ITCH20120008A1

ITCH20120008A1 - Uso di trop-2 come marcatore predittivo di risposta a terapia anti-tumorale basata su inibitori di cd9, akt e vie di segnale collegate

Info

Publication number: ITCH20120008A1
Application number: IT000008A
Authority: IT
Inventors: Saverio Alberti; Emanuela Guerra
Original assignee: Saverio Alberti
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-11-17
Also published as: JP2015524051A; CA2873017A1; CN104395754A; US20210311061A1; WO2013171777A2; IN2014DN10081A; EP2850433B1; AU2013261018A1; WO2013171777A3; EP2850433A2

Description

DESCRIZIONE “Uso di Trop-2 come marcatore predittivo di risposta a terapia anti-tumorale basata su inibitori di CD9, Akt e vie di segnale collegate”

La presente invenzione concerne l identificazione di vie di segnale dipendenti da Trop-2 come nuovi bersagli clinici e l identificazione di Trop-2 come marcatore predittivo di risposta a specifiche terapie. Più in particolare, la presente invenzione riguarda l identificazione di CD9 e Akt come molecole chiave del segnale Trop-2-dipendente, e di Trop-2 come fattore in grado di determinare risposta alla terapia anti-tumorale basata sull’ inibizione di tali molecole.

Le terapie antitumorali mirate di ultima generazione fanno uso di inibitori tirosinchinasici (TKI) e/o anticorpi monoclonali (mAb), aventi come bersaglio chinasi oncogeni che dominanti e/o recettori di fattori di crescita (Ellis and Hicklin 2009). Tuttavia, il beneficio clinico associato a tali agenti è in genere limitato a sottoinsiemi di pazienti trattati, in molti casi definiti da specifiche alterazioni molecolari (mutazioni, amplificazioni/delezioni, aumenti/diminuzioni di espressione) a livello tumorale. Questa scoperta ha evidenziato la possibile importanza di genotipi/fenotipi tumorali come determinanti di sensibilità a specifici trattamenti (McDermott and Settleman 2009) e la conseguente stratificazione dei pazienti prima del trattamento sulla base di alterazioni molecolari utilizzate come biomarcatori. Questi biomarcatori vengono studiati per poter essere utilizzati come “marcatori predittivi”, in grado, cioè, di prevedere la risposta o la resistenza ad una terapia mirata (McShane, Hunsberger et al. 2009), con l'obiettivo di ottimizzare i risultati clinici attraverso una efficace personalizzazione del trattamento (McDermott and Settleman 2009).

Biomarcatori predittivi sono correntemente utilizzati in clinica come guida per la scelta di pochissimi trattamenti mirati (Duffy 2005). Esempi includono recettori per estrogeni (ER) e progesterone, che vengono utilizzati per selezionare pazienti affette da carcinoma mammario da trattare con terapia endocrina (Group 1998); amplificazione di HER-2 per trattamento con Trastuzumab (Slamon, Leyland-Jones et al. 2001); traslocazioni BCR-ABL in leucemia mieloide cronica e mutazioni di c-Kit nei tumori stromali gastrointestinali per trattamento con Imatinib (Druker 2002; Heinrich, Corless et al. 2003); mutazioni di EGFR nel cancro polmonare per trattamento con Gefitinib/Erlotinib (Sequist, Bell et al. 2007); mutazioni di KRAS in cancro colo-rettale per trattamento con Cetuximab (Lievre, Bachet et al. 2008).

“Biomarcatori di arricchimento”, ossia marcatori in grado di predire quali sottogruppi possano rispondere alla terapia (McShane, Hunsberger et al. 2009) sono una necessità fondamentale. Possono infatti permettere di focalizzare la sperimentazione in sottogruppi in cui possa essere utile, aumentando la probabilità di successo e l'efficacia delle sperimentazioni di nuovi composti farmacologici. La combinazione HER2/Herceptest/Trastuzumab fornisce un esempio di uso con successo di mezzi diagnostici per terapia mirata (McShane, Hunsberger et al.

2009). Altri casi, peraltro in numero limitato, di marcatori predittivi e di arricchimento sostengono 1’ utilità di questa strategia (Karapetis, Khambata-Ford et al. 2008; McShane, Hunsberger et al. 2009).

Tuttavia, i marcatori biologici attualmente disponibili fanno riferimento, nella maggior parte dei casi, o al bersaglio terapeutico stesso o ad un componente individuale della via di segnale principale attraverso cui si pensa che il bersaglio agisca. Il limite comune a queste strategie è quello di considerare l’alterazione di una singola via di segnale come l’unica responsabile della crescita di un tumore. Alla base della tumorigenesi esiste, invece, un processo di progressione a più stadi (Hanahan and Weinberg 2000). Diverse linee di evidenza, tra cui i dati ottenuti dal sequenziamento di interi esomi (Greenman, Stephens et al. 2007; Wood, Parsons et al. 2007) e l’analisi su microarray dei profili di espressione genica tumorale (Sotiriou and Pusztai 2009) (Nevins and Potti 2007) rivelano in questi un numero estremamente elevato di mutazioni diverse ed una grande complessità di interazioni tra diverse vie di segnale. Queste indagini, classificando i tumori in sottogruppi differenziati rilevanti dal punto di vista clinico, fanno emergere l’importanza di colpire multiple vie di segnale o vie finali comuni al fine di ottenere un trattamento efficace.

Le alterazioni genetiche classicamente coinvolte nella tumorigenesi riguardano oncogeni, tra i quali PI3K, Ras, BCR-ABL, EGFR, HER-2 (“oncogene addiction” (Weinstein 2002)), e sono necessarie sia per l’ innesco che per il mantenimento dello stato oncogenico, risultando pertanto un logico bersaglio di terapia. Tuttavia, lo stato tumorigenico dipende anche da una grossa varietà di geni e pathways coinvolti nelle funzioni cellulari normali, che presentano una regolazione alterata pur non essendo intrinsecamente oncogenici (“non-oncogene addiction” (Solimini, Luo et al. 2007; Luo, Solimini et al. 2009). Questa dipendenza può fornire un ampio numero di bersagli farmacologici con tossicità differenziale tra cellule normali e tumorali (Luo, Solimini et al. 2009): tra di essi, alcuni sono in fase di studio su modelli pre-clinici. Solo alcuni sono in fase di sperimentazione clinica o già utilizzati in terapia (VEGF, ad esempio, per il trattamento con Bevacizumab (Ferrara, Hillan et al. 2004) o Sorafenib/Sunitinib (Motzer, Michaelson et al. 2006; Escudier, Eisen et al. 2007).

Al fine di migliorare l’efficacia delle terapie esistenti e di identificare nuovi bersagli terapeutici, all’analisi di oncogeni classici occorre, dunque, affiancare lo studio delle vie di segnale normali (Luo, Solimini et al. 2009). Tali marcatori “normali”, tuttavia, pur emergendo come fattori importanti nel sostegno della tumorigenesi, sono ancora poco utilizzati per la predizione di risposta a terapie nell’uomo.

Trop-2 è un controllore fondamentale di crescita tumorale

Trop-2 (AC: P09758) è una glicoproteina transmembrana in grado di trasdurre un segnale di aumento del calcio citoplasmatico (Ripani, Sacchetti et al. 1998), è coinvolta in processi di adesione cellula-cellula nei tessuti epiteliali, e guida reti di segnale che inducono crescita tumorale (Guerra, Trerotola et al. 2012). Trop-2 ha caratteristiche strutturali diverse da quelle delle quattro famiglie classiche di molecole di adesione, integrine, caderine, selectine e Ig-CAM (Chothia and Jones 1997; Aplin, Howe et al. 1998; Humphries and Newham 1998). Il dominio extracellulare di Trop-2 contiene una porzione globulare ricca di cisteine con un dominio simil-EGF (dominio GA733 tipo-I (Chong and Speicher 2001)) e un dominio di tipo tireoglobulinico (Linnenbach, Seng et al. 1993; Fornaro, Dell'Arciprete et al. 1995; El-Sewedy, Fornaro et al.

1998), necessari per la formazione di omo-multimeri (Balzar, Briaire-de Bruijn et al. 2001). Una regione senza cisteine (“stelo”) connette la parte globulare di Trop-2 all’ elica idrofobica transmembrana. La porzione intracellulare di Trop-2 è costituita da una coda di 26 aa priva di attività enzimatica, contenente una sequenza HIKE di legame ai fosfoinositidi (El-Sewedy, Fornaro et al. 1998; Ciccarelli, Acciarito et al. 2000). HIKE è presente in molecole che trasducono il segnale e può agire come sito di aggancio per molecole effettrici/regolatrici quali proteine G, PKC, calmodulina (Alberti 1999). HIKE include anche un sito di fosforilazione da parte di proteine PKC (S303) (Basu, Goldenberg et al. 1995).

L’ espressione di Trop-2 è stata associata alla crescita tumorale in modelli sperimentali (Klein, Hartmann et al. 1990; Basu, Goldenberg et al. 1995; Wang, Day et al. 2008; Cubas, Zhang et al. 2010; Goldstein, Stoyanova et al. 2010). Nei tumori umani Tiperespressione di Trop-2 ha valore prognostico negativo nei tumori del pancreas (Fong, Moser et al. 2008), dello stomaco (Muhlmann, Spizzo et al. 2009), del cavo orale (Fong, Spizzo et al. 2008), dell’ ovaio (Bignotti, Todeschini et al. 2010), del polmone (Kobayashi, Minami et al. 2010) e del colon-retto (Ohmachi, Tanaka et al. 2006). Trop-2 è inoltre un marcatore di cellule progenitrici neoplastiche a livello prostatico (Goldstein, Stoyanova et al. 2010; Trerotola, Rathore et al. 2010) .

Gli Autori della presente invenzione hanno precedentemente dimostrato che Trop-2 è espresso ad alti livelli dalla maggioranza dei tumori e linee cellulari tumorali nell’uomo (Trerotola, Cantanelli et al. 2012). In particolare gli Autori hanno dimostrato che Trop-2 è iperespresso nelle cellule tumorali anche rispetto a tessuti di origine che già lo esprimano (S. Alberti “Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in thè treatment and diagnosis of tumors” - PCT/IT2009/000035), indicando che l aumentata espressione conferisce un vantaggio selettivo alle cellule tumorali (Trerotola, Cantanelli et al. 2012).

Gli Autori della presente invenzione hanno precedentemente dimostrato la funzione di stimolo di Trop-2 nello sviluppo di tumori, in vitro ed in vivo. L’ iperespressione di Trop-2 stimola la crescita di cellule sia immortalizzate che tumorali, con un aumento della proporzione di cellule nella fase S del ciclo cellulare Al contrario, Tutilizzo di small-interfering (si)RNAs diretti contro Trop-2 abolisce la proliferazione di cellule di carcinoma mammario e di carcinoma del colon esprimenti Trop-2. Risultati simili sono stati ottenuti anche in tumori sperimentali: Γ iperespressione di Trop-2 aumenta drasticamente la crescita tumorale, in misura proporzionale ai livelli di espressione.

L’ integrità della coda citoplasmatica di Trop-2 è necessaria affinchè si abbia stimolo di crescita: delezione dell’ intera coda o del dominio HIKE, mutazioni puntiformi a carico della serina 303 (fosforilata da PKCa) e 322, sostituzione dei 4 residui di acido glutammico, che conferiscono carica negativa lungo tutto un versante dell’ α-elica, con residui positivi di lisina, provocano la perdita dell’ attività stimolatoria di Trop-2 (Figura 1).

La stimolazione della crescita cellulare, sia in vitro che in vivo, è stata ottenuta attraverso l iperespressione di un Trop-2 normale. In maniera coerente, gli Autori della presente invenzione non hanno identificato nei tumori mutazioni o alterazioni strutturali del gene TROP2, sia a livello di regione codificante che nelle regioni 5’ e 3’ UTR, e nelle regioni prossimali al promotore (Trerotola, Cantanelli et al. 2012).

Questi risultati indicano che il solo aumento di espressione di Trop-2, in assenza di mutazioni, è sia necessario che sufficiente per stimolare la crescita di cellule tumorali (Trerotola, Cantanelli et al. 2012). Trop-2 è pertanto un “non-oncogene” dalla cui iperespressione dipende la crescita tumorale (Trerotola, Cantanelli et al. 2012). Lo stimolo di crescita è indipendente dall’istotipo (carcinoma, sarcoma) e dalla specie (umana, murina), indicando che la rete di segnale attraverso cui Trop-2 agisce (Guerra, Trerotola et al. 2012) è altamente conservata (Trerotola, Cantanelli et al. 2012) (S. Alberti “Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in thè treatment and diagnosis of tumors” - PCT/IT2009/000035).

Questa rete di segnale viene ora ulteriormente definita dagli Autori, allo scopo di identificare molecole effettrici attivate in modo specifico e differenziale nei tumori iperesprimenti Trop-2, da utilizzare come bersagli di terapia antitumorale mirata Trop-2 dipendente.

Trop-2 è trasduttore di segnale attraverso reti di tetraspannine

Analisi di microscopia elettronica svolte dagli Autori dimostrano che Trop-2 si localizza in aggregati in macrovilli della superficie apicale della cellula, in villi che si estendono tra cellule e in regioni discrete di membrana (Figura 2). Ulteriori indagini hanno identificato tali aggregati come reti di tetraspannine, piattaforme strutturali di membrana in grado di dirigere reti molecolari di interazione tra proteine di segnale. Infatti Tanalisi sistematica in microscopia confocale delle interazioni tra Trop-2 e marcatori specifici di tali piattaforme macromolecolari (Barreiro, Zamai et al. 2008) ha rivelato co-localizzazione di Trop-2 con tetraspannine e molecole ad esse associate (CD9), sia in cellule intatte (Figura 3 a) che in “impronte cellulari” (“celi footprints” (Hakomori 2002)) (Figura 3c). E’ stata inoltre dimostrata un’interazione fisica diretta tra Trop-2 e CD9, CD81, CD82, CD151 in cellule umane e murine, mediante tecniche di co-capping e co-immunoprecipitazione (Figura 3b,e). Al contrario, Trop-2 non co-localizza con la caveolina, marcatore caratteristico dei lipid rafts (Figura 3a-c).

E noto come le tetraspannine leghino i propri partners in modo colesterolo-dipendente (Hakomori 2002): ulteriore conferma del fatto che Trop-2 sia componente integrale delle piattaforme tetraspanniniche è fornita dalla capacità di metil-β-ciclodestrina e digitonina, rispettivamente in grado di rimuovere e precipitare il colesterolo dalle membrane cellulari Hakomori, 2002 #12327, Charrin, 2003 #17269], di indurre il rilascio di Trop-2 nel terreno di coltura e la precipitazione di Trop-2 da Usati di membrane cellulari in BRIJ (Le Naour, Andre et al. 2006)) (Figura 3f).

La rete di segnale di Trop-2

Le reti di tetraspannine fungono da supporto per diversi recettori cellulari di superficie che attivano lipidi, proteine chinasi ed effettori intracellulari (Hemler 2003; Le Naour, Andre et al. 2006). Coerentemente, gli Autori della presente invenzione avevano già dimostrato come Trop-2 fosse in grado di modulare T espressione di recettori trans-membrana tirosina-chinasici (PDGFR, Met, Ret, VEGFR), tirosina- e serina/treonina-chinasi, fosfatasi, molecole regolatrici del ciclo cellulare e dell’ apoptosi (Guerra, Trerotola et al. 2012) (S. Alberti “Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in thè treatment and diagnosis of tumors” -PCT/IT2009/000035). Tali risultati vengono qui estesi grazie a nuove analisi proteomiche (Figura 4). L’ applicazione di strumenti bioinformatici per Tanalisi statistica dei contatti proteina-proteina (Minguez, Gotz et al. 2009) e per Γ analisi di pathway (Ingenuity Pathways Analysis software) ha quindi permesso di definire la principale rete di segnale di Trop-2 (Guerra, Trerotola et al. 2012) (Figura 5). Le molecole guidate da Trop-2 includono trasduttori di segnale (recettori transmembrana, Tyr e Ser/Thr chinasi citoplasmatiche fosfatasi), componenti della sintesi, modellamento e degradazione delle proteine, enzimi coinvolti nella sintesi di acidi nucleici e nel metabolismo di carboidrati). Più di due terzi (114/165) di tutte le proteine modulate da Trop-2 (Figura 4) sono legate in contatti proteina-proteina (Figura 5a). Questa rete di contatti proteina-proteina è stata identificata come un importante percorso di segnale per la crescita del cancro (Figura 5b), che comprende i pathways PKC, Akt/Gsk3β/S6K e ERK, e gli effettori NF-kB, Jun, CREB1, STATs, Rb e p53 (Guerra, Trerotola et al. 2012).

Reclutamento di Trop-2 e PKCa da parte di CD9

I dati ottenuti hanno quindi permesso agli Autori della presente invenzione di dimostrare che la rete di segnale di Trop-2 è mediata in modo fondamentale dalle PKC. Complessivamente, Trop-2 modula 7 PKC e 55 substrati/molecole regolatone di PKC (Figure 4 e 5). PKCa mostra il maggior aumento di fosforilazione al suo sito attivatorio S657 in cellule esprimenti Trop-2 (Figura 4a), indicando che la sua attivazione è Trop-2-dipendente. Ciò è coerente con l'attivazione della via di ERK (Kawakami, Kitaura et al. 2003), con la modulazione di PP2a (fosfatasi coinvolta nell’inattivazione di PKCa (Newton 1995)) e di PDK1 (che fosforila PKCa ai siti attivatori (Parekh, Ziegler et al. 2000)) indotta da Trop-2. PKCa è frequentemente overespressa nei tumori (Tan, Li et al. 2006), e guida i processi di segnale coinvolti nel cancro (Tan, Li et al. 2006; Rosse, Linch et al. 2010). PKCa è inoltre uno degli effettori principali di CD9 (Zhang, Bontrager et al. 2001), ed è reclutata verso i complessi tetraspanninici (Zhang, Bontrager et al. 2001; Rosse, Linch et al. 2010), dove viene attivata da diacilglicerolo (DAG) (Parekh, Ziegler et al. 2000).

In base a queste indicazioni, gli Autori della presente invenzione hanno dimostrato che microdomini di CD9 funzionano come punti di legame tra PKCa e Trop-2: PKCa coimmunoprecipita con le tetraspannine CD81 e CD151 e, soprattutto, con CD9 (Figura 3 e). In maniera analoga, Trop-2 co-immunoprecipita con CD9, CD81, CD82 e CD151 (Figura 3e). Inoltre CD9, Trop-2 e PKCa co-localizzano in sottodomini definiti di membrana in maniera fosforilazione-dipendente (Figura 3c, d), dimostrando quindi che sia Trop-2 che PKCa vengono reclutati verso i microdomini tetraspanninci mediante l’interazione con CD9.

Attivazione della via di Akt

L’ analisi bioinformatica di questa rete di segnale ha poi portato gli Autori ad identificare la via di Akt come via centrale nello stimolo della crescita cellulare indotto da Trop-2, attraverso le vie di GSK3 ed S6K, ma non quella di mTOR (Fig. 6). Akt è il principale effettore a valle di PI3K. I siti di attivazione di Akt, T308 e S473 sono bersagli di fosforilazione. Il complesso rictor-mTOR, insieme ad ILK (Koul, Shen et al. 2005), fosforila Akt alla S473 (Sarbassov, Guertin et al. 2005), ma non ha ruoli nella fosforilazione alla T308 e nell’attivazione degli effettori GSK3 e S6K (Iacinto, Facchinetti et al. 2006). Coerentemente, Trop-2 induce la fosforilazione di Akt-T308, ma non di Akt-S473 (Figura 6b), e modula la fosforilazione di GSK3 ed S6K (Figura 4a), ma non di mTOR La down regolazione di ILK, precedentemente dimostrata su chip proteomico dagli Autori della presente invenzione, e la riduzione, ulteriormente aumentata da PMA, della fosforilazione Akt-S473 da parte di Trop-2 (Figura 6b), è coerente con la down-regolazione di ILK e della fosforilazione Akt-S473 indotta da PKC (Wen, Huang et al.

2003). Al contrario, Trop-2 induce la fosforilazione Akt-T308 (Figura 6b), in maniera coerente con la riduzione stechiometrica, anch’essa precedentemente dimostrata su chip proteomico, delle subunità catalitica e regolatoria di PP2A (fosfatasi Ca<2+>-dipendente di T308) (Freeley, Park et al.

2007), piuttosto che con l’induzione di PDK1 (Figura 4a) Coerentemente con un meccanismo PKCa-independente, il PMA non ha effetto sui livelli di fosforilazione Akt-T308 (Figura 6b).

L’ interazione di Trop-2 con i complessi tetraspanninici di membrana ed in particolare con CD9 attiva quindi una complessa rete di segnale a valle, che ha come componente critico la via di Akt, e che induce stimolo della proliferazione cellulare.

Gli Autori hanno quindi studiato l effetto dell’ inibizione selettiva di CD9 e Akt in cellule proliferanti esprimenti Trop-2. L’abbattimento di CD9, mediato da siRNA (Figura 7a, b) risulta in una forte riduzione nella proliferazione di cellule MTE4-14 esprimenti Trop-2, ma non ha essenzialmente alcun impatto sulle cellule Trop-2-negative (Figura 7d). Tale riduzione è paragonabile a quella causata dal silenziamento di Trop-2 (Figura 7d), ed è coerente con il ruolo essenziale di Trop-2 nella crescita di cellule tumorali. Considerato, inoltre, che l’espressione di CD9 non è influenzata da Trop-2 (Figura 7c), questi risultati indicano anche che CD9 è necessario per la stimolazione della crescita tumorale da parte di Trop-2, ma è altrimenti inattiva sulla crescita cellulare basale. L’ inibizione di Akt sia mediante silenziamento che con farmaci specifici induce un forte calo della proliferazione cellulare in cellule esprimenti Trop-2, in maniera dose dipendente, mentre non ha effetto sulle cellule di controllo (Figura 8). Coerentemente tumori esprimenti Trop-2 iniettati sottocute in modelli animali vengono fortemente rallentati nella loro crescita da farmaci specifici che inibiscono l attività di Akt (Figura 9). Akt qundi ha un ruolo funzionale centrale nel mediare lo stimolo di crescita di Trop-2, e l’inibizione farmacologica di questa molecola ha effetto terapeutico anticancro in modelli preclinici. In sommario, gli Autori della presente invenzione hanno identificato una rete di segnale stimolatoria della crescita di tumori, che è specificamente attivata da Trop-2 attraverso Γ interazione con CD9 e l attivazione della via di segnale di Akt. L’ espressione di Trop-2 impone sensibilità agli inibitori di Akt e CD9, che arrestano selettivamente la crescita delle cellule esprimenti. Questi risultati aprono una modalità originale di terapia antitumorale personalizzata. Descrizione della presente invenzione

Oggetto della presente invenzione è l' identificazione di Trop-2 come marcatore predittivo di risposta a specifici approcci terapeutici. Gli autori hanno definito il proteoma di Trop-2 mediante indagini su vasta scala e analisi bioinformatiche stringenti. Questo ha permesso di identificare nodi centrali della rete di segnale di Trop-2, incluse le vie regolatone di proliferazione cellulare e della crescita tumorale, come bersagli terapeutici anicancro.

Gli autori hanno dimostrato che la molecola di membrana CD9 è fondamentale per Fazione di attività di stimolo di crescita da parte di Trop-2, e che Tinibizione di CD9 mediante siRNA anti-CD9 aventi sequenza bersaglio

senso 5’ GGTAGCAAGT GCATCAAAT 3’ (SEQ ID NO:l),

antisenso 5’ ATTTGATGCA CTTGCTACC 3’(SEQ ID NO:2),

ad esempio inclusa nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

senso 5’ gatccccGGT AGCAAGTGCA TCAAATttca agagaATTTG ATGCACTTGC TACCtttttg gaaa 3’ (SEQ ID NO:3),

antisenso 5’ agcttttcca aaaaGGTAGC AAGTGCATCA AATtctcttg aaATTTGATG CACTTGCTAC Cggg 3’ (SEQ ID NO:4),

è in grado di abolire la crescita cellulare indotta da Trop-2.

Gli autori hanno anche dimostrato che il segnale di Akt è fondamentale per Fazione di attività di stimolo di crescita da parte di Trop-2, e che l’inibizione di Akt mediante siRNA abolisce la crescita dipendente da Trop-2. Le sequenze di siRNA anti-Akt che si sono dimostrate efficaci nell’ inibizione della crescita stimolata da Trop-2 sono le seguenti:

#1 senso 5’ GCACCTTTAT TGGCTACAA 3’ (SEQ ID NO:5),

#1 antisenso 5’ TTGTAGCCAA TAAAGGTGC 3’ (SEQ ID NO:6),

ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina :

#1 senso 5’ gatccccGCA CCTTTATTGG CTACAAttca agagaTTGTA GCCAATAAAG GTGCtttttc 3’ (SEQ ID NO: 7),

#1 antisenso 5' tcgagaaaaa GCACCTTTAT TGGCTACAAt ctcttgaaTT GTAGCCAATA AAGGTGCggg 3’ (SEQ ID NO: 8)

e

#2 senso 5’ GGAAGGTGAT TCTGGTGAA 3’ (SEQ ID NO: 9),

#2 antisenso 5’ TTCACCAGAA TCACCTTCC 3’ (SEQ ID NO: 10)

ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

#2 senso 5' gatccccGGA AGGTGATTCT GGTGAAttca agagaTTCAC CAGAATCACC TTCCtttttc 3’ (SEQ ID NO:l 1),

#2 antisenso 5' tcgagaaaaa GGAAGGTGAT TCTGGTGAAt ctcttgaaTT CACCAGAATC ACCTTCCggg 3’ (SEQ ID NO: 12).

Gli autori hanno inoltre dimostrato che Γ inibizione di Akt mediante inibitori farmcologici, ad esempio MK-2206 ed A6730, è efficace nell’ inibire la crescita stimolata da Trop-2, sia in cellule in coltura che in tumori sperimentali.

In sommario, oggetto della presente invenzione è l’uso in campo terapeutico di Trop-2 come marcatore di risposta a terapie antitumorali che abbiano come bersaglio le molecole Trop-2-dipendenti descritte nella presente invenzione, e come specifico marcatore di risposta alla terapia anti-tumorale diretta contro CD9 e Akt.

Oggetto della presente invenzione è Γ uso di Trop-2 come indicatore chiave di terapia tumorale personalizzata, la cui espressione consente di individuare i pazienti sensibili a terapia.

Un’altra rivendicazione della presente invenzione sono metodi in vitro e in vivo per identificare inibitori di tirosin-chinasi, anticorpi monoclonali o qualsivoglia altra tipologia di agenti farmacologici diretti contro le molecole di segnale Trop-2-dipendenti descritte nella presente invenzione, e in modo specifico contro CD9 e Ak , che possano essere utilizzati a livello sperimentale o terapeutico per inibire selettivamente la crescita tumorale. Forma oggetto specifico della presente invenzione 1’ identificazione di Trop-2 come molecola in grado di predire la risposta all’inibizione di CD9 e Akt come nodi chiave del segnale Trop-2-dipendente, ed i modi e metodi usati per tale inibizione in campo terapeutico anticancro. Un esempio di tali metodi è costituito dal silenziamento dell’ RNA messaggero di tali molecole tramite silenziatori aventi le sequenze descritte nel presente brevetto ed identificate come SEQ ID NO: 1-12. Un altro esempio è costituito dall’ utilizzo di inibitori farmacologici di tali molecole, inclusi MK-2206 ed A6730.

Un metodo di realizzazione della presente invenzione è l’inibizione delle vie di segnale di Trop-2 per uso terapeutico. Sia Trop-2 che le molecole chiave di trasduzione di segnale dipendente da Trop-2 possono essere inibite, a titolo di esempio non esclusivo, usando molecole mutagenizzate corrispondenti, che fungano da ‘dominanti negativi’, o attraverso anticorpi intraed extra-cellulari, siRNA o farmaci specifici, applicando tecnologie note in arte.

Un altro modo di realizzazione della presente invenzione è attraverso metodi per la rilevazione o la diagnostica di malattie neoplastiche, pre-neoplastiche e non, esprimenti Trop-2 come marcatore di risposta/arricchimento oggetto della presente invenzione, in associazione o meno alla espressione di biomarcatori classici.

Trop-2 può essere quantificato a livello genomico o proteico su biopsie costituite da cellule e tessuti freschi e congelati da ricercatori esperti nell’arte applicando tecniche note. Kit e strumentazione per estrazione, purificazione e quantificazione possono essere acquisiti da fonti commerciali.

La determinazione dei livelli di Trop-2 può essere utilizzata per indirizzare o meno la terapia antitumorale con inibitori di chinasi o anticorpi monoclonali diretti contro molecole dipendenti da Trop-2 e contro CD9 e Akt in particolare, come descritto nella presente invenzione, dirigendo la scelta della terapia più idonea, mirata alle caratteristiche ‘personali’ di ogni singolo caso di tumore.

La determinazione dei livelli di Trop-2 può essere inoltre utilizzata per Tidentificazione di sottogruppi di pazienti potenzialmente responsivi, reclutabili in sperimentazioni cliniche di farmaci diretti contro molecole dipendenti da Trop-2, in modo particolare CD9 e Akt.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

Figura 1. Determinanti della coda citoplasmatica di Trop-2 responsabili dello stimolo di crescita, (a) Predizione della struttura secondaria della parte C-terminale di Trop-2 (aa 275-323); i residui aminoacidi ci carichi negativamente sono sottolineati. I programmi di predizione utilizzati sono indicati sulla sinistra, h (evidenziato in grigio scuro): oc-elica; e (evidenziato in nero): foglietto B; c (evidenziato in grigio chiaro): regione ponte (loop). La struttura secondaria consenso della predizione è indicata in basso, con il punteggio per singolo residuo in una scala dall’ 1 al 10. Lo score di accuratezza della previsione è >80% (cubic.bioc.columbia.edu). (b) Sequenza dei mutanti della coda citoplasmatica di Trop-2; la sequenza normale (wt) è riportata in alto. Il dominio HIKE è evidenziato dal riquadro grigio; la posizione delle serine fosforilabili è evidenziata in bianco. S303A, S322A: mutazioni puntiformi con trasformazione della serina 303 e 322, rispettivamente, in alanina; E->K: mutazioni puntiformi con trasformazione degli acidi glutammici 310, 313, 316 e 320 in lisine; AHIKE: delezione della regione HIKE; Acito: delezione dell’intera coda citoplasmatica, (c) Effetto delle mutazioni della coda citoplasmatica sulla crescita Trop-2 dipendente. Curve di crescita di cellule MTE4-14 transfettate con il vettore vuoto o con Trop-2 normale o i mutanti indicati. Differenza tra normale e mutanti: P<0.0001 (ANOVA a due vie). Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per singoli punti temporali (test di Bonferroni per confronti multipli): **** < 0.0001. Barre: errore standard della media.

Figura 2. Localizzazione dei signalosomi di Trop-2. Analisi in microscopia elettronica dell’ espressione di Trop-2. (a) Cellule di carcinoma mammario MCF7 colorate con anticorpi anti-Trop-2 coniugati ad oro colloidale (punti neri). Trop-2 viene identificato in corrispondenza di proiezioni villari allungate e macrovilli (punte di freccia) e in domini discreti di membrana. I cerchi bianchi di 30 nm di diametro sono centrati su particelle d’oro individuali, e comprendono le aree con più alta probabilità di contenere molecole legate a Trop-2. Barra: 50 nm. (b) Cellule esprimenti Trop-2 colorate con anticorpi anti-Trop-2 coniugati ad immuno-perossidasi (depositi granulari scuri). Cellule 293 trasfettate con Trop-2 (i), cellule di carcinoma ovarico OVCA-432 (ii) e cellule MCF7 (iii). Trop-2 si localizza a livello di membrana (punte di freccia) nei contatti cellula-cellula (i; inserto: ingrandimento dell’ area di contatto), in proiezioni villari (ii) e in domini discreti di membrana (iii). La presenza di Trop-2 viene rilevata anche a livello di vescicole intracitoplasmatiche (frecce).

Figura 3. Interazione di Trop-2 e PKCa con molecole tetraspanniniche e CD9. (a-d) Analisi in microscopia confocale di membrane cellulari intatte (a), zone di membrana soggette a co-capping (b), impronte di membrana cellulare (footprints) (c, d) di cellule MTE 4-14 trasfettate con Trop-2 (a-c, d sopra) o con il vettore vuoto (d sotto) trattate contemporaneamente con anticorpi anti-Trop-2 e anti-CD9 (componente di isole tetraspanniniche) o anti-caveolina (controllo negativo) (a-c) o anti CD9 e anti PKCa (d) coniugati con molecole fluorescenti. Zone di colocalizzazione sono evidenziate da punte di frecce, (e) Co-immunoprecipitazione di Trop-2, PKCa, CD9 e tetraspannine. L’immunoprecipitazione (IP) è stata effettuata usando anticorpi primari contro le molecole murine CD9, CD81 e CD151 (cellule MTE 4-14) o umane CD9, CD82 e CD151 (cellule MCF7); la presenza di Trop-2 e di PKCa nell’ immunoprecipitato è stata rivelata mediante Western blot. IP con anti-Trop-2: controllo positivo, (f) Associazione Trop-2/colesterolo. Rilascio di Trop-2 nel mezzo di coltura in seguito a trattamento con metil-βciclodestrina (MpCD) (sinistra). Precipitazione di Trop-2 con digitonina da Usati in BRIJ (destra). I trattamenti sono stati effettuati su cellule MTE4-14 trasfettate con Trop-2 e la presenza di Trop-2 nelle frazioni solubile e insolubile è stata valutata mediante Western blot.

Figura 4. Il proteoma di Trop-2. (a) Quantità e fosforilazione di molecole di segnale in trasfettanti MTE 4-14, misurate in Western blot. V: solo vettore; T2: Trop-2. 1 pannelli a quattro bande mostrano due paia di misurazioni indipendenti, (b) Gel bidimensionali di estratti proteici di cellule MTE 4-14 trasfettate con il solo vettore (sinistra) o con Trop-2 (destra); i cerchi indicano proteine represse (R; sinistra) o indotte (i; destra) dall’ espressione di Trop-2.

Figura 5. Rete di segnale di Trop-2. (a) Rete dei contatti proteina-proteina guidati da Trop-2 (analisi SNOW). Cerchi: tutte le proteine modulate da Trop-2 che possono entrare in contatto fisico tra di loro (114 delle 165 proteine identificate). Rettangoli: “connettori” tra due proteine. Le linee (“bordi”) rappresentano i contatti proteina-proteina, (b) Rete di segnale tumorale guidata da Trop-2. Le proteine modulate da Trop-2 (in nero) sono state mappate mediante il programma Ingenuity Pathway Analysis. Esagoni: chinasi; trapezi: piccole proteine G e loro interattori; rettangoli: fattori apoptotici; ovali: fattori di trascrizione/proteine di rimodellamento della cromatina; doppi cerchi: complessi proteici. In grigio sono evidenziate molecole segnale non proteiche. Linee grigie spesse: membrana cellulare; riquadri grigi: compartimenti nucleare e mitocondri al e. P = 6.19xl0<'45>.

Figura 6. Controllo della rete si segnale di Akt da parte di Trop-2. (a) Mappa della rete di segnale Trop-2/ Akt. Le proteine modulate da Trop-2 (in nero) sono state mappate mediante il programma Ingenuity Pthway Analysis. Esagoni: chinasi; rettangoli: fattori apoptotici; rombi: fosfatasi; ovali: fattori di trascrizione/proteine di rimodellamento della cromatina; doppi cerchi: complessi proteici. In grigio sono evidenziate molecole segnale non proteiche. Linea grigia spessa: membrana cellulare, (b) Modulazione dei livelli di fosforilazione in treonina 308 e serina 473 di Akt da parte di Trop-2. Western blot di cellule MTE 4-14 trasferiate con il solo vettore o con Trop-2, in presenza o meno di PMA; per ciascuna banda è indicata V intensità, normalizzata rispetto al controllo.

Figura 7. Trop-2 impone sensibilità all’ inibizione di CD9. (a, b) Controllo dell’ efficienza del silenziamento di CD9 in cellule MTE4- 14/vettore e MTE4-14/Trop-2. (a) Misurazione mediante real-time RT-PCR dei livelli di mRNA di CD9 24 ore dopo la trasfezione con siRNA inefficace di controllo o siRNA specifico anti-CD9. Barre: deviazione standard delle misurazioni, (b) Analisi in citofluorimetra a flusso dei livelli di CD9 48 ore dopo la transfezione con siRNA inefficace di controllo o siRNA specifico anti-CD9.. Profili bianchi: anticorpo di controllo, non colorato; profili grigi: anticorpo anti-CD9 coniugato ad Alexa-488. (c) Analisi in citofluorimetra a flusso dei ivelli di CD9 in cellule murine o umane stabilmente transfettate con Trop-2 (MTE 4-14/Trop-2, IGROV/Trop-2, KM12-SM/Trop-2) o endogenamente esprimenti Trop-2 (HCT116 U5.5, MCF7, HT29). Profili bianchi: anticorpo di controllo, non colorato; profili grigi: anticorpo anti-CD9 coniugato ad Alexa-488. (d) Curve di crescita di cellule MTE4-14/vettore (sinistra) e MTE 4-14/Trop-2 (destra) trasferiate con siRNA inefficace di controllo o specifico anti-CD9 o anti-Trop-2. Barre: errore standard della media.

Figura 8. Trop-2 impone sensibilità all’ inibizione di Akt. Curve di crescita di cellule MTE 4-14 trasferiate con il solo vettore o con Trop-2 e trattate con siRNA inefficaci di controllo o specifici anti-Akt (sinistra) o con solvente da solo o inibitori farmacologici di Akt (centro, destra), alla dose singola di 400 nM o a dosi diverse come indicato. Barre: errore standard della media.

Figura 9. Inibizione della crescita di tumori esprimenti Trop-2 mediante inibizione di Akt. Curve di crescita in vivo di cellule di cancro del colon Colo205 (alto) o MTE 4-14 trasferiate con Trop-2 (basso) trattate con il solo solvente o con V inibitore farmacologico di Akt MK-2206. Cellule MTE 4-14 di controllo trasferiate con il vettore vuoto non hanno potere tumorigenico in questo modello. Differenza tra controllo e trattato: P<0.0001 (ANOVA a due vie). Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per singoli punti temporali (test di Bonferroni per confronti multipli ): * < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001**** < 0.001. Barre: errore standard della media. Inserti, analisi citofluorimetrica dell’ espressione di Trop-2 nelle cellule tumorali e nei trasfettanti: profili bianchi, anticorpo di controllo, non colorato; profili grigi, anticorpo anti-Trop-2 coniugato ad Alexa-488.

ESEMPIO 1: Studio della rete di segnale di Trop-2 ed analisi in vitro e in vivo per la scoperta di bersagli terapeutici dipendenti da Trop-2 da utilizzare per terapie personalizzate anticancro secondo la presente invenzione.

Materiale e metodi

Colture cellulari

Le linee cellulari umane MCF-7 e OVCA-432 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (GibcoBRL, Paisley, Scotland). Le linee cellulari umane 293, KM12SC, e le cellule murine immortalizzate MTE 4-14 (Naquet, Lepesant et al. 1989) ed L sono state coltivate in DMEM. Ai terreni sono stati aggiunti il 10% di siero fetale bovino (GibcoBRL, Paisley, Scotland), 100 IU/ml penicillina e 100 μg/ml streptomicina (Euroclone, Milano, Italy).

Trasfezioni

Le cellule sono state transfettate con DNA mediante Lipofectamine 2000 o LTX (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. I transfettanti stabili sono stati selezionati in terreno contenente G-418.

Immunofluorescenza

Cellule seminate su vetrini copri-oggetto sono state colorate con gli anticorpi indicati, coniugati con Alexa Fluor-488/546/633, o con gli stessi anticorpi non coniugati rivelati da un anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor-488/546/633. Le cellule sono state o colorate da vive, prima della fissazione, mediante terreno addizionato di FBS al 10%, a 37°C per 5 minuti, o colorate dopo fissazione, mediante incubazione con gli anticorpi in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti Permeabilizzazione e blocco di interazioni non-specifiche sono stati effettuati con 10% FBS, 0,1% saponina (Polishchuk, Polishchuk et al. 2000) I vetrini sono stati poi lavati in PBS e montati per T osservazione mediante microscopio confocale LSM-510 META (Zeiss).

Impronte cellulari (“Celi footprints”)

I “celi footprints” sono residui di membrana cellulare che restano sulla piastre di coltura dopo il distacco delle cellule con EDTA (Hakomori 2002). Il trattamento delle cellule e Tanalisi in immunofluorescenza sono stati effettuati essenzialmente come descritto (Hakomori 2002).

Co-immunoprecipitazione.

Le cellule sono state lisate in buffer BRIJ (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgC12, 1 mM CaC12, 1% BRIJ, inibitori di proteasi). I Usati sono stati chiarificati mediante incubazione con Proteina-G accoppiata al sefarosio (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a 4 °C per 1 ora. I Usati chiarificati sono stati incubati con anticorpi primari diretti contro gli interattori di Trop-2 a 4 °C per 2 ore, e successivamente incubati con Proteina-G accoppiata al sefarosio (4 °C, 1 ora). I complessi proteici sono stati eluiti dalla resina con 0,1 M glicina, pH 2,5 ed analizzati mediante Western blot con gli anticorpi indicati.

Rimozione e precipitazione del colesterolo delle membrane cellulari

Per rimuovere il colesterolo dalle membrane cellulari cellule intatte sono state lavate tre volte con PBS per eliminare il siero e sono state successivamente incubate in terreno DMEM contenente 10 mM metil-P-ciclodestrina a 37 °C per 45 minuti (Keller and Simons 1998). Cellule di controllo sono state trattate in modo identico ma senza ciclodestrina I campioni sono stati poi centrifugati a 2000 g per rimuovere le cellule e il debris cellulare. Le proteine del sumatante sono statae precipitate con acido tri cloroacetico ed analizzate mediante Western blot.

Le cellule sono state anche staccate dalla piastra mediante raschiamento e Usate in buffer contenente 1%. BRIJ. U sumatante è stato mischiato con 1/10 (vol/vol) metanolo (controllo) o con 1/10 (vol/vol) 10% digitonina in metanolo e incubato in ghiaccio per 10 minuti (Serru, Le Naour et al. 1999). Le membrane cellulari sono state separate mediante centrifugazione a 12.000 g per 15 minuti. Il pellet è stato lavato in acetone freddo, risospeso in buffer di Laemmli e analizzato tramite Western blot.

Immuno-microscopia elettronica

Per la microscopia elettronica (EM) con anticorpi marcati con particelle d’ oro le cellule sono state fissate in 4% formaldeide, 0,05% glutaraldeide, 0,15 M HEPES, pH 7,3, per 10 minuti a 37 °C, e post-fissate per 50 minuti in 4% paraformaldeide, 0,15 M HEPES, pH 7,3, a temperatura ambiente come descritto precedentemente (Polishchuk, Polishchuk et al. 2000). Oro cationizzato, Proteina A accoppiata a oro, e anticorpi anti-coniglio coniugati a oro (particelle d’oro colloidale di 10 nm) sono state ottenute da British BioCell (Cardiff, UK). La EM con marcatura con immuno-perossidasi è stata effettuata come descritto precedentemente (Brown and Farquhar 1989). La stima di aree minime marcate è stata effettuata assumendo una lunghezza media delle molecole di anticorpo di 11 nm (Saltzman, Radomsky et al. 1994).

Saggi di crescita cellulare

Cellule MTE 4-14 trasferiate con il vettore vuoto o con Trop-2 sono state seminate in 3

quantità pari a 1,5-3 x 10 cellule/pozzetto in piastre a 96 pozzetti (cinque pozzetti replicati per ciascun punto sperimentale). Il numero di cellule è stato quantificato con il saggio colorimetrico MTT (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), o mediante colorazione con cristal violetto (Orsulic, Li et al. 2002). Il numero cellulare è stato normalizzato rispetto a una curva standard di campioni cellulari diluiti serialmente.

Anti corpi

L’antisiero policlonale di coniglio anti Trop-2 è stato generato mediante immunizzazione sottocutanea con Trop-2 ricombinante sintetizzato in batteri (Fornaro, Dell'Arciprete et al. 1995). Gli anticorpi Trop-2-reattivi sono stati purificati per legame a Trop-2 ricombinante immobilizzata su colonne NHS-Sepharose (Pharmacia), ed eluiti con glieina 0,2 M, pH 2,5. L’ anticorpo policlonale di capra anti-Trop-2 (AF650) è stato ottenuto dalla R&D Systems, Ine. (Minneapolis, MN). Gli anticorpi diretti contro molecole murine utilizzati sono: monoclonale di ratto anti-CD9 (se- 18869); monoclonale di coniglio anti-Akt (Ser473) (D9E) (Celi Segnale Technology, MA); policlonali di capra anti-CD151 (sc-18753), anti-phospho-PKCa (S657) (sc-12356), anti-Akt (sc-1618); policlonali di coniglio anti-caveolina-1 (sc-894), anti-PKCa (sc-208), anti-phospho-Akt (Thr 308) (sc-16646-R) (Santa Cruz Biotechnology); policlonale di criceto anti-CD81 (GTX75430) (GeneText, Irvine, CA). Gli anticorpi monoclonali di topo diretti contro le corrispondenti molecole umane utilizzati sono: anti-CD9 (14-0098), anti-CD98 (14-0982) (eBioscience, CA), anti-CD151 (H00000977-M02) (Abnova, Taiwan, China) e anti-CD81 (TS81) (fornito da F. Lanza). Gli anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor-488/546/633 sono stati ottenuti da Invitrogen (San Diego, CA).

Inibitori farmacologici

Le cellule sono state trattate con 50-100-200-400 nM A6730 SIGMA (Sigma Technical Company, St Louis, MO 63178-9916) o con 400nM MK-2206 (Selleck Chemicals, Houston, TX) per inibire AKT. Le soluzioni madre sono state preparate in DMSO e diluite in etanolo o acqua fino ad una concentrazione finale di DMSO e di etanolo inferiore allo 0,1% e 1%, rispettivamente. Le cellule di controllo sono state trattate con il solo solvente. Un secondo trattamento è stato effettuato 24 ore dopo la semina.

Modelli in vivo: allotrapianti in topi nudi atimici

La linea immortalizzata MTE 4-14 trasfettata con TROP2 (Alberti, Nutini et al. 1994), o cellule di carcinoma del colon Colo205, nativamente esprimenti Trop-2, sono state iniettate sottocute (4xl0<6>cellule/iniezione) in gruppi di topi nudi (femmine di 8 settimane, CDl-Foxnl nu/nu mice (Charles River Laboratories, Calco, Lecco, Italy). Le cellule MTE 4-14/T2 sono state coiniettate con Matrigel 1:3 vol/vol (Matrice con fattore di crescita ridotto, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ USA). Una soluzione stock di MK-2206 in DMSO è stata diluita al momento dell’ uso in soluzione fisiologica apirogenica, alla concentrazione finale di 0,7 mg/ml, ed il farmaco così preparato è stato somministrato intraperitonealmente alla dose di 0,35 mg/topo tutti i giorni, a partire dal momento in cui i tumori sono diventati palpabili. I topi nel gruppo di controllo sono stati trattati con il solo veicolo. I topi sono stati ispezionati visivamente ogni 5-7 giorni e sono stati misurati i diametri maggiore e minore dei tumori sperimentali. Il volume dei tumori è stato calcolato usando la formula per i volumi di ellissoide (Dxd2/2) (Tomayko and Reynolds 1989). Le cellule MTE 4-14 trasferiate con il vettore vuoto sono risultate prive di potere tumorigenico in questo modello. Le procedure coinvolgenti animali e il loro trattamento sono stati effettuati in conformità con linee guida istituzionali, le leggi nazionali e i protocolli intemazionali (D.L. No.116, G.U., Suppl. 40, Feb.18, 1992; No. 8, G.U., July, 1994; UKCCCR Guidelines for thè Welfare of Animals in Experimental Neoplasia; EEC Council Directive 86/609, OJ L 358. 1, Dee.12, 1987; Guide for thè Care and Use of Laboratory Animals, United States National Research Council, 1996).

Co-capping mediato da anticorpi

Le cellule sono state staccate dalle piastre di coltura mediante tripsina, e incubate con Fanticorpo primario anti-Trop-2 (T16) (Alberti, Miotti et al. 1992) per 20 minuti in ghiaccio. Dopo i lavaggi, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor-488 per 10 minuti a 37°C, al fine di ottenere il cross-link delle molecole bersaglio e di indurre il capping del complesso antigene-anticorpo (Levy and Shoham 2005) Le cellule così tarttate sono state fissate con 1% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente. La paraformaldeide è stata poi bloccata con FBS e le cellule sono state colorate con anticorpi diretti contro le proteine di membrana di interesse.

Analisi di Western blot

Le analisi di Western blot sono state eseguite come descritto precedentemente (El-Sewedy, Fornaro et al. 1998). In breve, i Usati cellulari sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) ed elettrotrasferiti su filtri di nitrocellulosa. I filtri sono stati incubati con anticorpi primari (Abcam, Cambridge, UK; Santa Cruz, Santa Cruz, CA) in TBS con 5% di latte scremato in polvere. I filtri ibri dizzati sono stati lavati in TBS con 0,1% Tween-20. Il legame con l’an ti corpo è stato rivelato in chemiluminescenza (ECL; Amersham, Aylesbury, UK) utilizzando anticorpi secondari anti-topo o anti-coniglio coniugati a perossidasi (Calbiochem, La Jolla, CA). L’intensità di segnale è stata quantificata mediante il programma NIH-image 1.62, usando la curva standard di scala di grigi della Kodak (www.kodak.com). Plasmidi

Il vettore di espressione pEYFP è stato ottenuto dalla Clontech (Palo Alto, CA). Un vettore corrispondente, privato della sequenza codificante EYFP, è stato utilizzato per esprimere i cDNA di TROP2 wild-type o mutagenizzato. La sequenza codificante del TROP2 umano è stata amplificata per PCR con il primer senso 5’ GCGATTCTCG AGTCCGGTCC GCGTTCC 3’ (SEQ ID NO: 13) e con il primer antisenso 5’ GCGCCGGTAC CAAGCTCGGT TCCTTTC 3’(SEQ ID NO:14) e sottoclonata nel vettore pEYFP-Nl. I vettori di espressione CD9 pCMV-SPORT6 e CD316 pCMV-SPORT6 sono stati ottenuti da Imagenes (Berlin, Germany). Le proteine chimeriche tra CD9 (EcoRI/BamHI), CD316 (EcoRI/Agel) e mCherry sono state costruite seguendo le procedure sopra descritte.

siRNA

Sono state seguite quattro strategie di progettazione, secondo le procedure fornite da: criteri Tuschl (Elbashir, Harborth et al. 2001); Invitrogen (rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/), Whitehead Institute web site (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) (Semizarov, Frost et al. 2003); Sonnhammer (sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/) (Chalk, Wahlestedt et al. 2004). I siRNA scelti sono stati quelli identificati da più di uno dei precedenti metodi, o considerati ottimali da almeno uno di essi. Le sequenze codificanti per RNA a forcina (shRNA) così ottenute (Elbashir, Harborth et al.

2001), specifiche per i geni di interesse, sono state sottoclonate nel vettore pSUPER (Brummelkamp, Bemards et al. 2002), sotto il controllo del promotore della RNA polmerasi III HI.

L’ inibizione di CD9 è stata ottenuta mediante siRNA anti-CD9 aventi sequenza bersaglio senso 5’ GGTAGCAAGT GCATCAAAT 3’ (SEQ ID NO:l), antisenso 5’ ATTTGATGCA CTTGCTACC 3’(SEQ ID NO:2), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

antisenso 5’ agcttttcca aaaaGGTAGC AAGTGCATCA AATtctcttg aaATTTGATG CACTTGCTAC Cggg 3’ (SEQ ID NO:4).

L’ inibizione di Akt è stata ottenuta mediante siRNA anti-Akt aventi sequenza bersaglio #1 senso 5’ GCACCTTTAT TGGCTACAA 3’ (SEQ ID NO:5), #1 antisenso 5’ TTGTAGCCAA TAAAGGTGC 3’ (SEQ ID NO:6), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

#1 antisenso 5' tcgagaaaaa GCACCTTTAT TGGCTACAAt ctcttgaaTT GTAGCCAATA AAGGTGCggg 3’ (SEQ ID NO: 8),

e #2 senso 5’ GGAAGGT GAT TCTGGTGAA 3’ (SEQ ID NO:9), #2 antisenso 5’ TTCACCAGAA TCACCTTCC 3’ (SEQ ID NO: 10), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

I costrutti così ottenuti sono stati transfettati in maniera transiente in cellule MTE 4-14, ed è stato valutato il loro effetto sulla proliferazione cellulare. I livelli dei trascritti dopo silenziamento sono stati quantificati mediante reai -rime RT-PCR. Sono stati utilizzati come controlli negativi dei siRNA diretti contro bersagli irrilevanti, scelti dopo verifiche approfondite di mancanza di effetti spuri sulla crescita cellulare. Le sequenze corrispondenti sono riportate di seguito; per ciascun siRNA è indicato il gene specifico al quale si riferisce, con il codice identificativo secondo la banca dati RefSeq.

siRna diretto contro Co-029/Tspan8 murino (NM 146010.2), utilizzato come controllo negativo per cellule umane, avente sequenza bersaglio senso 5’CTTTCAAACC TGAGTATAA 3’(SEQ ID NO: 15), antisenso 5’ TTATACTCAG GTTTGAAAG 3’ (SEQ ID NO: 16), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

senso 5’gatccccCTT TCAAACCTGA GTATAAttca agagaTTATA CTCAGGTTTG AAAGtttttg gaaa 3 ’ (SEQ ID NO: 17),

antisenso 5’agcttttcca aaaaCTTTCA AACCTGAGTA TAAtctcttg aaTTATACTC AGGTTTGAAA Gggg 3’(SEQ ID NO: 18).

siRna diretto contro CD133 umano (NM 006017.2), utilizzato come controllo negativo per cellule murine, avente sequenza bersaglio senso 5’ CTTGACAACG TTAATAACG 3’ (SEQ ID NO: 19), antisenso 5’ CGTTATTAAC GTTGTCAAG 3’ (SEQ ID NO:20), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

senso 5’gatccccCTT GACAACGTTA ATAACGttca agagaCGTTA TTAACGTTGT CAAGtttttg gaaa 3 ’ (SEQ ID NO:21),

antisenso 5’agcttttcca aaaaCTTGAC AACGTTAATA ACGtctcttg aaCGTTATTA ACGTTGTCAA Gggg 3’

(SEQ ID NO:22).

siRna diretto contro (CD316 umano, NM 052868.2), utilizzato come controllo negativo per cellule murine, avente sequenza bersaglio senso 5’ TGCAGGAAGTG GTGGGAAT 3’ (SEQ ID NO:23), antisenso 5’ ATTCCCACCA CTTCCTGCA 3’ (SEQ ID NO:24), ad esempio incluse nelle seguenti sequenze per la trascrizione di RNA a forcina:

senso: 5’gatccccTGC AGGAAGT GGT GGGAATttca agagaATTCC CACCACTTCC TGCAtttttg gaaa 3’

(SEQ ID NO:25),

antisenso 5’ agcttttcca aaaaTGCAGG AAGTGGTGGG AATtctcttg aaATTCCCAC CACTTCCTGC Aggg 3’ (SEQ ID NO:26).

Il silenziamento di TROP2 è stato ottenuto come precedentemente descritto (Trerotola, Cantanelli et al. 2012)

Mutagenesi del dominio citoplasmatico di Trop-2.

I mutanti del dominio citoplasmatico di Trop-2 sono stati ottenuti per PCR con i seguenti primers:

Trop-2 Acito

senso 5’ CTCGGATCCA CCATGGCTCG GGGCCCC 3’ (SEQ ID NO:27),

antisenso 5’ CTCGAATTCC CGGTTGGTGA TCACCAG 3’ (SEQ ID NO:28).

Trop-2 E→K

senso 5’ GCGgaattcC GTCCGGTCCG CGTTCCT 3’ (SEQ ID NO:29),

anti senso

5’ GCGtctagaC TACAAGCTCG GTTTCTTTCT CAACTTCCCC AGTTTCTTGA TCTTCACCTT CTTG 3’ (SEQ ID NO:30).

Trop-2 ΔΗΙΚΕ

senso 5’ GCGgaattcC GTCCGGTCCG CGTTCCT 3’ (SEQ ID NO:31),

anti senso

5’ GCGtctagaC TACAAGCTCG GTTCCTTTCT CAACTCCCCC AGTTCCTTGA TCTCCACTCT CCGGTTGGTG ATCAC3’ (SEQ ID NO:32).

Trop-2 S303A

senso 5’ CTCGGATCCA CCATGGCTCG GGGCCCC 3’ (SEQ ID NO:33),

antisenso 5’ GCGTCTAGAC TACAAGCTCG GTTCCTTTCT CAACTCCCCC AGTTCCTTGA TCTCCACCTT CTTGTACTTC CCCGCCTTTC TCCGG 3’ (SEQ ID NO:34).

Trop-2 S322A

senso 5’ CTCGGATCCA CCATGGCTCG GGGCCCC 3’ (SEQ ID NO: 35),

snti senso 5’ GCGTCTAGAC TACAAGGCCG GTTCCTTTCT CAACTCCCC 3’ (SEQ ID NO: 36).

Tutte le regioni amplificate sono state sequenziate interamente per verificare l’assenza di mutazioni indotte dalla Taq-polimerasi.

RT-PCR quantitativa

L’RNA totale dalle linee cellulari indicate è stato estratto in Trizol (Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore. Un microgrammo di RNA è stato utilizzato per ciascuna reazione di trascrizione inversa, effettuata con l’enzima ImProm-II Reverse Transcri ptase (Promega) secondo il protocollo standard. Le reazioni di PCR quantitativa sono state condotte nell’ ABI-PRISM 7900HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in presenza del colorante fluorescente di sonde TaqMan® (Roche) e primers (Hs99999905; CD9: Mm00514275_gl; B2M: Mm00437762_ml) (Applied Biosystems), secondo le istruzioni del produttore. Ogni campione è stato analizzato in triplicato con il metodo 2<'&&cr>per calcolare i cambiamenti reaitivi di espressione genica (Livak and Schmittgen 2001). Considerato che per duplicare il materiale amplificato occorrono 1.1 cicli, è stata utilizzata una base più accurata, pari a 1,8336551199 (Guerra, Trerotola et al. 2008). I geni housekeeping GAPDH e B2M sono stati utilizzati come controlli interni. Per ogni cDNA è stato calcolato: ACT (CT, target gene - CT, GAPDH/B2M), utilizzando l’analisi di regressione lineare con metodo dei minimi quadrati. Dato che l’efficienza di amplificazione si è mantenuta lineare oltre il range della quantità di RNA usato, le curve di amplificazione sono state utilizzate per calcolare i punti di sovrapposizione con i valori ottenuti dai campioni trattati con siRNA. Ogni campione è stato analizzato per la contaminazione da DNA genomico usando RNA isolato non retrotrascritto, come templato per reazioni di PCR.

2D gel e spettrometria di massa

Una visione sull’intero genoma è stata ottenuta per 2D eseguita come descritto (Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) - http://us.expasy.org/ch2d/protocols/). Le analisi di spettrometria di massa sono state ottenute presso l’Università di York (www.york.ac.uk/depts/biol/tf/proteomics/).

Analisi di pathways e costruzione delle reti di segnale di Trop-2

Il proteoma di Trop-2 è stato analizzato mediante i tools bioinformatici SNOW (snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi) e Ingenuity Pathways Analysis (IP A, Ingenuity Systems, www.ingenuity.com). SNOW (snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi) costruisce reti di interazione proteina-proteina, mappando le proteine su un interattoma di riferimento. L’ interattoma di riferimento è costituito da una serie di coppie di proteine che interagiscono fisicamente, in cui i nodi sono le proteine stesse e le linee che le uniscono (“bordi”) sono gli eventi di interazione. L’ interattoma diretto da Trop-2 è stato costruito utilizzando le banche dati HPRD (Human Protein Reference Database), IntAct, BIND (Biomolecular Interaction Network Database), DIP (Database of Interacting Proteins) e MINT (Molecular Interaction Database). Queste banche dati sono state usate per costruire una rete di connessioni minima (“minimal connected network”, MCN). Le reti di connessione sono state valutate in base al livello di connessione dei nodi (numero di bordi di ciascun nodo); la centralità (“betweenness”, una misura di centralità dei nodi e della loro distribuzione); la distribuzione dei coefficienti di raggruppamento (la connettività del vicinato di ciascun nodo); il numero dei componenti della rete (i diversi gruppi di nodi che vengono generati nel corso di una analisi di rete); i bicomponenti (il numero di gruppi di nodi connessi ad un altro gruppo di nodi da un solo bordo) e i punti di articolazione (i bordi che uniscono tra di loro i bicomponenti nella rete). Gli MCNs sono stati identificati mediante Γ algoritmo di Dijkstra, applicando Γ opzione stringente che permette Γ introduzione di una sola proteina di connessione esterna tra ogni coppia di proteine dell’ analisi. In questo modo è stato possibile ottenere una singola rete che unisce 114 delle 165 proteine modulate da Trop-2 sottoposte all’ analisi, con 22 connettori. La significatività statistica è stata verificata mediante confronti con reti generate dall’ intero interattoma di riferimento e reti a composizione casuale. Per T analisi tramite il software Ingenuity Pathways Analysis valori di espressione proteica, espressi come rapporto tra le intensità medie normalizzate del segnale dei trasfettanti con Trop-2 e dei controlli sono stati trasformati in valori di incremento, con Γ inverso negativo (-1/x) adottato per valori compresi tra 0 e 1. Visto che il set di dati era già stato filtrato, non sono stati imposte soglie minime di valore. Tutte le molecole (identificate secondo la banca dati Swiss-Prot) sono state mappate sulla banca dati relazionale Ingenuity Knowledge Base come punti focali. Questa banca dati proprietaria organizza in formato ontologico le interazioni tra proteine, estratte mediante analisi manuale dai risultati sperimentali pubblicati. Reti di molecole sono state generate massimizzando la connettività specifica, cioè la connettività tra singoli membri verso quella tra tutte le molecole della banca

dati. Le reti molecolari sono state classificate tramite un punteggio costituito dal logaritmo

negativo del valore p risultante dal test esatto di Fisher ad una coda, che considera il numero di

molecole utilizzabili della rete e la sua dimensione finale, così come la dimensione del set di dati

inserito e il numero totale di molecole della banca dati incluse nella rete. Maggiore è il

punteggio, minore è la probabilità di avere reti di interazione casuale. Le molecole identificate

come punti focali sono poi state mappate sulle vie di segnale canoniche estratte da Ingenuity.

Analisi statistica

Il test ANOVA a due vie è stata utilizzato per confrontare le curve di crescita tumorale

(Rossi, Di Lena et al. 2008).

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento caratterizzato dal fatto che Trop-2 sia utilizzato come indicatore per effettuare terapia anticancro con farmaci diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, includendo in modo non esclusivo CD9, Akt e vie di segnale collegate.
2. Procedimento come alla rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che Trop-2 sia utilizzato come indicatore predittivo di risposta a terapia anticancro con farmaci diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, includendo in modo non esclusivo CD9, Akt e le vie di segnale collegate.
3. Procedimento come alla rivendicazione n.l, caratterizzato dal fatto che Trop-2 sia utilizzato come marcatore di arricchimento in sperimentazioni cliniche sulTuomo di farmaci anticancro diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, includendo in modo non esclusivo CD9, Akt e le vie di segnale collegate.
4. Procedimento come alla rivendicazione n.l, caratterizzato dal fatto che Trop-2 sia marcatore di selezione di pazienti tumorali per terapia con farmaci anticancro diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, includendo in modo non esclusivo CD9, Akt e le vie di segnale collegate.
5. Procedimento per lo screening in vitro di farmaci specifici diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, inclusi CD9, Akt e le vie di segnale collegate, caratterizzato dall’ utilizzo di cellule esprimenti Trop-2 e cellule di controllo prive di Trop-2, coltivate in piastra, esposte all’ inibitore e analizzate a tempi diversi con saggi che misurino la proliferazione cellulare, inclusi ma non limitati a conta cellulare, colorazione con DAPI accoppiata ad analisi di immagine, colorazione con cristal violetto, e saggi colorimetrici con MTT.
6. Procedimento per lo screening in vivo di farmaci specifici diretti contro componenti della rete di segnale di Trop-2, inclusi CD9 e Akt e le vie di segnale collegate, caratterizzato dall’ utilizzo di cellule esprimenti Trop-2, eventualmente marcate con molecole emettenti fluorescenza o altro segnale rilevabile. In questo procedimento, cellule esprimenti Trop-2 e cellule di controllo prive di Trop-2 vengono iniettate sottocute o in altre sedi in modelli animali, inclusi ma non limitati a topi immunosoppressi, esposte all’ inibitore e analizzate a tempi diversi con saggi che misurino la crescita tumorale, inclusi ma non limitati a misurazioni periodiche di diametri tumorali e rilevazioni del segnale, ad esempio fluorescente, emesso dalle cellule iniettate.
7. Procedimento caratterizzato dal fatto che Γ inibizione di CD9, Akt e molecole collegate venga ottenuta mediante Γ utilizzo di siRNA specifici, aventi in modo non esclusivo le seguenti sequenze: SEQ ID NO:l, sequenza bersaglio per il silenziamento di CD9, senso: 5’ GGTAGCAAGT GCATCAAAT 3’ SEQ ID NO:2, sequenza bersaglio per il silenziamento di CD9, antisenso: 5’ ATTTGATGCA CTTGCTACC 3’ SEQ ID NO:3, oligonucleotide per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di CD9, senso: 5’ gatccccGGT AGCAAGTGCA TCAAATttca agagaATTTG ATGCACTTGC TACCtttttg gaaa 3’ SEQ ID NO:4, oligonucleotide per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di CD9, antisenso: 5’ agcttttcca aaaaGGTAGC AAGTGCATCA AATtctcttg aaATTTGATG CACTTGCTAC Cggg 3’ SEQ ID NO:5, sequenza bersaglio #1 per il silenziamento di Akt, senso: 5’ GCACCTTTAT TGGCTACAA 3’ SEQ ID NO:6, sequenza bersaglio #1 per il silenziamento di Akt, antisenso: 5’ TTGTAGCCAA TAAAGGTGC 3’, SEQ ID NO:7, oligonucleotide #1 per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di Akt, senso: 5’ gatccccGCA CCTTTATTGG CTACAAttca agagaTTGTA GCCAATAAAG GTGCtttttc 3’ SEQ ID NO:8, oligonucleotide #1 per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di Akt, antisenso: 5' tcgagaaaaa GCACCTTTAT TGGCTACAAt ctcttgaaTT GTAGCCAATA AAGGTGCggg 3’ SEQ ID NO:9, sequenza bersaglio #2 per il silenziamento di Akt, senso: 5’ GGAAGGTGAT TCTGGTGAA 3’ SEQ ID NO: 10, sequenza bersaglio #2 per il silenziamento di Akt, antisenso: 5’ TTCACCAGAA TCACCTTCC 3’ SEQ ID NO: 11, oligonucleotide #2 per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di Akt, senso: 5' gatccccGGAA GGTGATTCTG GTGAAttcaa gagaTTCACC AGAATCACCT TCCtttttc 3’ SEQ ID NO: 12, oligonucleotide #2 per la trascrizione di RNA a forcina per il silenziamento di Akt, antisenso: 5' tcgagaaaaa GGAAGGTGAT TCTGGTGAAt ctcttgaaTT CACCAGAATC ACCTTCCggg 3’ inclusi vettori plasmidici e virali che le contengano e le composizioni farmaceutiche contenenti siRNA, diluenti o carrier relativi, accettabili per uso farmaceutico, incluse le modalità di somministrazione delle stesse.
8. Procedimento caratterizzato dal fatto che Γ inibizione di CD9, Akt e molecole funzionalmente collegate venga ottenuta in pazienti con tumori overesprimenti Trop-2 mediante somministrazione di farmaci costituiti da, ad esempio non esclusivo, acidi nucleici in grado di silenziare le suddette molecole secondo la rivendicazione 7, oppure dominanti negativi, oppure anticorpi per bersagli intra- o extra-cellulari, oppure composti chimici inibitori di Akt, inclusi, ma non limitati a, MK-2206 ed A6730, allo scopo di inibire la crescita tumorale.
9. Procedimento caratterizzato dal fatto che Γ inibizione di CD9, Akt e molecole collegate venga ottenuta in pazienti con tumori overesprimenti Trop-2 mediante somministrazione di combinazioni di farmaci secondo la rivendicazione n.8, allo scopo di inibire la crescita tumorale.
10. Procedimento caratterizzato dal fatto che uno o più farmaci secondo la rivedicazione 8 vengano utilizzati in pazienti con tumori overesprimenti Trop-2 in combinazione con altri trattamenti antitumorali, inclusi ma non limitati a chemioterapia, allo scopo di inibire la crescita tumorale.