KR101492435B1 - ＨＩＦ­１α ｓｉＲＮＡ를 유효성분으로 함유하는 ＴＳＬＰ에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HIF-1α 유전자의 siRNA, 안티센스, shRNA, 또는 HIF-1α에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 JNK/ERK의 활성화로 인한 HIF-1α 의존적 TSLP 발현이라는 새로운 신호경로를 차단하여 TSLP 매개되는 염증성질환, 또는 알레르기질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

ＨＩＦ­１α ｓｉＲＮＡ를 유효성분으로 함유하는 ＴＳＬＰ에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING TSLP-MEDIATED DISEASES COMPRISING siRNA AGAINST HIF-1α AS AN ESSENTIAL COMPONENT}

본 발명은 HIF-1α siRNA를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 HIF-1α가 TSLP 단백질 발현을 조절하는 인자임을 확인하고 HIF-1α 유전자를 표적화하는 작은간섭 RNA(siRNA)을 함유하는, TSLP에 의해 매개되는 염증질환 또는 알레르기질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

최근 오존층의 손상과 기후변화로 인해 자외선에 대한 경각심이 더욱 증가되고 있는 추세이다. 자외선은 태양으로부터 방출되는 전자기파 스펙트럼에서 보이지 않는 영역으로 파장에 따라 A, B 그리고 C로 구별된다. 이중 파장이 가장 짧은 C는 오존층에서 흡수되며, A와 B는 각 320∼400, 280∼320nm 파장대로 대기층을 투과하여 지구상의 생명체에 영향을 미친다.

사람의 피부는 지속적으로 자외선에 노출이 되기 때문에 자외선은 환경적 요소로써 위험성이 더욱 부각되고 있다. 피부는 이러한 외부의 유해한 요소들로부터 신체를 보호하는 첫 번째 방어벽 역할을 한다 (비특허문헌 1). 그렇기 때문에 피부각질세포는 면역세포로써의 기능을 갖는다. 따라서, 알레르겐 (allergen)의 접촉과 자외선 노출과 같은 외부 유해요소부터 유도되는 세포내 반응을 조절하고 개시함에 있어서 피부각질세포의 중요성은 더욱 높이 평가되고 있다. 자외선은 피부 세포에서 DNA의 화학적 구조의 변화와 산화적 스트레스를 일으키며 (비특허문헌 2,3), 세포손상을 비롯해 피부노화 (비특허문헌 4)와 피부암 (비특허문헌 5)을 일으키는 주범으로 많은 연구가 진행되어왔다. 특히, 자외선으로부터 유도된 다양한 사이토카인 (cytokine)들은 세포내 면역학적으로 염증성 반응을 일으키는 주된 매개체로써 피부에 그 이상의 손상을 초래한다 (비특허문헌 6).

흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)은 DC cell을 활성화 (activation) 시킴으로써 (비특허문헌 7) Th2 면역 반응 (Th2 immune response)을 야기하는 초기에 반응하는 사이토카인이다. TSLP는 면역에 관련된 질병에서 두드러지게 발현되어서 면역세포를 이용한 연구가 많이 진행되었고 (비특허문헌 8), 면역성 질병의 진행과 발달에 중요한 역할을 한다는 내용이 밝혀졌다 (비특허문헌 10). 게다가, 최근에는 암 (cancer) 진행에도 중요한 연관성이 있다는 연구결과들이 보고된바 있다 (비특허문헌 11). 일부 연구에선 각질세포에서 TSLP 발현에 관한 연구로는 TLRs 리간드 (TLRs ligand)나 바이러스성 감염과 같은 외부 알레르겐 (allergen)들이 TLR 경로를 통해서 TSLP를 유도함이 알려져 있고, 인간 기도 상피 세포주 (human airway epithelial cell line), BEAS-2B에서는 파파인 (papain)이 부분적으로 PAR-2 경로를 통해 TSLP의 발현을 증가시킨다는 연구가 보고되었지만 (비특허문헌 12), TSLP의 분비의 활성을 유도하는 인자는 아직 명백히 밝혀지지 않았다. 알레르기 질환 (allergic disease)의 발병과 TSLP에 의해 매개되는 질병의 치료와 예방을 위해서는 TSLP의 발현에 관한 조절인자를 찾는 것은 매우 중요하다고 할 것이다. 또한 자외선은 피부에 지속적 자극을 줄 수 있는 자연적 요소로써 세포내 많은 신호전달 분자들을 교란시키고 다양한 Th1 type의 사이토카인을 유도한다고 알려져 있으나, Th2 type의 사이토카인인 TSLP의 발현과의 관계는 알려진 바가 없다.

본 발명의 배경이 되는 기술로, 대한민국 등록특허 제10-1114506호 (2012.03.14)에 빈랑 열수 추출물 및 정향수피 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 TSLP 저해능에 의한 아토피 피부염 개선능을 가지는 한방 조성물이 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2012-0081936호 (2012.07.20)에 Hif1a의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 항암 조성물에 대해 기재되어 있다. 그러나, HIF-1α에 의한 TSLP 발현 조절 및 이를 이용한 아토피와 같은 피부염증질환을 포함한 TSLP에 의해 매개되는 질환 치료제에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1114506호 (2012.03.14) 대한민국 공개특허 제10-2012-0081936호 (2012.07.20)

Nickoloff BJ, Naidu Y, Perturbation of epidermal barrier function correlates with initiation of cytokine cascade in human skin. (1994)J Am Acad Dermatol 30:535-46. Gilchrest and yaar, Ageing and photoageing of the skin: observations at the cellular and molecular level.(1992) 41:25-30 Scharffetter-kochanek et al.,UV-induced reactive oxygen species in photo carcinogenesis and photoagingBiol Chem. (1997) Nov;378(11):1247-57. Fisher GJ, Kang S, Vanrani J et al.,Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. (2002) Arch Dermatol 138:1462-70 G.J. Fisher, S.C. Datta, H.S. Talwar, Z.Q. Wang, J. Varani, S. Kang, J.J. Voorhees, Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism, Nature 379 (1996) 335-339. Seiji Kondo, Takeshi Kono et al., IL-8 gene expression and production in human keratinocytes and their modulation by UVB.( 1993) J Invest Dermatol 101:690-694. V. Soumelis, P.A. Reche, H. Kanzler, W. Yuan, G. Edward, B. Homey, M. Gilliet, S. Ho, S. Antonenko, A. Lauerma, K. Smith, D. Gorman, S. Zurawski, J. Abrams, S. Menon, T. McClanahan, R. de Waal-Malefyt Rd, F. Bazan, R.A. Kastelein, Y.J. Liu, Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP, Nat Immunol 3 (2002) 673-680. J.N. Barker, R.S. Mitra, C.E. Griffiths, V.M. Dixit, B.J. Nickoloff, Keratinocytes as initiators of inflammation, Lancet 337 (1991) 211-214. Y.J. Liu, Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation, J Exp Med 203 (2006) 269-273. Y.H. Wang, Y.J. Liu, Thymic stromal lymphopoietin, OX40-ligand, and interleukin-25 in allergic responses, Clin Exp Allergy 39 (2009) 798-806. Purevdorj B. Olkhanud, Yrina Rochman et al., Thymic stromal lymphopoietin is a key mediator of breast cancer progression.(2011) 186:5656-5662. Hideaki Kouzaki, Scott M O'Grady,et al., Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.The Journal of Immunology (2009) 183:2: 1427-1434. Briot A, Lacroix M, Robin A, Steinhoff M, Deraison C, Hovnanian A Par2 inactivation inhibits early production of TSLP, but not cutaneous inflammation, in Netherton syndrome adult mouse model.J Invest Dermatol. 2010 Dec;130(12):2736-42. Rezvani HR, Dedieu S, North S, Belloc F, Rossignol R, Letellier T, de Verneuil H, TaA, Mazurier F. Hypoxia-inducible factor-1alpha, a key factor in the keratinocyte response to UVB exposure.J Biol Chem. 2007 Jun 1;282(22):16413-22 DMA, Michaud MD, Richard DE. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators.Int J Biochem Cell Biol. 2005 Mar;37(3):535-40. Review

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점 등을 해결하기 위한 것으로, 본 발명자들은 피부각질세포를 이용하여 자외선에 의해 TSLP의 발현 양상을 평가하고 TSLP 프로모터 분석을 통해 TSLP의 발현을 증가시키는 전사조절인자를 선별하고 그에 따른 세포내 신호전달경로를 밝혀내고자 하였다.

그 결과 본 발명자는 HIF-1α가 TSLP 프로모터에 결합하여 UVB에 의한 TSLP 발현을 조절하는 것을 확인하였고, JNK/ERK의 활성화로 인한 HIF-1α 의존적 TSLP 발현이라는 신호전달 경로를 규명하였고, 이러한 신호전달 기전이 UVB에 의한 피부염증반응에 중요한 기전 중 하나임을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명은 JNK/ERK의 활성화로 인한 HIF-1α 의존적 TSLP 발현을 억제할 수 있는 HIF-1α의 발현을 저해하는 siRNA, 또는 항체를 포함하는 TSLP 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 신호전달 활성화로 인해 유도되는 피부염증반응을 억제하는, 아토피를 포함하는 피부염증질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 TSLP 조절제로 선별된 HIF-1α 발현 증가를 계측함으로써 자외선에 의한 피부 염증성질환 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 HIF-1α 유전자의 siRNA, 안티센스, shRNA, 또는 HIF-1α에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 JNK 억제제, ERK 억제제 또는 p38 억제제를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 (i) HIF-1α 유전자의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적인 서열, (iv) HIF-1α 유전자로부터 발현되는 단백질, 또는 (v) 그 단백질에 특이적인 결합제를 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 염증성질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 1) HIF-1a의 전사 조절에 관여하는 전사인자를 찾는 단계; 2) 상기 전사인자를 조절하는 물질을 선발(screening)하는 단계; 및 3) 상기 물질이 HIF-1a 유전자의 발현을 조절하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 TSLP 매개되는 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명은 HIF-1α 유전자의 siRNA, 안티센스, shRNA, 또는 HIF-1α에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

본 발명에서 제시하는 siRNA는 표적 유전자의 mRNA 절단을 통해 RNA 간섭 현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 제공하는 HIF-1α 작은간섭 RNA(siRNA)는 이중가닥 siRNA로서 HIF-1α의 상보적인 mRNA에 결합하여 발현을 억제하는 것이다. HIF-1α 유전자는 TSLP 발현을 증가시키는 전사인자로서 HIF-1α 작은간섭 RNA(siRNA)에 의해 TSLP로 매개되는 질환 치료효과를 증진시키는 화학적 조성물로서 제공된다.

본 발명의 siRNA의 경우 생체내 핵산 분해효소에 의한 기능상실을 막기 위해 화학적으로 변형된 siRNA를 포함하는 것으로 해석된다.

본 발명에 있어서, 상기 HIF-1α 유전자는 이에 한정되는 것은 아니나, 진 뱅크 등록번호 NM_001530(서열번호 1 및 서열번호 2) 및 진 뱅크 등록번호 NM_024359를 이용할 수 있다.

또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 30 염기이다.

siRNA 말단 구조는 HIF-1α 유전자 등의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 상기 siRNA은 서열번호 3의 염기서열을 갖는다. 본 발명에 따르면, UVB가 조사된 HaCaT 세포주에서 HIF-1α-siRNA를 처리함에 따라 TSLP mRNA가 발현이 감소됨을 확인하였다 (도 7 참조).

또한, 본 발명의 siRNA는 재조합 바이러스 벡터로부터 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 siRNA을 암호화하는 서열 및 siRNA 서열을 발현하는데 적합한 임의의 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스프로모터가 포함된다. 당 분야의 숙련가라면 다른 적합한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함할 수 있다.

발현될 siRNA 분자에 대한 암호화 서열을 수용할 수 있는 어떠한 바이러스 벡터도 사용할 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스(AV), 아데노바이러스-수반 바이러스(AAV), 레트로바이러스(예: 렌티바이러스(LV), 라브도바이러스, 쥐 백혈병바이러스), 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 있다. 또한, 바이러스 벡터의 친화성은, 다른 바이러스의 외피 단백질 또는 기타 표면 항원으로 벡터를 가성형태화시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 소수포구내염 바이러스(VSV), 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스, 모콜라 바이러스 등의 표면 단백질로 가성형태화시킬 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터, siRNA을 발현시키기 위해 핵산 서열을 벡터에 삽입하는 방법 및 목적하는 세포에 바이러스 벡터를 전달하는 방법의 선택은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들을 참조한다[참조문헌: Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis MA(1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; and Anderson WF (1998Nature 392: 25-30] .

본 발명에 있어, 항체는 본원발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 이용하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 상기 단백질에 결합하는 한 특별히 제한은 없으며, 폴리클론 항체, 단일클론항체 외에 인간 항체, 유전자 재조합에 의한 인간화 항체, 또한 그 항체 단편이나 변형된 항체도 포함된다.

본 발명에 있어, TSLP 매개되는 질환은 염증성질환, 알레르기질환, 또는 암으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나,바람직하게 상기 질환은 자외선에 의한 피부 염증성질환 또는 아토피성 피부염일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 JNK 억제제, ERK 억제제 또는 p38 억제제를 함유하는 TSLP에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 있어 JNK 억제제는 SP600125이고, ERK 억제제는 U0126, 또는 PD-98059이고, p38 억제제는 SB239063일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 TSLP 프로모터에 결합하여 TSLP 발현을 조절하는 HIF-1α를 발굴하고, 이를 근거로 HIF-1α의 발현 증가를 TSLP로 매개되는 질환 진단용 키트 내지 DNA 칩, 단백질 칩 등에서의 소재로 이용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명은 HIF-1α와 반응하는 하나 이상의 물질 및 반응 생성물 검출용 시약을 포함하는 피부 염증성질환 진단용 키트 및 진단방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 예를 들어, HIF-1α와 반응하는 하나 이상의 물질은 HIF-1α의 RNA 또는 DNA에 상보적인 RNA 또는 DNA 및 HIF-1α 단백질에 결합하는 항체일 수 있고, 반응 생성물 검출용 시약은 핵산 또는 단백질 표지 및 발색시약일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 의한 진단용 키트 또는 진단 마커를 검출하는 방법은 HIF-1α 유전자나 그의 단편 또는 그의 상보적인 서열과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 진단하는 원리를 이용한다. 상기 HIF-1α 유전자 등과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이(in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 즉 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 써던블로팅(Southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blooting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 또는 저발현된 상태인지 조사하면 TSLP 매개되는 질환 발생 여부를 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 HIF-1α 유전자를 포함하는 TSLP 매개되는 질환 치료제 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 TSLP 매개되는 질환에서 관찰되는 HIF-1α를 발굴하고, 이를 근거로 HIF-1α의 발현 증가를 확인하여 TSLP 매개되는 질환 치료제 스크리닝에 이용할 수 있다.

보다 스크리닝 방법은 구체적으로, 1) HIF-1α의 전사 조절에 관여하는 전사인자를 찾는 단계; 2) 상기 전사인자를 조절하는 물질을 선발(screening)하는 단계; 및 3) 상기 물질이 HIF-1α 유전자의 발현을 조절하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계로 구성된 HIF-1α 활성 조절제(활성 억제제 혹은 증가제)를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법에서 HIF-1α 활성 조절 후보물질이 HIF-1α 유전자의 발현 또는 단백질 활성을 억제 혹은 증가하는지를 결정하는 단계에서 RNA-RNA, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-단백질, RNA-화합물, DNA-단백질, DNA-화합물, 단백질-단백질 또는 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 JNK/ERK의 활성화로 인한 HIF-1α 의존적 TSLP 발현이라는 새로운 신호경로를 차단할 수 있는 HIF-1α의 발현을 저해하는 siRNA, 또는 항체를 이용하여 TSLP 매개되는 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 자외선에 의한 피부 염증성 질환 및 난치성 질환인 아토피성 피부염을 효과적으로 치료할 수 있다.

나아가, 본 발명에 의하면, TSLP에 의해 매개되는 질환의 진단에 상기 신호 전달에 중심에 있는 HIF-1α를 진단 마커로 사용할 수 있다.

도 1은 3차원 인공 피부 모델을 나타낸 도면이다.
도 2는 인간 유래 각질세포에서의 자외선에 의한 TSLP 발현 유도를 보인 도면이다.
도 3은 인간 3차원 피부모델에서의 자외선에 의한 TSLP 발현 유도를 보인 도면이다.
도 4는 인간 유래 각질세포에서 자외선에 의한 HIF-1α 발현을 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 인간 유래 각질 세포에서 JNK 와 Erk 1/2의 인산화(phosphorylation)가 UVB 조사에 의한 HIF-1α 발현을 매개하는 것을 보여주는 도면이다.
도 6은 HIF-1α 결합부위를 포함하는 TSLP 프로모터의 개략적 도면이다.
도 7은 인간 유래 각질 세포에서 HIF-1α에 의한 TSLP 발현 조절을 보여주는 도면이다.
도 8은 인간 유래 각질 세포에서 HIF-1α가 TSLP 프로모터에 결합하여 TSLP 발현을 조절하는 것을 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

방법

1. 세포배양

인간 유래 피부각질세포주, HaCaT 세포를 cell lines service(CLS; Cell lines Service, Eppelheim, Germany)에서 얻어 10% FBS와 penicillin 100 IU/ml, and streptomycin 100 μg/ml(GIBCO)를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; HyClone, Logan, UT, USA)로 5% CO₂가 포함된 37℃ 배양기에서 키웠다.

2. 3차원 인공피부모델, EpiDerm ™ models ( EPI -200)

EpiDerm™ models(EPI-200), 3차원 인공피부모델은 MatTek Corporation (Ashland, MA, USA)로부터 구입하였다. 3차원 인공피부모델, HSEMs는 인간 정상피부조직과 유사하게 기저층 (basal), 유극층 (spinous), 과립층 (granular)과 각질층 (cornified layer)을 포함하여 여러 층 구조로 구성되어있다. HSEMs는 assay medium를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

3. 자외선 조사 (UV Irradiation)

세포는 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척 (washing)하여 UVB 범위 (280∼320nm)를 방출하는 자외선 B램프를 이용하여 자외선에 노출하였다. 자외선에 노출 후, FBS가 없는 배양배지를 넣어주고 목표하는 시간까지 배양하였다. 대조군 세포는 자외선에 노출 없이 모든 과정을 동일하게 수행하였다.

4. 화학 시약 ( Chemical reagents )

각 키나제 신호전달 (Kinase pathway)의 억제를 위해 JNK의 억제제로써 SP600125 (calbichem), ERK의 억제제로써 U0126 (Santa Cruz Biotechnology), p38의 억제제로써 SB239063 (calbichem)이 사용되었다.

5. DNA 구조물 및 siRNA 트랜스펙션 ( DNA constructs and siRNA transfection )

인간 HIF-1α DNA 구조물을 만들기 위해 wild HIF-1α를 주형으로 degradation의 target이 되는 아미노산 서열을 P402A, P564A로 치환하는 돌연변이 DNA 단편 (mutant DNA fragment)을 다음의 프라이머 (primer)로 증폭하여 pcDNA3/HIF-1α P402A, P564A를 만들었다. primers : sense; 5’-GCAGATCTATGCCGACGG TGGAGGAGC-3’, antisense; 5’-GCGAATTCGTATTTCCCCTGAAGGCTC-3’. HIF-1α 발현을 억제하기 위하여 HIF-1α를 위한 작은 간섭 RNA (siRNA)를 합성하였다. HIF-1α siRNA 서열 : ccuaucccaauggaugaug(dtdt)(서열번호 3). 대조군으로는 scrambled siRNA를 사용하였다. siRNA를 처리하기 위해 6 well plate에 1x10⁵ HaCaT 세포를 배양 후 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 20 nM의 siRNA를 transfection 시킨다. 세포는 실험에 이용되기 전 48시간동안 안정화 되었고, siRNA에 의한 gene-silencing 효과는 PCR을 이용하여 HIF-1α mRNA 발현량을 확인하였다.

6. 반정량 PCR ( Semiquintitative PCR )

피부각질세포에 자외선에 조사 후 FBS가 없는 배양배지를 넣어 목표하는 시간까지 배양하였다. TRIzol Reagent를 이용하여 제조사의 방법에 따라 RNA를 추출하였다. RNA 1ug을 이용하여 cDNA를 합성하였고, 다음 primer를 이용해 RT-PCR을 수행하였다. TSLP: sense 5’-TAGCAATCG GCCACATTGCCT-3’, antisense 5’-GAAGCGACGCCACAATCCTTG-3’, HIF-1α: sence 5'-GATTTTGGC AGCAACGACAC-3', antisense 5'-TGAATCTGGGGCATGGTAAA-3', β-actin: sense 5′-ACAGGAAGTCCC TTGCCATC-3′; antisense 5′-AGGGAGACCAAAAGCCTTCA-3′. PCR은 MyCycler^TM Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.

7. 웨스턴 블러팅 ( Western blotting)

세포를 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1% NP40, 0.5% sodium deoxychlolate, 10 mM glycerophosphate, 0.1 mM orthovanadate, protease inhibitor가 포함된 lysis buffer로 30분간 lysis시킨 후 13000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 BCA method를 이용해 정량하여 시료 당 동일한 단백질량을 10∼12% SDS-PAGE로 전기영동 하여 분리한 후 PVDF membrane으로 이동시킨다. Membrane은 5% skim milk로 blocking 시킨 후 HIF-1α, TSLP, MAPKs, Lamin A/C, α-tubulin 과 β-actin specific antibody로 blotting 후 ECL kit로 검출하였다.

8. ELISA

세포를 UVB에 노출한 후 FBS가 없는 배양배지로 24시간 배양한 후 배양배지를 모아 1500 rpm에서 7분간 원심 분리한 후 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. 배양배지에 분비된 TSLP의 염역반응은 ELISA kits (DuoSet; R&D System, Minneapolis, MN)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정되었다. 96 well plate에 TSLP capture 항체로 16시간 코팅한 후, plate를 3번 씻어내고 blocking solution을 이용하여 blocking한다. 1시간 후, washing buffer로 plate를 3번 씻어내고 TSLP recombinant를 이용하여 농도별 standard를 만들어 standard와 시료를 각 well에 넣고 2시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후, 3회 plate를 씻어내고 TSLP detection 항체를 넣어 2시간 반응시킨다. 그 후 plate를 3회 씻어내고 HRP가 붙은 항체를 넣어주고 20분간 반응시킨다. 그 다음, plate를 3회 씻어준 후 TMB solution을 넣어주고 20분간 반응 시킨 후, stop solution을 넣어주고 ELISA reader기로 흡광도를 읽었다.

9. 면역조직화학법 ( Immunohistochemistry )

3차원 인공피부모델을 UVB에 노출한 다음 24시간 후에 4% paraformaldehyde으로 고정시킨 후 파라핀 블록을 만들었다. 블록 내 조직을 4 um의 두께로 section 하고 탈 파라핀 한 뒤 탈수 과정 후 두 번 세척하였다. endogenous peroxidase에 의한 nonspecific background staining을 줄이기 위해 슬라이드를 10분간 Hydrogen Peroxide로 반응시킨 후 4 회 세척하였다. primary TSLP 항체를 이용하여 반응 후 4 회 세척하였다. 그 후, Primary Antibody Enhancer를 이용하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 4 회 세척하였다. HRP polymer로 30분간 상온에서 반응시킨 후 4 회 세척 후 hematoxylin으로 반응시킨 후 증류수로 4 회 세척한 후 counterstaining한다.

10. 루시페아제 분석 ( Luciferase assay )

TSLP promoter(-2056/-123) construct는 TSLP 유전자의 시작코돈으로부터 upstream -2kb 까지의 서열을 포함하였다. 인간 게놈 DNA를 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하여 증폭시킨 후 pGL3 벡터를 이용하여 클로닝 (cloning)을 하였다. primers: 5’-AGTGGTACCACTCTCTGGCCCTACAG CAA-3’(forward, KpnⅠsite was underlined) and 5’-AGTAAGCTTCCACAGGAAGCCCTTATTCA -3’(reverse, HindⅢ site was underlined). PCR로 DNA 절편을 증폭시킨 후 제한효소 KpnⅠ과 HindⅢ로 자르고 pGL3.0 luciferase reporter vector (Promega, Madison, WI)와 ligation 한다. cloning 된 DNA는 서열분석으로 검증하였다. HaCaT 세포(인간 유래 각질 세포)는 6 well plate 에 배양 후 TSLP/pGL3-Luc plasmid와 control vector pRL-TK(Promega)를 Lipofectamine 2000 transfection regent(Invitrogen)를 이용하여 동시에 트랜스펙션 (transfection)시켰다. pRL-TK의 발현은 transfection 효율을 보정하기 위해 internal control로써 사용되었다. Transfection 후 5시간 경과 후 세포는 배양배지로 교체 한 후 16시간 동안 안정화시킨 뒤, UVB를 조사하였다. 세포는 PBS로 2회 씻어낸 후 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하고 luciferase assay reagent를 넣고 luminometer로 luciferase activity를 측정하였다.

실시예 1. 인간 유래 각질세포에서 자외선에 의한 TSLP 발현 유도

인간 유래 각질 세포 HaCaT에서 UVB가 TSLP의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해, UVB 조사에 따른 TSLP 발현량을 조사하였다. TSLP mRNA와 단백질 발현량의 확인은 각각 RT-PCR, western blot 그리고 ELISA를 이용하여 수행되었다. TSLP mRNA 발현량은 UVB 조사량에 따라 증가하였으며, 100mJ/cm² 조사량부터 1.5배 이상 증가하는 것을 확인하였다(도 2의 a). 따라서, 이후 실험에 사용될 UVB 조사량을 결정하기 위해, cell viability assay를 수행하였고, 결과를 바탕으로 세포에 viability 손상이 10% 미만이면서 TSLP의 발현량이 1.5배 이상 증가하는 100mJ/cm²로 UVB 조사량을 결정하였다. TSLP 단밸질의 세포내 발현이 증가하는 시간을 확인하기 위해, UVB 100mJ/cm²을 조사한 후 시간대별로 TSLP 단백질 발현량을 확인하였을 때, 24 시간 후에 의미 있게 증가함을 확인하였다(도 2의 b). ELISA 실험을 이용해 TSLP 단백질 분비량 또한 UVB 조사량에 따라 증가하였음을 검증하였다(도 2의 c).

실시예 2. 인간 3차원 피부모델에서 자외선에 의한 TSLP 발현 유도

실제 피부에서 UVB에 의해 TSLP 발현이 증가하는지를 조사하기 위해, 동물실험을 대신하여 인간 3차원 피부모델을 이용하여 실험을 수행하였다. 인간 3차원 피부모델은 정상 인간 각질세포로 기저층 (basal), 유극층 (spinous), 과립층 (granular) 및 각질층 (cornified layer)을 포함하여 분화된 조직으로 여러 층 구조로 구성되어있으며 정상 인간 표피와 유사하게 제작되었다. 인간 3차원 피부모델은 UVB 100mJ/cm²로 조사 후 24 시간 동안 배양하였으며, 이 조직을 이용하여 TSLP 발현량을 확인하기 위해 TSLP 항체를 이용하여 면역조직화학법 (immunohistochemistry)을 수행하였다. TSLP 발현은 UVB를 조사하지 않은 조직에 비해 UVB를 조사한 조직에서 증가하였다. 이 결과는 인간 각질세포에서 UVB가 TSLP 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다(도 3).

실시예 3. 각질 세포에서의 자외선에 의한 HIF -1α 축적 ( accumulation ) 유도

이전 실험에서 UVB에 의한 TSLP mRNA 발현이 증가한 것을 확인하였다. 따라서 UVB에 의한 TSLP 발현 조절은 전사조절 단계를 통한 발현 조절이 추정된다. HIF-1α는 transcription factor로서 UVB에 의해 HIF-1α의 단백질 량이 증가한다는 것은 잘 알려져 있고 (비특허문헌 14), 각질 세포에서 UVB에 의해 발현량이 증가하는 HIF-1α를 확인하였다. HIF-1α는 산소정상상태 (normoxia)에서 일정량이 발현되지만 곧 ubiquitination-mediated proteasome에 의해 분해되어지는 단백질로써 UVB에 의해 HIF-1α의 mRNA 발현량은 증가하지 않았지만(도 4의 a), 단백질 량은 UVB 조사 후 16 시간 이후에 차츰 증가하는 것이 확인 되었다(도 4의 b). 또한 UVB에 의해 증가된 HIF-1α는 핵으로 이동하여 transcription factor로써의 기능을 할 가능성을 확인하였다(도 4의 c).

실시예 4. 인간 각질 세포에서 JNK 와 Erk 1/2의 인산화 ( phosphorylation )에 의한 UVB 조사에 의한 HIF -1α 발현 매개

MAPKs는 인간각질세포에서 세포내 많은 신호전달 기전에 주된 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있으며 또한 UVB에 의해 활성화된다 (비특허문헌 13). 기존의 연구들에서 UVB에 의해 유도된 MAPK 활성이 HIF-1α 단백질의 축적에 연관되어 있음이 보고된바 있다. 기존의 연구에서와 같이 UVB 조사에 따른 HIF-1α 발현량에 MAPKs의 연관성을 확인하기 위해 MAPKs의 활성을 평가하였다. 이미 보고된 연구결과들과 일치하게 (비특허문헌 13) HaCaT 세포에서 UVB에 의해 Erk1/2, JNK 그리고 p38 MAPK의 인산화가 UVB 조사 후 2시간 내에 관찰되었다(도 5의 a). 특히 JNK 인산화는 UVB에 의해 2시간 내에 가장 많이 증가하였고, ERK 인산화와 p-38 인산화 또한 UVB에 의해 증가하였음이 확인되었다. 이들 MAPKs의 인산화가 HIF-1α의 발현에 관련이 있는지를 확인하기 위해, 각 MAPKs의 억제제를 이용하여 HIF-1α 발현을 조사하였다. HaCaT 세포는 UVB 조사 전에 MAPKs 각각의 억제제들로 전 처리 하였고, 각 inhibitor는 JNK의 inhibitor로써 SP600125, ERK의 inhibitor로써 U0126, p38의 inhibitor로써 SB239063이 사용되었다. 실험 결과 UVB에 의해 증가된 HIF-1α의 발현량은 SP600125와 U0126를 처리하였을 때 감소하였고, 이와 유사하게 UVB에 의해 증가된 TSLP 발현량 또한 SP600125와 U0126를 처리하였을 때 가장 많이 감소되었음이 확인 되었다(도 5의 b). 이 결과로 UVB에 의한 HIF-1α와 TSLP 발현증가에 JNK와 ERK가 연관이 되었음을 확인하였다.

실시예 5. HIF -1α에 의한 HaCaT 세포에서의 UVB 에 의한 TSLP 발현 조절

HIF1 complexes(HIF1α/β)는 VEGF를 포함하여 많은 표적 유전자 (target gene)의 HRE와 작용한다. 따라서 HIF-1α가 UVB에 의한 TSLP 발현조절에 관여하는지를 확인하기 위해, transcription factor binding sites prediction program(GeneCards)을 이용해 TSLP 프로모터 서열분석을 수행하였고, 서열분석결과 TSLP의 프로모터 부위에 HIF-1α 결합부위 (binding site)가 있음을 확인하였다 (도 6).

또한, HIF-1α의 TSLP 발현에 대한 직접적인 효과를 확인하기 위해 HIF-1α 과발현 벡터 (overexpression vector)를 이용하여 TSLP mRNA 발현량과 단백질 발현량을 조사하였다. HIF-1α 과발현 벡터를 트랜스펙션시킨 세포에서 벡터만을 형질전환시킨 세포에 비해 HIF-1α의 mRNA 발현량이 증가하였음을 RT-PCR을 이용해 확인하였고, 그에 따른 TSLP mRNA 발현량도 증가하였음이 확인 되었다(도 7의 a). TSLP 단백질 발현량을 확인하기 위해 동일하게 HIF-1α 과발현 벡터를 트랜스펙션시킨 세포에서 웨스턴 블럿 (western blot)을 수행한 결과 HIF-1α 과발현 벡터를 트랜스펙션시킨 세포에서 벡터만을 트랜스펙션시킨 세포에 비해 TSLP의 발현량이 증가하였다(도 7의 b). 또한, UVB에 의한 TSLP 발현에 HIF-1α의 역할을 확인하기 위해, siRNA를 이용한 HIF-1α 유전자 발현의 넉다운 (knockdown)을 진행하였다. HIF-1α의 발현을 감소시키기 위해 HIF-1α siRNA와 대조구 (control)로써 scrambled siRNA를 HaCaT 세포에 각각 transfection 시킨 후 24 시간 안정화 후 UVB를 조사하고 무혈청 배지 (serum free media)로 교체한 후 24 시간 후에 RNA를 추출하였다. HIF-1α와 TSLP 발현량의 확인은 RT-PCR을 이용하여 수행되었다. UVB에 의해 증가하였던 TSLP mRNA 발현량이 HIF-1α siRNA를 처리한 세포에서 대조구 수준 (control level)까지 감소하였음이 확인 되었다(도 7의 c). 이 결과는 UVB에 의한 TSLP 발현은 HIF-1α에 의해 조절되는 것을 확인하였다.

실시예 6. HIF -1α에 의한 TSLP 프로모터 결합에 의한 TSLP 의 발현 조절

UVB에 의한 TSLP 발현증가에 HIF-1α의 transcriptional activation이 관여하는지를 확인하기 위해, Luciferase assay를 이용하여 TSLP 프로모터 활성 (promoter activity)을 측정하였다. TSLP 프로모터는 앞서 설명하였듯이 TSLP upstream 2kb 내의 서열을 포함하고 있으며 HIF-1α가 결합할 수 있는 Hypoxia-response element(HRE)을 가지고 있다. 우선, UVB에 의해 TSLP 프로모터가 활성을 갖는지 확인 한 결과 UVB를 조사한 세포에서 UVB를 조사하지 않은 세포에 비해 TSLP 프로모터 활성이 약 3 배 증가하였음이 확인 되었고(도 8의 a), HIF-1α가 직접적으로 관여하는지 확인하기 위해 벡터와 HIF-1α 과발현 벡터를 각각 트랜스펙션시킨 세포에서 TSLP 프로모터 활성을 측정한 결과 HIF-1α 과발현 벡터를 트랜스펙션시킨 세포에서 벡터만 트랜스펙션시킨 세포에서보다 TSLP 프로모터 활성이 2 배정도 증가하였음을 확인 하였다(도 8의 b). 또한 HIF-1α가 TSLP 프로모터에 직접적으로 결합하는지를 확인하기 위해 ChIP assay를 수행하였다. 인간 각질세포에 HIF-1α의 단백질 발현량을 증가시키는 CoCl₂를 처리한 후 6시간 배양 후 HIF-1α 항체를 이용하여 크로마틴 복합체 (chromatin complex)를 면역침강 하였다. 면역 침강된 크로마틴 복합체 (chromatin complex)로부터 DNA를 추출한 후 TSLP 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, HIF-1α와 결합한 TSLP 프로모터 부위는 HIF-1α 항체에 의해 면역침강 되었고, PCR을 통해 TSLP 프로모터가 검출된 것이 확인되었다. 결과적으로 UVB에 의해 TSLP 발현증가는 HIF-1α의 발현이 TSLP 프로모터 조절에 관여함을 보여 준다.

TSLP의 발현이 알레르기 질환 (allergic disease) 및 염증성 질병의 발병에 직접적 영향을 가지고 있기 때문에 TSLP에 의해 매개되는 질병의 치료와 예방을 위해서는 TSLP의 발현에 관한 조절인자 찾는 것은 매우 중요하다고 할 것이다. 따라서 본 발명에서는 피부각질세포를 이용하여 자외선에 의해 Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)의 발현 양상을 평가하고 TSLP 프로모터 분석을 통해 TSLP의 발현을 증가시키는 전사조절인자를 선별하고 그에 따른 세포내 신호전달경로를 연구하여 TSLP 관련 질병의 치료법과 예방법을 연구하는데 기초를 마련하고자 하였다.

자외선은 피부에 지속적 자극을 줄 수 있는 자연적 요소로써 세포내 많은 신호전달 분자들을 교란시키고 염증성 질병을 초래하기 때문에 TSLP의 발현에 관련이 있을 가능성이 높다고 판단되었고, 본 발명을 통해, 인간 유래 각질 세포와 인간의 피부와 가장 유사한 인간 3차원 피부모델에 UVB를 조사하였을 때 UVB가 조사량과 시간에 따라 TSLP 발현을 유도함을 확인하였다.

인간 각질 세포에서 UVB에 의한 TSLP 발현증가에 관련된 세포내 신호전달 경로를 파악하기 위해 신호전달경로를 확인한 결과 UVB에 의해 MAPKs가 활성화되는 을 확인하였고, 각각의 억제제를 처리한 실험에서 이들 중 JNK 와 Erk1/2의 인산화가 UVB 조사에 의한 TSLP 발현을 매개한다는 것이 확인되었다. 또한 TSLP의 전사단계에서의 발현을 조절할 가능성이 있는 HIF-1α를 찾았으며 HIF-1α 발현의 증가가 UVB에 의해 활성화된 MAPKs에 의해 조절되는 것을 확인하였다. HIF-1α의 과발현 벡터와 siRNA를 이용하여 HIF-1α가 TSLP 발현 조절에 직접적 관련이 있음을 검증 하였고, 이는 TSLP 프로모터 활성 분석 (TSLP promoter activity assay)을 통해서 HIF-1α가 TSLP 프로모터의 활성을 조절한다는 결과를 얻었다.

지금까지 UVB에 의해 유도된 사이토카인들이 많이 보고가 되었지만, 본 발명을 통해 밝혀진 UVB에 의해 TSLP의 발현증가는 보고된 바 없었으며, 기존의 보고된 사이토카인들이 Th1 type의 사이토카인인 반면에 TSLP는 Th2 type의 염증반응을 일으키는 사이토카인으로써 UVB에 의한 새로운 효과를 확인하였다. 또한, 인간 각질세포를 이용하여 TSLP를 조절하는 몇몇 연구결과들이 보고되고 있지만, 본 발명에서는 TSLP를 조절하는 새로운 전사조절인자, HIF-1α와 이에 관여하는 MAPKs의 신호전달 경로를 밝힘으로써 UVB에 의한 TSLP의 발현조절 메카니즘을 제공하였다.

결과적으로 UVB에 노출된 피부각질세포에서 JNK/ERK → HIF-1α 의존적으로 TSLP가 발현됨을 규명하였고 이러한 신호전달 기전이 UVB에 의한 피부염증반응에 중요한 기전 중의 하나라는 것을 확인하고, TSLP에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료에 기여할 수 있게 되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING TSLP-MEDIATED DISEASES COMPRISING siRNA AGAINST HIF-1a AS AN ESSENTIAL COMPONENT <130> P11-121203-02 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2481 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta 600 tatgatacca 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gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt 2340 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt 2400 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga 2460 gctttggatc aagttaactg a 2481 <210> 2 <211> 826 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 2 Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu 1 5 10 15 Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys 20 25 30 Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His 35 40 45 Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile 50 55 60 Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile 65 70 75 80 Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile 100 105 110 Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr 115 120 125 Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met 130 135 140 Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu 145 150 155 160 Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr 165 170 175 Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu 180 185 190 His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro 195 200 205 Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys 210 215 220 Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys 225 230 235 240 Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp 245 250 255 Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr 275 280 285 Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln 290 295 300 Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val 325 330 335 Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe 340 345 350 Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp 355 360 365 Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser 370 375 380 Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn 405 410 415 Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn 420 425 430 Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu 435 440 445 Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser 450 455 460 Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro 465 470 475 480 Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp 485 490 495 Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu 500 505 510 Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val 515 520 525 Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr 530 535 540 Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser 565 570 575 Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser 580 585 590 Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln 595 600 605 Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu 610 615 620 Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala 625 630 635 640 Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser 645 650 655 Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala 660 665 670 Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro 675 680 685 Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu 690 695 700 Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg 705 710 715 720 Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr 725 730 735 Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp 740 745 750 Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln 755 760 765 Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly 770 775 780 Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys 785 790 795 800 Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn 820 825 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> HIF-1a siRNA <400> 3 ccuaucccaa uggaugaugd tdt 23

Claims (7)

1. HIF-1α 유전자의 siRNA, 안티센스, shRNA, 또는 HIF-1α에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 자외선에 의한 피부염증성 질환 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 siRNA은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것은 특징으로 하는 약제학적 조성물.
3. JNK 억제제, ERK 억제제 또는 p38 억제제를 유효성분으로 함유하는 흉선 기질 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)에 의해 매개되는 자외선에 의한 피부염증성 질환 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. (i) HIF-1α 유전자의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적인 서열, (iv) HIF-1α 유전자로부터 발현되는 단백질, 또는 (v) 그 단백질에 특이적인 결합제를 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부염증성 질환 또는 아토피성 피부염 진단용 키트.
7. 다음 단계를 포함하는 TSLP에 의해 매개되는 자외선에 의한 피부염증성 질환 또는 아토피성 피부염 치료제 스크리닝 방법:
   1) 자외선에 의해 HIF-1 발현이 증가된 세포 또는 인간 3차원 피부모델에 HIF-1 발현 억제 후보물질을 처리하는 단계;
   2) 상기 HIF-1 발현 억제 후보물질을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 HIF-1 발현을 측정하여 비교하는 단계; 및
   3) 상기 실험군의 HIF-1 발현 수준을 대조군에 비해 유의성 있게 감소시키는 후보물질을 TSLP에 의해 매개되는 자외선에 의한 피부염증성 질환 또는 아토피성 피부염 치료제로 선별하는 단계.

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