IT202000031838A1

IT202000031838A1 - Piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali diretti contro antigeni processati tumore-specifici

Info

Publication number: IT202000031838A1
Application number: IT102020000031838A
Authority: IT
Inventors: Saverio Alberti; Emanuela Guerra; Marco Trerotola
Original assignee: Saverio Alberti
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-22
Also published as: US20240043557A1; EP4267967A1; WO2022136452A1; EP4267968A1; CN116829952A; WO2022136191A1; CN117377498A

Description

?PIATTAFORMA PER OTTENERE ANTICORPI MONOCLONALI DIRETTI CONTRO ANTIGENI PROCESSATI TUMORE-SPECIFICI?

CAMPO DI APPLICAZIONE

La presente invenzione riguarda una piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati che leghino con alta affinit? proteine processate, specificamente espresse in tumori, per usi medici e industriali. Pi? in dettaglio, l' invenzione riguarda un metodo per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati che siano in grado di legare ad alta affinit? la proteina Trop-2 nella forma specificamente processata nelle cellule tumorali. Tale metodo trova applicazione in campo diagnostico, prognostico e terapeutico delle neoplasie che esprimono Trop-2. I tumori correlati includono, ma non sono limitati a, i tumori del seno, testa e collo, pelle, colon-retto, stomaco, polmone, ovaio, tiroide, prostata, pancreas, endometrio, cervice uterina, cistifellea, dotti biliari, rene, vescica urinaria e coriocarcinomi.

STATO DELL? ARTE

La proteina Trop-2 (NCBI accession number: NP_002344.2; SEQ ID NO: 1) ? anche conosciuto come trasduttore del segnale di calcio associato al tumore-2 (TACSTD-2) (Fornaro, Dell'Arciprete et al. 1995, Calabrese, Crescenzi et al. 2001), o come GA733-1, EGP, MR23, MR54, RS-7 o T16 (Fradet, Cordon-Cardo et al.1986, Stein, Chen et al.1990, Alberti, Miotti et al. 1992). Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che Trop-2 si localizza lungo la membrana cellulare negli epiteli (Alberti, Miotti et al. 1992) e funziona come un trasduttore di segnale (Basu, Goldenberg et al.1995, Ripani, Sacchetti et al.1998), che induce un segnale di calcio intracellulare dopo multimerizzazione mediata da anticorpi (Ripani, Sacchetti et al. 1998) e attiva una rete di segnale che induce crescita e che converge su AKT (Guerra, Trerotola et al.2016).

Il dominio extracellulare delle molecole Trop (Trop-2 e il paralogo Trop-1/EpCAM, NCBI accession number: NP_002345.2) contiene un dominio GA-733 (EGF-simile) e un dominio tireoglobulinico, che ospitano 12 residui di cisteina conservati (Fornaro, Dell'Arciprete et al.1995, El Sewedy, Fornaro et al.1998, Calabrese, Crescenzi et al.2001). Questa regione ricca di cisteine costituisce un dominio globulare (aminoacidi 31-145 di SEQ ID NO: 1) ed ? seguita da una regione priva di cisteine (aminoacidi 146-274 di SEQ ID NO: 1), che agisce come uno "stelo" di collegamento al dominio transmembrana (Figura 1). Le molecole di Trop-2 sono coinvolte in interazioni omofiliche tra cellule adiacenti e stabiliscono complessi multimerici con proteine delle giunzioni strette. Sia i domini EGF-simili che i tireoglobulinici sono coinvolti in interazioni omofiliche intra- e inter-membrana nel caso di Trop-1/Ep-CAM (Balzar, Briaire-de Bruijn et al.2001, Zanna, Trerotola et al.2007).

Trop-2 ? sovraespresso dalla maggior parte delle cellule tumorali nell'uomo (Trerotola, Cantanelli et al. 2013). La sovraespressione ? stata riscontrata nelle cellule del cancro al seno (Fradet, Cordon-Cardo et al. 1984, Govindan, Stein et al. 2004, Trerotola, Cantanelli et al.2013, Ambrogi, Fornili et al.2014), nel cancro della vescica (Fradet, Cordon-Cardo et al. 1984), nel carcinoma papillare sieroso ovarico (Santin, Zhan et al. 2004), e in numerosi altri tumori, ad esempio cancro ai polmoni non a piccole cellule (Stein, Chen et al.

1990), coriocarcinomi (Lipinski, Parks et al.1981, Alberti, Miotti et al.1992), tumori del colonretto, cancro della prostata e dell? endometrio (Ohmachi, Tanaka et al. 2006, Trerotola, Cantanelli et al. 2013). La trasformazione dei cheratinociti con SV40 induce un'espressione da 3 a 4 volte superiore di Trop-2 rispetto alle loro controparti normali (Schon and Orfanos 1995), coerentemente con un ruolo diretto di Trop-2 nella progressione del tumore. Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che Trop-2 guida lo sviluppo e la progressione del cancro attraverso l'interazione e la regolazione dell'espressione di diverse proteine coinvolte nell'adesione tra cellule e tra cellula e matrice nei tessuti epiteliali. La sovraespressione di TROP2 si ? dimostrata necessaria e sufficiente per stimolare la crescita del tumore (Trerotola, Cantanelli et al. 2013), e Trop-2 ? stato dimostrato indurre la crescita in proporzione diretta ai suoi livelli di espressione (Trerotola, Cantanelli et al. 2013). Inoltre l'espressione di Trop-2 ? stata associata a prognosi sfavorevole di tumori del pancreas (Fong, Moser et al. 2008), dello stomaco (Muhlmann, Spizzo et al. 2009), del polmone (Kobayashi, Minami et al. 2010), del cavo orale (Fong, Spizzo et al. 2008), dell? ovaio (Bignotti, Todeschini et al. 2010) e del colon-retto (Ohmachi, Tanaka et al. 2006). In particolare, l? iperespressione di Trop-2 in membrana (Lin, Huang et al. 2012) ? stata associata a prognosi sfavorevole del cancro al seno (Ambrogi, Fornili et al.2014). Gli autori della presente invenzione hanno anche dimostrato che il Trop-2 pu? essere rivelato in compartimenti intracellulari, in modo eterogeneo in diversi casi di tumore (Trerotola, Cantanelli et al.2013) e che alti livelli di espressione intracellulare di Trop-2, al contrario dell? iperespressione in membrana, sono associati a prognosi migliore nel cancro del seno (Ambrogi, Fornili et al. 2014). Ci? dimostra l'utilit? della misurazione della localizzazione subcellulare di Trop-2 per procedure prognostiche.

La malattia metastatica ? la causa dominante di morte nei pazienti oncologici (De Vita, Lawrence et al. 2008, Siegel, Miller et al. 2019) ed ? il pi? grande ostacolo per la cura del cancro (Wan, Pantel et al. 2013), poich? il cancro metastatico ? in gran parte resistente alla terapia. L'identificazione di proteine/geni legati al fenotipo metastatico (Nguyen, Bos et al. 2009, Polyak and Weinberg 2009, Hanahan and Weinberg 2011, Vanharanta and Massague 2013) ? utile (Amit, Citri et al. 2007), in quanto questi marcatori possono contribuire all'identificazione dei casi aggressivi in una fase precoce e fornire nuovi bersagli per nuove terapie (De Vita, Hellman et al.2001). Questa ricerca ? stata condotta dagli autori della presente invenzione, che hanno cercato geni che fossero disregolati in modo parallelo in modelli indipendenti di metastasi. Seguendo questo approccio, gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che TROP2 ? l? unico gene concordemente iperespresso nei tumori metastatici in diversi sistemi sperimentali, tipi tumorali e specie animali. Un'analisi su larga scala dell'espressione di Trop-2 in tumori primari umani e nelle loro corrispondenti metastasi ha rivelato che Trop-2 ? iperespresso nelle metastasi dei tumori del colon, dello stomaco, del seno e delle ovaie. E? stato poi dimostrato che l? iperespressione di Trop-2 determina lo sviluppo di metastasi e influenza l'esito della malattia in tumori del colon, dello stomaco, del seno, del pancreas, del polmone e dell? ovaio. Ci? ha dimostrato che Trop-2 (Alberti, Miotti et al.1992, Fornaro, Dell'Arciprete et al.1995, El Sewedy, Fornaro et al.1998, Ripani, Sacchetti et al. 1998, Trerotola, Cantanelli et al. 2013) ? causa di progressione di tumore e di diffusione metastatica (Guerra, Trerotola et al. 2008, Trerotola, Rathore et al.

2010, Stoyanova, Goldstein et al.2012, Trerotola, Cantanelli et al.2013).

Gli alti livelli di espressione di Trop-2 in molti tumori umani e nelle loro metastasi hanno reso questa molecola un bersaglio attraente per l' immunoterapia "adottiva", cio? basata sulla somministrazione di anticorpi prodotti sperimentalmente (Fradet, Cordon-Cardo et al. 1986, Stein, Chen et al. 1990, Alberti, Miotti et al. 1992). Gli autori della presente invenzione hanno sviluppato anticorpi monoclonali anti-Trop-2 in grado di riconoscere e legare diverse regioni della molecola Trop-2 con alta efficienza (Domanda di brevetto WO2010089782 e WO2016087651) per usi diagnostici e terapeutici nel cancro. Sacituzumab govitecan-hziy, un anticorpo anti-Trop-2 umanizzato coniugato al farmaco SN-38, ? stato dimostrato essere efficace in pazienti metastatici di cancro al seno triplo-negativo (triple negative breast cancer, TNBC) (Bardia, Mayer et al. 2017, Bardia, Mayer et al.2019). Questo ha portato all'approvazione accelerata di Sacituzumab govitecan-hziy da parte dell? FDA (Food and Drug Administration, Agenzia per gli alimenti e i medicinali statunitense) con il nome di Trodelvy, per l'uso in clinica (www.fda.gov/drugs/drug-approvals-anddatabases/drug-trial-snapshot-trodelvy). Ci? ha indicato che anticorpi monoclonali diretti contro Trop-2 possono essere utilizzati per generare farmaci per il trattamento del cancro, compresi i casi avanzati che sono progrediti alla metastasi.

PROBLEMA TECNICO

L'espressione di Trop-2 non ? limitata esclusivamente ai tumori. Trop-2 ? espresso anche nei tessuti umani normali, in particolare ad alti livelli nella pelle, esofago, tonsille, cornea, a livelli inferiori nei polmoni, pancreas esocrino, prostata, ghiandole salivari, urotelio, dotti biliari, seno, rene, e talvolta nello stomaco e nell' endometrio (Alberti, Miotti et al.1992, El Sewedy, Fornaro et al.1998, Trerotola, Cantanelli et al.2013). A differenza di Trop-1, che ? espresso da cellule epiteliali proliferanti (Schon, Schon et al. 1994), Trop-2 ? espresso prevalentemente da cellule epiteliali in stadi avanzati di differenziamento (Alberti, Miotti et al.

1992). Nell'epidermide, in particolare, l'espressione di Trop-2 viene rilevata nei cheratinociti dello strato soprabasale e aumenta salendo verso la superficie della pelle, con i pi? alti livelli di espressione nello strato corneo (Alberti, Miotti et al.1992).

L'espressione dell'antigene nei tessuti normali pone seri problemi di tossicit? dipendente dal bersaglio (on-target) che limitano fortemente l'uso di farmaci mirati ad elevata potenza. Ad esempio in uno studio di Fase 1 con dosi scalari di bivatuzumab mertansine, che si lega alla variante associata ai tumori v6 del recettore di membrana CD44 (CD44v6), espressa anche in cheratinociti cutanei e in altri epiteli, si sono registrati grave tossicit? cutanea ed un evento fatale dovuto allo sviluppo di una massiccia necrolisi epidermica dopo la seconda infusione alla dose pi? alta (Tijink, Buter et al. 2006). BAY794620, un altro coniugato anticorpo-farmaco che lega l'antigene CA9, espresso anche all'interno dell'intestino, ha mostrato tossicit? gastrointestinale fatale in due pazienti (Rapporto di studio clinico n.: PH-37705/12671. Bayer Healthcare, 2014). In particolare per la terapia mirata contro le molecole Trop sono stati osservati nei pazienti oncologici effetti avversi a carico di organi che normalmente esprimono la molecola. L? utilizzo terapeutico dell? anticorpo umanizzato anti-Trop-1 ad alta affinit? ING-1 ha causato casi di pancreatite acuta nei pazienti (de Bono, Tolcher et al. 2004). Un recente studio di Fase 1 con dosi scalari di PF-06664178d, un coniugato anti-Trop-2/Aur0101,in pazienti con tumori solidi avanzati o metastatici, ha rivelato una tossicit? eccessiva che si ? manifestata con neutropenia, eruzione cutanea e infiammazione delle mucose (King, Eaton et al. 2018). In entrambi i casi gli studi clinici sono stati interrotti.

La possibilit? di ottenere anticorpi monoclonali specifici per i tumori consentirebbe di generare farmaci mirati con elevata potenza antitumorale e bassa tossicit? dipendente dal bersaglio, ottenendo un indice terapeutico nettamente migliore. Gli oncogeni/oncosoppressori classici acquisiscono potere trasformante a seguito di mutazioni nelle sequenze codificanti o di regolazione. Le mutazioni oncogeniche nella sequenza aminoacidica che ricorrono ad alta frequenza possono potenzialmente offrire bersagli specifici per i tumori. Tuttavia, questo non ? il caso di Trop-2. Infatti, mentre sono state descritte mutazioni ereditarie del gene TROP2 che causano l'amiloidosi corneale nota come distrofia gelatinosa a goccia (Gelatinous Drop-Like Dystrophy, GDLD) (Tsujikawa, Kurahashi et al. 1999), nei tumori Trop-2 ? espresso come una molecola sostanzialmente normale (wild-type, wt) per quanto riguarda la sequenza (Trerotola, Cantanelli et al. 2013). (cancer.sanger.ac.uk/cosmic/search?q=TACSTD2).

SOLUZIONI DEL PROBLEMA TECNICO

Al fine di migliorare l'efficacia della terapia anticancro mirata per mezzo degli anticorpi monoclonali, prevenendone allo stesso tempo la tossicit?, ? importante che tali anticorpi monoclonali riconoscano epitopi della molecola bersaglio che siano esposti in maniera specifica nelle cellule tumorali (Johnson and Janne 2006). Questo rende anche possibile legare un maggior numero di cellule tumorali, quando gli epitopi dei singoli anticorpi sono espressi selettivamente in diversi stadi di sviluppo del tumore, risparmiando le cellule normali.

Gli autori della presente invenzione hanno scoperto che il processamento posttraduzionale di Trop-2 da parte di ADAM10 ? una caratteristica delle neoplasie. Il modello della struttura tridimensionale della proteina Trop-2 mostra come questo processamento causi un riarrangiamento spaziale della porzione extracellulare della molecola e la conseguente esposizione di domini che sarebbero normalmente inaccessibili. Questi domini forniscono nuovi bersagli specifici per il tumore. Pertanto forma oggetto della presente invenzione una piattaforma che utilizzi metodi di immunizzazione per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati, che presentino la massima eterogeneit? di epitopo, insieme a metodi di selezione che individuino fra tali anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati, quelli che riconoscono differenzialmente l? antigene espresso nei tumori rispetto a quello espresso nei tessuti normali. Questa piattaforma pu? essere applicata alle proteine che subiscono un processamento specifico nel tumore per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati che si leghino specificamente ai tessuti tumorali, fornendo cos? i mezzi per ridurre la tossicit? associata ai trattamenti mirati e migliorare le terapie anticancro.

DESCRIZIONE DELL? INVENZIONE

Il processamento post-traduzionale ? una fase di attivazione fondamentale per numerosi induttori della crescita tumorale e molecole di adesione. La presente invenzione si riferisce ad una piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati, specifici per tali forme processate

? quindi oggetto della presente invenzione un metodo per ottenere anticorpi monoclonali, loro frammenti leganti l? antigene e coniugati, che riconoscano e leghino con alta affinit? proteine processate che vengono espresse in modo specifico nei tumori locali e metastatici, detto metodo caratterizzato da procedure di immunizzazione e screening secondo la presente invenzione.

Le procedure volte ad ottenere anticorpi monoclonali per antigeni tumorali tipicamente usano come materiale immunogenico lisati proteici da cellule tumorali. Tuttavia, questo pu? portare alla presentazione di un epitopo principale (immunodominante) che influenzer? corrispondentemente la generazione di anticorpi determinando la produzione di una singola specie di anticorpo anche da procedure di immunizzazione indipendenti. Ci? ? stato dimostrato dagli Autori della presente invenzione che hanno scoperto che gli anticorpi anti-Trop-2 162-46.2, ottenuto mediante immunizzazione con materiale proveniente dalla linea cellulare di coriocarcinoma umano BeWo (Lipinski, Parks et al. 1981), T16, ottenuto mediante immunizzazione con materiale proveniente da cellule di tumore della vescica (Fradet, Cordon-Cardo et al. 1986), e RS7-3G11, ottenuto mediante immunizzazione con materiale proveniente da un carcinoma squamoso del polmone (brevetto US7238785B2) riconoscono tutti lo stesso epitopo, espresso anche in tessuti normali. Quindi un oggetto della presente invenzione ? costituito da procedure di immunizzazione che aumentino la probabilit? di ottenere anticorpi monoclonali in grado di riconoscere una variet? di epitopi diversi. In tali procedure il materiale immunogenico ? costituito dalla proteina bersaglio, suoi frammenti e coniugati, prodotti in diversi organismi, comprese le cellule tumorali che esprimono naturalmente la proteina bersaglio e cellule trasformate e tumorali di mammifero, cellule di insetto, cellule di lievito, trasfettate con vettori che esprimono l? intera proteina bersaglio, suoi frammenti e coniugati. Diversi domini della proteina bersaglio possono essere espressi come proteine di fusione con altre sequenze (tag) che migliorano l' immunogenicit? di piccoli peptidi non immunogenici, innescando la produzione di una pi? ampia variet? di anticorpi. Le sequenze tag possono anche codificare per elementi utili alla visualizzazione e alla purificazione delle proteine e polipeptidi prodotti.

Un altro oggetto della presente invenzione consiste in procedure di screening appositamente progettate per selezionare anticorpi monoclonali in grado di accedere e legarsi alla proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori. Un oggetto specifico della presente invenzione ? quindi un metodo che comprende le fasi di: a) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori; b) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori; c) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali; d) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali; e) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con un controllo negativo, comprendente o consistente in proteina o proteine diverse dalla proteina bersaglio e/o cellule che non esprimono la proteina bersaglio; f) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e il controllo negativo; g) selezionare l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati che mostra assenza di legame con il controllo negativo e legame con la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori almeno 10 volte maggiore del legame con la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali. Queste diverse fasi possono avvenire in maniera sequenziale o in parallelo. Il legame antigene-anticorpo pu? essere misurato mediante citometria a flusso e/o saggio ELISA e/o saggio ELISA su cellule e/o microscopia e/o interferometria bio-strato e/o calorimetria isotermica di titolazione e/o termoforesi su microscala e/o risonanza plasmonica di superficie.

La proteina nella sua forma processata pu? essere espressa da tumori che la esprimono in maniera endogena, o pu? essere espressa da cellule tumorali trasfettate da appositi vettori. La proteina nella sua forma non processata pu? essere espressa da tessuti normali che la esprimono in maniera endogena o pu? essere espressa da cellule normali trasfettate con appositi vettori. Il controllo negativo pu? essere una proteina o miscuglio di proteine diverse dalla proteina bersaglio, o cellule che non esprimono la proteina bersaglio, o cellule che non esprimono la proteina bersaglio trasfettate con il vettore vuoto. Cellule esprimenti e non esprimenti possono essere identificate mediante anticorpi anti-proteina bersaglio gi? noti nell? arte. L? utilizzo di cellule trasfettate con vettori esprimenti la proteina bersaglio e delle stesse cellule trasfettate con il vettore vuoto come controllo negativo offre il vantaggio di un confronto stringente, in quanto la proteina bersaglio ? l? unica variabile diversa tra i due sistemi. La proteina bersaglio pu? essere nella sua forma wild-type o pu? essere ingegnerizzata in corrispondenza dei siti interessati al processamento, che tramite questa ingegnerizzazione possono essere pienamente attivati in maniera costitutiva o possono essere inattivati rendendo cos? la proteina resistente al processamento.

In un oggetto preferito della presente invenzione il processamento della proteina bersaglio ? post-traduzionale e comprende almeno una delle modifiche selezionate dal gruppo costituito da: taglio del legame peptidico, modificazioni di amminoacidi, inclusa la deamidazione, aggiunta di gruppi chimici, incluse la fosforilazione, l? acetilazione, l? idrossilazione, la metilazione, aggiunta di molecole organiche complesse, tra cui la lipidazione, l? AMPilazione, l? ubiquitinazione, la SUMOilazione. Pi? preferibilmente il processamento consiste nel taglio di almeno un legame peptidico della proteina bersaglio. Inoltre, pi? preferibilmente, la proteina bersaglio ? Trop-2.

In un oggetto preferito della presente invenzione i tumori in cui si verifica processamento specifico includono tumori del seno, della testa e del collo, della pelle, del colon-retto, dello stomaco, del polmone, dell'ovaio, della tiroide, della prostata, del pancreas, dell'endometrio, della cervice uterina, della cistifellea, dei dotti biliari, dei reni, della vescica urinaria, coriocarcinomi, e loro metastasi.

Un oggetto della presente invenzione ? una piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati diretti contro antigeni processati specifici dei tumori per uso come medicamento, preferibilmente per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di tumori e metastasi, pi? preferibilmente dei tumori e metastasi che esprimono Trop-2, ancor pi? preferibilmente in combinazione con almeno un agente o un trattamento terapeutico. L? agente terapeutico utilizzato pu? essere un farmaco antitumorale che consiste in una sostanza citotossica, inclusi isotopi radioattivi, agenti chemioterapeutici e tossine di origine batterica, fungina, vegetale o animale, e loro frammenti. Un agente chemioterapeutico ? un composto chimico utile nel trattamento del cancro, tra cui adriamicina, doxorubicina, 5-fluorouracile, citosina-arabinoside ("Ara-C"), ciclofosfamide, tiotepa, busulfano, taxolo, metotrexate, cisplatino, Melphalan e altre mostarde azotate, vinblastina, bleomicina, etoposide, ifosfamide, mitomicina C, mitoxantrone, vincristina, vinorelbina, carboplatino, teniposide, aminopterina, dactinomicina, esperamicine. L'agente terapeutico pu? essere un mediatore intercellulare, ad esempio una citochina, includendo in modo non esclusivo linfochine, monochine, ormoni, fattori di crescita, interferone, interleuchine, provenienti sia da fonti naturali sia da colture cellulari ricombinanti, nonch? equivalenti biologicamente attivi di citochine native. I trattamenti terapeutici possono essere la rimozione chirurgica del tumore e delle relative metastasi e/o la radioterapia.

Un altro oggetto della presente invenzione ? una piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati diretti contro antigeni processati specifici dei tumori per l? uso nella diagnosi e/o prognosi di tumori o metastasi, nella valutazione del rischio di sviluppare un tumore o metastasi, nel monitoraggio della progressione di un tumore o metastasi, nel monitoraggio dell'efficacia di un trattamento terapeutico antitumorale o antimetastatico, nello screening di trattamenti terapeutici antitumorali o antimetastatici.

APPLICAZIONE INDUSTRIALE E FORME DI REALIZZAZIONE

La presente invenzione trova applicazione nel campo della generazione di anticorpi monoclonali per uso clinico, ove insegna nuove procedure di immunizzazione e metodi di screening per ottenere specificit? verso forme processate tumorali di proteine bersaglio. Ibridomi producenti anticorpi monoclonali possono essere ottenuti attraverso tecniche note nell? arte, mediante fusione di cellule producenti immunoglobuline isolate da animali immunizzati, ad esempio dalla milza di topi BALB/c, con cellule provenienti da linee cellulari immortalizzate, ad esempio linee di mieloma murino. L? immunizzazione pu? avvenire attraverso iniezioni di materiale immunogenico secondo modi e tempi di somministrazione noti nell? arte. In una forma di realizzazione della presente invenzione il materiale immunogenico contiene la proteina bersaglio prodotta da diversi organismi, consistenti in cellule tumorali umane naturalmente esprimenti la proteina bersaglio e cellue trasformate o tumorali di mammifero, cellule di insetto, cellule di lievito, trasfettate con vettori che esprimono la proteina bersaglio intera, suoi frammenti e coniugati. Le cellule tumorali comprendono a titolo di esempio non esclusivo cellule di tumore del seno, testa e collo, pelle, colon-retto, stomaco, polmone, ovaio, tiroide, prostata, pancreas, endometrio, cervice, cistifellea, dotti biliari, rene, vescica urinaria e cellule di coriocarcinomi. Cellule trasformate comprendono a titolo di esempio non esclusivo cellule 293 di rene umano embrionale trasformate con DNA adenovirale.

Una molecola di acido nucleico che codifica per la proteina bersaglio o sue forme mutate o frammenti o coniugati secondo la presente invenzione pu? essere generata secondo tecnologie note nell? arte, ad esempio l? amplificazione per PCR a partire da molecole stampo o la sintesi genica. Un frammento della proteina bersaglio pu? essere, nel caso di proteine di membrana, la porzione extracellulare. Un frammento della proteina bersaglio pu? anche essere un particolare dominio strutturale e/o funzionale, identificato sulla base di omologia di sequenza, predizioni di struttura, determinazioni di struttura o studi funzionali noti nell? arte. La proteina bersaglio pu? essere coniugata mediante le tecnologie del DNA ricombinante note nell? arte a molecole fluorescenti, enzimi, o sequenze specifiche (tag) per ottenere proteine di fusione per rivelazione, purificazione, e per aumentare l? immunogenicit?. Possono essere anche aggiunte sequenze all? N terminale per guidare la secrezione (sequenze leader). La coniugazione pu? avvenire inserendo sequenze ?ponte? a monte del tag che possono essere tagliate in vitro mediante enzimi noti nell? arte per restituire la proteina bersaglio nativa. Esempi di tag per facilitare la purificazione includono la coda di 6 istidine, la glutatione S-trasferasi, la proteina che lega maltosio, la proteina che lega chitina, la sequenza FLAG, il myc-tag, l? emoagglutinina. Tag per aumentare l? immunogenicit? sono noti nell? arte ed includono domini immunoglobulinici o corte catene peptidiche formate da 2 glicine seguite da 5 isoleucine o 5 proline o 5 arginine (Rahman 2020).

La molecola di acido nucleico pu? essere clonata in un vettore di espressione per mezzo delle tecnologie del DNA ricombinante note nell? arte. Vettori di espressione plasmidici e virali sono noti, adatti a diversi organismi eucarioti, quali mammiferi, insetti, lieviti, e procarioti, quali batteri. Il vettore per l? espressione della proteina bersaglio o sue forme mutate, o frammenti, o coniugati pu? essere inserito nelle cellule ospite attraverso trasfezione chimica o mediante elettroporazione. Metodi di trasfezione sono noti nell? arte e kit di trasfezione e apparati per elettroporazione sono disponibili sul mercato. Vettori di espressione virali possono essere trasfettati in cellule ospite competenti insieme a vettori codificanti per elementi virali strutturali, per ottenere virus in grado di infettare le cellule ospite in cui avverr? la produzione della proteina ricombinante. I virus possono essere ad esempio baculovirus, lentivirus, retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati.

Le cellule esprimenti la proteina bersaglio, suoi frammenti o coniugati possono essere fatte crescere in terreni di coltura e condizioni note nell? arte. In una forma di realizzazione l? immunogeno pu? contenere la proteina bersaglio purificata da lisati cellulari e/o da terreni di coltura in cui vengano secrete sue forme solubili. In un? altra forma di realizzazione l? immunogeno pu? derivare da lisati cellulari e/o da terreni di coltura come sopra non frazionati. La proteina bersaglio, suoi frammenti o coniugati pu? essere purificata da persone esperte nell? arte utilizzando procedimenti noti nell? arte, ad esempio cromatografia per affinit? o cromatografia per esclusione molecolare. Un frammento della proteina bersaglio pu? essere, nel caso di proteine di membrana, la porzione extracellulare, che pu? essere cos? secreta nel terreno di coltura.

Il metodo di screening di anticorpi monoclonali secondo la presente invenzione misura e confronta il legame dell? anticorpo alla proteina bersaglio processata in maniera tumore-specifica o suoi frammenti o coniugati rispetto alla proteina bersaglio non processata espressa da cellule normali non trasformate, o suoi frammenti o coniugati e rispetto al controllo negativo come definito sopra. Metodi per la misurazione del legame anticorpoantigene sono noti nell? arte. In una forma di realizzazione tale metodo ? la citometria a flusso, in cui viene misurata la quantit? di anticorpo che si lega a ciascuna cellula esprimente l? antigene, preferibilmente un antigene di membrana e preferibilmente espresso da cellule vive, ad esempio linee cellulari tumorali o cellule isolate da tumori primari e metastasi, oppure cellule trasfettate. L? espressione della proteina bersaglio nelle sue varie forme (processata e non processata) viene rivelata da anticorpi non tumore-specifici noti nell? arte. Il processamento viene effettuato sulla proteina wild-type ad opera dell? apparato molecolare specifico della cellula tumorale. La misurazione in citofluorimetria a flusso viene effettuata attraverso misurazione della fluorescenza associata all? anticorpo, direttamente se questo ? coniugato ad una molecola fluorescente, o indirettamente se questo viene legato da un anticorpo secondario coniugato ad una molecola fluorescente. Molecole fluorescenti con specifici spettri di emissione ed eccitazione e citofluorimetri corrispondenti sono noti nell? arte.

In una forma di realizzazione della presente invenzione il legame antigeneanticorpo viene misurato mediante saggio ELISA su cellule o attraverso microscopia ottica o fluorescente, utilizzando anticorpi marcati mediante tag enzimatici o fluorescenti. In un?altra forma di realizzazione della presente invenzione il legame antigene-anticorpo viene misurato mediante saggio ELISA classico su proteine bersaglio, loro frammenti o coniugati purificati da cellule tumorali trasfettate o con espressione endogena e da cellule isolate da tessuti normali. In un altro aspetto della presente invenzione il legame antigene-anticorpo ? misurato attraverso uno a pi? metodi quali interferometria bio-strato, calorimetria isotermica di titolazione, termoforesi su microscala, risonanza plasmonica di superficie.

La presente invenzione verr? ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Sequenza di Trop-2

Sequenza aminoacidica di Trop-2 (SEQ ID NO: 1). Le diverse regioni della molecola sono indicate; aa: aminoacidi.

Figura 2. Purificazione, sequenziamento e analisi di Trop-2 immunoprecipitato da cellule tumorali.

A. (riquadro superiore) Allineamento tra la sequenza aminoacidica ottenuta mediante degradazione di Edman (sottolineata; SEQ ID NO: 2) dell? immunoprecipitato con l? anticorpo E1 e la sequenza canonica di Trop-2 (aa 88-97 di SEQ ID NO: 1).; (riquadro inferiore) allineamento dei siti di processamento di Trop-2 e Trop-1 (Sch?n, Sch?n et al. 1993). Le teste di freccia indicano il sito di processamento.

B. (pannello di sinistra) Western blotting (WB) di Trop-2 purificato, corso su gel SDS-PAGE a gradiente di concentrazione in condizioni native (non riducenti); (pannello di destra) colorazione con blu di Coomassie di Trop-2 purificato corso in maniera analoga in condizioni native o riducenti, come indicato.

C. Studi di competizione tra l? anticorpo E1 e anticorpi monoclonali anti-Trop-2 noti nell? arte sono stati effettuati colorando miscele di cellule L costituite per il 70% da cellule parentali e per il 30% da cellule trasfettate con TROP2 (Alberti, Bucci et al.1991) mediante incubazione con E1 coniugato a FITC (FITC-E1) dopo preincubazione con un eccesso 100x di ciascuno degli anticorpi indicati. La competizione tra anticorpi, dipendente dal riconoscimento di un epitopo condiviso, viene rivelata dalla scomparsa del picco corrispondente alle cellule colorate da FITC-E1. mAb di controllo: anticorpo monoclonale che non riconosce Trop-2. Linea nera: campione colorato con FITC-E1; linea grigia: campione non colorato.

D. Immagine al micoscopio confocale di cellule L trasfettate con TROP2 colorate con l? anticorpo coniugato FITC-E1.

Figura 3. Struttura del dominio tireoglobulinico di Trop-2.

Generazione del modello tridimensionale del dominio tireoglobulinico di Trop-2 (aa 71-145 di SEQ ID NO: 1) utilizzando approcci di modellamento per omologia e la struttura di p41 (aa 211-271 della sequenza con NCBI accession number: NP_001020330.1) come stampo.

A. Allineamento tra la sequenza aminoacidica della proteina da analizzare (Trop-2) e la sequenza aminoacidica della proteina da utilizzare come riferimento (p41), per generare il file di input per il modellamento strutturale per omologia.

B. Rappresentazione a bastoncini mediante RODS-Raster3D della struttura 3D del dominio tireoglobulinico di Trop-2. Residui aminoacidici di classi diverse sono indicati in diversi toni di grigio. Le tre frecce bianche indicano i ponti disolfuro. Sono indicati gli aminoacidi Arg87 e Thr88 che fiancheggiano il sito di processamento.

C. Grafico di Ramachandran del dominio tireoglobulinico di Trop-2; le conformazioni per cui non si hanno ingombri sterici (core regions) evidenziate in grigio scuro.

D. Modello 3D ?a nastro? ottenuto mediante MOLMOL del dominio tireoglobulinico di Trop-2 (grigio scuro) sovrapposto al corrispondente dominio di p41 (grigio chiaro). Il sito di processamento ? indicato dalla freccia.

E. Scheletro polipeptidico 3D del primo loop del dominio tireoglobulinico di Trop-2. Sono indicate le due cisteine impegnate in un ponte disolfuro e i due residui aminoacidici che fiancheggiano il sito di processamento, con le relative catene laterali.

Figura 4. Struttura tridimensionale e sequenza di siti processati da ADAM10.

A-D. Strutture tridimensionali estratte dal database ?Protein Data Bank? (PDB: www.rcsb.org) di substrati di ADAM10. La sequenza consenso del sito di processamento ? riportata nel rettangolo ed evidenziata in grigio. A: beta-cellulina 2 umana (PDB accession number: 1IOX)B: Fattore di crescita trasformante alfa (TGF-alfa; PDB accession number: 1YUG). C: beta-amiloide (PDB accession number: 2OTK). D: prione mutato umano (PDB accession number: 2KUN). In tutti i casi il processamento avviene in una porzione della proteina a struttura flessibile (loop).

E. Sequenze consenso di substrati di ADAM10 al sito di processamento. La tabella ? stata ricavata dalla banca dati Merops (merops.sanger.ac.uk) integrata con dati addizionali sui siti di processamento di proteine native. Le proteine sono elencate con i loro codici identificativi Uniprot. Gli aminoacidi fiancheggianti il sito di processamento sono indicati (SEQ ID NOs: 3-44). I residui/posizioni corrispondenti nella sequenza di Trop-2 sono evidenziati in grigio chiaro.

Figura 5. Colocalizzatione di ADAM10 con Trop-2 e Trop-2 mutato nel sito di processamento.

Analisi in microscopia confocale della localizzazione di ADAM10 e Trop-2. Le due proteine colocalizzano nella membrana cellulare di cellule MTE 4-14 trasfettate con Trop-2 nella versione a sequenza normale (wt; a sinistra) e mutagenizzata (a destra). Le teste di freccia bianche indicano aree di colocalizzazione. Completa colocalizzazione ? stata osservata nel 72,2% delle cellule (n=54), parziale colocalizzazione nel 22,2% e assenza di colocalizzazione nel 5,5%. wild-type: versione a sequenza normale (SEQ ID NO: 1); R87A-T88A: versione mutagenizzata nel sito di processamento (SEQ ID NO: 45), ove R87 e T88 vengono sostituiti da due alanine (A).

Figura 6. Identificazione di ADAM10 come interattore di Trop-2

Il materiale coimmunoprecipitato con Trop-2 ? stato sottoposto ad analisi di spettrometria di massa (MS) per l? identificazione degli interattori. Mediante procedure multiple di analisi sono stati individuati quattro peptidi indipendenti (riquadro superiore, output di analisi; SEQ ID NOs: 46-49) riconducibili ad ADAM10 (riquadro inferiore, sequenza di ADAM10, SEQ ID NO: 50; in grigio sono evidenziati i peptidi individuati mediante MS).

Figura 7. Processamento di Trop-2 da parte di ADAM10

L? attivit? di ADAM10 ? stata inibita nei trasfettanti MTE 4-14/Trop-2 mediante trattamento con inibitori chimici o silenziamento dell? mRNA, ed ? stato poi valutato l? effetto di questa inibizione sul processamento di Trop-2 e sulla crescita cellulare Trop-2 dipendente.

A. Analisi di WB dopo trattamento con l? inibitore di metalloproteasi a largo spettro GM6001 o specifico per ADAM10 GI254023X (Ludwig, Hundhausen et al. 2005) o silenziamento di ADAM10 mediante siRNA, come indicato. L? inibizione chimica dell? attivit? di ADAM10 ha determinato su Trop-2 una riduzione della banda processata di 40 kD e un corrispondente aumento della forma nativa (l? istogramma riporta la quantificazione mediante analisi di immagine dell? intensit? delle bande corrispondenti alla forma nativa e processata di Trop-2 dopo trattamento con GI254023X, paragonata al controllo trattato con il solo veicolo. L? inibizione dell? espressione di ADAM10 mediante siRNA, evidenziata dalla scomparsa della bannda corrispondente (destra, pannello superiore: WB per ADAM10) ha inibito il processamento di Trop-2, evidenziato dalla scomparsa delle bande di 40 kD and 10 kD (destra, pannello inferiore: WB per Trop-2). T2-p: Trop-2 processato; na: forma nativa; pr: forma processata.

B. (sinistra) livelli di mRNA di ADAM10 misurati mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale 48 ore dopo la trasfezione con siRNA specifici o siRNA di controllo (CD133 umano) di cellule MTE 4-14 trafettate col vettore vuoto (vettore), con Trop-2 wt o con il Trop-2 mutato resistente al processamento R87A-TA88A. (destra) Livelli di mRNA delle metalloproteasi MMP3, MMP9, Presenilin-2 (PSEN2) and ADAM10 dopo trattamento con siRNA specifici o siRNA di controllo. Le barre indicano la deviazione standard.

C. Curve di crescita in vtro di cellule MTE 4-14 trasfettate col vettore vuoto (vettore), con Trop-2 wt o con Trop-2 R87A-TA88A sottoposte a silenziamento di ADAM10 (pannelli superiori, curva in nero) o MMP9 (pannelli inferiori, curva in nero) e a siRNA di controllo (CD133 umano; curve in grigio). Barre: SEM. Il valore di p per l? unica differenza statisticamente significativa riscontrata secondo analisi ANOVA ? indicato. Gli asterischi indicano i valori di p del test statistico post-hoc di Bonferrori (* ? 0.05, * ? 0.001).

Figura 8. La mutazione R87A-T88A rende Trop-2 resistente al processamento e inibisce la crescita in vitro.

A. Analisi di WB di trasfettanti MTE 4-14/Trop-2 in crescita in coltura a diverse densit? (pannello superiore) o per tempi diversi (panello inferiore). Il processamento di Trop-2 aumenta quando le cellule entrano in contatto tra loro in colture ad alta confluenza (semine ad alta densit? o tempi in coltura prolungati).

B. Sequenza di Trop-2 R87A-T88A (SEQ ID NO: 45) confrontata con Trop-2 wt (SEQ ID NO: 1) (pannello superiore) ed analisi in citometria a flusso dei rispettivi trasfettanti con l? anticorpo anti-Trop-2 T16 noto nell? arte (pannello inferiore).

C. Analisi di WB dei trasfettanti MTE4-14/Trop-2 mediante anticorpi policlonali che si legano al dominio extracellulare (extra) o alla coda citoplasmatica (intra). Il Trop-2 processato (T2-p) mantiene la coda citoplasmatica.

D. Analisi di WB di KM12SM trasfettate con Trop-2 wt o con il mutante R87A-T88A. La mutagenesi che sostituisce l? arginina in posizione 87 e la treonina in posizione 88 con due alanine rende Trop-2 resistente al processamento.

E. Curve di crescita in vitro di KM12SM e MTE 4-14 trasfettate con Trop-2 wt, con il mutante R87A-T88A o con il vettore vuoto di controllo, come indicato.

Figura 9. Il mancato processamento di Trop-2 inibisce la crescita tumorale e la diffusione metastatica.

A. Curve di crescita tumorale in vivo di cellule L (sinistra) e 293 (destra), trasfettate con Trop-2 wt o R87A-T88A. Barre: errore standard della media (SEM).

B. Analisi boxplot del volume delle metastasi al fegato da saggi in vivo utilizzando cellule metastatiche di cancro del colon KM12SM trasfettate con Trop-2 wt o R87A-T88A.

C. Curve di distribuzione dei volumi delle singole metastasi ottenute nei saggi in vivo come sopra. Le distribuzioni sono state analizzate mediante il test statistico non parametrico di Mann-Whitney, che ha rivelato una significativa (P value = 0.0436). riduzione del volume delle metastasi di R87A-T88A (linea continua nera) rispetto al Trop-2 wt (linea tratteggiata).

Figura 10. Processamento di Trop-2 nel cancro del seno

A. Analisi di WB di Trop-2 in campioni congelati da una casistica consecutiva di cancri del seno. T2-p: Trop-2 processato.

B. Analisi di WB di Trop-2 in campioni congelati di tessuto di seno normale (da 8 individui). T2-p indica il peso molecolare corrispondente al Trop-2 processato

C. Distribuzione dei valori della frazione percentuale di Trop-2 processato ricavati dall? analisi di immagine del WB dei singoli casi di cancro della mammella mostrato in (A). Le linee tratteggiate indicano i punti di flesso della curva di distribuzione.

Figura 11. Processamento di Trop-2 nei tumori e in tessuti normali di primati

A. Analisi di WB di Trop-2 in cellule di epidermide normale e in tumori della pelle (CSC: carcinoma squamocellulare; KA: cheratoacantoma; CBC: carcinoma basocellulare).

B. Analisi di WB di Trop-2 in tessuti normali di primati (Macaca mulatta): (pannello superiore) 1: lingua; 2: vescica urinaria; 3: cuore; 4: ghiandola salivare; 5: ghiandola mammaria; 6: pelle; 7: rene; (pannello centrale) 1: ghiandola parotide; 2: esofago; 3: pancreas; 4: stomaco; 5: timo; (pannello inferiore) 1: cervello; 2: occhio; 3: tiroide; 4: ghiandola parotide; 5: esofago; 6: polmone; 7: fegato; 8: pancreas.

C. Analisi di WB di Trop-2 in vitro e in vivo in linee cellulari tumorali con espressione endogena di Trop-2 (HT-29, colon; MCF-7, seno; OVCA: OVCA-432, ovaio;) o trasfettate con vettori esprimenti Trop-2 (MTE4-14, cellule trasformate di timo; HCT116, cancro del colon; NS-0, mieloma; L, fibrosarcoma; 293, cellule trasformate di rene embrionale) in coltura (sinistra) o cresciute come tumori in topi nudi (destra). N: cellule non trasfettate; V: trasfettate con il vettore vuoto; T2: trasfettate con Trop-2; aT2, bT2: cellule NS-0 trasfettate con Trop-2 e selezionate rispettivamente per alti o bassi livelli di espressione di Trop-2.

T2-p: Trop-2 processato.

Figura 12. Screening di anticorpi monoclonali secondo la presente invenzione: riconoscimento di Trop-2.

Cellule L di fibrosarcoma murino trasfettate con Trop-2 wt o con il vettore vuoto (controllo) sono state incubate con anticorpi monoclonali generati secondo la presente invenzione. Il legame degli anticorpi ? stato rivelato mediante incubazione con un antisiero di capra antitopo coniugato al fluoroforo Alexa-488 ed analisi in citometria a flusso. Due degli anticorpi anti-Trop-2 identificati sono mostrati come esempio.

Figura 13. Screening di anticorpi monoclonali secondo la presente invenzione: riconoscimento differenziale di Trop-2 nella sua forma processata tumore specifica.

Cellule KM12-SM di cancro del colon umano trasfettate con Trop-2 o con il mutante R87A-T88A resistente al processamento (si veda Figura 8D) sono state incubate con anticorpi monoclonali anti-Trop-2 generati secondo la presente invenzione e coniugati con Alexa488. Il legame degli anticorpi ? stato rivelato mediante analisi in citometria a flusso. Uno degli anticorpi anti-Trop-2 che hanno mostrato riconoscimento differenziale, specifico per il Trop-2 processato nei tumori, ? mostrato come esempio. Le frecce evidenziano la diversit? di segnale. I livelli di espressione di Trop-2 wt processato e del mutante R87A-T88A resistente al processamento sono uguali, come dimostrato dalla colorazione com l? anticorpo anti-Trop-2 noto nell? arte T16 (riquadro in alto).

Figura 14. Saggi di competizione incrociata tra gli anticorpi anti-Trop-2 generati secondo la presente invenzione

Cellule KM12-SM di cancro del colon umano trasfettate con Trop-2 sono state incubate con ciascuno di due anticorpi monoclonali anti-Trop-2 specifici per la forma processata tumorale generati secondo la presente invenzione o con l? anti-Trop-2 noto nell? arte T16, tutti coniugati con Alexa488, insieme ad un eccesso di 10 volte degli anticorpi indicati non marcati. Il legame degli anticorpi ? stato rivelato mediante analisi in citometria a flusso. La competizione per un epitopo condiviso tra due anticorpi ? rivelata dalla corrispondente riduzione del segnale fluorescente (1A9 e 1B4, evidenziata dalle frecce). Ciascun anticorpo mostra competizione con se stesso, come atteso.

ESEMPI

Materiali e metodi

Trasfezione di DNA

Le cellule sono state trasfettate con DNA purificato (Alberti and Fornaro 1990) utilizzando Lipofectamine 2000 o LTX (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.

Citometria a flusso

La colorazione delle cellule per analisi di citometria a flusso ? stata eseguita come descritto (Dell'Arciprete, Stella et al.1996), applicando la sottrazione dell? autofluorescenza cellulare e lo spostamento delle cellule colorate con Alexa-488 o FITC nel canale del rosso (Alberti, Parks et al.1987, Alberti, Bucci et al.1991). I trasfettanti per Trop-2 sono stati selezionati in modo da avere livelli di espressione paragonabili a quelli delle cellule tumorali che esprimono Trop-2 in maniera endogena (Alberti and Herzenberg 1988, Ripani, Sacchetti et al. 1998). Miscele di cellule L native e trasfettate con Trop-2 (Alberti, Bucci et al. 1991) sono state usate per gli studi di legame e competizione dell? anticorpo E1 con altri anticorpi monoclonali anti-Trop-2, preincubando le cellule con un eccesso 100x di ciascuno degli anticorpi indicati.

Microscopia a fluorescenza

Le cellule sono state fatte crescere su vetrini e fissate con 4% paraformaldeide in PBS per 20 min. La colorazione ? stata effettuata con gli anticorpi anti-Trop-2 T16 (Alberti, Miotti et al. 1992) e E1 (Alberti, Nutini et al. 1994) e anti-ADAM10 noti nell? arte, dopo permeabilizzazione e blocco in 10% siero fetale bovino (FBS) 0.1% saponina (Polishchuk, Polishchuk et al. 2000). I vetrini sono stati osservati con un microscopio confocale LSM-510 META (Zeiss).

Casistica di pazienti con tumore al seno

Sono stati analizzati pazienti con cancro al seno (N = 453) con diametro del tumore T1/T2, senza coinvolgimento linfonodale (Querzoli, Pedriali et al. 2006, Biganzoli, Pedriali et al.

2010) e senza metastasi a distanza al momento della diagnosi. Sono stati determinati lo stato clinico e patologico, il tipo di tumore, il grado, l'espressione di ER?, PgR, l? indice Ki-67 (Ambrogi, Biganzoli et al.2006), l' espressione di Trop-2, uPA/PAI-1, MMP11 e catepsina D. I campioni tumorali sono stati lisati e processati per analisi di WB.

Cellule

Le linee cellulari di cancro al seno MCF-7, di cancro del colon HT29, HCT116 e KM12SM, di cancro dell? ovaio OVCA-432 e di mieloma murino NS-0 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 con aggiunta di 10% FBS. Le linee cellulari di rene umano trasformate 293, di timo murino trasformate MTE4-14 e di fibrosarcoma murino L (Alberti and Herzenberg 1988) sono state coltivate in DMEM con aggiunta di 10% FBS. I trasfettanti stabili sono stati coltivati in mezzo completo con aggiunta di 100 ?g/ml di G418.

Campioni di primati

Campioni congelati di organi di macaco rhesus (Macaca mulatta) sono stati analizzati mediante WB per rivelare l'espressione e il livello di processamento di Trop-2 nei tessuti normali dei primati. Per queste analisi ? stato utilizzato un anticorpo policlonale di coniglio anti-Trop-2 umano che si ? dimostrato altamente specifico per il Trop-2 di macaco. I campioni di tessuto comprendevano: lingua, vescica urinaria, cuore, ghiandola salivare, ghiandola mammaria, pelle, rene, ghiandola parotide, esofago, pancreas, stomaco, timo, cervello, occhio, tiroide, polmone, fegato.

Saggi di crescita cellulare in vitro

Le cellule trasfettate sono state seminate alla densit? di 1,5-3,0 ? 10<3 >cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti (cinque pozzetti replicati per ciascun tempo). Il numero di cellule ? stato quantificato mediante colorazione con cristal violetto (Orsulic, Li et al. 2002). I valori di densit? ottica sono stati convertiti in numero di cellule mediante una curva di riferimento standard di campioni cellulari diluiti serialmente di un fattore due.

Anticorpi

Generazione dell? anticorpo monoclonale E1: topi BALB/c sono stati immunizzati con cellule Fe. La fusione cellulare e il clonaggio degli ibridomi sono state eseguite come descritto in precedenza (Zardi, Carnemolla et al.1980). Gli ibridomi sono stati sottoposti a screening per riconoscimento di antigeni di superficie mediante immunoistochimica su cellule Fe (Carnemolla, Neri et al. 1996) e mediante citometria a flusso su cellule trasfettate con Trop-2. Gli anticorpi monoclonali prodotti dall? ibridoma E1 sono stati purificati mediante cromatografia di affinit? su Proteina-A Sepharose e coniugati con fluoresceina-isotiocianato (FITC) o NHS-Alexa Fluor 488 come descritto (Alberti, Nutini et al.1994).

Generazione di anticorpi policlonali di coniglio: antisieri policlonali anti-Trop-2 di coniglio sono stati generati mediante immunizzazione sottocutanea con il dominio extracellulare ricombinante di Trop-2 umano sintetizzato nei batteri (El Sewedy, Fornaro et al.1998), o con un peptide corrispondente alla coda citoplasmatica del Trop-2 umano biotinilato all? N terminale e coniugato con il KLH (keyhole limpet haemocyanin; emocianina di patella) per aumentarne l? immunogenicit?. Gli anticorpi policlonali anti Trop-2 sono stati purificati mediante cromatografia di affinit? su Trop-2 ricombinante coniugato a NHS-Sepharose (GE Healthcare) o sulla coda citoplasmatica biotinilata di Trop-2 coniugata a Streptavidina-Agarose (Sigma-Aldrich). Gli anticorpi purificati sono stati eluiti con glicina 0,2 M pH 2,5.

Anticorpi noti nell? arte: gli anticorpi monoclonali anti-Trop-2162-46.2 (Lipinski, Parks et al.

1981), T16 (Fradet, Cordon-Cardo et al. 1984, Trerotola, Cantanelli et al. 2013) e RS7 (brevetto US7238785B2) sono stati purificati dagli asciti corrispondenti. L? anticorpo policlonale anti-Trop-2 di capra AF650 ? stato acquistato dalla R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). L? anticorpo policlonale anti-ADAM10 di coniglio ? stato acquistato dalla Calbiochem (Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK); l? anticorpo policlonale anti-ADAM10 di capra (sc-31853) ? stato acquistato dalla Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA). Gli anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor (488, 546 e 633) sono stati acquistati dalla Invitrogen.

Immunoprecipitazione

Le cellule sono state lavate con tampone di lavaggio freddo (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 8) e lisate con 3 ml di tampone di lisi (1% Triton, 0,1% SDS, 20 mM NaF, 1 mM NaVO4, 2 mM PMSF, 5 ?M Pepstatina, 5 ?M Leupeptina). Dopo centrifugazione a 15.000 rpm per 5 min a 4 ?C la concentrazione proteica del surnatante ? stato quantificato con il saggio di Bradford e il surnatante ? stato utilizzato per l? immunoprecipitazione (IP). Quattro milligrammi di lisato sono stati incubati con resina Sepharose coniugata all? anticorpo monoclonale anti-Trop-2 T16 (T16-NHS-Sepharose) su una ruota rotante a 4 ?C per 3 ore. Dopo centrifugazione a 1.000 rpm, la resina ? stata lavata 3 volte con PBS. I complessi Trop-2/proteina legati a T16 sono stati eluiti per 3 volte consecutive con 150 ?l di tampone 0,1 M glicina pH 2,5. Le soluzioni eluite sono state immediatamente neutralizzate con TRIS 1 M pH 11,5.

Purificazione dell'antigene e sequenziamento proteico

Trop-2 ? stato purificato mediante cromatografia di affinit? su una colonna di E1-NHS-Sepharose. In breve, monostrati di cellule Fe in piastra sono stati lavati con PBS e lisati mediante trattamento con una soluzione di 20 mM TRIS-Cl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 50 U/ml aprotinina, 1 mM AEBSF per 20 minuti a 4 ?C. Il lisato cellulare ? stato centrifugato a 1.500 g per 10 min; il surnatante ? stato ulteriormente centrifugato a 12.000 g per 20 min e fatto passare attraverso una colonna di idrossiapatite (Bio-Gel HTP privo di DNAsi contaminanti, Richmond, CA). La frazione non legata ? stata caricata su una colonna di Sepharose coniugata all? anticorpo monoclonale E1 (E1-NHS-Sepharose). Il materiale legato ? stato eluito con 0,1 M glicina pH 2,7, 0,1% Triton X-100. L'eluato ? stato immediatamente neutralizzato con 1 M TRIS pH 9 e le frazioni eluite sono state analizzate mediante SDS-PAGE su gel a gradiente al 4-18% e WB. Le frazioni contenenti il materiale immunoreattivo verso E1 sono state riunite, concentrate, trasferite su membrana di PVDF e sottoposte a sequenziamento N-terminale mediante degradazione di Edman. L'N-terminale del Trop-2 non processato ? apparso bloccato/resistente alle procedure di sequenziamento.

Analisi di spettrometria di massa

Gli immunoprecipitati sono stati incubati a 37 ?C con tripsina suina purificata per sequenziamento (Promega). Un'aliquota di 1 ml di ciascuna miscela di peptidi ? stata analizzata mediante spettrometria di massa (MS) MALDI (www.york.ac.uk/depts/biol/tf/proteomics/). Gli spettri di massa degli ioni positivi sono stati ottenuti utilizzando un Bruker Ultraflex III in modalit? ?reflectron?, dotato di un laser smartbeam Nd: YAG. Le identificazioni sono state ottenute utilizzando l? applicazione web MS-Fit di ProteinProspector v5.7.3 (prospector.ucsf.edu/prospector/cgibin/msform.cgi?form=msfitstandard; UCSF). Come input ? stato utilizzato l'elenco dei picchi dello spettrometro di massa. Come modifica costante ? stata imposta la carbammidometilazione, per reazione con iodoacetamide. L'ossidazione della metionina, l'acetilazione N-terminale e la trasformazione del peptide N-terminale Gln in pyroGlu sono state imposte come modifiche riconoscibili. La tolleranza di massa ? stata fissata a 100 ppm. Le masse contaminanti dell'acido ?-ciano-4-idrossicinnamico della matrice sono state escluse dall'analisi. L'identificazione delle proteine ? stata classificata in base al punteggio MOWSE. Il punteggio MOWSE riportato da MS-Fit si basa su un sistema di punteggio aggiornato (Pappin, Hojrup et al.1993).

Identificazione dei siti di processamento mediante MS

Per identificare i siti di processamento proteolitico di Trop-2, gli elenchi dei picchi dello spettrometro di massa PMF sono stati analizzati per mezzo di MS-Fit come sopra. Per identificare il processamento in vivo, gli spettri sono stati scansionati per sequenze di peptidi che non si adattavano ai siti consenso di taglio della tripsina. La tolleranza di massa ? stata fissata a 20 o 50 ppm (vengono mostrati i dati di 50 ppm). Le masse contaminanti dell'acido ?-ciano-4-idrossicinnamico della matrice sono state escluse dall'analisi.

Western blotting

Il Western blotting (WB) ? stato eseguito come descritto (El Sewedy, Fornaro et al. 1998). I tumori degli animali da esperimento sono stati rapidamente congelati dopo la rimozione chirurgica e conservati a ?80 ?C. I campioni congelati sono stati rapidamente scongelati e omogeneizzati con un omogeneizzatore Dounce. Omogeneizzati di tumori e lisati da cellule in coltura, dopo centrifugazione per eliminare il particolato, sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e trasferiti su filtri di nitrocellulosa. I filtri sono stati ibridati con anticorpi anti-Trop-2 umano (antisiero policlonale di coniglio purificato per affinit?) o anticorpi anti-ADAM10. Il legame degli anticorpi ? stato rivelato da perossidasi coniugata ad anticorpi secondari di capra anti-coniglio o di coniglio anti-capra (Calbiochem, La Jolla, CA) tramite chemiluminescenza (ECL; Amersham, Aylesbury, UK) (El Sewedy, Fornaro et al.1998).

Vettori

Il vettore pBJI-neo ? stato fornito dal Dr. M. Davis. Il vettore Bluescript ? stato ottenuto da Stratagene (La Jolla, CA). Il vettore di espressione pcDNA3 ? stato ottenuto da Invitrogen (Gr?ningen, Paesi Bassi). Il pEYFP-N1 ? stato ottenuto da Clontech (Palo Alto, CA).

Costrutti per l? espressione di TROP2

Un cDNA E1/TROP2 completo, della lunghezza di 970 bp, ? stato ricavato da cellule Fe mediante RT-PCR, utilizzando il kit Titan System della Boehringer (Mannheim, Germania) e l'RNA totale di cellule Fe come stampo. La banda amplificata ? stata digerita con Bam HI ed Eco RI e sottoclonata nei siti corrispondenti del vettore di espressione pcDNA3 utilizzando i seguenti primer:

primer senso:5?-CTCGGATCCATGGCTCGGGGCCCCGGCCTC-3? (SEQ ID NO: 51)

primer antisenso: 5?-CTCGAATTCCAAGCTCGGTTCCTTTCTCAA-3? (SEQ ID NO:

52).

Un vettore di espressione derivato da pEYFP privato della sequenza codificante per la proteina fluorescente EYFP (vettore p?EYFP) o il vettore pBJIneo sono stati usati per esprimere Trop-2 nelle cellule di mammifero. Le cellule trasfettate con il p?EYFP o pBJIneo senza inserto sono indicate come ?cellule di controllo, o ?vettore?. Sono stati usati anche il vettore pFastBac HTA (Thermofisher, Waltham, MA USA) per l? espressione in baculovirus (Vidmar, Pavsic et al. 2013) e il vettore YEPsec per l? espressione in cellule di lievito (Cereghino and Cregg 2000), secondo le istruzioni dei produttori. Il TROP2 wt ? stato ottenuto tramite PCR dal clone genomico contenente l? intera sequenza di TROP2 originariamente isolato dagli Autori della presente invenzione (Fornaro, Dell'Arciprete et al.

1995), e inserito nel vettore p?EYFP utilizzando i siti XhoI e KpnI. Per la reazione di PCR sono stati utilizzati i seguenti primer:

primer senso: 5?-GCGATTCTCGAGTCCGGTCCGCGTTCC-3? (SEQ ID NO: 53) (il sito XhoI ? sottolineato)

primer antisenso: 5?-GCGCCGGTACCAAGCTCGGTTCCTTTC-3? (SEQ ID NO: 54) (il sito KpnI ? sottolineato).

Il mutante di Trop-2 R87A-T88A ? stato generato tramite mutagenesi sito-specifica del sito di processamento utilizzando il kit Quikchange? Site-directed mutagenesis (Stratagene) secondo le istruzioni del produttore, con i seguenti primer:

primer senso: 5?-AGCGCCCCCAAGAACGCCGCCGCGCTGGTGCGGCCG-3?(SEQ ID NO:

55)

primer antisenso: 5?-CGGCCGCACCAGCGCGGCGGCGTTCTTGGGGGCGCT-3? (SEQ ID

NO: 56).

Tutti gli inserti ottenuti per PCR sono stati interamente sequenziati per verificare l? assenza di mutazioni introdotte dalla Taq polimerasi.

Inibitori di ADAM10

Le cellule sono state trattate con inibitori di ADAM10 per 24 ore alla concentrazione minima efficace nell'inibire il processamento di Trop-2, quindi analizzate come indicato. L'inibitore della famiglia delle metalloproteasi GM6001 (Calbiochem) ? stato sciolto in DMSO e utilizzato a 6,5-13 ?M per 24 ore; concentrazioni fino a 50 ?M di GM6001 sono risultate efficaci. L'inibitore selettivo di ADAM10 GI254023X, disciolto in DMSO, ? stato gentilmente fornito dal Dr. A. Ludwig. Le cellule hanno ricevuto due dosi (10 ?M) ogni 24 ore per 48 ore; concentrazioni fino a 20 ?M di GI254023X sono risultate efficaci. Le cellule di controllo hanno ricevuto il solo veicolo.

Silenziamento genico mediante siRNA

Le sequenze bersaglio per siRNA specifici ed efficaci per il silenziamento genico sono state scelte utilizzando strategie complementari. In breve, sono stati considerati i criteri di Tuschl, ovvero posizione nell' mRNA, contenuto di GC, composizione in basi e sequenze fiancheggianti (Elbashir, Harborth et al. 2001); ? stato utilizzato l? algoritmo proprietario Invitrogen (rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) che esegue un' analisi statistica della sequenza bersaglio, in base alla composizione in basi della sequenza, al contenuto nucleotidico e alle propriet? termodinamiche, e confronta i candidati con sequenze di siRNA validate; ? stata applicata la procedura del Whitehead Institute (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) che combina i criteri di Tuschl con previsioni di energie di legame per siRNA sia senso che antisenso e applica alle sequenze ibridizzanti filtri di distribuzione di omologia di sequenza tramite BLAST (Semizarov, Frost et al. 2003); ? stata applicata la procedura Sonnhammer (sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/) per ricerca in banche dati di siRNA convalidati (siSearch), utilizzando regole di pattern di sequenze e parametri energetici (Chalk, Wahlestedt et al.2004). Sono stati sintetizzati i siRNA identificati da pi? di un metodo o considerati ottimali da una qualsiasi delle procedure di cui sopra. Gli oligonucleotidi sono stati fatti appaiare e sono stati sottoclonati nel vettore pSUPER, gentilmente fornito dal Dr. R. Bernard (Brummelkamp, Bernards et al.2002), sotto il controllo del promotore del gene H1 trascritto dalla RNA polimerasi III. I costrutti codificanti per questi siRNA sono stati trasfettati transientemente in cellule MTE 4-14, di cui ? stata misurata la crescita in vitro come descritto a partire da 24 ore dopo la trasfezione. I livelli dei trascritti bersaglio dei siRNA sono stati quantificati mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale. Come controllo negativo sono stati utilizzati siRNA di controllo diretti verso bersagli irrilevanti; questi sono stati scelti dopo numerosi test per verificare l? assenza di effetti indipendenti dal bersaglio sulla crescita cellulare.

siRNA specifico per ADAM10 murino (NM_007399.3, nt 292-309 ) (Schramme, Abdel-Bakky et al.2008):

senso:

5?-gatccccAGACATTATGAAGGATTATttcaagagaATAATCCTTCATAATGTCTtttttggaaa-3? (SEQ ID NO: 57)

antisenso:

5?-agcttttccaaaaaAGACATTATGAAGGATTATtctcttgaaATAATCCTTCATAATGTCTggg-3? (SEQ ID NO: 58).

siRNA specifico per MMP9 murino (NM_013599, nt 1780-1798):

senso:

5?-gatccccCCGCAGACCAAGAGGGTTTttcaagagaAAACCCTCTTGGTCTGCGGtttttggaaa-3? (SEQ ID NO: 59)

antisenso:

5?-agcttttccaaaaaCCGCAGACCAAGAGGGTTTtctcttgaaAAACCCTCTTGGTCTGCGGggg-3? (SEQ ID NO: 60).

siRNA specifico per CD133 umano (NM_006017.1, nt 1061-1079) da utilizzare come controllo negativo per cellule murine:

senso:

5??gatccccCTTGACAACGTTAATAACGttcaagagaCGTTATTAACGTTGTCAAGtttttggaaa-3? (SEQ ID NO: 61)

antisenso:

5??agcttttccaaaaaCTTGACAACGTTAATAACGtctcttgaaCGTTATTAACGTTGTCAAGggg-3?

(SEQ ID NO: 62).

siRNA specifico per CD316 umano (NM_052868.2, nt 801-819) da utilizzare come controllo negativo per cellule murine:

senso:

5??gatccccTGCAGGAAGTGGTGGGAATttcaagagaATTCCCACCACTTCCTGCAtttttggaaa? 3? (SEQ ID NO: 63)

antisenso:

5??agcttttccaaaaaTGCAGGAAGTGGTGGGAATtctcttgaaATTCCCACCACTTCCTGCAggg-

3

(SEQ ID NO: 64).

RT-PCR quantitativa in tempo reale

Un microgrammo di RNA totale ? stato retrotrascritto con la trascrittasi inversa ImProm-II (Promega) seguendo il metodo standard. La quantificazione del DNA retrotrascritto mediante PCR in tempo reale ? stata condotta utilizzando il sistema ABI-PRISM 7900HT e il reagente Power SYBR? Green PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) secondo le istruzioni del produttore (Giulietti, Overbergh et al.2001), con i seguenti primer:

ADAM10 murino primer senso: 5?-AGCAACATCTGGGGACAAAC-3? (SEQ ID NO: 65)

ADAM10 murino primer antisenso: 5?-TTGCACTGGTCACTGTAGCC-3? (SEQ ID NO: 66)

MMP9 murino primer senso:5?-GTGCGACCACATCGAACTT-3? (SEQ ID NO: 67)

MMP9 murino primer antisenso: 5?-GGATGCCGTCTATGTCGTCT-3? (SEQ ID NO: 68)

B2M murino primer senso:5?-GAGCCCAAGACCGTCTACTG-3? (SEQ ID NO: 69)

B2M murino primer antisenso: 5?-AAAGAAGGTGATGTGTACATTGCT-3? (SEQ ID NO: 70).

Ciascun campione ? stato analizzato in triplicato. Le variazioni relative nei livelli di espressione genica sono state misurate mediante il metodo 2-??CT (Livak and Schmittgen 2001). Dato che il raddoppiamento del materiale nel corso dell? amplificazione richiede 1.1 cicli, ? stata usata per accuratezza una base pari a 1.834 (Guerra, Trerotola et al. 2008), Come controllo interno ? stata usato il gene costitutivo che codifica per la ?2-microglobulina (B2M). Per allestire le reazioni sono stati calcolati i ?CT (CT, gene bersaglio - CT, gene costitutivo) per ciascuna diluizione di cDNA. I dati sono stati analizzati utilizzando il metodo dei minimi quadrati. Poich? l? efficienza relativa di amplificazione ? risultata invariante per le quantit? di RNA utilizzate (Zanna, Trerotola et al. 2007, Guerra, Trerotola et al. 2008), le curve di amplificazione sono state utilizzate per calcolare i valori dei punti di incrocio per ciascuno dei campioni silenziati. L? assenza di contaminazione da DNA genomico in tutti i campioni ? stata sistematicamente verificata utilizzando RNA non retrotrascritto come stampo per reazioni di PCR.

Analisi di sequenza

I frammenti di PCR sottoclonati sono stati sequenziati con il metodo Sanger (Sambrook, Fritsch et al. 1989), per confermare la correttezza del costrutto e l? assenza di mutazioni introdotte dalla Taq polimerasi. Le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche sono state analizzate usando I pacchetti di programmi GCG e EMBOSS (www.uk.embnet.org/Software/EMBOSS/). L? analisi dei substrati di ADAM10 ? stata condotta utilizzando la banca dati Merops (merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/protsearch.pl). Il risultato della ricerca ? stato incrociato con dati addizionali aggiornati pubblicati sui siti di taglio di proteine native.

Analisi e predizioni di struttura tridimensionale

La struttura del dominio tireoglobulinico dell? isoforma p41 della catena invariante del complesso maggiore di istocompatibilit? (Major histocompatibility complex, MHC) di classe II (PDB code 1ICF, chain I) (Guncar, Pungercic et al.1999) ? stata utilizzata come stampo per la costruzione del modello per omologia di sequenza della regione tireoglobulinica di Trop-2. I domini tireoglobulinici di Trop-2 (aa 71-145 di SEQ ID NO: 1) e p41 (aa 211-271 di NP_001020330.1) sono stati allineati utilizzando I programmi GAP e NEEDLE. Nelle regioni di bassa conservazione gli allineamenti sono stati perfezionati manualmente, utilizzando come punti di ancoraggio cisteine e strutture secondarie conservate. La presenza di una corta ?-elica intorno alla prima cisteina del dominio tireoglobulinico di Trop-2 ? stata predetta in maniera concorde da pi? programmi di predizione di struttura secondaria (PHDsec, cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/; jpred2, jura.ebi.ac.uk:8888/; 3D-pssm, www.bmm.icnet.uk/~3dpssm/), in buon accordo con quella di p41. Un modello della struttura terziaria del dominio tireoglobulinico di Trop-2 ? stato costruito utilizzando i programmi MODELLER-4 (Sali and Blundell 1993) and WHATIF (bioslave.uio.no/Programs/MVL/index.php3). Risultati simili sono stati ottenuti con entrambi i programmi, e solamente il modello generato da MODELLER ? stato ulteriormente analizzato. Le propriet? stereochimiche dei modelli sono state investigate mediante il programma PROCHECK. Le rappresentazioni grafiche dei risultati di MODELLER sono state effettuate con i programmi MOLMOL, Swiss-PdbViewer (www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html), RasMol (www.umass.edu/microbio/rasmol/) e Raster3D (asdp.bnl.gov/asda/LSD/Modeling/Raster3D.html) (Merritt and Bacon 1997). La costruzione e la valutazione dei modelli sono state effettuate mediante una workstation Silicon Graphics Octane r12000. I files PDB delle proteine processate da ADAM10 sono stati estratti dalla banca dati PDB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do), e analizzati come descritto sopra. Le immagini di struttura sono state generate mediante PyMol (www.pymol.org/).

Tumori e metastasi sperimentali

Linee cellulari trasformate e trasfettanti per TROP2 sono stati iniettati per via sottocutanea (SC) in topi atimici Crl:CD1-Foxn1nu femmine di 8 settimane di et? (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). La crescita sottocutanea dei tumori ? stata quantificata come descritto (Rossi, Di Lena et al. 2008). Per valutare la diffusione metastatica, i trasfettanti delle cellule di cancro del colon KM12SM (Morikawa, Walker et al. 1988) sono stati iniettati nella milza di topi atimici Crl:CD1-Foxn1nu femmine di 8 settimane di et?. Dopo 4 settimane i topi sono stati sacrificati e sono state determinate la crescita e la diffusione del tumore al fegato o ad altri organi. Tutti i campioni autoptici sono stati sottoposti ad analisi istopatologica microscopica per rilevare la minima presenza di tumori e metastasi.

Le procedure di sperimentazione animale sono state condotte in conformit? con le linee guida istituzionali, le leggi nazionali e i protocolli internazionali (DL n. 116, GU, Suppl.40, 18 febbraio 1992; n. 8, GU, luglio 1994; the Welfare of Animals in Experimental Neoplasia; EEC Council Directive 86/609, OJL358.1, Dec.12.1987; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, United States National Research Council, 1996).

Risultati

Identificazione di un epitopo immunodominante di Trop-2

L? anticorpo E1 generato come descritto sopra e selezionato per il riconoscimento del Trop-2 nativo in cellule tumorali ? stato paragonato mediante esperimenti di competizione in citometria a flusso ad anticorpi monoclonali anti-Trop-2 noti nell? arte (Figura 2). Una efficiente competizione con E1, evidenziata dalla scomparsa di colorazione specifica per cellule esprimenti Trop-2, ? stata mostrata dagli anticorpi anti-Trop-2 162-46.2 (Lipinski, Parks et al.1981), T16 (Fradet, Cordon-Cardo et al.1984, Trerotola, Cantanelli et al.2013) e RS7-3G11, da cui derivata l'IMMU132 terapeutico umanizzato (Bardia, Mayer et al. 2019). Questo indica l? esistenza di un epitopo immunodominante di Trop-2 condiviso da pi? anticorpi monoclonali ottenuti da procedure di immunizzazione indipendenti, presente in tessuti tumorali e in tessuti normali (Fradet, Cordon-Cardo et al.1984). Il mappaggio di Trop-2 ha identificato questo epitopo immunodominante nella regione aminoacidica D146-R178 (Ikeda, Yamaguchi et al.2015), tra la regione globulare e lo stelo.

Identificazione di forme processate di Trop-2 nei tumori

Trop-2 ? stato immunoprecipitato da cellule di carcinoma dell? ovaio utilizzando l? anticorpo E1, purificato tramite cromatografia di affinit? su una colonna di E1-NHS-Sepharose mAb come descritto (purezza>95%, come indicato da analisi di WB, Figura 2,B) e sequenziato all? N-terminale mediante degradazione di Edman. Il sequenziamento ha identificato una forma di Trop-2 con inizio corrispondente alla treonina in posizione 88 (T88) (SEQ ID NO: 71) originato con tutta probabilit? da un processamento della molecola completa in corrispondenza di un sito di taglio tra arginina 87 (R87) e T88 nel dominio tireoglobulinico (Figura 2). Questo risultato ? stato poi confermato mediante analisi di spettrometria di massa del Trop-2 purificato, che ha identificato 4 peptidi indipendenti per la forma processata. L? allineamento della sequenza di Trop-2 con quella del paralogo Trop-1 evidenzia la corrispondenza tra il sito di processamento R87-T88 di Trop-2 e R80-R81 di Trop-1 (Sch?n, Sch?n et al. 1993). Altri autori hanno identificato in maniera indipendente l? esistenza di forme multiple di processamento della molecola Trop-2, in corrispondenza dello stesso sito R87-T88 (Kamble, Rane et al. 2020, Wu, Lu et al. 2020) o del sito A187-V188 e successivamente G285-V286, in una attivazione a due stadi ad opera di TACE e preseniline che porta al rilascio e traslocazione nel nucleo della coda citoplasmatica di Trop-2 (Stoyanova, Goldstein et al.2012).

Ricostruzione tridimensionale del dominio tireoglobuinico di Trop-2

Gli autori della presente invenzione hanno generato un modello tridimensionale del dominio tireoglobulinico di Trop-2 (Figura 3), applicando approcci di modellamento per omologia di sequenza sullo stampo della struttura tridimensionale della catena invariante del MHC II p41 (Guncar, Pungercic et al. 1999) come descritto sopra. Questo ha permesso di individuare 3 distinte strutture ad ansa (?loops?) a diverso orientamento spaziale, con il sito di processamento R87-T88 nel primo loop. In base al modello, il taglio in questa posizione genera due catene polipeptidiche di ~10 kDa (SEQ ID NO: 72) e ~40 kDa (SEQ ID NO: 71) collegate da un ponte disolfuro tra le due cisteine in posizione 73 e 108 (le posizioni aminoacidiche sono riferite alla molecola Trop-2 intera SEQ ID NO: 1). La previsione ? confermata dalla corsa su SDS-PAGE di Trop-2 in condizioni non riducenti e riducenti, in cui si osserva per queste ultime un peso molecolare minore di circa ~10 kDa rispetto alla molecola non ridotta (Figura 2). Il modello indica anche come il processamento renda la subunit? minore libera di ruotare rispetto al resto della proteina, il che ? predetto avere conseguenze importanti su struttura, interazioni molecolari e funzione di Trop-2.

Identificazione dell? effettore molecolare del processamento di Trop-2

? noto nell? arte come gruppi coordinati di proteasi siano responsabili del processamento di molecole di superficie che vengono cos? ad attivare vie di segnale coinvolte nella diffusione metastatica (Chen, Zhao et al. 2018). Famiglie di proteasi legate al cancro come uPA / PAI-1, MMP11 e catepsina D sono state valutate in una casistica di pazienti con cancro al seno, ma nessuna ? risultata direttamente correlata al processamento di Trop-2. Sono state quindi studiate altre metalloproteasi coinvolte nei meccanismi di adesione cellulare ed espresse nel cancro. Tra queste la metalloproteasi ADAM10 ha dimostrato di tagliare le molecole bersaglio all? interno di loops che presentano caratteristiche strutturali simili a quelle identificate in Trop-2 (Figura 4). ADAM10 ? iperespressa nei carcinomi dello stomaco (Wang, Ye et al. 2011), del fegato (Bai, Nasser et al. 2009), del colon-retto (Gavert, Conacci-Sorrell et al. 2005), dell? utero, dell? ovaio (Fogel, Gutwein et al. 2003) e nei carcinomi squamocellulari del cavo orale (Ko, Lin et al. 2007), in modo simile a quanto dimostrato per Trop-2 (Trerotola, Cantanelli et al.2013). Inoltre l' analisi del sito di processamento R87-T88 di Trop-2 ha mostrato caratteristiche comuni ai siti bersaglio di ADAM10 (SEQ ID NOs: 3-44) (Figura 4). In accordo con queste osservazioni, ? stato dimostrato che ADAM10 colocalizza con Trop-2 sulla membrana cellulare (Figura 5). L'analisi di spettrometria di massa sul coimmunoprecipitato con Trop-2 ha identificato quattro peptidi indipendenti (SEQ ID NOs: 46-49) riconducibili alla sequenza di ADAM10 (SEQ ID NO: 50), ed ha cos? formalmente dimostrato l? interazione fisica tra ADAM10 e Trop-2 (Figura 6).

Al fine di confermare che ADAM10 sia effettivamente il reponsabile del processamento di Trop-2 sopra descritto, cellule trasfettate esprimenti Trop-2 sono state trattate con un inibitore dell? attivit? enzimatica delle metalloproteasi (GM6001) o specifico per ADAM10 (GI254023X), o sottoposte a silenziamento dell? espressione genica di ADAM10 mediante siRNA specifici (Figura 7). In tutti i casi l? inibizione di ADAM10 ha determinato una riduzione del processamento di Trop-2, che ? risultato praticamente annullato nei campioni silenziati per ADAM10. Questi dati confermano dunque il ruolo di ADAM10 come molecola effettrice del processamento di Trop-2.

Inoltre ? stato dimostrato che il Trop-2 processato in R87-T88 viene riconosciuto da anticorpi policlonali diretti contro la coda citoplasmatica (Figura 8,C), ad indicare che la coda citoplasmatica viene mantenuta come parte integrante della molecola processata. Il processamento qui descritto quindi ? diverso ed indipendente da quello noto nell? arte ad opera di TACE e preseniline (Stoyanova, Goldstein et al.2012).

Ruolo pro-tumorale e pro-metastatico del processamento di Trop-2

Per studiare il ruolo funzionale del processamento di Trop-2 ? stata creata una versione di Trop-2 mutata in cui i due aminoacidi fiancheggianti il sito di processamento sono stati sostituiti con due alanine (SEQ ID NO: 45). Analisi di WB hanno dimostrato che questo mutante R87A-T88A ? resistente al processamento (Figura 8,D), e saggi di crescita in vitro hanno dimostrato che il mutante non processato perde la capacit? di stimolare la proliferazione cellulare (Figura 8,E). Saggi di proliferazione in vitro di trasfettanti esprimenti Trop-2 wt o mutato R87A-T88A trattati con siRNA per ADAM10 o inattivi di controllo hanno dimostrato che l? inibizione di ADAM10 annulla lo stimolo di crescita Trop-2 dipendente nei trasfettanti con Trop-2 wt, mentre non ha effetto sul Trop-2 mutato R87A-T88A o sui trasfettanti con il vettore vuoto (controllo) (Figura 7,C). I trasfettanti con Trop wt trattati con siRNA per ADAM10 crescono in maniera identica ai trasfettanti con il Trop-2 mutato resistente al processamento. Silenziamento di controllo avente come bersaglio la metalloproteasi MMP9 non ha alcun effetto sulla proliferazione cellulare (Figura 7,C).

Sono stati anche condotti saggi di crescita tumorale e di diffusione metastatica in vivo, in cui cellule di cancro del colon esprimenti il Trop-2 wt o mutato resistente al processamento sono stati inoculati in topi nudi tramite iniezione sottocute (modello di crescita tumorale) o intrasplenica (modello di diffusione metastatica al fegato) (Figura 9). In entrambi I modelli l? inattivazione del sito di processamento di Trop-2 mediante mutagenesi R87A-T88A elimina lo stimolo di crescita e metastatizzazione tumorale.

Tutti questi dati dimostrano che il processamento ad opera di ADAM10 ? necessario affinch? Trop-2 possa esercitare la funzione di stimolo della crescita tumorale e della diffusione metastatica.

Il processamento di Trop-2 ? presente nei tumori e assente nei tessuti normali

Il processamento di Trop-2 fin qui descritto ? stato evidenziato mediante l? utilizzo di modelli di linee cellulari trasformate o francamente tumorali. Per meglio definire quanto questo processamento sia diffuso nei tumori ? stata condotta un? analisi di WB di una casistica di pazienti con cancro al seno (Figura 10). Questa analisi ha mostrato che il 100% dei tumori presentava molecole Trop-2 processate, pi? della met? delle quali in misura elevata. Al contrario, tessuti normali analizzati in parallelo hanno mostrato completa assenza di processamento (Figura 10). Una simile analisi ? stata estesa a campioni di tumori della pelle, paragonati ad epidermide normale (in cui Trop-2 ? espresso a livelli elevati), e ad un pannello di linee cellulari tumorali di diversa origine esprimenti Trop-2 in maniera endogena (MCF-7, cancro del seno; OVCA: OVCA-432, cancro dell? ovaio; HT-29, cancro del colon) o trasfettanti (NS-0, mieloma; 293, rene trasformato, L, fibrosarcoma, MTE 4- 14, timo trasformato, HCT116, cancro del colon) (Figura 11). Nella stragrande maggioranza delle cellule trasformate (cancro della pelle, carcinomi delle ovaie, della mammella e del colon; trasfettanti di carcinoma, mieloma e cellule di fibrosarcoma) Trop-2 ? risultato processato, mentre l? epidermide normale ha mostrato assenza di processamento.

La sequenza di Trop-2 nei primati ? molto simile a quella del Trop-2 umano. In particolare il Trop-2 di macaco (Macaca mulatta) (SEQ ID NO: 73) presenta il 98,1% di omologia con il Trop-2 umano, e conservazione perfetta della sequenza di processamento. E? stato quindi analizzato un esteso pannello di tessuti normali di macaco tramite WB per Trop-2 (Figura 11), ? anche in questo caso ? stata rivelata assenza di processamento.

Pertanto il processamento di Trop-2 da parte di ADAM10 si verifica in maniera specifica nei tumori.

Procedure di produzione e screening di anticorpi monoclonali per il riconoscimento di forme processate di Trop-2 specifiche per tumori

Specifici approcci analitici e terapeutici indirizzati a Trop-2 noti nell? arte hanno fatto uso di anticorpi anti-Trop-2 che riconoscono un unico epitopo immunodominante, posizionato tra la regione globulare e la regione stelo, accessibile e riconosciuto in tutte le cellule esprimenti. Sono state qui messe a punto e applicate con successo procedure di generazione e selezione di nuovi anticorpi monoclonali contro epitopi di Trop-2 diversi, con il fine di ottenere anticorpi anti-Trop-2 capaci di riconoscere con alta affinit? e in maniera differenziale forme processate della molecola bersaglio espresse in maniera specifica nelle cellule tumorali.

Per massimizzare l? eterogeneit? di riconoscimento di epitopi corrispondenti a regioni della molecola bersaglio con distinte caratteristiche strutturali e funzionali ? stato usato un immunogeno comprendente sia l? intera porzione extracellulare (aminoacidi 31-274 di SEQ ID NO: 1) sia singoli domini di Trop-2 (dominio globulare: aminoacidi 31-145 di SEQ ID NO: 1; ?stelo?: aminoacidi 146-274 di SEQ ID NO: 1), prodotti in forma nativa in cellule trasformate umane epiteliali di rene 293 e di adenocarcinoma del seno MCF-7 (Taylor-Papadimitriou, Burchell et al.1999), e murine di fibrosarcoma L e di mieloma NS-0, in cellule di lepidottero Sf9 , in cellule di lievito. I costrutti sono stati preparati utilizzando amplificazioni per PCR di sequenze codificanti di Trop-2, fuse a tag per purificazione o per aumento di immunogenicit?. I frammenti ottenuti per PCR sono stati sottoclonati nei vettori descritti ed espressi negli ospiti corrispondenti. Le proteine Trop-2 prodotte sono state purificate tramite cromatografia di affinit?. Topi BALB/c sono stati sottoposti a cicli multipli di immunizzazione con l? immunogeno sopra descritto, seguendo le migliori procedure note nell? arte (Weir, Herzenberg et al. 1986). Gli splenociti provenienti dai topi immunizzati sono stati fusi a cellule di mieloma Sp2/0 o NS-0 e sono stati ottenuti i corrispondenti ibridomi, secondo i metodi noti nell? arte (Weir, Herzenberg et al. 1986). Gli anticorpi prodotti dagli ibridomi cos? ottenuti sono stati sottoposti a screening per reattivit? specifica e differenziale verso il Trop-2 processato espresso dalle cellule tumorali. In una fase dello screening ? stata misurata la capacit? degli anticorpi di legare in maniera specifica il Trop-2. Si veda la Figura 12 per un esempio di applicazione di questa fase dello screening, in cui ? stata utilizzata analisi in citometria a flusso di cellule L trasfettate con TROP2 o trasfettate con il vettore vuoto (controllo negativo): sono mostrati i profili di due nuovi anticorpi, 1A9 e 1B4, che legano con alta efficienza Trop-2 e non legano il controllo negativo. In un? altra fase dello screening ? stata misurata la capacit? degli anticorpi di riconoscere e legare con alta affinit? la forma processata di Trop-2 espressa dai tumori, in modo differenziale rispetto alla forma non processata espressa dai tessuti normali. Si veda la Figura 13 per un esempio di applicazione di questa fase dello screening, in cui ? stata utilizzata analisi in citometria a flusso di trasfettanti KM12SM esprimenti il Trop-2 wt (SEQ ID NO: 1) processato o il Trop-2 mutato R87A-T88A (SEQ ID NO: 45) resistente al processamento (corrispondenti analisi di WB di questi trasfettanti sono mostrate in Figura 8,D), e trasfettanti di controllo con il vettore vuoto: ? mostrato il profilo dell? anticorpo 1A9, che ? in grado di legare con alta efficienza solamente il Trop-2 nella sua forma processata, e non il Trop-2 mutato resistente al processamento, nonostante i livelli di espressione di Trop-2 wt e mutante nei trasfettanti siano identici, come dimostrato da analoga analisi utilizzando l? anticorpo anti-Trop-2 noto nell? arte T16 (Figura 13, pannello in alto a sinistra). Esperimenti di competizione reciproca in citometria a flusso tra gli anticorpi 1A9, 1B4 e T16 su trasfettanti KM12SM/Trop-2 wt e KM12SM/vettore hanno dimostrato che 1A9 e 1B4 bloccano reciprocamente il legame a Trop-2, indicando il riconoscimento di un epitopo condiviso. Al contrario non si registra alcuna competizione di 1A9 e 1B4 nei confronti di T16, dimostrando come le procedure descritte abbiano effettivamente permesso di ottenere anticorpi che riconoscono un epitopo diverso dall? epitopo immunodominante.

Le procedure di immunizzazione e screening descritte, pertanto, hanno permesso di ottenere nuovi anticorpi che riconoscono in maniera specifica e differenziale l? antigene processato espresso nelle cellule tumorali, rispetto all? antigene espresso nei tessuti normali. Simili procedure possono essere applicate all? ottenimento di anticorpi per una variet? di antigeni che subiscano processamento specifico e differenziale nelle cellule tumorali rispetto ai tessuti normali.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Un metodo per ottenere anticorpi monoclonali, o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati, che leghino con alta affinit? proteine processate specificamente espresse in tumori locali e metastatici.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente procedure di immunizzazione in cui l? immunogeno consiste nella proteina bersaglio, suoi frammenti e coniugati prodotti in organismi diversi, incluse cellule tumorali naturalmente esprimenti la proteina bersaglio processata e cellule trasformate e tumorali di mammifero, cellule di insetto, cellule di lievito trasfettate con vettori che esprimono la proteina bersaglio e suoi frammenti, anche come proteine di fusione con altre sequenze.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui gli anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati vengono selezionati mediante procedure di screening che comprendono :

a) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori;

b) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori;

c) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali; d) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali;

e) mettere in contatto l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati con un controllo negativo, comprendente o consistente in proteina o proteine diverse dalla proteina bersaglio e/o cellule che non esprimono la proteina bersaglio;

f) misurare il legame tra l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati e il controllo negativo;

g) selezionare l? anticorpo monoclonale o suoi frammenti leganti l? antigene o coniugati che mostra assenza di legame con il controllo negativo e legame con la proteina bersaglio nella sua forma processata specifica dei tumori almeno 10 volte maggiore del legame con la proteina bersaglio nella sua forma non processata dei tessuti normali.

Queste diverse fasi possono essere eseguite in maniera sequenziale o in parallelo.

4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui il legame viene misurato mediante citometria a flusso e/o saggio ELISA e/o saggio ELISA su cellule e/o microscopia e/o interferometria biostrato e/o calorimetria isotermica di titolazione e/o termoforesi su microscala e/o risonanza plasmonica di superficie.

5. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, in cui il processamento ? posttraduzionale, e comprende almeno una delle modificazioni selezionate dal gruppo costituito da: taglio del legame peptidico, modificazioni di aminoacidi, inclusa la deamidazione, aggiunta di gruppi chimici, incluse la fosforilazione, l? acetilazione, l? idrossilazione, la metilazione, aggiunta di molecole organiche complesse, incluse la lipidazione, l? AMPilazione, l? ubiquitinazione, la SUMOilazione.

6. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, in cui il processamento consiste nel taglio di almeno un legame peptidico della proteina bersaglio.

7. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, in cui la proteina bersaglio ? Trop-2.

8. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, in cui i tumori includono i tumori del seno, testa e collo, pelle, colon-retto, stomaco, polmone, ovaio, tiroide, prostata, pancreas, endometrio, cervice, cistifellea, dotti biliari, rene, vescica urinaria, coriocarcinomi, e loro metastasi.

9. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, finalizzato all? ottenimento di anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati per uso come medicamento, preferibilmente per uso nella prevenzione e/o trattamento di tumori e metastasi, pi? preferibilmente dei tumori e metastasi che esprimono Trop-2, ancora pi? preferibilmente in combinazione con almeno un agente o un trattamento terapeutico.

10. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, finalizzato all? ottenimento di anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l? antigene o coniugati da utilizzare per diagnosticare e/o valutare il rischio di sviluppare e/o fornire una prognosi e/o monitorare la progressione e/o monitorare l?efficacia di un trattamento terapeutico e/o per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore o metastasi in un soggetto.