KR101167675B1

KR101167675B1 - Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１(ＤＫＫ１) 유전자의 저발현에 의해 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법

Info

Publication number: KR101167675B1
Application number: KR1020090119786A
Authority: KR
Inventors: 김인규; 김국찬; 김은진; 이소용
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2012-07-20
Also published as: KR20110062918A

Abstract

본 발명은 Dickkopf-1(DKK1) 유전자 저발현에 의해 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 폐암 세포주에서 DKK1의 발현량이 높아짐으로써 방사선 스트레스에 대한 저항성이 증가하는 것으로 나타났고, 상기 DKK1의 발현을 억제함으로써 방사선 스트레스에 대한 암세포의 민감도가 증진되어 세포사멸을 촉진시키므로, 본 발명의 DKK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 방사선 감작제는 암세포의 성장을 억제하고 방사선과 같은 스트레스에 대한 민감도를 증진시켜 세포사멸을 극대화하므로 방사선요법과 병행하여 사용할 경우, 항암치료에 있어서 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

Dickkopf-1(DKK1), 방사선, 저항성, 민감도, 방사선 감작제, 세포사멸

Description

Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１(ＤＫＫ１) 유전자의 저발현에 의해 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법{Method for the enhancement of radiosensitivity of cancer cells by inhibiting the expression of Dickkopf-1}

본 발명은 Dickkopf-1(DKK1) 유전자의 저발현에 의한 암세포의 방사선에 대한 민감도 증진 방법에 관한 것이다.

Wnt 신호(signaling) 경로는 태아 발생(embryogenesis) 과정 중에 세포의 성장 조절 및 분화(differentiation)에 중추적 역할을 하며 조직 항상성 및 복구를 위하여 요구되는 중요한 유전자 또는 단백질이 포함된다. 이러한 기능적 역할에 있어서 Dickkopf-1(DKK1)이라는 Wnt 신호 경로의 중요한 억제자(inhibitor)의 역할이 중요한데, 양서류의 머리의 형성에 있어서 Wnt 신호의 억제인자인 DKK1이 필수적인 것으로 보고되고 있다(Kawano, Y. et al., J. Cell Sci. 116(pt13): 2627-2634, 2003; Niehrs, C. et al., Int . J. Dev . Biol. 45(1): 237-240, 2001). 특히, 이러한 Wnt 신호 경로 및 길항제(antagonist)인 DKK1의 발현은 성인의 뼈형 성(bone formation), 뼈의 복구(bone repair) 또는 뼈의 질환(bone disease)의 중요한 표적이 되고 있다(Gregory, C.A. et al., Acad Sci. 1049: 97-106, 2005; Nishimura, R. et al., Clin . Calcium, 16(5):817-822, 2006; Hall, C.L. et al., J. Cell Biochem. 97(4):661-672; Roodman G. D., Clin . Cancer Res. 12(20Pt2):6270s-6273s, 2006; Baron, R. et al., Endocrinology, 148(6):2635-2643, 2007; Niehrs, C., Oncogene, 25(57):7469-7481, 2006; Pinzone, J.J., et al., Blood, 113(3):517-525, 2009; Gavriatopoulou, M., et al., Expert Opin . Ther . Targets, 13(7)839-848).

Wnt 신호는 그 자체가 중요한 종양유전자(oncogene)로서 이것이 과발현될 경우 또는 돌연변이 될 경우에 세포분열을 증가시키거나 세포의 변형을 증가시켜 종양 형성을 유도한다. 종양세포에서 DKK1 역시 Wnt 신호 경로의 길항제로서 작용하여 세포의 증식 억제를 유도한다고 보고되고 있다. 따라서 다양한 종양세포에서 DKK1 유전자가 메틸화(methylation) 등에 의하여 비유전적으로 침묵(silencing) 되어있다고 보고되고 있다(Hussain, M., et al., Cacer Res. 69(8): 3570-3578; Lee, J., et al., Gynecol . Oncol. 109(2): 270-274. 2008; Licchesi, J.D., et al., Carcinogenesis, 29(5):895-904, 2008; Suzuki, H., et al., Br . J. cancer, 98(6):1147-1156. 2008; Mikheev, A.M., et al., Breast Cancer Res. Treat, 112(2):263-273, 2008; Sato, H., et al,, Carcinogenesis, 28(12):2459-2466, 2007; Niehrs, C., Oncogene, 25(57):7469-7481, 2006; Maehata, T., et al., World J. Gastroenterol. 14(17): 2702-2714, 2008). 또한, 비타민 D의 경우 대장암 세포에서 DKK1 유전자의 발현을 증가시켜 Wnt 신호 경로를 저해하는 기능을 한다고 알려지고 있다(Pendas-Franco, M., et al., Anticancer Res. 28(5A) 2613-2623, 2008). 이처럼 DKK1의 증가가 Wnt 신호를 저해하여 암세포 성장을 억제하는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.

이와 같이, 암의 발병 과정은 다양한 유전적 변이에 의해서 여러 단계를 거쳐 생긴다. 이런 유전적 변이는 DNA 염기 서열의 변화(genetic change)를 동반하기도 하지만 염기 서열의 변화는 동반하지 않고 유전자의 발현을 억제하는 후성유전적(epigenetic) 변화도 중요하다는 것이 알려졌고, 암의 발병 과정에서 여러 종양 관련 유전자의 발현이 관여하는 것에 주목하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 암세포의 방사선 민감도에 대한 DKK1 유전자의 효과를 밝히고자 연구하던 중, 비소세포성 폐암 세포주(non small cell lung cancer)를 대상으로 DKK1의 발현을 조사한 결과, 방사선에 민감한 세포주인 H460 세포주에서, DKK1의 발현이 감소하였음을 확인하였고, 방사선에 저항성이 강한 세포주인 A549 또는 H1299 세포주에서는 DKK1 발현이 H460 세포주보다 증가되어 있음을 확인한 결과를 바탕으로, siRNA를 이용하여 폐암 세포주(A549 또는 H1299)에서의 DKK1 발현을 억제한 결과, 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가한 것을 확인하였으므로, DKK1의 발현 또는 활성 억제제를 방사선요법과 병행하여 사용할 경우, 항암치료에 있어서 매우 효과적으로 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Dickkopf-1(DKK1) 유전자의 저발현에 의해 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 Dickkopf-1(DKK1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 치료용 방사선 감작제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 방사선에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) DKK1 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 DKK1 유전자의 siRNA를 이용하여 폐암 세포주에서 DKK1 발현을 억제한 결과, 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였으므로, DKK1의 발현 또는 활성 억제제는 암 치료용 방사선 감작제로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Dickkopf-1(DKK1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 치료용 방사선 감작제를 제공한다.

상기 DKK1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 DKK1 단백질이 과발현되는 암은 모두 해당될 수 있고, 폐암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방사선 감작제는 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암세포는 폐암세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, DKK1 단백질이 과발현되는 암세포는 모두 해당될 수 있다.

상기 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고, 감마방사선인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 DKK1 단백질의 발현 억제제는 DKK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)인 것이 바람직하고, DKK1 단백질의 활성 억제제는 DKK1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 siRNA는 인간 DKK1 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호: 2)의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 한정되는 것은 아니나, 19개의 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하고, 서열번호 9 또는 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 가장 바람직하다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al ., J. Natl. Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 DKK1 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 DKK1 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al . Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al . J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al . in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al . in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al . Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al . in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.

본 발명자들은 폐암 세포주에서 방사선 민감성에 따른 DKK1 발현량을 확인하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 웨스턴 블랏(Western blot)을 통하여 A549, H460 또는 H1299 세포주에서의 DKK1 유전자 및 단백질 발현량을 비교하였다. 그 결과, 방사선에 민 감한 H460 세포주에 비하여 방사선 저항성을 갖는 A549 및 H1299 세포주에서 DKK1의 발현량이 현저히 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 2 참조). 이에, 상기 DKK1의 과발현이 방사선에 대한 저항성을 높이는 작용을 하는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 DKK1의 발현 억제가 방사선에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, DKK1 유전자의 3종류의 siRNA를 형질도입하여 상기 유전자의 발현을 억제하였고, RT-PCR을 통하여 siRNA의 형질도입에 의해 DKK1 유전자 발현량이 억제되었음을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 또한, 콜로니 형성 분석을 통하여 감마방사선에 대한 민감도를 확인하였다. 그 결과, DKK1 유전자를 억제한 폐암 세포주에서 콜로니 형성이 감소하여 방사선에 대한 민감도가 증가한 것으로 나타났다(도 5 및 도 6 참조). 이에, DKK1 유전자의 발현량이 방사선에 대한 세포의 민감도에 영향을 주고, DKK1의 발현을 억제할 경우, 암세포의 방사선에 대한 민감도가 증가하는 것을 알 수 있다.

따라서, 암세포의 치료에 있어서 DKK1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 방사선 등의 DNA 손상인자(DNA damaging agents) 처리시 세포사멸을 증진시킬 수 있으므로 DKK1 단백질 발현 또는 활성 억제제는 방사선 감작제로서 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동 일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 방사선에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.

상기 DKK1 단백질의 발현 억제제는 DKK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)인 것이 바람직하고, DKK1 단백질의 활성 억제제는 DKK1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고, 감마방사선인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 폐암 세포주에서 DKK1 단백질이 과발현되었을 경우, 감마방사선에 상당한 저항성을 보이며, 반대로 siRNA를 이용하여 DKK1 단백질의 발현을 억제한 경우에는 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, DKK1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여함으로써 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) DKK1 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 DKK1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 당업자에게 알려 진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다. 또한, 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 암세포는 폐암세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, DKK1 단백질이 과발현되는 암세포는 모두 해당될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고 감마방사선인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 폐암 세포주에서 DKK1 단백질이 과발현되었을 경우에 감마방사선에 상당한 저항성을 보이며, 반대로 siRNA를 이용하여 DKK1 단백질의 발현을 억제한 경우에는 방사선에 대하여 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, DKK1 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 피검물질을 선별함으로써 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 폐암 세포주의 DKK1 유전자 발현량 확인

<1-1> 역전사 중합효소연쇄반응( Reverse transcription - Polymerase chain reaction, RT - PCR )을 통한 폐암 세포주의 DKK1 ( Dickkopf -1) 유전자 발현량 확인

서울대학교 의과대학 부설암연구소의 한국세포주은행에서 구입한 폐암 세포주 A549, H460 또는 H1299 세포에서 DKK1 유전자의 발현량을 비교하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 역전사 반응은 10 mM dNTPs 혼합물(mixture), 5× RT 완충용액(buffer), 0.5 ㎍/㎕ 올리고(Oligo) dT, 폐암 세포주 H460, A549 또는 H1299의 65℃에서 10분간 열 변성시킨 전체 RNA 4 ㎍ 및 200 U/㎕ M-MLV RTase를 각각 첨가하여, 0.02% 디에틸피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate, DEPC)가 처리된 멸균수로 최종 부피를 20 ㎕로 맞춘 후, 45℃에서 60분간 반응시켰다. 그런 다음, 94℃에서 다시 5분간 가열한 후 얼음에서 급냉시켜서 M-MLV RTase를 비활성화시켰다. 상기 방법으로 합성된 cDNA 중 1 ㎕를 10× 완충용액(MgCl₂ free), 2.5mM dNTPs, 10× MgCl₂, Taq DNA 폴리머라제(polymerase) 및 DKK1에 대한 20 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머(primer){EcoRI/ 정방향: 5'-ATATGAATTCATGATGGCTCTGGGC-3'(서열번호 3), XhoI /역방향: 5'-ATATCTCGAGTTAGTGTCTCTGACAAGTGTG-3'(서열번호 4)를 혼합하여 하기의 조건에서 증폭하였다. 먼저 94℃에서 5분간 전 초기-변성(pre-denature)시킨 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 58℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 신장(elongation)을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10분간 마지막 신장(post-elongation)을 수행하였다. PCR 반응이 종결되면 1% 아가로즈 겔(agarose gel) 상 에서 전기영동을 실시하여 DKK1 유전자 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 방사선에 민감한 H460 세포주에서 DKK1 유전자의 발현이 가장 낮았고, 이에 비해 방사선 저항성을 가진 세포주인 A549 및 H1299 세포주에서는 DKK1 유전자 발현이 현저히 증가된 것으로 나타났다(도 2).

<1-2> 웨스턴 블랏(Western blot)을 통한 폐암 세포주의 DKK1 유전자 발현량 확인

폐암 세포주 A549, H460 또는 H1299 세포주에서 DKK1의 단백질 발현량을 비교하기 위하여, 웨스턴 블랏(western blot)을 실시하였다. 6 웰 배양접시에 A549, H460 또는 H1299 세포주를 1×10⁵ 세포수로 접종하하여 배양하였고, 48시간 동안 배양한 후, 세포를 수득하여 세포용해완충용액(RIPA lysis buffer, santa cruz,USA)을 사용하여 단백질을 추출하였다. 단백질정량키트(total protein kit, sigma)를 사용하여 상기 추출한 단백질 40 ㎍을 정량하였고, 소혈청알부민(Bovin serum albumin, BSA, Amesco)을 사용하여 단백질 표면에 비특이적으로 결합하는 항체(antibody)를 제거하였다. DKK1 항체(cell signaling, USA)를 1:5000으로 희석하여 단백질에 결합시키고 이 항체를 인식하여 발색하는 효소(α-rabbit, cell signaling, USA)를 다시 결합시켜 필름에 감광되는 것으로 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 방사선에 민감한 H460 세포주에서 DKK1 단백질의 발현이 가장 낮았고, 이에 비해 방사선 저항성을 가진 세포주인 A549 및 H1299 세포주에서는 DKK1 단백질 발현이 현저히 증가된 것으로 나타났다(도 2).

< 실시예 3> siRNA 를 이용한 A549 및 H1299 폐암 세포주의 DKK1 유전자 발현 억제

<3-1> DKK1 이중 올리고뉴클레오티드( duplex oligoribonucleotides )의 제작 및 형질도입

방사선 저항성을 가지는 A549 및 H1299 폐암 세포주의 DKK1 유전자 저발현 유도를 위해 DKK1에 대한 siRNA를 형질도입하였다. 상기 siRNA는 BIONEER사에서 제공한, 하기 표 1 및 도 1에 기재된 3종류의 19머(mer) DKK1 siRNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)(DKK1 #1, DKK1 #2 및 DKK1 #3)를 사용하였다. A549 또는 H1299 세포 2×10⁵개당 각각의 RNAi는, A549에는 50 또는 100 nM, H1299에는 100 nM을 취해 Lipofectamine RNAi MAX(invitrogen)를 이용하여 형질도입하였다. DKK1-siRNA 이중 올리고뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides)를 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 용액 및 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가되지 않은 배지에서 형질도입한 세포를 4 ~ 6시간 동안 반응시킨 후, 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 용액(penicillin-streptomycin solution, Hyclone) 및 FBS가 첨가된 배지로 교체하여 배양하였다. 형질도입한 날로부터 72시간 후에 세포를 수득하였다.

	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
DKK1 #1	CAC UAA ACC AGC UAU CCA A	5
DKK1 #1	UUG GAU AGC UGG UUU AGU G	6
DKK1 #2	GGU AAU GAU CAU AGC ACC U	7
DKK1 #2	AGG UGC UAU GAU CAU UAC C	8
DKK1 #3	GAA UAA GUA CCA GAC CAU U	9
DKK1 #3	AAU GGU CUG GUA CUU AUU C	10

<3-2> 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 siRNA 형질도입 폐암 세포주의 DKK1 유전자 발현량 확인

상기 실시예 <1-1>의 RT-PCR 방법에 따라, 폐암 세포주인 A549 또는 H1299 세포주에 Scrambled Stealth^TM RNA 분자를 형질도입한 세포(음성대조군)와 DKK1-siRNA 이중 올리고리보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides) 3종류를 각각 형질도입한 세포에서의 DKK1의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, H1299 세포에 DKK1 #1, DKK1 #2 또는 DKK1 #3 DKK1-siRNA 100 nM을 처리하였을 경우, 음성대조군에 비하여 DKK1-siRNA를 형질도입한 세포들의 DKK1의 발현량이 감소하였고, 3종류의 siRNA 모두 DKK1 발현을 저해시키는 것으로 나타났다(도 3). 한편, A549 세포에서는, 각각의 si-DKK1을 100 nM로 처리하였을 경우, DKK1 #2는 DKK1 발현을 감소시켰고 DKK1 #3은 DKK1 발현을 저해하는 것으로 나타났다(도 3 및 도 4).

< 실시예 4> DKK1 의 발현억제가 세포의 감마방사선에 대한 민감도에 미치는 영향 분석

DKK1의 발현이 억제된 폐암 세포주에서의 방사선에 대한 민감도를 알아보기 위하여, 콜로니 형성 분석(colony formation assay)을 실시하였다. 상기 실시예 <3-1>에 따라 35 ㎜ 디쉬에 A549 또는 H1299 세포를 2×10³세포수로 접종하였고, 상기 <실시예 3>에서 가장 효과적으로 DKK1 유전자 발현을 억제한 DKK1 #3 si-RNA 5 nM 또는 10 nM, 또는 음성대조군 10 nM을 Lipofectamine RNAi MAX(Invitorgen)를 이용해 FBS가 없는 배지에서 A549 및 H1299 세포에 형질도입하였다. 형질도입 6시간 후, FBS가 첨가된 배지로 교체한 뒤 배양하였다. 형질도입 48시간 후, 2 Gy의 감마방사선을 조사한 뒤, 5% CO₂ 세포배양기에서 7 ~ 10일 동안 배양하였다. 배양한 후 10일 뒤 콜로니를 인산염완충식염수(phosphate bufferd salin, PBS)로 2회 세척하고 0.5% 크리스탈바이올렛용액(crystal violet solution)으로 10분 동안 염색한 뒤 PBS로 5회 세척하여 콜로니를 관찰하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, A549 또는 H1299 세포에 2 Gy 선량의 감마방사선을 조사하였을 경우, 세포주 대조군, siRNA 대조군(음성대조군)에서는 콜로니 형성의 차이가 없었으나 siRNA-DKK1 #3을 처리하였을 경우, 농도에 따라 콜로니 형성이 감소하였다. 한편, siRNA-DKK1을 도입한 H1299 세포에서는 감마방사선에 대한 민감도의 유의성 있는 차이가 없었던 반면에, A549 세포의 경우에는 감마 방사선 조사에 의하여 콜로니 형성이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(도 5 및 도 6).

상기와 같이, Dickkopf-1(DKK1) 발현 또는 활성 억제제는 폐암 세포주의 방사선에 대한 민감도를 높여 세포사멸을 촉진시키므로, DKK1의 발현 또는 활성의 증가와 관련된 암의 예방 및 치료용 항암 보조제 또는 방사선 감작제로 유용하게 사용될 수 있고, DKK1 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 후보 물질을 스크리닝함으로써 새로운 항암 후보 물질의 개발 및 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 DKK1의 전체 게놈 서열을 나타낸 그림이고, 밑줄친 부분은 DKK1 단백질을 합성하는 코딩(coding) 서열을 나타낸 것이며, 굵게 밑줄친 부분은 si-DKK1의 siRNA 프라이머 서열을 표시한 부분을 나타낸 그림이다.

도 2는 RT-PCR(위) 및 웨스턴 블랏(western blot)(아래)을 이용하여 폐암 세포주 A549, H460 또는 H1299에서의 DKK1 발현량을 측정한 것을 나타낸 그림이다.

도 3은 폐암 세포주 H1299에 각각의 si-DKK1을 100 nM로 처리하여 RT-PCR을 통하여 DKK1의 발현량을 나타낸 그림이다.

도 4는 폐암 세포주 A549에 각각의 si-DKK1을 50 nM 또는 100 nM로 처리하여 RT-PCR을 통하여 DKK1의 발현량을 나타낸 그림이다.

도 5는 A549세포에서 DKK1의 발현 억제가 감마방사선에 대한 민감도에 미치는 영향을 콜로니 형성분석(colony forming assay)(위) 및 세로막대 그래프(아래)로 나타낸 그림이다.

도 6은 H1299세포에서 DKK1의 발현 억제가 감마방사선에 대한 민감도에 미치는 영향을 콜로니 형성분석(colony forming assay)(위) 및 세로막대 그래프(아래)로 나타낸 그림이다.

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Method for the enhancement of radiosensitivity of cancer cells by inhibiting the expression of DicKKopf-1 <130> 9p-11-31 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (DKK1) <400> 1 Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Thr Arg Val Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr 20 25 30 Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro 35 40 45 Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro 50 55 60 Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr 65 70 75 80 Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu 100 105 110 Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys 115 120 125 Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn 130 135 140 His Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly Asn 145 150 155 160 Asp His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Leu Ser Ser 165 170 175 Lys Met Tyr His Thr Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser 180 185 190 Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys 195 200 205 Ile Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His Arg 210 215 220 Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys Gly 225 230 235 240 Glu Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser Asn 245 250 255 Ser Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His *** 260 265 <210> 2 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (DKK1) <400> 2 atgatggctc tgggcgcagc gggagctacc cgggtctttg tcgcgatggt agcggcggct 60 ctcggcggcc accctctgct gggagtgagc gccaccttga actcggttct caattccaac 120 gctatcaaga acctgccccc accgctgggc ggcgctgcgg ggcacccagg ctctgcagtc 180 agcgccgcgc cgggaatcct gtacccgggc gggaataagt accagaccat tgacaactac 240 cagccgtacc cgtgcgcaga ggacgaggag tgcggcactg atgagtactg cgctagtccc 300 acccgcggag gggacgcagg cgtgcaaatc tgtctcgcct gcaggaagcg ccgaaaacgc 360 tgcatgcgtc acgctatgtg ctgccccggg aattactgca aaaatggaat atgtgtgtct 420 tctgatcaaa atcatttccg aggagaaatt gaggaaacca tcactgaaag ctttggtaat 480 gatcatagca ccttggatgg gtattccaga agaaccacct tgtcttcaaa aatgtatcac 540 accaaaggac aagaaggttc tgtttgtctc cggtcatcag actgtgcctc aggattgtgt 600 tgtgctagac acttctggtc caagatctgt aaacctgtcc tgaaagaagg tcaagtgtgt 660 accaagcata ggagaaaagg ctctcatgga ctagaaatat tccagcgttg ttactgtgga 720 gaaggtctgt cttgccggat acagaaagat caccatcaag ccagtaattc ttctaggctt 780 cacacttgtc agagacacta a 801 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 EcoR1/Forward <400> 3 atatgaattc atgatggctc tgggc 25 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 Xho1/reverse <400> 4 atatctcgag ttagtgtctc tgacaagtgt g 31 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #1 <400> 5 cacuaaacca gcuauccaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #1 <400> 6 uuggauagcu gguuuagug 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #2 <400> 7 gguaaugauc auagcaccu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #2 <400> 8 aggugcuaug aucauuacc 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #3 <400> 9 gaauaaguac cagaccauu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 #3 <400> 10 aauggucugg uacuuauuc 19

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 Dickkopf-1(DKK1) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 유효성분으로 함유하여 DKK1 단백질의 발현 억제하는 것에 의하여 방사선 저항성을 가진 폐암 세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 것을 특징으로 하는 방사선 감작제.
제 1항에 있어서, 상기 작은 간섭 RNA는 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 1쌍의 작은 간섭 RNA인 것을 특징으로 하는 방사선 감작제.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 방사선 저항성을 가진 폐암세포는 A549 또는 H1299 세포주인 것을 특징으로 하는 방사선 감작제.
제 1항에 있어서, 상기 방사선은 감마방사선인 것을 특징으로 하는 방사선 감작제.
삭제
1) DKK1 단백질 발현 폐암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 폐암 세포주의 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 DKK1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 방사선 저항성을 가진 폐암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법.
삭제
제 10항에 있어서, 상기 방사선 저항성을 가진 폐암세포는 A549 또는 H1299 세포주인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 10항에 있어서, 단계 3)의 방사선은 감마 방사선인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.