KR101099650B1

KR101099650B1 - 인테그린알파５를 이용한 항암제 또는 ｓｉｐ１／ｚｅｂ２ 저해제의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101099650B1
Application number: KR1020090057666A
Authority: KR
Inventors: 김세미; 강희영; 남은희; 최명숙; 유진산; 박영규
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-06-26
Publication date: 2011-12-29
Also published as: WO2010061997A1; US20120201838A1; US9562227B2; KR20100061296A

Abstract

본 발명은 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 프로모터와 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 사이의 상호 결합 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 암세포의 침윤과 관련된 것으로 각각 알려진 SIP1/ZEB2과 인테그린알파5 프로모터 사이의 직접적인 상호결합의 저해제를 항암제로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 암세포에서 과발현되는 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현을 감소시키는 항암제 또는 인테그린알파5의 프로모터에 결합하여 발현을 조절하는 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 인테그린알파5의 발현을 측정함으로써 간편하게 항암제를 스크리닝할 수 있는 바, 의약분야에 유용하게 응용될 수 있다.

SIP1/ZEB2, 인테그린알파5, 항암제, SIP1/ZEB2 저해제

Description

인테그린알파５를 이용한 항암제 또는 ＳＩＰ１／ＺＥＢ２ 저해제의 스크리닝 방법{Method for screening anticancer agent or SIP1/ZEB2 inhibitor using integrin α5}

본 발명은 인테그린알파5(human integrin alpha5)와 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2)를 이용한 항암제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

암에 대한 연구가 30년 이상 심도 있게 이루어진 현재에도 환경오염, 잘못된 식생활습관 등으로 인하여 암 발생률은 계속 증가하여 전 세계적으로 매년 1,000만 명이 넘는 환자가 발생하고 있으며, 세계보건기구(WHO)는 사망의 주요원인 중 하나로 암을 꼽고 있다.

새로운 암 치료법이 꾸준히 개발되고 있지만, 일반적인 암의 치료법으로는 수술과 방사선 또는 항암제 치료를 병행하는 것이다. 하지만, 일반적으로 항암제는 특정암에 작용하나 그 외 암에는 작용하지 않는 경향이 많고, 내성이 생기는 경 우가 많으므로, 암 치료 효과를 높이기 위해서는 다양한 신규 항암제의 개발이 필수적이며, 이에 맞추어 신규 항암제를 간편하게 스크리닝하는 방법의 개발 역시 요구된다.

신규 항암제 스크리닝을 위한 표적(target)을 검색하던 중, 본 발명자는 TMPRSS4(transmembrane protease, serine 4)가 과발현된 세포주의 경우 침윤능이 증가하고, 상기 TMPRSS4를 특이적인 siRNA(small interfering RNA)로 저해할 경우, 침윤능이 저하되어, TMPRSS4가 항암제 개발을 위한 표적이 될 수 있음을 밝힌 바 있다(Jung et al.,Oncogene, 27: 2635-2647, 2008, 대한민국 공개특허 제2007-0114970호). 또한, 종래 연구에서 TMPRSS4 과발현시 다양한 인자들이 과발현됨을 확인하였고, 이들 중 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2)와 인테그린5알파(human integrin alpha5)의 작용 및 역할에 초점을 맞추게 되었다.

SIP1/ZEB2 아연 핑거(Zinc finger) 핵인자(nuclear factor)인 δEF-1 계열(family)의 일원으로서, 발생과정 중 상피-중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition, EMT)에 관여하는데, 이는 SIP1/ZEB2가 E-카드헤린(E-cadherin)이나 데스모솜(desmosome)과 같은 간극연접(Gap-junction)을 이루는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 하향 조절함으로써 이루어지는 것으로 알려져 있다(Vandevalle et al, Nucleic Acids Res . 33(20): 6566-6578, 2005). 뿐만 아니라, SIP1/ZEB2는 암 의 전이를 촉진하는데, 상기 SIP1/ZEB2와 microRNA-200 계열 사이의 이중-음성 피드백 루프에 의해 상기 전이가 조절된다고 알려져 있다(Bracken et al.,Cancer Res . 68(19):7846-54, 2008).

δEF-1 계열의 두 멤버인 SIP1/ZEB2 및 ZEB1은 분리된 2개의 아연 핑거 클러스터(zinc finger cluster)를 가지고 있는데, 각각의 아연 핑거 클러스터는 E box(예를 들어, CACCT 서열)에 결합하는 것으로 알려져 있다. 또한, SIP1/ZEB2는 EMSA 분석(electrophoretic mobility shift assay) 결과, Xbra(Xenopus Brachyury), 인간 인테그린알파4(human integrin alpha4) 및 인간 E-카드헤린 유전자의 프로모터에 결합하는 것으로 보고된바 있다(Remacle et al. EMBO J. 18, 5073-5084, 1999). 나아가, SIP1/ZEB2 및 ZEB1은 중추신경계(central nervous system), 다양한 근육 세포 및 조혈 세포와 같은 정상적인 E-카드헤린-음성 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있다(Postigo and Dean, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97, 6391-6396, 2000). 특히, SIP1/ZEB2는 E-카드헤린 유전자의 프로모터에 결합하여 침윤억제역할을 하는 세포-세포 부착 분자인 E-카드헤린의 전사를 억제함으로써, 결과적으로 암세포 침윤을 유도하는 것으로 알려져 있다(Comijin et al. mol . Cell 7: 1267-1278, 2001). 한편, E-카드헤린의 전사를 억제하고 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도함으로써 결과적으로 암 침윤 및 전이를 유도하는 인자로서 SIP1/ZEB2 외에 SNAI1(snail ho㏖og 1), SNAI2(snail ho㏖og 2), TWIST(B-HLH DNA binding protein ) 및 E47 등이 알려져 있다(Peinado et al.,Nature Rev . Cancer 7: 415-428, 2007). 특히, 상기 인자들은 암의 종류에 따라 각각 다르게 발현된 다(Peinado et al., Nature Rev. Cancer 7: 415-428, 2007). SIP1/ZEB2는 주로 난소암, 위암, 췌장암, 및 편평세포암종(squamous cell carcinoma; SCC)에서 발현되는 반면, ZEB1은 대장암, 자궁암에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, 위암의 미만성 아형(diffuse subtype)에서는 TWIST 및 SNAI1의 발현 정도가 증가한 반면, 위암의 장 아형(intestinal subtype)에서는 SIP1/ZEB2가 증가됨이 보고된바 있다(Rosivatz et al., Am . J. Pathol . 161: 1881-1891, 2002). 이러한 결과들은 상피-중간엽 전이 및 전이 유도 인자들이 암 종류에 따라 각각 다른 조합을 이루어 각각 다른 역할을 함을 시사하였다. 하지만, SIP1/ZEB2의 대장암에서의 발현 및 역할에 대해 아직까지 알려진 바 없다.

한편, 인테그린알파5(integrin subunit alpha 5)는 알파쇄와 베타쇄로 구성된 인테그린의 알파 사슬 중의 하나로서, 세포외 도메인에서 번역 후 절단과정을 거쳐서 이황화결합으로 연결된 경쇄 및 중쇄를 형성한 후, 베타 1과 합쳐지고, 이후 파이브로넥틴(fibronectin) 수용체를 형성한다. 인테그린 계열(family)에는 18개의 알파쇄와 8개의 베타쇄의 패어링(pairing)에 의해 최소 25종 이상이 존재하는 것으로 알려져 있다(van der Flier and Sonnenberg, Cell Tissue Res . 305:285-298, 2001). 인테그린은 주로 세포외 기질과 결합하는 수용체로서 세포내 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 연결되어 있고, 또한 인테그린은 세포표면 매개 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 인테그린알파5베타1은 파이브로넥틴과 결합하는 것으로 알려져 있는데, 인테그린알파5는 간암(Yao et al., Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 77(5):382-384, 1997)과 흑색종(Mortarini et al., Cancer Res. 52(16):4499-4506, 1992)의 진행, 침윤 및 전이에 관여되어 있다고 알려져 있다. 인테그린알파5베타1은 약한 발암성의 대장암 세포주들에서보다 강한 발암성의 대장암 세포주들에서 더 높게 발현된다는 보고가 있는 반면(Gong et al., Cell Growth & Differentiation 8:83-90, 1997), 반대로, 인테그린알파5베타1의 발현이 대장암 발생시 종종 사라지고, 또한 인테그린알파5베타1이 발현하지 않는 대장암세포에 인테그린알파5베타1을 재발현(re-expression)시킨 경우, 인테그린알파5베타1에 의해 HER-2의 하향 조절이 유도됨으로써 인테그린알파5베타1(즉, 인테그린알파5)이 종양 억제 유사 활성(tumor suppressor-like activity)을 가지는 것으로 보고된바 있다(Kuwada and Li, ㏖. Biol. Cell 11:2485-2496, 2000; Kuwada et al., J. Biol . Chem . 280:19027-19035, 2005). 따라서, 대장암에서 인테그린 알파5(인테그린알파5)의 역할은 아직까지 불분명하다.

이에, 본 발명자들은 항암제 또는 SIP1/ZEB2 저해제의 스크리닝을 위한 표적물질을 찾던 중, SIP1/ZEB2와 인테그린알파5에 의해 암세포의 침윤이 증가하며, SIP1/ZEB2 과발현시 인테그린알파5가 과발현됨을 확인하고, 상기 인테그린알파5를 이용한 항암제 또는 SIP1/ZEB2 저해제의 스크리닝 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암세포의 침윤 능력에 중요한 역할을 하는 인테그린알파5(human integrin alpha5)를 이용한 항암제 또는 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 발현 세포주에 피검화합물을 처리한 후, 상기 세포주에서의 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현이 감소하였는지를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 또는 SIP1/ZEB2 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 암세포에서 과발현되는 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현을 감소시키는 항암제 또는 인테그린알파5의 프로모터에 결합하여 발현을 조절하는 SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 인테그린알파5의 발현을 측정함으로써 간편하게 항암제를 스크리닝할 수 있는 바, 의약분야에 유용하게 응용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2)를 발현하는 세포주를 배양하면서 SIP1/ZEB2의 발현을 유도하는 단계;

2) 상기 배양된 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

3) 상기 피검화합물이 처리된 세포주(실험군) 내의 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현량을 측정하는 단계; 및,

4) 대조군(미처리군)에 비하여 상기 실험군에서 발현량을 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) SIP1/ZEB2를 발현하는 세포주를 배양하면서 SIP1/ZEB2의 발현을 유도하는 단계;

2) 상기 형질전환된 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

3) 상기 피검화합물이 처리된 세포주(실험군) 내의 인테그린알파5의 발현량을 측정하는 단계; 및,

4) 상기 실험군에서 대조군(미처리군)에 비하여 발현량을 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 SIP1/ZEB2 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 SIP1/ZEB2를 발현하는 세포주는 인테그린알파5를 발현하는 것으로 알려진 동물 세포, 바람직하게는 SW480이다.

본 발명에 따른 일 실시예에서는 전체 길이의 SIP1/ZEB2를 코드하는 cDNA의 N-말단에 myc-tag을 추가한 후, 이를 벡터에 삽입하여 세포주에 형질전환하였다.

상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 세포주에 SIP1/ZEB2 도입시 인테그린알파5의 발현이 증가함을 보였으며, 상기 인테그린알파5의 발현 증가가 대장암 침윤 증가를 야기시킴을 확인하였다(도 1 참조). 따라서, SIP1/ZEB2가 발현이 유도되었을 때 인테그린알파5의 발현을 감소시키는 물질은 항암활성을 갖는다고 판단할 수 있다.

상기 발현 발현량 측정은 전사체의 양을 측정하는 방법 또는 단백질의 양을 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 전사체의 양을 측정하는 방법은 RT(Reverse transcriptase)-PCR을 수행하여, 상기 단백질의 양을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명자들은 SIP1/ZEB2 발현 저해에 따른 효과를 살펴보기 위하여, siRNA를 상위표적(예를 들면, TMPRSS4)에 의해 SIP1/ZEB2가 발현유도된 세포주(대한민국 공개특허 제2007-0114970호; Jung et al., Oncognen , 27:2635-2647, 2008)에 SIP1/ZEB2 특이적 siRNA를 도입한 결과, siRNA에 의해 SIP1/ZEB2의 발현이 현저하게 감소할 뿐만 아니라, 인테그린알파5의 발현도 유의적으로 감소하였다(도 1 참조). 또한, 그 결과 SIP1/ZEB2 siRNA 도입 세포주의 경우 대조군에 비하여 침윤 능력이 감소하였다(도 2 참조). 나아가, SIP1/ZEB2 도입에 따른 효과를 살펴보기 위하여, SIP1/ZEB2를 과발현하지 않는 세포주에 SIP1/ZEB2를 형질도입한 결과, SIP1/ZEB2의 발현 증가와 함께 인테그린알파5의 발현이 증가하였고(도 3 참조), 대조군 대비 암세포의 침윤이 증가하였다(도 4 참조).

종합적으로, SIP1/ZEB2가 암세포의 침윤 및 전이와 연관이 있음을 확인하였으며, 동시에 SIP1/ZEB2가 인테그린알파5의 발현을 유도함을 알 수 있었다.

인테그린알파5 활성 억제에 의한 효과를 살펴보기 위하여, SIP1/ZEB2 과발현 세포주에 항-인테그린알파5 항체를 처리한 결과, 세포신호전달효소인 ERK(extracelluar signal-regulated kinase)와 FAK(focal adhesion kinase)의 인산화가 유의적으로 감소하였고, 특히, 인테그린알파5의 활성억제에 의해 E-카드헤린(E-cadherin)의 발현이 증가하였다(도 5 참조). 또한, 항-인테그린알파5 항체 또는 RGD 펩타이드(인테그린 길항제) 첨가시, IgG(대조군) 및 RGE 펩타이드(음성 대조군)에 비하여 암세포의 침윤이 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

반대로, SIP1/ZEB2를 발현하지 않는 세포주에 인테그린알파5를 도입한 결과, 인테그린알파5가 과발현되면서 E-카드헤린(E-cadherin)이 감소하고, ERK와 FAK의 인산화가 증가하여 SIP1/ZEB2를 과발현한 대장암세포주와 동일한 특성을 나타내었다(도 7 참조). 한편, 인테그린알파5의 과발현에 의해 세포의 퍼짐이 증가하고, 라벨리포듐(lamellipodium)이 형성되며(도 8 참조), 암세포의 침윤이 증가함을 확인 할 수 있었다(도 9 참조).

상기 결과들로부터, SIP1/ZEB2 과발현시 인테그린알파5가 증가되며, 그 결과, 세포신호전달효소(ERK 및 FAK)의 인산화가 증가하고, E-카드헤린의 감소가 유도되어 암세포의 침윤이 야기되는 것으로 나타났다. 따라서, SIP1/ZEB2 과발현 세포에서 인테그린알파5의 발현을 억제하는 물질을 찾아낸다면, 상기 물질은 암세포의 침윤 및 전이를 억제할 수 있으므로, 항암제 또는 SIP1/ZEB2 저해제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히, 인테그린알파5에 의해 E-카드헤린의 감소가 유도될뿐만 아니라(도 7 참조), 인테그린알파5 활성억제에 의해 E-카드헤린의 증가가 유도됨은(도 5 참조), 대장암세포에서 인테그린알파5가 E-카드헤린의 발현을 조절함을 다시 한번 확인한 것이다. 종합하면, 대장암세포에서 SIP1/ZEB2에 의해 인테그린알파5가 발현유도되고, 이는 침윤억제 및 E-카드헤린의 발현억제를 유도한다.

한편, 본 발명은

1) SIP1/ZEB2가 발현되는 세포주에 인테그린알파5 유전자의 프로모터 및 이에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 발현벡터를 형질감염하는 단계;

2) 단계 1)의 형질전환된 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계; 및

3) 상기 세포주 내의 리포터 유전자의 발현량이 대조군에 비하여 감소한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 리포터 유전자는 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase ; CAT) 유전자, 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase; GUS) 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자, 베타-갈락토시다제 유전자, 형광 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 형광 단백질은 그린 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP), 블루 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP), 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein; YFP), 시안 형광 단백질(CFP; cyan fluorescent protein) 및 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 리포터 유전자가 형광 단백질일 경우, 형광 현미경을 이용하여 리포터 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.

상기 세포주는 SIP1/ZEB2를 발현하는 동물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포주는 SIP1/ZEB2 과발현 세포주 또는 SIP1/ZEB2 발현유도 세포주이다. 상기 SIP1/ZEB2 발현유도 세포주는 상위 표적에 의해 SIP1/ZEB2의 발현이 증가된 세포주를 의미한다.

또한, 본 발명은

1) SIP1/ZEB2 단백질 및 인테그린알파5 프로모터 DNA를 제작하는 단계;

2) 반응용기에서 상기 단계 1)에서 제작한 SIP1/ZEB2 단백질 및 인테그린알파5 프로모터 DNA를 결합시키는 단계;

3) 상기 결합체에 피검화합물을 처리하는 단계;

4) 상기 결합 여부를 측정하는 단계; 및,

5) 대조군(미처리군)과 비교하여 상기 결합을 억제한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.

인테그린알파5 프로모터와 SIP1/ZEB2의 직접적 결합을 확인하기 위하여, 우선SIP1/ZEB2와 결합하는 것으로 알려진 CDH1(E-cadherin) 프로모터(pGL3basic_CDH1) 및 본 발명의 인테그린알파5 프로모터(pGL3basic_인테그린알파5)를 클로닝한 후, SIP1/ZEB2가 상기 프로모터들과 결합하여 유전자 발현에 영향을 미치는지 듀얼 루시퍼라제 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, SIP1/ZEB2 는 이미 알려진 대로 CDH1(E-cadherin)의 발현을 약 70% 정도 저해하는 반면, 인테그린알파5의 발현은 약 3배 증가시킴을 확인하였다(도 11 참조).

나아가, 상기 SIP1/ZEB2에 의한 인테그린알파5의 발현 증가가, SIP1/ZEB2 단백질의 인테그린알파5 프로모터에의 직접적 결합에 의한 것인지 확인하기 위하여 비오틴화된 인테그린알파5 프로모터 및 CDH1 프로모터를 제조하여 DNA-매개 풀다운 분석(DNA-mediated pull down assay)를 수행하였다. 그 결과, 비오틴화된 CDH1 프로모터 및 비오틴화된 인테그린알파5 프로모터에 SIP1/ZEB2가 결합한 반면, 비오틴 화된 프로모터 및 비오틴화하지 않은 프로모터를 함께 처리한 경우에서는 SIP1/ZEB2가 거의 검출되지 않았다(도 12 참조). 상기 결과는 SIP1/ZEB2가 CDH1 프로모터 및 인테그린알파5 프로모터에 특이적으로 결합하는 것을 시사하였다.

즉, 본 발명자들은 SIP1/ZEB2가 이미 알려진 대로 CDH1(E-cadherin) 프로모터에 결합하여 저해하면서 동시에 SIP1/ZEB2가 인테그린알파5 프로모터에 직접적으로 결합하여 기능함을 새롭게 확인하였다. 따라서, 종합하면 이러한 결과들은 SIP1/ZEB2가 인테그린알파5 프로모터에 직접 결합함으로써, 인테그린알파5의 발현을 유도하는 것으로 결론지을 수 있다.

상기 단계 에서 SIP1/ZEB2 단백질과 인테그린알파5 프로모터 DNA와의 결합량은 칩 분석[Chromosomal Immunoprecipitation(CHIP) assay]; EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay); 겔 쉬프트 분석(Gel Shift assay); DNA 풋 프린팅(DNA foot-printing); DNA-풀다운 분석(DNA-full down assay); SPR(Surface Plasmon Resonance); 및, DNA 칩 또는 단백질 칩을 이용하여 방사선 동위원소 또는 형광물질로 확인하는 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 측정될 수 있다.

상기 칩 분석은 단백질과 DNA를 UV-교차 연결시켜 결합시킨 후, 상기 결합이 깨어지지 않을 정도로 초음파 분쇄하여 결합체들을 균질화 시켜준 다음, 특이적인 항체로 단백질을 골라내어 PCR로 DNA가 결합하였는지 확인하는 방법이다. 상기 EMSA는 방사선 동위원소로 표지한 DNA 또는 RNA에 단백질을 결합시킨 뒤, DNA 또는 RNA를 분해한 후 전기영동 하여, 단백질에 의해 보호된 부위를 찾는 방법이다. 상기 겔 쉬프트 분석은 단백질을 전기영동 할 때, DNA와 결합한 단백질은 결합하지 않은 단백질과 비교하여 전개가 지체되는 것으로 결합을 확인하는 방법이다. 상기 DNA 풋 프린팅은 DNA의 한 쪽 말단을 방사선 동위원소(³²P)로 표지한 후, 단백질과 결합시킨 뒤 DNase1으로 처리하여 결합시키지 않은 DNA와 함께 전기영동 시켜 결합 여부를 확인하는 방법이다. DNA-풀다운 분석은 비오틴으로 표지한 DNA에 단백질을 결합시킨 다음, 스트렙타비딘 비드로 DNA를 얻은 후, SDS-PAGE로 DNA와 결합하여 함께 얻어진 단백질을 전개시켜준 뒤, 항체를 이용하여 단백질을 확인하는 방법이다. 상기 SPR은 단백질을 기판에 고정시킨 뒤 DNA 또는 RNA를 흘려보내 주고, 공명각의 변화를 측정하여 결합 여부를 확인하는 방법이다. DNA 또는 RNA를 기판에 고정시킨 후 단백질을 흘려보내 줄 수도 있다.

본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법은 당업자에 의해 변형이 가능하지만, 이로써 본 발명의 권리범위를 벗어나는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 인테그린알파5의 저해제를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 인테그린알파5의 저해시 세포신호전달이 감소하고, 암세포 침윤이 감소하였으므로(도 5 및 도 6 참조), 인테그린알파5의 저해제를 대장암 치료 및 예방 용도로 사용가능할 것이다. 상기 저해제는 인테그린알파5에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA), 인테그린알파5 단백질에 결합하는 기질 유사체, 항체 및 상기 단백질의 활성을 저해하는 작은 화합물을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명은 인테그린알파5의 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료대상에 투여하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 SIP1/ZEB2의 저해제를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 SIP1/ZEB2 저해시 인테그린알파5의 발현 및 암세포 침윤이 감소하였으므로(도 1 및 도 2 참조), SIP1/ZEB2의 저해제를 대장암 치료 및 예방 용도로 사용가능할 것이다. 상기 저해제는 SIP1/ZEB2에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA), SIP1/ZEB2 단백질에 결합하는 기질 유사체, 항체 및 상기 단백질의 활성을 저해하는 작은 화합물을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명은 SIP1/ZEB2의 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료대상에 투여하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 이로써 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: SIP1 / ZEB2 저해에 따른 효과 분석

SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2) 저해에 따른 효과를 살펴보기 위하여, SIP1/ZEB2-특이적 siRNA(small interfering RNA: 이하 'siRNA')를 제작하였고, 이를 SW480(ATCC CCL 228) 세포주에 도입한 후, 발현수준과 침윤 능력을 분석하였다.

<1-1> siRNA 제작

SIP1/ZEB2의 발현을 저해하기 위하여, 하기 서열을 갖는 4종의 혼합된 합성 siRNA 이중체 올리고머 및 음성 대조군으로서 비특이적 siRNA를 다마콘(Dharmacon,미국)에서 구입하였다. 상기 4종의 SIP1/ZEB2 특이적 siRNA의 서열은 다음과 같다:

(1) 센스서열: 5'-GAACAGACAGGCUUACUUAUU-3'(서열번호 1)

안티센스서열: 5'-UAAGUAAGCCUGUCUGUUCUU-3'(서열번호 2)

(2) 센스서열: 5'-GAAGCUACGUACUUUAAUAUU-3'(서열번호 3)

안티센스서열: 5'-UAUUAAAGUACGUAGCUUCUU-3'(서열번호 4)

(3) 센스서열: 5'-CAACAUAUCCACUCCAUUUUU-3'(서열번호 5)

안티센스서열: 5'-AAAUGGAGUGGAUAUGUUGUU-3'(서열번호 6)

(4) 센스서열: 5'-GGAGACAGAUCAGUAAUAUUU-3'(서열번호 7)

안티센스서열: 5'-AUAUUACUGAUCUGUCUCCUU-3'(서열번호 8)

<1-2> 형질전환

본 발명자의 특허출원(대한민국 공개특허 제2007-0114970)과 논문(Jung et al., Oncognen, 27:2635-2647, 2008)에서 SIP1/ZEB2의 상위 표적인 TMPRSS4의 과발현에 의해 SW480 세포주에서 SIP1/ZEB2가 발현유도된 세포에 상기 특이적 siRNA 및 비특이적 siRNA를 마이크로포레이션 기법을 이용하여 도입하였다. 상기 도입은 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 간략하게, 수확한 세포를 PBS로 세척하고, R 버퍼에 3×10⁵ cell/12μL의 농도로 재현탁한 뒤, 20 μM siRNA 2μL를 첨가하고, 마이크로포레이터(microporator) 기기(Incyto, 한국)를 이용하여 형질전환하였다.

<1-3> SIP1 / ZEB2 저해에 따른 SIP1 / ZEB2 의 발현 수준 분석

RT-PCR을 이용하여 SIP1/ZEB2의 발현 수준을 분석하였다. 구체적으로, 고순도(High Pure) RNA 분리(Isolation) 키트(Roche, 독일)를 이용하여 상기 실시예 1-2의 세포주로부터 총 RNA를 분리하였다. 상기 RNA(5 μg)를 70℃에서 10분 동안 변성시키고, SuperScript II 역전사 효소(Invitrogen)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 올리고(dT) 프라이머로 역전사 반응을 수행하였다. 상기 역전사 효소는 90℃ 에서 2분 동안 불활성화시켰다. cDNA의 PCR 증폭은 SIP1/ZEB2-특이적 프라이머로서 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머(5'-TCTCGCCCGAGTGAAGCCTT-3')와 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GGGAGAATTGCTTGATGGAGC-3')를 사용하였다. 한편, 내부 대조군으로는 베타-액틴(β-actin)을 사용하였고, 베타-액틴 특이적 프라이머로서 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3')와 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머(5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3')를 사용하였다.

PCR 조건은 다음과 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 58℃(베타-액틴의 경우 55℃)에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. 상기 PCR 생성물은 2% 아가로스 또는 8% 폴리아크릴아미드 젤로 전기영동하였다. 모든 반응은 최소 2회 반복 수행하였다.

도 1에서 나타난 바와 같이, SIP1/ZEB2에 특이적인 siRNA를 도입한 결과, 비특이적 siRNA가 도입된 음성 대조군에 비하여 SIP1/ZEB2의 발현이 현저하게 감소하였다. 따라서, SIP1/ZEB2 특이적 siRNA가 SIP1/ZEB2를 효과적으로 저해했음을 확인하였다.

<1-4> SIP1 / ZEB2 저해에 따른 인테그린알파5의 발현 수준 분석

웨스턴 블롯을 이용하여 SIP1/ZEB2 저해에 따른 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현 수준을 분석하였다. 구체적으로, 세포를 RIPA 버퍼(10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)로 용해하였다. 상기 세포 용해물을 시판중인 변형된 브래드포드 분석법(Bio-Rad Laboratories, 미국)으로 정량하였다. 세포 용해물 30 ㎍을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열하였고, 6 또는 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동하였다.　분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 차단하였다. 이 후 항-베타-액틴(1:1000 희석: Santa Cruz, 미국)과 항-인테그린알파5 항체(1:1000 희석: BD transduction laboratories, 미국)를 함께 반응시키고, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후, ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 이용해 신호를 검출하였다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, SIP1/ZEB2에 특이적인 siRNA를 도입한 결과, 비특이적 siRNA가 도입된 음성 대조군에 비하여 인테그린알파5 발현이 현저하게 감소하였다. 따라서, SIP1/ZEB2 가 인테그린알파5의 발현과 밀접한 관련이 있는 것으로 판단된다.

<1-5> SIP1 / ZEB2 저해에 따른 암세포 침윤 분석

한편, SIP1/ZEB2 저해에 따른 암세포 침윤능력의 변화를 분석하기 위하여, 실시예 1-2의 특이적 및 비특이적 siRNA가 도입된 세포주를 대상으로 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다. 구체적으로, 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; Costar,미국)의 다공성 막을 무혈청(serum free) 배지로 희석된 250 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕ 마트리젤(BD Biosciences, 미국)로 코팅하였고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 고형화시켰다. 트렌스웰 플레이트의 하층은 화학유인물(chemoattractant)로서 10 ㎍/㎖ 농도의 인간 콜라겐 타입 I(Chemicon, USA) 100 ㎕를 이용하여 코팅하였다. 무혈청 배지에서 배양한 2.5×10⁴ 개의 세포를 상층 챔버에 분주하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 전이되지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였다. 하층 챔버로 전이한 세포는 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데하이드로 고정하였고, 2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척한 뒤, 선택 면적(×200)의 사진을 찍었고, 전이한 세포수는 3개의 선택 면적에서 계수하였다. 실험은 동일한 조건의 2개로 최소 2회 이상 반복한 수 대표결과를 나타내었다. 데이터 값은 전이세포±표준편차의 수를 반영하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, SIP1/ZEB2의 발현 저해시 마트리젤을 분해하고 이동한 암세포 수가 음성 대조군에 비하여 35% 감소하였다. 따라서, 상기 결과로부터, SIP1/ZEB2가 암세포의 침윤, 전이에 있어서 결정적 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 2: SIP1 / ZEB2 도입에 따른 효과 분석

SIP1/ZEB2 도입에 따른 효과를 분석하기 위하여, SIP1/ZEB2 발현 구조체(construct)를 제조하였고, 이를 대장암 세포에 형질전환한 후, SIP1/ZEB2 과발현에 따른 인테그린알파5의 발현 수준과 암 침윤 정도를 측정하였다.

<2-1> 동물세포 발현 구조체( construct )의 제조

SIP1/ZEB2를 코딩하는 cDNA(서열번호 25)를 매멀리안 진 컬렉션(Mammalian Gene Collection, NIH, USA)에서 얻은 후, 이를 Pfu 폴리머라제(Stratagene, 미국)을 사용하여 PCR 증폭하고 pcDNA3.1(Invitrogen, 미국)에 서브클로닝하였다. 이 때, 정제 효율을 높이기 위하여 SIP1/ZEB2의 N-말단에 myc tag을 첨가하였다.

PCR 증폭을 위하여 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GCTCTAGA GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG atgaagcagc cgatcatggc-3')와 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GCTCTAGA ttaca tgccatcttc catat-3')를 사용하였다.

PCR 반응 조건은 다음과 같다. SIP1/ZEB2의 cDNA를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하고 94℃, 30초, 58℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pcDNA3.1을 각각 XbaI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사의 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 대장균 XL1-Blue(Stratagene, USA)를 형질전환하여 앰피실린이 함유된 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 확인하 였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pcDNA3.1-myc-SIP1/ZEB2'로 명명하였다.

<2-2> 형질전환

상기 실시예 2-1에서 제조된 발현벡터 및 대조군인 공벡터(SIP1/ZEB2가 삽입되지 않은 벡터)를 마이크로포레이션 기법으로 SW480 세포에 형질전환하였다.

<2-3> SIP1 / ZEB2 과발현에 따른 인테그린알파5 발현 수준 분석

실시예 2-2의 형질전환된 세포를 형질전환 3일 후 세포를 용해하고, 상기 세포 용해물을 대상으로, 상기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 SIP1/ZEB2 과발현 여부와 이에 따른 인테그린알파5의 발현 수준을 분석하였다. 베타-액틴은 내부 대조군으로 사용하였고, SIP1/ZEB2의 발현은 항-myc 항체(Upstate)를, 인테그린알파5의 발현은 항-인테그린알파5 항체(BD transduction laboratories)를, 베타-액틴의 발현은 항-베타-액틴 항체(Santa Cruz)을 사용하였고, 그 외, 항-pY925FAK 항체(Cell signaling technology), 항-pY397FAK 항체(Santa Cruz), 항-FAK 항체(Santa Cruz), 항-pERK 항체(Cell signaling technology), 항-ERK 항체(Cell signal) 및 항-E-카드헤린 항체(R&D systems)로 이용하였고, 상기 항체들은 모두 1:1000으로 희석하여 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 공(mock)벡터로 형질전환한 대조군에 비하여 SIP1/ZEB2 발현벡터로 형질전환한 경우 SIP1/ZEB2가 과발현되어, 발현벡터의 도입을 확인할 수 있었다. 또한, SIP1/ZEB2 과발현에 의하여 인테그린알파5의 발현도 증가하였음을 확인하였다. 따라서, SIP1/ZEB2에 의해 인테그린알파5가 유도되는 것으로 시사되었다. 그 외에도 SIP1/ZEB2에 의해 결과적으로E-카드헤린이 감소하였고, ERK와 FAK의 인산화가 증가하는 것으로 나타났다. 이는 SIP1/ZEB2가 대장암세포에서 침윤과 관련한 주요 신호전달을 유도함을 시사하였다.

<2-4> SIP1 / ZEB2 과발현에 따른 암세포 침윤 분석

SIP1/ZEB2 과발현에 따른 암세포 침윤 능력의 변화를 살펴보기 위하여, 실시예 1-5와 동일한 방법으로 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, SIP1/ZEB2 도입에 의하여 암세포의 침윤이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

따라서, SIP1/ZEB2가 암세포의 침윤 및 전이에 있어서 결정적 역할을 수행함을 시사하였다.

실시예 3: 인테그린알파5 저해에 따른 효과 분석

<3-1> 인테그린알파5 저해에 따른 세포신호전달 변화 분석

인테그린알파5 저해에 따른 세포신호전달의 변화를 분석하기 위하여, 길항작용을 하는 항-인테그린알파5 항체를 사용하여 활성을 저해한 후, 세포신호전달효소인 FAK(focal adhesion kinase)와 ERK(extracelluar signal-regulated kinase)의 인산화 정도를 측정하였다. 대조군으로는 정상 IgG를 사용하였다.

구체적으로, 실시예 1-3의 SIP1/ZEB2 과발현 세포주를 수확한 후, 7x10⁵ 세포를 25 μg/mL 의 길항작용을 하는 항-인테그린알파5 항체 및 IgG를 각각 섞은 후 20분간 37℃에서 전-배양하고 나서, 6-웰 플레이트에 도말하였다. 10시간 후, 세포를 용해하여 세포용해물을 얻어 실시예 1-4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 웨스턴 블롯 수행시, 항-pY925FAK 항체, 항-FAK 항체, 항-pERK 항체, 항-ERK 항체 및 항-E-카드헤린 항체을 사용하여 세포신호전달효소인 FAK와 ERK의 인산화정도 및 E-카드헤린의 발현수준을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 대조군인 IgG을 혼합한 경우에 비하여 항-인테그린알파5 항체를 혼합하여 인테그린알파5의 발현을 억제한 경우, 인산화된 FAK와 ERK의 양이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, E-카드헤린의 발현양이 증가함을 확인하였다. 따라서, 인테그린알파5의 저해시 세포신호전달이 감소하여 암세포의 전이를 억제할 수 있을 것으로 시사되었다.

<3-2> 인테그린알파5 저해에 따른 암세포 침윤 분석

인테그린알파5 저해에 따른 암세포 침윤 변화를 살펴보기 위하여, 항-인테그린알파5 항체와 길항제인 RGD(arginine-glycine-aspartate) 펩타이드를 사용하여 인테그린알파5의 발현을 저해한 후, 실시예 1-5와 동일한 방법으로 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다.

인테그린알파5 의 발현을 저해하기 위한 물질로, 항-인테그린알파5 항체와 이를 포함한 몇몇 인테그린의 잘 알려진 길항제인 RGD 펩타이드(GRGDSP, 서열번호 27)를 사용하였고, 대조군으로서 IgG와 음성대조군으로서 RGE펩타이드(GRGESP, 서열번호 28)를 사용하였다. 상기 펩타이드는 펩트론(peptron; 대한민국)에서 합성하였다.

측정 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-인테그린알파5 항체와 RGD 펩타이드로 인테그린알파5를 저해시킨 경우, 대조군인 IgG와 음성 대조군인 RGE 사용시에 비하여 암세포의 침윤이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 따라서, 인테그린알파5가 암세포의 침윤 및 전이에 있어서 결정적 역할을 수행함을 시사하였다.

실시예 4: 인테그린알파5 도입에 따른 효과 분석

인테그린알파5 도입에 따른 효과를 분석하기 위하여, 인테그린알파5 발현 구조체(construct)를 제조하였고, 이를 대장암 세포에 형질전환한 후, 인테그린알파5 과발현에 따른 세포신호전달의 변화와 암세포 침윤 능력의 변화를 측정하였다.

<4-1> 동물세포 발현 구조체( construct ) 및 형질전환체의 제조

인테그린알파5를 코딩하는 cDNA(서울대학교, 세포역학 연구소, 의과 대학, 암 연구소, 이정원 교수)를 Pfu 폴리머라제을 사용하여 PCR 증폭하고 pcDNA3.1에 서브클로닝하였다.

PCR 증폭을 위하여 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머(5'- GCTCTAGAatggggagccgg acgccag-3')와 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GCTCTAGAtcaggcatcagaggtggc-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같 다. 인테그린알파5의 cDNA(서열번호 26)를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하였고 94℃, 30초, 55℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pcDNA3.1을 각각 XbaI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, 리가아제 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션 반응 후 대장균 XL1-Blue를 형질전환하여 앰피실린이 함유된 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱을 통해 최종적으로 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pcDNA3.1-인테그린알파5'로 명명하였다. 상기에서 제조된 발현벡터 및 대조군인 공(mock)벡터(인테그린알파5가 삽입되지 않은 벡터)를 마이크로포레이션 기법으로 SW480 세포에 형질전환하였다.

<4-2> 인테그린알파5 과발현에 따른 인테그린알파5 발현 및 세포신호전달 변화 분석

실시예 4-1의 형질전환된 세포를 형질전환 3일 후 세포를 용해하고, 상기 세포 용해물을 대상으로, 상기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 인테그린알파5 과발현 여부와 이에 따른 세포신호전달 변화를 분석하였다. 베타-액틴은 내부 대조군으로 사용하였고, 인테그린알파5의 발현은 항-인테그린알파5 항체를, 베타-액틴의 발현은 항-베타-액틴을 사용하였고, 그 외 항-pY925FAK 항체, 항-pY397FAK 항체, 항-FAK 항체, 항-pERK 항체, 항-ERK 항체 및 항-E-카드헤린 항체을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 공벡터로 형질전환한 대조군에 비하여 인테그린알파5 발현벡터로 형질전환한 경우 인테그린알파5가 과발현되어, 발현벡터의 도입을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 인테그린알파5 과발현에 의하여 E-카드헤린이 감소하였고, ERK와 FAK의 인산화가 증가하는 것으로 나타났다. 이는 인테그린알파5가 직접적인 신호전달/침윤 유도의 매개자임을 시사하였다. 특히, 인테그린알파5에 의해 E-카드헤린의 감소가 유도될 뿐 아니라(도 7), 인테그린알파5 활성억제에 의해 E-카드헤린의 증가가 유도되는 것은(도 5) 대장암세포에서 E-카드헤린의 발현이 인테그린알파5에 의해 조절됨을 시사하였다.

<4-3> 인테그린알파5 과발현에 따른 세포 형태 분석

한편, 상기 실시예 4-1에서 인테그린알파5 발현벡터와 공(mock)벡터로 형질전환된 세포를 대상으로, 광학 현미경(Nikon light microscope, 일본)으로 100배 확대하여 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과, 도 8에 보는 바와 같이, 인테그린알파5에 의해 세포의 퍼짐이 증가하고, 물결처럼 흔들리면서 세포로 하여금 세포 기질에 따라 움직이게 하는 역할을 하는 유주 다형 핵 백혈구에서 생산되는 세포 형질의 피막 돌기(라멜리포듐, lamellipodium)가 형성되었음을 확인할 수 있었다.

<4-4> 인테그린알파5 과발현에 따른 암세포 침윤 분석

인테그린알파5 과발현에 따른 암세포 침윤 능력의 변화를 살펴보기 위하여, 실시예 1-5와 동일한 방법으로 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 인테그린알파5 과발현에 의하여 공벡터 도입시에 비하여 암세포의 침윤이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

따라서, 인테그린알파5가 암세포의 침윤 및 전이에 있어서 결정적 역할을 함을 알 수 있었다.

한편, 도 4의 결과와 도 9의 결과로부터 공벡터 형질전환 대비 SIP1/ZEB2 및 인테그린알파5의 각각 형질전환에 의한 대장암세포의 침윤정도의 비율을 구하였다. 또한, 도 3과 도 7의 결과로부터 각각의 경우의 인테그린알파5의 발현양을 웨스턴 블롯의 밴드를 밀도계(densitometry)로 정량화하였다. 먼저, 베타-액틴 발현양으로 정상화(normalization) 한 후, 각각의 경우의 인테그린알파5의 발현양의 비율을 계산하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군인 공벡터 형질전환에 비하여, SIP1/ZEB2 및 인테그린알파5의 도입으로 대장암세포의 침윤이 증가하였고, 인테그린알파5의 발현정도에 비례하여 대장암세포의 침윤능이 증가함을 보여주었다.

실시예 5: 인테그린알파5 프로모터를 포함하는 벡터의 제조

<5-1> 인테그린알파5 프로모터의 클로닝

인테그린알파5 프로모터와 SIP1/ZEB2의 직접적인 결합 여부를 확인하기 위하여 우선 인테그린알파5 프로모터(서열번호 29)를 클로닝하였다. 구체적으로, SW480 세포로부터 유전체 DNA를 분리하여(G-spin^TM Genomic DNA Extraction Kit, Intron, 미국) PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 서열번호 17(5'-CCGCTCGAG gagctgaaggttgggtcc-3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 18(5'-CCGCTCGAG cc gtctg ttccc ggc-3')로 기재되는 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 94℃ 2분 처리 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분 과정을 30회 반복한 다음, 72℃ 10분간 연장과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 인테그린알파5 프로모터 영역(-863부터 +286까지)의 PCR 단편을 제조하였다. 또한, 서열번호 19(5'-CCGCTCGAG acaaaagaactcagccaagtg-3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20(5'-CCGCTCGAG cttccgcaagctcacagg-3')으로 기재되는 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 상기와 동일한 PCR 조건으로 PCR을 수행하여, 리포터 분석의 대조군으로 사용할 CDH1(E-cadherin) 프로모터 영역(-308부터 +41까지)의 DNA 단편을 제조하였다.

증폭된 PCR 산물은 XhoI으로 절단하고 정제하였다. 상기 두 PCR 산물을 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pGL3basic 벡터(Promega, 미국)에 삽입한 후 박테리아에 형질전환하였다. 상기에서 수득한 형질전환 클론들 중 DNA 서열 분석을 통하여 올바른 방향으로 삽입된 DNA 절편을 가진 클론을 선별하였다. 각각을 pGL3basic_인테그린알파5 및 pGL3basic_CDH1 으로 명명하였다.

<5-2> 듀얼 루시퍼라제 분석을 통한 인테그린알파5 프로모터의 활성 확인

실시예 5-1에서 제조한 벡터를 이용하여 SIP1/ZEB2가 인테그린알파5 및 E-카 드헤린의 프로모터와 결합하여 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 구체적으로, 먼저 6-웰 플레이트에 SW480 대장암 세포주(2.5×10⁵ cells/well)를 깔고 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen) 3 ㎕ 및 플라스미드 DNA 혼합물 4 ㎍[(① pGL3basic_CDH1 2 ㎍ + pcDNA3.1 1.8 ㎍, ② pGL3basic_CDH1 2 ㎍ + pcDNA3.1-myc-SIP1/ZEB2 1.8 ㎍, ③ pGL3basic_인테그린알파5 2 ㎍ + pcDNA3.1 1.8 ㎍, ④ pGL3basic_인테그린알파5 2 ㎍ + pcDNA3.1-myc-SIP1/ZEB2 1.8 ㎍) + pRL-TK 0.2 ㎍]를 섞어 형질전환한 후, 5시간 뒤 배양 배지를 새로운 배지로 바꾸었다. 48시간 이후, 세포를 용해하여 듀얼-루시퍼라제 분석 시스템(Dual-luciferase reporter assay system, Promega, 미국)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정한 후, 파이어플라이 루시퍼라제 활성(firefly luciferase activity)/레닐라 루시퍼라제 활성(Renilla luciferase activity) 값을 구하여 최종 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 이 때, 상기 pRL-TK는 레닐라 루시퍼라제를 발현하는 벡터로서, 형질전환한 각각의 웰에서의 형질전환효율을 나타내는 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다.

그 결과, SIP1/ZEB2 는 이미 알려진 대로 CDH1(E-cadherin)의 발현을 약 70% 정도 저해하는 반면, 인테그린알파5의 발현은 약 3배 증가시킴을 확인하였다(도 11).

실시예 6: SIP1 / ZEB2 와 인테그린알파5 프로모터의 직접적 결합 확인

웨스턴 블롯 및 루시퍼라제 분석에서 확인된, SIP1/ZEB2에 의한 인테그린알파5의 발현 증가가, SIP1/ZEB2 단백질의 인테그린알파5 프로모터에의 직접적 결합에 의한 것인지를 DNA-매개 풀다운 분석(DNA-mediated pull down assay)를 통해 검증하였다.

<6-1> 인테그린알파5 프로모터 DNA 의 제조

비오틴화된 인테그린알파5 프로모터 DNA(-863부터 +286까지)를 얻기 위하여, 인테그린알파5 프로모터를 서열번호 21(5'-aagagctgaaggttgggtcc-3', 5' 말단에 비오틴 표지) 및 서열번호 22(5'-cc gtctg ttccc ggc-3')로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 5-2와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 제조하였다. 비오틴화된 CDH1(E-cadherin) 프로모터 DNA(-269부터 +41까지)도 서열번호 23(5'-aaccaggtcttagtgagccacc-3', 5' 말단에 비오틴 표지) 및 서열번호 24(5'-cttccgcaagctcacagg-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 제조하였다. 또한, 5'-말단에 비오틴이 붙지 않은 프라이머로 PCR을 수행하여 비오틴으로 표지되지 않은 DNA(cold DNA)를 각각 제조하였다.

<6-2> SIP1 / ZEB2 단백질을 포함하는 핵추출물의 분리

SIP1/ZEB2 단백질은 pcDNA3.1-myc-SIP1/ZEB2를 293E(American Type culture Collection, 미국) 세포에 PEI로 형질전환한 후, 48시간 뒤 핵 분획을 얻어 사용하였다. 상기 293E(CRL-10852) 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루 타민, 소디움 피루베이트, 글루코오스가 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium: GIBCO, 미국) 배지에서 배양하였다. 이후 293E 세포주(2×10⁶)를 100 mm 배양 접시에 깔아주었다. 다음 날, 10 ㎍ pcDNA3.1-myc-SIP1/ZEB2를 1 ml의 무혈청 배지(serum-free medium)와 혼합하고, 1-2 분 후, 10 ㎍ PEI(polyethylenimine, Polysciences, 미국, 2 mg/ml)를 넣고 고르게 혼합하였다. 10-15분 후, 상기 혼합물을 세포에 방울(drop)로 떨어뜨렸다. 6시간 후, PBS로 세척하였고 혈청(serum)이 포함된 신선한 배양 배지를 첨가하였다. 24시간 후 혈청이 포함된 신선한 배양 배지로 교체하였다. 형질도입(transfection) 48시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 1ml의 PBS에 세포를 긁어 모은 뒤, 3000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포 침전물을 490 ㎕의 버퍼 A(10 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl)에 재현탁한 후, 10분간 얼음에서 방치하고, 1 ㎖의 주사기에 30회 통과시켰다. 5분간 13000 rpm에서 원심분리하고, 얻어진 핵 침전물은 버퍼 B(20 mM HEPES-KOH pH 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 420 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 25% 글리세롤) 150 ㎕에 재현탁하였다. 얼음에서 20분 간 방치한 뒤, 10분 간 13000 rpm에서 원심분리한 상층액을 새 튜브로 옮겨 단백질을 정량하였다.

<6-2> DNA -매개 풀다운 분석

정제한 프로모터 DNA 300 f㏖(hot 300 f㏖ 또는 hot 30 f㏖+cold 270 f㏖)과 스트렙타비딘-아가로즈 비드(streptavidin-agarose bead, Pierce) 10 ㎕를 버퍼 C[20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 1 mM DTT, 0.1% NP-40, 0.25 mM　EGTA, 10% 글리세롤, 1 ㎍ polydIdC, 1 mM PMSF, 완전 프로테아제 억제제(complete protease inhibitor)]조건 하에 섞은 후, 4℃에서 90분간 배양하였다. SIP1/ZEB2 단백질을 포함한 핵 분획 10 ㎍를 첨가한 후, 상온에서 20분간 배양하였다. 4℃, 6000 rpm에서 30초간 원심분리하고, 비드를 300 ㎕의 버퍼 C로 2회 세척하였다. 최종 비드 시료를 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열한 후, 전기영동 후 항-myc 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 구체적으로, 8% SDS-PAGE 젤에 전기영동한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, 5% 스킴 밀크로 차단하였다. 이 후, 항-myc 항체를 처리한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 그리고 나서, ECL 키트를 제조사의 방법대로 처리하였다.

그 결과, 비오틴화된 CDH1 프로모터 및 비오틴화된 인테그린알파5 프로모터에 SIP1/ZEB2가 결합한 반면(도 12의 레인 2 및 3), 비오틴화하지 않은 cold DNA 와 비오틴화된 hot DNA를 9:1의 비율로 사용한 경우, SIP1/ZEB2가 거의 검출되지 않았다(도 12의 레인 4 및 5).

이 결과는 SIP1/ZEB2가 CDH1 프로모터 및 인테그린알파5 프로모터에 특이적으로 결합함을 의미한다. 즉, 본 발명자들은, 이미 알려진 대로 SIP1/ZEB2가 CDH1 프로모터에 결합함을 확인하였을 뿐만 아니라, SIP1/ZEB2가 인테그린알파5 프로모터에 직접적으로 결합함이 새롭게 확인하였다. 따라서, 종합하면, 이러한 결과들은 SIP1/ZEB2가 인테그린알파5 프로모터에 직접 결합함으로써, 인테그린알파5의 발현을 유도하는 것을 확인하였다.

도 1은 SIP1/ZEB2 특이적인 siRNA를 이용하여 SIP1/ZEB2의 발현을 억제함으로써 나타나는 SIP1/ZEB2, β-액틴(대조군), 인테그린알파5(human integrin alpha5)의 발현수준을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 측정한 것이다.

도 2는 SIP1/ZEB2 특이적인 siRNA를 이용하여 SIP1/ZEB2의 발현을 억제함으로써 나타나는 침윤 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 SIP1/ZEB2를 도입함으로써 나타나는 인테그린알파5, E-카드헤린, β-액틴(대조군)의 발현수준 및 세포신호전달의 변화를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.

도 4는 SIP1/ZEB2를 도입함으로써 나타나는 침윤 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 인테그린알파5 특이적인 항-인테그린알파5 항체를 이용하여 인테그린알파5의 활성을 억제함으로써 나타나는 E-카드헤린의 발현변화 및 세포신호전달의 변화를 웨스턴 블롯으로 측정한 도이다.

도 6은 인테그린알파5 특이적인 항-인테그린알파5 항체와 RGD를 이용하여 인테그린알파5의 활성을 억제함으로써 나타나는 침윤 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다. IgG는 대조군이며, RGE 펩타이드는 음성 대조군이다.

도 7은 인테그린알파5를 도입함으로써 나타나는 인테그린알파5, E-카드헤린, β-액틴(대조군) 및 세포신호전달의 변화를 웨스턴 블롯으로 측정한 것이다.

도 8은 인테그린알파5를 도입한 세포를 광학현미경으로 촬영한 사진이다.

도 9는 인테그린알파5를 도입함으로써 나타나는 침윤 세포수의 변화를 나타낸 도이다.

도 10은 도 4와 도 9의 결과로부터 공벡터 형질전환 대비 SPI1/ZEB2 및 인테그린알파5의 침윤정도의 비율 및 도3 과 도 7의 결과로부터 인테그린알파5의 발현정도의 비율을 나타낸 그래프이다.

도 11은 SIP1/ZEB2가 CDH1(E-cadherin) 프로모터 및 인테그린알파5 프로모터에 결합하여 유전자 발현을 조절하는지 루시퍼라제 분석을 통하여 확인한 그래프이다.

도 12는 SIP1/ZEB2 단백질이 인테그린알파5 프로모터에와 직접 결합하는지 DNA-매개 풀다운 분석(DNA-mediated pull down assay)를 통해 확인한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for screening anticancer agent or SIP1/ZEB2 inhibitor using integrin alpha5 <130> 9p-03-42 <150> KR10-2008-0119773 <151> 2008-11-28 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA sense1 <400> 1 gaacagacag gcuuacuuau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA antisense1 <400> 2 uaaguaagcc ugucuguucu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA sense2 <400> 3 gaagcuacgu acuuuaauau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA antisense2 <400> 4 uauuaaagua cguagcuucu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA sense3 <400> 5 caacauaucc acuccauuuu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA antisense3 <400> 6 aaauggagug gauauguugu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA sense4 <400> 7 ggagacagau caguaauauu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific siRNA antisense4 <400> 8 auauuacuga ucugucuccu u 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific sense primer <400> 9 tctcgcccga gtgaagcctt 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 specific antisense primer <400> 10 gggagaattg cttgatggag c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin sense primer <400> 11 gctcgtcgtc gacaacggct c 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin antisense primer <400> 12 caaacatgat ctgggtcatc ttctc 25 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 myc tag sense primer <400> 13 gctctagaga gcagaaactc atctctgaag aggatctgat gaagcagccg atcatggc 58 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIP1 ZEB2 myc tag antisense primer <400> 14 gctctagatt acatgccatc ttccatat 28 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 sense primer <400> 15 gctctagaat ggggagccgg acgccag 27 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 antisense primer <400> 16 gctctagatc aggcatcaga ggtggc 26 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 promotor sense primer <400> 17 ccgctcgagg agctgaaggt tgggtcc 27 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 promotor antisense primer <400> 18 ccgctcgagc cgtctgttcc cggc 24 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH1 promotor sense primer <400> 19 ccgctcgaga caaaagaact cagccaagtg 30 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH1 promotor antisense primer <400> 20 ccgctcgagc ttccgcaagc tcacagg 27 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin ITGA5 sense primer <400> 21 aagagctgaa ggttgggtcc 20 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin ITGA5 antisense primer <400> 22 ccgtctgttc ccggc 15 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin CDH1 promotor sense primer <400> 23 aaccaggtct tagtgagcca cc 22 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin CDH1 promotor antisense primer <400> 24 cttccgcaag ctcacagg 18 <210> 25 <211> 5583 <212> DNA <213> Homo sapiens zinc finger E-box binding homeobox 2 (ZEB2) mRNA <400> 25 ataatctatc ccagatcctt tcccagagag aaacttggcg atcacgtttt cacatgatgc 60 tcacgctcag ggcgcttcaa ttatccctcc ccacaaagat aggtggcgcg tgtttcaggg 120 tctctcgtct ctctcctaca gaaaagaaaa agaaaaaaat gtcattagaa gaggcgtaac 180 acgtcagtcc gtccccaggt ttgtgtttcc tggagtggcc gaaagagatc agttctaacc 240 tgctctgcag gaataacggt cctgcctccc gacactcttg gcgaggtttt tgtacagttt 300 gctccgggag ctgtttcttc gcttccacct ttttctcccc cacacttcgc ggcttcttca 360 tgctttttct tctcaccatt tctggccaaa actacaaaca agacttcgca gatcgagcct 420 gcgtgctgcc gaagcagggc gccgagtcca tgcgaactgc catctgatcc gctcttatca 480 atgaagcagc cgatcatggc ggatggcccc cggtgcaaga ggcgcaaaca agccaatccc 540 aggaggaaaa acgtggtgaa ctatgacaat gtagtggaca caggttctga aacagatgag 600 gaagacaagc ttcatattgc tgaggatgac ggtattgcca accctctgga ccaggagacg 660 agtccagcta gtgtgcccaa ccatgagtcc tccccacacg tgagccaagc tctgttgcca 720 agagaggaag aggaagatga aataagggag ggtggagtgg aacacccctg gcacaacaac 780 gagattctac aagcctctgt agatggtcca gaagaaatga aggaagacta tgacactatg 840 gggccagaag ccacgatcca gaccgcaatt aacaatggta cagtgaagaa tgcaaattgc 900 acatcagatt ttgaggaata ctttgccaaa agaaaactgg aggaacgcga tggtcatgca 960 gtcagcatcg aggagtacct tcagcgcagt gacacagcca ttatttaccc agaagcccct 1020 gaggagctgt ctcgccttgg cacgccagag gccaatgggc aagaagaaaa tgacctgcca 1080 cctggaactc cagatgcttt tgcccaactg ctgacctgcc cctactgcga ccggggctac 1140 aagcgcttga catcactgaa ggagcacatc aagtaccgcc acgagaagaa 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tccactttct 5400 tcatcttgtt ttttagctaa aaagagggac tgttaaatac aatgtatgat accatgacaa 5460 aaatctttcc tgaattgtct ttgtaaaagt attattgaat tttcaatttg taatttcttt 5520 tgaaaatgac catgctcgaa taaaaatgta gccaaactaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5580 aaa 5583 <210> 26 <211> 4267 <212> DNA <213> Homo sapiens integrin, alpha 5 (fibronectin receptor, alpha polypeptide) (ITGA5), mRNA <400> 26 attcgcctct gggaggttta ggaagcggct ccgggtcggt ggccccagga cagggaagag 60 cgggcgctat ggggagccgg acgccagagt cccctctcca cgccgtgcag ctgcgctggg 120 gcccccggcg ccgacccccg ctgctgccgc tgctgttgct gctgctgccg ccgccaccca 180 gggtcggggg cttcaactta gacgcggagg ccccagcagt actctcgggg cccccgggct 240 ccttcttcgg attctcagtg gagttttacc ggccgggaac agacggggtc agtgtgctgg 300 tgggagcacc caaggctaat accagccagc caggagtgct gcagggtggt gctgtctacc 360 tctgtccttg gggtgccagc cccacacagt gcacccccat tgaatttgac agcaaaggct 420 ctcggctcct ggagtcctca ctgtccagct cagagggaga ggagcctgtg gagtacaagt 480 ccttgcagtg gttcggggca acagttcgag cccatggctc ctccatcttg gcatgcgctc 540 cactgtacag ctggcgcaca gagaaggagc cactgagcga ccccgtgggc acctgctacc 600 tctccacaga taacttcacc cgaattctgg agtatgcacc ctgccgctca gatttcagct 660 gggcagcagg acagggttac tgccaaggag gcttcagtgc cgagttcacc aagactggcc 720 gtgtggtttt aggtggacca ggaagctatt tctggcaagg ccagatcctg tctgccactc 780 aggagcagat tgcagaatct tattaccccg agtacctgat caacctggtt caggggcagc 840 tgcagactcg ccaggccagt tccatctatg atgacagcta cctaggatac tctgtggctg 900 ttggtgaatt cagtggtgat gacacagaag actttgttgc tggtgtgccc aaagggaacc 960 tcacttacgg ctatgtcacc atccttaatg gctcagacat tcgatccctc tacaacttct 1020 caggggaaca gatggcctcc tactttggct atgcagtggc cgccacagac gtcaatgggg 1080 acgggctgga tgacttgctg gtgggggcac ccctgctcat ggatcggacc cctgacgggc 1140 ggcctcagga ggtgggcagg gtctacgtct acctgcagca cccagccggc atagagccca 1200 cgcccaccct taccctcact ggccatgatg agtttggccg atttggcagc tccttgaccc 1260 ccctggggga cctggaccag gatggctaca atgatgtggc catcggggct ccctttggtg 1320 gggagaccca gcagggagta gtgtttgtat ttcctggggg cccaggaggg ctgggctcta 1380 agccttccca ggttctgcag cccctgtggg cagccagcca caccccagac ttctttggct 1440 ctgcccttcg aggaggccga gacctggatg gcaatggata tcctgatctg attgtggggt 1500 cctttggtgt ggacaaggct gtggtataca ggggccgccc catcgtgtcc gctagtgcct 1560 ccctcaccat cttccccgcc atgttcaacc cagaggagcg gagctgcagc ttagagggga 1620 accctgtggc ctgcatcaac cttagcttct gcctcaatgc ttctggaaaa cacgttgctg 1680 actccattgg tttcacagtg gaacttcagc tggactggca gaagcagaag ggaggggtac 1740 ggcgggcact gttcctggcc tccaggcagg caaccctgac ccagaccctg ctcatccaga 1800 atggggctcg agaggattgc agagagatga agatctacct caggaacgag tcagaatttc 1860 gagacaaact ctcgccgatt cacatcgctc tcaacttctc cttggacccc caagccccag 1920 tggacagcca cggcctcagg ccagccctac attatcagag caagagccgg atagaggaca 1980 aggctcagat cttgctggac tgtggagaag acaacatctg tgtgcctgac ctgcagctgg 2040 aagtgtttgg ggagcagaac catgtgtacc tgggtgacaa gaatgccctg aacctcactt 2100 tccatgccca gaatgtgggt gagggtggcg cctatgaggc tgagcttcgg gtcaccgccc 2160 ctccagaggc tgagtactca ggactcgtca gacacccagg gaacttctcc agcctgagct 2220 gtgactactt tgccgtgaac cagagccgcc tgctggtgtg tgacctgggc aaccccatga 2280 aggcaggagc cagtctgtgg ggtggccttc ggtttacagt ccctcatctc cgggacacta 2340 agaaaaccat ccagtttgac ttccagatcc tcagcaagaa tctcaacaac tcgcaaagcg 2400 acgtggtttc ctttcggctc tccgtggagg ctcaggccca ggtcaccctg aacggtgtct 2460 ccaagcctga ggcagtgcta ttcccagtaa gcgactggca tccccgagac cagcctcaga 2520 aggaggagga cctgggacct gctgtccacc atgtctatga gctcatcaac caaggcccca 2580 gctccattag ccagggtgtg ctggaactca gctgtcccca ggctctggaa ggtcagcagc 2640 tcctatatgt gaccagagtt acgggactca actgcaccac caatcacccc attaacccaa 2700 agggcctgga gttggatccc gagggttccc tgcaccacca gcaaaaacgg gaagctccaa 2760 gccgcagctc tgcttcctcg ggacctcaga tcctgaaatg cccggaggct gagtgtttca 2820 ggctgcgctg tgagctcggg cccctgcacc aacaagagag ccaaagtctg cagttgcatt 2880 tccgagtctg ggccaagact ttcttgcagc gggagcacca gccatttagc ctgcagtgtg 2940 aggctgtgta caaagccctg aagatgccct accgaatcct gcctcggcag ctgccccaaa 3000 aagagcgtca ggtggccaca gctgtgcaat ggaccaaggc agaaggcagc tatggcgtcc 3060 cactgtggat catcatccta gccatcctgt ttggcctcct gctcctaggt ctactcatct 3120 acatcctcta caagcttgga ttcttcaaac gctccctccc atatggcacc gccatggaaa 3180 aagctcagct caagcctcca gccacctctg atgcctgagt cctcccaatt tcagactccc 3240 attcctgaag aaccagtccc cccaccctca ttctactgaa aaggaggggt ctgggtactt 3300 cttgaaggtg ctgacggcca gggagaagct cctctcccca gcccagagac atacttgaag 3360 ggccagagcc aggggggtga ggagctgggg atccctcccc cccatgcact gtgaaggacc 3420 cttgtttaca cataccctct tcatggatgg gggaactcag atccagggac agaggcccca 3480 gcctccctga agcctttgca ttttggagag tttcctgaaa caacttggaa agataactag 3540 gaaatccatt cacagttctt tgggccagac atgccacaag gacttcctgt ccagctccaa 3600 cctgcaaaga tctgtcctca gccttgccag agatccaaaa gaagccccca gctaagaacc 3660 tggaacttgg ggagttaaga cctggcagct ctggacagcc ccaccctggt gggccaacaa 3720 agaacactaa ctatgcatgg tgccccagga ccagctcagg acagatgcca cacaaggata 3780 gatgctggcc cagggcccag agcccagctc caaggggaat cagaactcaa atggggccag 3840 atccagcctg gggtctggag ttgatctgga acccagactc agacattggc acctaatcca 3900 ggcagatcca ggactatatt tgggcctgct ccagacctga tcctggaggc ccagttcacc 3960 ctgatttagg agaagccagg aatttcccag gaccctgaag gggccatgat ggcaacagat 4020 ctggaacctc agcctggcca gacacaggcc ctccctgttc cccagagaaa ggggagccca 4080 ctgtcctggg cctgcagaat ttgggttctg cctgccagct gcactgatgc tgcccctcat 4140 ctctctgccc aacccttccc tcaccttggc accagacacc caggacttat ttaaactctg 4200 ttgcaagtgc aataaatctg acccagtgcc cccactgacc agaactagaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaa 4267 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD peptide <400> 27 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDE peptide <400> 28 Gly Arg Gly Glu Ser Pro 1 5 <210> 29 <211> 1149 <212> DNA <213> Human integrin alpha5 promoter <400> 29 gagctgaagg ttgggtccct ttgcaagact ttccaccacc accaccacct ctcacaattc 60 tccaggtttg taggaacccg gccagtttaa tcaagcaggt actgaggggc cagccactcg 120 caggcttttg gtcaactgtc agatccaagg aaggggctca gcagaggttt acatacccta 180 ggaccaagaa gggggcaaac tggagcagaa tcctcctgat gaatgacccc aaactcctgg 240 gttttcaata ctagcaagct tggaggagga agcagcggaa cttgaggagc ccgtgtaggt 300 cctctagcaa gctgactgcg aacgctgtct ctgtacctca actgttgtgt cccaaatcca 360 gctggccaga acccaggcac ccggcggccc cggaaggcaa gggggaatcc cagttggccg 420 gacgccagag gagtctcctg tctctttaga ccccaaagtc tcctccctaa agcactgagg 480 gagaccccac acacatatac aggcttcctc cgcccaccag aggtgattcc tttcctcatt 540 aggaaattct ccgctccctt ttccgactcg ttttccgagc gtttacgttg tacatctgga 600 aaggaatggg gaggaaggag ggggaagcag agaggagggg gaagaaccca aacccgccca 660 gtctaaccca gtccagacaa ccggcttcca gctggggctg gggaaagggg gttggagggg 720 tgcgcccccc ccccacgccc cttaggggtg ggggacgcgg gctcagagtt ccagggaccc 780 aggaatgccc ccccgccagc cccctcggca ggcgggggga gggctcagcc gggagtttgg 840 caaactcctc cccgcgttga gtcattcgcc tctgggaggt ttaggaagcg gctccgggtc 900 ggtggcccca ggacagggaa gagcgggcgc tatggggagc cggacgccag agtcccctct 960 ccacgccgtg cagctgcgct ggggcccccg gcgccgaccc ccgctgctgc cgctgctgtt 1020 gctgctgctg ccgccgccac ccagggtcgg gggcttcaac ttagacgcgg aggccccagc 1080 agtactctcg gggcccccgg gctccttctt cggattctca gtggagtttt accggccggg 1140 aacagacgg 1149

Claims

2) 상기 배양된 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

4) 대조군(미처리군)에 비하여 상기 실험군에서 발현량을 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.

2) 상기 배양된 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

4) 상기 실험군에서 대조군(미처리군)에 비하여 발현량을 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 SIP1/ZEB2 저해제의 스크리닝 방법.

제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 세포주는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 3항에 있어서, 상기 동물 세포는 SW480인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 단계 3)의 발현량 측정은 전사체의 양을 측정하는 방법 또는 단백질의 양을 측정하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.

1) SIP1/ZEB2가 발현되는 세포주에 인테그린알파5 유전자의 프로모터 및 이 에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 발현벡터를 형질감염하는 단계;

3) 상기 세포주 내의 리포터 유전자의 발현량이 대조군에 비하여 감소한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 인테그린알파5 유전자의 프로모터는 서열번호 29로 기재되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 베타-글루쿠로니다제(GUS) 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자, 베타-갈락토시다제 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 9항에 있어서, 상기 형광 단백질은 그린 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP), 블루 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP), 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein; YFP), 시안 형광 단백질(CFP; cyan fluorescent protein) 및 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 형광 단백질일 경우, 리포터 유전자의 발현량은 형광 현미경을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 7항에 있어서, 상기 세포주는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.

제 13항에 있어서, 상기 동물 세포는 SW480인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

3) 상기 결합체에 피검화합물을 처리하는 단계;

4) 상기 결합 여부를 측정하는 단계; 및,

5) 대조군(미처리군)과 비교하여 상기 결합을 억제한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 인테그린알파5 유전자의 프로모터는 서열번호 29로 기재되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 단계 3)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, SIP1/ZEB2 단백질과 인테그린알파5 프로모터 DNA와의 결합량은 칩 분석[Chromosomal Immunoprecipitation(CHIP) assay]; EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay); 겔 쉬프트 분석(Gel Shift assay); DNA 풋 프린팅(DNA foot-printing); DNA-풀다운 분석(DNA-full down assay); SPR(Surface Plasmon Resonance); 및, DNA 칩 또는 단백질 칩을 이용하여 방사선 동위원소 또는 형광물질로 확인하는 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

인테그린알파5에 특이적인 항체 또는 RGD(arginine-glycine-aspartate) 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물.

SIP1/ZEB2 특이적 siRNA(small interfering RNA)를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물.