KR101128297B1

KR101128297B1 - Ｔｓｐｙｌ５ 유전자 발현을 억제하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법

Info

Publication number: KR101128297B1
Application number: KR1020090109125A
Authority: KR
Inventors: 김인규; 김국찬; 이소용; 김태림; 김은진; 정일래
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2009-11-12
Publication date: 2012-03-23
Also published as: KR20110052184A; US8343940B2; US20110111400A1

Abstract

본 발명은 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 유전자 발현을 억제하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 폐암세포주에서 발현되는 TSPYL5 단백질의 메틸화가 저해되어 유전자 발현량이 높아짐으로써 방사선 또는 항암제 등의 스트레스에 대한 저항성이 증가한 것으로 나타났고, 상기 TSPYL5 유전자의 발현을 억제함으로써 방사선 또는 항암제 등의 스트레스에 대한 암세포의 민감도를 증진시켜 세포사멸을 촉진시키므로, 본 발명의 TSPYL5 유전자 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암보조제는 암세포의 성장을 억제하고 다양한 스트레스에 대한 민감도를 증진시켜 세포사멸을 극대화하므로 방사선요법 또는 화학요법과 병행하여 사용할 경우, 항암치료에 있어서 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

TSPYL5, 항암제, 방사선, 저항성, 민감도, 메틸화, 과메틸화, 항암 보조제, 세포사멸

Description

ＴＳＰＹＬ５ 유전자 발현을 억제하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법{Method for the enhancement of chemical sensitivity or radiosensitivity of cancer cells by inhibiting the expression of TSPYL５}

본 발명은 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 유전자 발현을 억제하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진하는 방법에 관한 것이다.

DNA의 메틸화(methylation)는 유전자 형질 발현을 조절하는 화학적 변형 중 하나로, DNA의 반응성을 낮추고 안정성을 높여서 유전자 발현을 억제하며, 정상적인 발달(normal development) 과정에 매우 중요하다. DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 시토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사 인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단된다. 특히, DNA의 과메틸화(hypermethylation)에 의하여 변화되는 특정 유전자 발현은 암 또는 종양과 같은 인간의 질병과 매우 깊은 관련이 있다. 따라서, 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이를 암의 진단 및 조기 진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적 조사, 항암 요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용 가능하다.

암의 발병 과정은 다양한 유전적 변이에 의해서 여러 단계를 거쳐 생긴다. 이런 유전적 변이는 DNA 염기 서열의 변화(genetic change)를 동반하기도 하지만 염기 서열의 변화는 동반하지 않고 유전자의 발현을 억제하는 후성유전적(epigenetic) 변화도 중요하다는 것이 알려졌고, 암의 발병 과정에서 여러 종양 관련 유전자의 발현이 관여하는 것에 주목하게 되었다. 프로모터 CpG island 과메틸화와 히스톤 변경으로 대변되는 후성유전적 변화는 거의 모든 종류의 암에서 발견되는 중요한 발암기전이다. 인간 유전자의 60 ~ 70% 가량이 프로모터에 CpG islands를 가지고 있으며, 이 유전자들 중 일부가 과메틸화됨으로써 암과 관련된 해당 유전자의 발현이 차단되어, 종양의 발병에 영향을 주게 된다.

DNA 메틸화(methylation)와 히스톤 탈아세틸화(hitone deacetylation) 억제제에 의하여 신경교종 세포주(glioma cell line)에서 160개 이상의 유전자들의 발현이 증가되는 것이 보고되었는데, 이때, 정소 특이적 Y-encoded-like 5 단백질(testis-specific protein, Y-encoded-like 5)을 암호화하는 TSPYL5 유전자도 그중의 하나이며, 유의성 있게 유전자의 발현이 유발되는 것으로 나타났다. TSPYL5 유전자는 교종(glial tumor) 및 신경교종 세포주(glioma cell line)에서 높은 빈도로 DNA 메틸화됨으로써, 전이 억제자(metastasis suppressor)인 CST6 유전자와 세 포사멸 유도자(apoptosis-inducer)인 BIK 유전자와 함께 유전자 침묵(silencing) 되어있음이 보고되었다(Kim, T.Y. et al., Cancer Res. 66(15):7490-7501, 2006). 또한, SPYL5 유전자는 위암 세포주(gastric cancer cell line)에서 흔히 발현이 저하되며, 9개의 위암 세포주 중에 7개에서 DNA 메틸화에 의해 비활성화되어 있어, TSPYL5 발현량이 매우 낮았고, 초기 위암(Primary gastric tumor)의 36 케이스 중 23 케이스에서 TSPYL5 유전자의 프로모터가 과메틸화(hypermethylation) 되어있음을 확인하였다. 또한. TSPYL5 유전자는 두경부암(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma)과 폐 편평세포암종(Lung Squamous Cell Carcinoma)을 구분하기 위한 분류 유전자로서의 가능성이 있는 10개 유전자 중 하나로 보고되었다(Kim , T.Y., Zhong, S., Fields , C.R., Kim , J.H., Robertson , K.D. Clin . Cancer Res . 13(10):2905-2915, 2007). 그러나 아직 TSPYL5 유전자의 세포생리학적인 기능은 잘 알려져 있지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 암세포의 항암제 및 방사선 민감도에 대한 TSPYL5 유전자의 효과를 밝히고자 연구하던 중, 폐암세포주를 대상으로 TSPYL5 유전자의 발현을 조사한 결과, 방사선 및 항암제에 민감한 세포주인 H460 세포주에서, TSPYL5 유전자 프로모터 부위의 DNA 과메틸화(hypermethylation)에 의해 TSPYL5의 발현이 감소하였음을 확인하였고, 방사선 및 항암제에 저항성이 강한 세포주인 A549 혹은 H1299 세포주에서는 메틸화 정도가 감소하여 TSPYL5 유전자발현이 H460 세포주보다 증가되어있음을 확인한 결과를 바탕으로 siRNA를 이용하여 폐암세포주(A549 또는 H1299)에서의 TSPYL5 단백질 발현을 억제시킨 경우, 항암제 및 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였으므로, TSPYL5의 발현 또는 활성 억제제는 방사선요법 또는 화학요법과 병행하여 사용할 경우, 항암치료에 있어서 매우 효과적으로 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 유전자 발현을 억제하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시켜 암세포의 세포사멸 효과를 증진하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TSPYL5 유전자의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TSPYL5 유전자의 메틸화 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 유전자의 발현을 억제함으로써 방사선 또는 항암제 등의 스트레스에 대한 암세포의 민감도를 증진시켜 세포사멸을 극대화하므로, 방사선요법 또는 화학요법과 병행하여 사용할 경우, 항암치료에 있어서 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암보조제를 제공한다.

상기 TSPYL5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 항암보조제는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 암세포는 폐암세포인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않고, TSPYL5 단백질이 과발현되는 암세포는 모두 해당될 수 있다.

상기 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고, 감마방사선인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 TSPYL5 단백질의 발현 억제제는 TSPYL5 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)인 것이 바람직하고, TSPYL5 단백질의 활성 억제제는 TSPYL5 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 siRNA는 인간 TSPYL5 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호: 2)의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 서열번호 8, 9, 10, 11, 12 또는 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하고, 서열번호 10 또는 11로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 가장 바람직하다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al ., J. Natl. Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 TSPYL5 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 TSPYL5 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.

본 발명자들은 폐암세포주에서의 항암제 및 방사선 민감성에 따른 TSPYL5 단백질 발현량을 확인하기 위하여, 마이크로어레이(microarray) 및 역전사 중합효소 연쇠반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 통하여 A549, H460 또는 H1299 세포주에서의 TSPYL5 유전자 발현량을 비교하였다. 그 결과, 항암제 및 방사선에 민감한 H460 세포주에 비하여 항암제 및 방사선 저항성을 갖는 A549 및 H1299 세포주에서 TSPYL5의 발현량이 현저히 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조). 이에, 상기 TSPYL5의 과발현이 항암제 및 방사선에 대한 저항성을 높이는 작용을 하는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 폐암세포주에서의 TSPYL5의 발현량에 따른 TSPYL5 유전자의 메틸화 상태를 확인하기 위하여, A549, H460 또는 H1299 세포주의 TSPYL5 유전자 프로모터에 대해 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다. 그 결과, A549 또는 H1299 세포에 비하여 H460 세포에서 메틸화가 증가된 것으로 나타났다(도 3 참조). 이에, A549 또는 H1299 세포에서는 메틸화가 저하되어 있어 TSPYL5 유전자 발현량이 증가되고, H460 세포에서는 과메틸화로 인하여 TSPYL5 유전자 발현량이 현저하게 감소한 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 TSPYL5의 발현 억제가 항암제 및 방사선에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, TSPYL5 유전자의 siRNA를 형질도입하여 상기 유전자의 발현을 억제하였고, RT-PCR을 통하여 siRNA의 형질도입에 의해 TSPYL5 유전자 발현량이 억제되었음을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 유세포 분석을 통하여 시스플라틴(cisplatin)을 이용하여 항암제에 대한 세포의 민감도를 확인하였고, 유세포 분석 및 콜로니 형성 분석을 통하여 감마방사선에 대한 민감도를 확인하였다. 그 결과, TSPYL5 유전자를 억제한 폐암세포주에서 항암제 및 방사선에 대한 민감도가 증가한 것으로 나타났다(도 5, 도 6 및 도 7 참조). 이에, TSPYL5 유전자의 발현량이 항암제 및 방사선에 대한 세포의 민감도에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 또한, TSPYL5 유전자가 세포의 성장저해, 세포사멸 및 저항성에 관련되는 인자를 조절한다는 것을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 암세포의 치료에 있어서 TSPYL5 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제함으로써 항암제 또는 방사선 등의 DNA 손상인자(DNA damaging agents) 처리시, 세포사멸을 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약 제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리 하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.

상기 TSPYL5 단백질의 발현 억제제는 TSPYL5 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)인 것이 바람직하고, TSPYL5 단백질의 활성 억제제는 TSPYL5 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane- sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고, 감마방사선인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서는 TSPYL5 유전자가 스트레스 저항성과 관련이 있는 메틸화를 통해 발현량을 조절하는 것을 확인하였고, 폐암세포주에서 TSPYL5 단백질이 과발현되었을 경우, 항암제 및 감마방사선에 상당한 저항성을 보이며, 반대로 siRNA를 이용하여 TSPYL5 단백질의 발현을 억제시킨 경우에는 항암제 및 방사선에 대한 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, TSPYL5 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여함으로써 암세포의 항암제 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명은

1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 TSPYL5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 메틸화 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩(chip), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않고, 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고, 감마방사선인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 암세포는 폐암세포인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않고, TSPYL5 단백질이 과발현되는 암세포는 모두 해당될 수 있다.

본 발명에서는 TSPYL5 유전자가 스트레스 저항성과 관련이 있는 메틸화를 통해 발현량을 조절하는 것을 확인하였고, 폐암세포주에서 TSPYL5 단백질이 과발현되었을 경우에 항암제 및 감마방사선에 상당한 저항성을 보이며, 반대로 siRNA를 이용하여 TSPYL5 단백질의 발현을 억제시킨 경우에는 항암제 및 방사선에 대하여 민감도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, TSPYL5 유전자의 메틸화가 증가한 피검물질을 선별함으로써 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다. 또한, 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석 법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸 메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐 퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 방사선은 감마방사선, X선 또는 전자선 모두 가능하고 감마방사선인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

따라서, TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 정도가 증가한 피검물질을 선별함으로써 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 폐암세포주의 TSPYL5 유전자 발현량 확인

<1-1> 마이크로어레이 ( microarray )를 통한 폐암세포주의 TSPYL5 유전자 발현량 확인

서울대학교 의과대학 부설암연구소의 한국세포주은행에서 구입한 폐암세포주 A549, H460 또는 H1299세포에서 TSPYL5의 발현량을 비교하기 위하여, 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라, 마이크로어레이(microarray)를 수행하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 방사선 및 항암제에 민감한 비소세포성(non small cell lung cancer) 폐암세포주인 H460 세포주에 비하여 항암제 및 방사선 저항성을 가진 세포주인 A549 또는 H1299 세포주에서 TSPYL5의 발현량이 약 50배 증가한 것으로 나타났다(도 1).

<1-2> 역전사 중합효소연쇄반응( reverse transcription polymerase chain reaction, RT - PCR )을 통한 폐암세포주의 TSPYL5 유전자 발현량 확인

폐암세포주 A549, H460 또는 H1299세포에서 TSPYL5의 발현량을 비교하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다. 역전사 반응은 10 mM dNTPs 혼합물(mixture), 5X RT 완충용액(buffer), 0.5 ㎍/㎕ 올리고(oligo) dT, 폐 암세포주 H460, A549 또는 H1299의 열 변성(70℃, 10분)시킨 총 RNA 4 ㎍, 및 200 U/㎕ M-MLV RTase를 각각 첨가하였고, 0.02% 디에틸피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate, DEPC)가 처리된 멸균수로 최종 20 ㎕의 부피로 맞춘 후, 45℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 94℃에서 5분간 가열한 후 얼음에서 급냉시켜서 M-MLV RTase를 비활성화시켰다. 상기의 방법으로 합성된 cDNA 중 1 ㎕를 10X 완충용액(buffer)(MgCl₂ free), 2.5mM dNTPs, 10X 염화마그네슘(MgCl₂), Taq DNA 폴리머라제(polymerase)를 혼합하고, TSPYL5 또는 ß-actin에 대한 10 pmol의 프라이머를 첨가하여 하기의 조건에서 증폭하였다. 이때, TSPYL5 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머(primer) EcoRI/Forward: 5'-CCGGAATTCAT GAGCGGCCGAAGTCGGGGT-3' 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머 EcoRI/reverse: 5'-CCGGAATTCTC AGTTGGATTGGCTCACCCC-3'을 사용하였다. 94℃에서 5분간 초기 변성(pre-denature)시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 60℃에서 1분 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 신장(elongation)을 45회 반복한 다음, 72℃에서 10분간 마지막 신장(post-elongation)을 수행하였다. PCR이 끝나면 1% 아가로즈 젤(agarose gel) 상에서 전기영동을 통하여 TSPYL5 유전자의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, H460 세포주에 비하여 방사선 및 항암제 저항성을 가진 세포주인 A549 및 H1299세포주에서 TSPYL5 유전자의 발현이 현저히 증가된 것으로 나타났다(도 2).

< 실시예 2> 파이로시퀀싱 ( pyrosequencing )을 이용한 TSPYL5 메틸화( methylation )의 정량 분석

TSPYL5에 존재하는 프로모터 부위에 CpG 섬(CpG island)의 메틸화 상태를 생화학적으로 확인하기 위하여, 폐암세포주 H460, A549 및 H1299 각각의 TSPYL5 유전자 프로모터에 대해 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다. 바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, H460, A549 및 H1299로부터 각각 전체 게놈 DNA를 분리하여, 게놈 DNA 200 ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 유지되었다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20 ㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱을 수행하였다. 바이설파이트가 처리된 게놈 DNA 20 ng을 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR 프라이머는 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 5'-TTAGAAAATAGGTGATGGGGGATA-3 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머 5'-Biotin-AAATACTACCATTTCATCTCTTCC-3'을 사용하였다. PCR은 95℃에서 5분간 변성단계를 거쳐, 95℃에서 45초, 62℃에서 45초, 72℃에서 30초간 처리한 것을 한 사이클로 하여 총 45회 수행하였고, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장하였다. 그 후, 상기 바이오틴으로 표지된 주형 DNA를 정제하고, PyroMark ID(Biotage, 미국)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 시퀀싱 프라이머는 서열번호 7로 기재되는 5'-GGTGGTGATGGTTTTTA-3'을 사용하였고, 상기 PCR 및 시퀀싱 프라 이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 하기 [표 1]의 밑줄친 염기서열은 TSPYL5의 파이로시퀀싱 부위를 나타낸 것이다.

TSPYL5 (-280 ~ -161nt, y: CpG site) (서열번호 14)

GTTTAGTTTA GAAAATAGGT GATGGGGGAT AGGTGGTGAT
GGTTTTTAG Y GTTGTTTTGT TTAA Y GAGAT TTTGAGAGTA
Y GATGAGTT Y G Y G Y GGAAGA GATGAAATGG TAGTATT

TSPYL5 시퀀싱 프라이머(Sequencing primer) : 5'-GGTGGTGAT GGTTTTTA-3'

분석을 위한 TSPYL5 서열(TSPYL5 Sequence to analyze) : G Y GTTGTTTTGTTTAA Y GAGATTTTGAGAGTA Y GATGAGTT Y G Y G Y GGA (서열번호 15)

Y : methylated position in H460 and/or A549 (position 1 to 6).

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, H460 세포주는 A549 세포주에 비하여 약 3배, H1299 세포주에 비하여 약 4.5배 메틸화가 더 많이 일어난 것으로 나타났다(도 3).

< 실시예 3> siRNA 를 이용한 폐암세포주의 TSPYL5 유전자 발현 억제

<3-1> TSPYL5 - siRNA 이중 올리고리보뉴클레오티드( duplex oligoribonucleotides )의 제작 및 형질도입

TSPYL5 유전자에 대한 siRNA는 Invitrogen사에 유전자 서열정보를 제공한 후, 맞춤 서비스(custom survice)로 제작 주문한 하기 표 1에 기재된 3 종류의 25머(mer) TSPYL5 stealth-RNAi를 사용하였다. 상기 siRNA의 세포내의 도입은 A549 또는 H1299 세포 2×10⁵개당 각각의 RNAi를 40 ~ 80 nM씩 취해 Lipofectamine RNAi MAX(invitrogen)를 이용하여 실시하였다. TSPYL5-siRNA 이중 올리고리보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides)를 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin solution)(Hyclone)이 첨가되지 않은 배지에서 세포에 형질도입하여 4 ~ 6시간 반응 후, 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin solution)을 첨가한 배지로 바꾸어 배양하였다.

	프라이머 서열(5' - 3')
HSS131713 (C1)	(RNA)-ACCACACCCAUAUUCCUUGAUGAGC (서열번호 8)
HSS131713 (C1)	(RNA)-GCUCAUCAAGGAAUAUGGGUGUGGU (서열번호 9)
HSS131714 (C2)	(RNA)-AAAGGUAGAACUGCAAGGGAUUGGG (서열번호 10)
HSS131714 (C2)	(RNA)-CCCAAUCCCUUGCAGUUCUACCUUU (서열번호 11)
HSS131715 (C3)	(RNA)-UUCUUCUGCCUCCCACCAGCUAUGA (서열번호 12)
HSS131715 (C3)	(RNA)-UCAUAGCUGGUGGGAGGCAGAAGAA (서열번호 13)

<3-2> 형질도입한 폐암세포주의 배양

인간 폐암세포주인 A549, H1299 세포주에 Scrambled Stealth^TM RNA 분자(molecule)을 도입한 세포(음성 대조군; siControl)와 TSPYL5 발현을 억제시키는 siRNA 이중 올리고리보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides)를 형질도입한 세포를 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin- streptomycin solution)(Hyclone), 10% 우태아혈청(Hyclone)을 포함한 RPMI 배지에 1 × 10⁵ 세포수/3 ㎖로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<3-3> 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 siRNA 형질도입 폐암세포주의 TSPYL5 유전자 발현량 확인

상기 실시예 <1-2>의 RT-PCR 방법에 따라, 폐암세포주인 A549 또는 H1299 세포주에 Scrambled Stealth^TM RNA 분자를 형질도입한 세포(음성 대조군; siControl)와 TSPYL5-siRNA 이중 올리고리보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides) 후보 프라이머(candidate primer) 3 종류를 각각 형질도입한 세포(C1-131713, C2-131714 및 C3-131715)에서의 TSPYL5의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Scrambled Stealth^TM RNA 분자를 형질도입한 세포(음성 대조군; siControl)에 비하여 TSPYL5-siRNA를 형질도입한 세포들의 TSPYL5의 발현량이 감소하였고, 특히 A549 및 H1299 세포주에서, TSPYL5-siRNA 3 종류(25mer) 중 C2-131714가 가장 효과적으로 TSPYL5의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 4).

< 실시예 4> TSPYL5 의 발현 억제가 시스플라틴(cisplatin)에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향 분석

TSPYL5의 발현이 억제된 폐암세포주에서의 항암제에 대한 민감도를 알아보기 위하여, 유세포 분석을 실시하였다. 상기 <실시예 3>에 따라 TSPYL5-siRNA를 형질도입한 뒤 72시간 후, 배양된 5×10⁵세포를 수득하여 차가운 70% 에탄올 500 ㎕로 부유하여 -20℃에서 30분간 세포를 고정시킨 후, 원심분리하여 에탄올을 제거하고 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척하였다. 그 후, 시스플라틴(Cisplatin)(Plantinol^？ AQ, USA) 100 또는 200 μM을 24시간 처리한 후, 프로피디움아이오다이드(propidium iodide, PI)염색시약(PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM EDTA, 0.05 ㎎/㎖ RNase A(50 units/㎎), 50 ㎍/㎖ propidium iodide) 500 ㎕를 넣어 4℃에서 1시간 염색한 뒤 세포사멸 및 세포주기를 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, A549 세포주의 대조군 및 음성대조군 보다 TSPYL5-siRNA를 형질도입한 세포주에서 세포사멸이 5배 증가하였고, H1299의 경우 2배 증가한 것으로 나타났다. 즉, TSPYL5의 발현 억제는 폐암세포주에서 시스플라틴에 의한 세포사멸을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다(도 5).

< 실시예 5> TSPYL5 의 발현억제가 감마방사선 처리 후에 세포의 민감도에 미치는 영향 분석

<5-1> 유세포분석 ( flowcytometry )을 통한 세포의 민감도 확인

TSPYL5의 발현이 억제된 폐암세포주에서의 방사선에 대한 민감도를 알아보기 위하여, 한국원자력 연구원의 감마선 조사시설(선원; ⁶⁰C₀)을 이용하여 감마선을 조사하고 유세포 분석을 실시하였다. 상기 <실시예 3>에 따라 TSPYL5-siRNA를 형질도입한 뒤 48시간 후, 10 Gy의 방사선을 조사한 뒤, 배양된 5×10⁵세포를 수득하여 차가운 70% 에탄올 500 ㎕로 부유하여 -20℃에서 1시간 세포를 고정시킨 후, 원심분리하여 에탄올을 제거하고 PBS로 세척한 후 PI 염색시약 500 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 염색한 뒤 세포사멸 및 세포주기를 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TSPYL5의 발현 억제는 방사선 조사에 의한 세포사멸을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다(도 6).

<5-2> 콜로니 형성 분석( colony forming assay )을 통한 세포의 민감도 확인

TSPYL5의 발현이 억제된 폐암세포주에서의 방사선에 대한 민감도를 알아보기 위하여, 한국원자력 연구원의 감마선 조사시설(선원; ⁶⁰C₀)을 이용하여 감마선을 조사하여 콜로니 형성 분석(colony formation assay)을 실시하였다. 35 ㎜ 배양접시(dish)에 A549 세포주를 2×10³세포수로 접종하였고, 맞춤 주문한 상기 표 1의 siRNA 5 또는 10 nM, 음성 대조군 10 nM을 Lipofectamine RNAi MAX(Invitorgen)을 이용하여 우태아혈청이 없는 배지에서 A549 세포주에 도입하였다. 형질도입한 뒤 6시간 후, 우태아혈청이 첨가된 배지로 교체한 뒤 배양하였다. 형질도입 48시간 후, 2 Gy의 방사선을 조사한 뒤, 5% CO₂ 배양기에서 5 ~ 10일간 배양하였다. 배양 10일 후, 콜로니를 PBS로 2회 세척하고 크리스탈바이올렛(crystal violet solution)으로 10분간 염색한 뒤 PBS로 5회 세척하고 콜로니를 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, A549 세포주에 2 Gy 선량의 감마방사선을 조사하였을 때, 대조군 및 siRNA 대조군인 음성 대조군을 형질도입한 세포주는 콜로니 형성의 차이가 없었으나, TSPYL5-siRNA를 형질도입한 세포주의 경우에는 siRNA의 농도에 따라 콜로니 형성이 감소할 뿐만 아니라 감마방사선 조사에 따른 상승적 효과로 인하여 콜로니 형성이 현저하게 감소하였다(도 7).

< 실시예 6> TSPYL5 의 발현억제를 통한 단백질 발현에 미치는 영향 분석

TSPYL5의 발현이 억제된 폐암 세포주에서의 단백질의 발현을 분석하기 위하여 특수 단백질 발현 검사(Western blot)를 실시하였다. 6 웰(well) 배양접시(dish)에 A549 세포주를 1×10⁵세포수로 접종하였고, 맞춤 주문한 상기 [표 2]의 siRNA 100 nM, 음성 대조군 100 nM을 Lipofectamine RNAi MAX(Invitorgen)을 이용하여 우태아혈청이 없는 배지에서 A549 세포주에 도입하였다. 형질도입한 뒤 6시간 후, 우태아혈청이 첨가된 배지로 교체한 뒤 배양하였다. 형질도입 48시간 후 세포를 수확한 뒤 세포용해 용액(RIPA lysis buffer-santa cruz, USA)를 사용하여 단백질을 추출하였고, 단백질 정량 세트(total protein kit ,sigma)를 사용하여 40 ㎍을 정량하여 단백질의 발현을 확인하였다. BSA(bovine serum albumin ,Amesco)을 사용하여 단백질 표면에 비특이적으로 결합하는 항체(antibody)를 제거하였다. 하기 [표 3]에 나타낸 선별단백질항체를 희석하여 단백질에 결합시키고 이 항체를 인식하여 발색하는 효소를 다시 결합시켜 필름에 감광되는 것을 분석하였다.

선별단백질항체	희석양	항체인식효소	희석양
α-bax(upstate,USA)	1:1000	α-rabbit (cell signaling,USA)	1:10000
α-pAKT(cell signaling,USA)	1:500	α-rabbit (cell signaling,USA)
α-bcl2(santa cruz,USA)		α-mouse (cell signaling,USA)
α-p53(santa cruz,USA)
α-pTEN(santa cruz,USA)
α-p21(santa cruz,USA)

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, A549 세포주에 TSPYL5-siRNA를 형질도입하였을 때, 세포사멸과 관련된 α-bax 단백질의 발현은 증가하였고, 항-세포사멸과 관련된 α-bcl2 단백질은 발현이 저해되는 것으로 나타났다. 또한, 발암억제유전자인 α-pTEN 및 세포증식조절인자인 α-p21의 발현은 증가하였고 세포생존촉진유전자인 α-pAKT의 발현은 감소하는 것으로 확인되었다(도 8).

상기와 같이, TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 발현 또는 활성 억제제는 폐암세포주의 항암제 및 방사선에 대한 민감도를 높여 세포사멸을 촉진시키므로, TSPYL5의 발현 또는 활성의 증가로 인한 암의 예방 및 치료를 위한 항암제 또는 항암보조제의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있고, TSPYL5 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 후보 물질을 스크리닝함으로써 새로운 항암 후보 물질의 개발 및 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 폐암세포주 A549, H460 또는 H1299에서의 TSPYL5 발현량을 측정한 것을 나타낸 그래프이다.

도 2는 RT-PCR을 이용하여 폐암세포주 A549, H460 또는 H1299에서의 TSPYL5 발현량을 측정한 것을 나타낸 그림이다.

도 3은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법을 이용하여 폐암세포주 A549, H460 또는 H1299에서의 TSPYL5 메틸화(methylation)를 정량분석한 결과(위) 및 정량분석 결과를 오차값과 함께 세로막대형(아래)으로 나타낸 그래프이다.

도 4는 폐암세포주인 A549세포와 H1299세포에 Scrambled Stealth^TM RNA molecule를 형질도입한 세포(Negative control; siControl) 및 TSPYL5-siRNA duplex oligoribonucleotides candidate primer 3종류를 각각 형질도입한 세포(C1-131713, C2-131714, C3-131715)에서의 TSPYL5 발현을 RT-PCR을 이용하여 나타낸 그림이다.

도 5는 TSPYL5의 발현억제가 시스플라틴(cisplatin)에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향을 유세포 분석을 통하여 나타낸 그래프이고(위), 유세포 분석 결과를 편차값과 함께 세로막대형으로 나타낸 그래프이다(아래).

도 6은 TSPYL5의 발현억제가 감마방사선 처리 후, 시간에 따른 세포의 민감도에 미치는 영향을 유세포 분석을 통하여 나타낸 그래프(위) 및 유세포 분석 결과를 오차값과 함께 세로막대형으로 나타낸 그래프(아래)이다.

도 7은 TSPYL5의 발현억제가 감마방사선에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향을 콜로니 형성 분석(colony forming assay)을 이용하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 TSPYL5의 발현억제로 단백질의 발현에 미치는 영향을 특수단백질 발현 검사(western blot)를 이용하여 확인한 그림이다.

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Method for the enhancement of chemical sensitivity or radiosensitivity of cancer cells by inhibiting the expression of TSPYL5 <130> 9p-09-28 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> TSPYL5 <400> 1 Met Ser Gly Arg Ser Arg Gly Arg Lys Ser Ser Arg Ala Lys Asn Arg 1 5 10 15 Gly Lys Gly Arg Ala Lys Ala Arg Val Arg Pro Ala Pro Asp Asp Ala 20 25 30 Pro Arg Asp Pro Asp Pro Ser Gln Tyr Gln Ser Leu Gly Glu Asp Thr 35 40 45 Gln Ala Ala Gln Val Gln Ala Gly Ala Gly Trp Gly Gly Leu Glu Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ala Gln Leu Leu Arg Leu Gly Glu Glu Ala Ala Cys Arg 65 70 75 80 Leu Pro Leu Asp Cys Gly Leu Ala Leu Arg Ala Arg Ala Ala Gly Asp 85 90 95 His Gly Gln Ala Ala Ala Arg Pro Gly Pro Gly Lys Ala Ala Ser Leu 100 105 110 Ser Glu Arg Leu Ala Ala Asp Thr Val Phe Val Gly Thr Ala Gly Thr 115 120 125 Val Gly Arg Pro Lys Asn Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Arg Gly Pro 130 135 140 Ala Gly Lys Lys Ala Pro Glu Thr Cys Ser Thr Ala Gly Arg Gly Pro 145 150 155 160 Gln Val Ile Ala Gly Gly Arg Gln Lys Lys Gly Ala Ala Gly Glu Asn 165 170 175 Thr Ser Val Ser Ala Gly Glu Glu Lys Lys Glu Glu Arg Asp Ala Gly 180 185 190 Ser Gly Pro Pro Ala Thr Glu Gly Ser Met Asp Thr Leu Glu Asn Val 195 200 205 Gln Leu Lys Leu Glu Asn Met Asn Ala Gln Ala Asp Arg Ala Tyr Leu 210 215 220 Arg Leu Ser Arg Lys Phe Gly Gln Leu Arg Leu Gln His Leu Glu Arg 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Ile Gln Asn Ile Pro Gly Phe Trp Gly Gln Ala Phe 245 250 255 Gln Asn His Pro Gln Leu Ala Ser Phe Leu Asn Ser Gln Glu Lys Glu 260 265 270 Val Leu Ser Tyr Leu Asn Ser Leu Glu Val Glu Glu Leu Gly Leu Ala 275 280 285 Arg Leu Gly Tyr Lys Ile Lys Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Pro Tyr Phe 290 295 300 Gln Asn Lys Val Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Cys Gly Pro Ser Gly Gln 305 310 315 320 Val Val Ser Arg Ser Thr Pro Ile Gln Trp Leu Pro Gly His Asp Leu 325 330 335 Gln Ser Leu Ser Gln Gly Asn Pro Glu Asn Asn Arg Ser Phe Phe Gly 340 345 350 Trp Phe Ser Asn His Ser Ser Ile Glu Ser Asp Lys Ile Val Glu Ile 355 360 365 Ile Asn Glu Glu Leu Trp Pro Asn Pro Leu Gln Phe Tyr Leu Leu Ser 370 375 380 Glu Gly Ala Arg Val Glu Lys Gly Lys Glu Lys Glu Gly Arg Gln Gly 385 390 395 400 Pro Gly Lys Gln Pro Met Glu Thr Thr Gln Pro Gly Val Ser Gln Ser 405 410 415 Asn *** <210> 2 <211> 1254 <212> DNA <213> TSPYL5 <400> 2 atgagcggcc gaagtcgggg tcgaaagtcc tcccgcgcca aaaaccgggg caaaggccgc 60 gccaaagccc gagtccgccc tgctccggac gacgccccgc gcgacccgga cccttcacag 120 taccagagtc tcggggaaga cacccaggcg gcacaggtgc aggctggcgc ggggtggggt 180 ggcctggaag ccgctgcgtc cgcgcagctc ctccggctcg gggaggaggc cgcctgccgg 240 ctccccctgg actgtggcct cgcgctgcgg gcccgagctg cgggggacca cgggcaggcc 300 gcggccaggc ccggcccggg gaaggccgca tctctctcgg agcgcctggc cgcagacact 360 gtcttcgtgg gaacagcggg aaccgtggga aggccgaaaa atgccccccg cgttggaaac 420 cggcgtggcc ctgccgggaa gaaggcccca gaaacctgta gcaccgcggg gagggggcct 480 caggtcatag ctggtgggag gcagaagaaa ggggcggcag gggagaatac ctcggtgtca 540 gctggggagg aaaagaagga agagagggat gcagggtcgg ggcccccagc gacggaaggc 600 agcatggata cgctggagaa cgtgcagctg aagctggaga acatgaacgc ccaggcggac 660 agggcctacc ttcggctctc caggaagttt gggcagttgc gactgcagca cttggagcgc 720 aggaaccacc tcatccaaaa tatcccgggc ttctgggggc aagcatttca gaaccatccc 780 cagctagcat cctttctgaa tagccaagag aaagaggtac tgagctactt aaacagcttg 840 gaagtggaag agctcggcct tgccagattg ggctacaaaa tcaagttcta cttcgatcgc 900 aacccgtatt tccaaaataa ggtgctcatc aaggaatatg ggtgtggtcc ttctggccag 960 gtggtgtctc gttctactcc aatccagtgg ctcccagggc atgatctcca gtccctaagc 1020 cagggaaacc cagaaaacaa ccgtagtttc tttgggtggt tttcaaacca cagctccatt 1080 gagtctgaca agattgtgga gataatcaac gaagaattgt ggcccaatcc cttgcagttc 1140 taccttttga gtgaaggggc tcgtgtagag aaaggaaagg aaaaagaagg caggcaaggt 1200 ccaggaaagc agccaatgga gactactcag cctggggtga gccaatccaa ctga 1254 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPYL5 EcoR1/forward primer <400> 3 ccggaattca tgagcggccg aagtcggggt 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPYL5 EcoR1/reverse primer <400> 4 ccggaattct cagttggatt ggctcacccc 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPYL5 forward primer <400> 5 ttagaaaata ggtgatgggg gata 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPYL5 reverse primer <400> 6 aaatactacc atttcatctc ttcc 24 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSPYL5 sequencing primer <400> 7 ggtggtgatg gttttta 17 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131713(C1) <400> 8 accacaccca uauuccuuga ugagc 25 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131713(C1) <400> 9 gcucaucaag gaauaugggu guggu 25 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131714(C2) <400> 10 aaagguagaa cugcaaggga uuggg 25 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131714(C2) <400> 11 cccaaucccu ugcaguucua ccuuu 25 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131715(C3) <400> 12 uucuucugcc ucccaccagc uauga 25 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSS131715(C3) <400> 13 ucauagcugg ugggaggcag aagaa 25 <210> 14 <211> 117 <212> DNA <213> TSPYL5 (-280 ~ -161nt, y: CpG site) <220> <221> variation <222> (50) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (65) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (81) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (90) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (92) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (94) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <400> 14 gtttagttta gaaaataggt gatgggggat aggtggtgat ggtttttagy gttgttttgt 60 ttaaygagat tttgagagta ygatgagtty gygyggaaga gatgaaatgg tagtatt 117 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> TSPYL5 sequence to analyze <220> <221> variation <222> (2) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (17) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (33) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (42) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (44) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <220> <221> variation <222> (46) <223> y is methylated position in H460 and/or A549 <400> 15 gygttgtttt gtttaaygag attttgagag taygatgagt tygygygga 49

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 함유하는 항암보조제.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 항암보조제는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 것을 특징으로 하는 항암보조제.
제 4항에 있어서, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 하는 항암보조제.
제 4항에 있어서, 상기 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암보조제.
제 4항에 있어서, 상기 방사선은 감마방사선인 것을 특징으로 하는 항암보조제.
삭제
1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TSPYL5 유전자의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TSPYL5 유전자의 메틸화 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)의 TSPYL5 유전자의 메틸화 정도는 PCR(polymerase chain reaction), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩(chip), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 3)의 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 3)의 방사선은 감마방사선인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
1) TSPYL5 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TSPYL5 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 단계 3)의 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate, MMS) 및 하이드로겐퍼옥사이드(Hydrogen peroxide, H₂O₂)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 단계 3)의 방사선은 감마 방사선인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.