학적 조성물.
  31. 제27항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 약제학적 조성물.
  32. 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  33. 제27항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.





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