JP2015524051A - ＣＤ９、Ａｋｔおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子の阻害剤に基づく抗腫瘍療法に対する応答の予測マーカーとしてのＴｒｏｐ−２の使用 - Google Patents

ＣＤ９、Ａｋｔおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子の阻害剤に基づく抗腫瘍療法に対する応答の予測マーカーとしてのＴｒｏｐ−２の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、腫瘍におけるTrop-2レベルが、対応する正常組織におけるTrop-2レベルと比較して増加しているという事実によって特徴づけられる癌の診断および治療法を構成し、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を阻害する薬物を含むがこれに限定されない、Trop-2シグナル伝達ネットワークの成分に対する薬物による抗癌療法に対する腫瘍応答性を予測できる生物学的マーカーを構成する。より具体的には、本発明は、新たな化合物のスクリーニングにおけるならびに臨床における、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を阻害する薬物を含むがこれに限定されないTrop-2シグナル伝達ネットワーク分子を標的にした抗癌薬を使用する指針としての、生物学的マーカーTrop-2の使用に関する。

Description

本発明は、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を阻害する薬物を含むがこれに限定されない、Trop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に対する薬物による、Trop-2を過剰発現している腫瘍を有する患者の診断および抗癌療法に関する。Trop-2の過剰発現は、新たな化合物の抗癌活性のin vitroおよびin vivoスクリーニングに利用することもできる。
最新世代の標的化抗癌療法は、優性腫瘍形成性キナーゼおよび/または増殖因子受容体を標的とするチロシン-―キナーゼ阻害剤(TKI)および/またはモノクローナル抗体(mAb)を利用する。しかし一般に、これらの薬剤と関連する臨床上の有益性は、多くの場合に、腫瘍における特異的分子変換(変異、増幅/欠失、発現の増加/低下)によって定義される治療を受けた患者のサブセットに限定される。この発見により、特定の治療に対する感受性決定因子として腫瘍の遺伝子型/表現型の考え得る重要性が強調されることから、バイオマーカーとして使用される分子の変化に基づいて治療前に患者の層別化がもたらされる。治療を効率的に個人化させることにより臨床結果を最適化する目的で、これらバイオマーカーが「予測マーカー」(すなわち標的療法に対する応答性または耐性を予測することができる)として使用するために研究される。
予測バイオマーカーは、極めて少ない標的治療の採択指針としてクリニックにおいて現在使用されている。例として、内分泌療法で治療すべき乳癌患者を選択するために使用されるエストロゲン(ER)およびプロゲステロンの受容体;トラスツズマブでの治療に対してはHER-2の増幅;イマチニブでの治療に対しては慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL転位および消化管間質腫瘍におけるc-kitの変異;ゲフィチニブ/エルロチニブでの治療に対しては肺癌におけるEGFR変異;セツキシマブでの治療に対しては結腸直腸癌におけるKRAS変異が含まれる。
「強化バイオマーカー」、すなわち患者のどのサブグループが治療に応答する可能性が高いかについて予測することができるマーカーは、必要不可欠である。実際にそのマーカーを使用して、有用になる可能性があるサブグループへと実験を集中させ、それにより新薬の成功の可能性および臨床試験の有効性を高めることができる。HER2/ハーセプテスト/トラスツズマブの組み合わせにより、標的療法の診断ツールの成功使用例が得られる。多くはないが、予測および強化マーカーの他の場合が、この戦略の有用性を支持している。
しかしほとんどの場合において、現在利用可能な生物学的マーカーとは、治療標的自体かまたはその標的が作用すると考えられる主要なシグナル伝達経路の個々の成分のいずれかのことを指す。これらの戦略の一般的な制約は、単一のシグナル伝達経路の変化が、ある腫瘍の増殖に関与する唯一の変化と考えられていることである。それどころか、腫瘍形成の根底には多段階の進行過程がある。全エキソームの配列決定および腫瘍の遺伝子発現プロファイルのマイクロアレイ分析から得られたデータを含む複数の方針の証拠により、腫瘍における極めて多くの異なる変異および異なるシグナル伝達経路間の非常に複雑な相互作用が明らかになる。これらの調査により、効率的な治療を得るためには、区別され、臨床的に関連するサブグループに腫瘍を分類し、複数のシグナル伝達経路または最終的な共通経路をたたくことが重要であることが強調される。
古くから腫瘍形成に関与する遺伝的変化は、PI3K、Ras、BCR-ABL、EGFR、HER-2などの癌遺伝子と関係があり(「癌遺伝子依存性」)、腫瘍形成条件の誘発と維持の両方に必要であり、したがって療法に対する論理的な標的になる。しかし、腫瘍形成性の状態は、正常細胞機能に関与する様々な遺伝子および経路によっても決まり、それらは、本質的に腫瘍形成性でなくても(「非癌遺伝子依存性」)、調節の変化を表す。この依存性により、正常細胞と腫瘍細胞の間で毒性に差がある多数の薬物標的をえることができ:中でも、いくつかは前臨床モデルで研究されている。これらの標的のうちいくつかしか、臨床試験で試験されたりすでに療法に使用されたりしていない(例えば、ベバシズマブまたはソラフェニブ/スニチニブでの治療に対するVEGF)。
したがって、既存の療法の有効性を改善して、新たな治療標的を同定するには、正常なシグナル伝達経路の研究と同時に古くからの癌遺伝子の分析を行わなければならない。これらの「正常」マーカーは、腫瘍形成を裏づける際に重要な因子として現れるが、ヒトにおける療法に対する応答の予測にまだほとんど使用されていない。
Trop-2(AC: P09758)は、細胞質内のカルシウム増加シグナルを伝達することができる膜貫通糖タンパク質であり[Ripani、1998年、#648]、上皮組織における細胞-細胞接着に関与し、腫瘍増殖を誘導するシグナル伝達ネットワークを駆動する(Guerra, Trerotolaら2013年)。Trop-2は、4つの古典的な接着分子ファミリー、すなわちインテグリン、カドヘリン、セレクチンおよびIg-CAMとは異なる構造的特徴を有する。Trop-2の細胞外ドメインは、EGF-様のドメインを持つシステインに富む球状部分(GA733-I型ドメイン(ChongおよびSpeicher、2001年))およびサイログロブリンドメイン(Linnenbach、Sengら1993年; Fornaro、Dell'Arcipreteら1995年; El Sewedy、Fornaroら1998年)を含有し、これらのドメインは、ホモマルチマーの形成に必要である(Balzar、Briaire-de Bruijnら2001年)。システインのない領域(「基部」)は、疎水性膜貫通らせんにTrop-2の球状部分を接続する。Trop-2の細胞内部分は、酵素活性を欠いた26aaの尾部からなり、ホスホイノシチド結合HIKEを含有する(El Sewedy、 Fornaroら1998年; Ciccarelli、Acciaritoら2000年)。HIKEは、シグナル伝達物質分子中に見いだされ、Gタンパク質、PKC、カルモジュリンなどエフェクター/調節分子のドッキング部位として作用することができる(Alberti 1999年)。HIKEは、PKCリン酸化部位(S303)も含む(Basu、Goldenbergら1995年)。
実験モデルにおいて、Trop-2発現は腫瘍増殖と関連した(Klein, Hartmannら1990年; Basu、Goldenbergら1995年; Wang, Dayら2008年; Cubas、Zhangら2010年; Goldstein、Stoyanovaら2010年)。ヒト腫瘍において、Trop-2の過剰発現は、膵臓、胃、口腔、卵巣、肺および結腸直腸癌の腫瘍における負の予後因子である(Trerotola、Cantanelliら2013年)。さらに、Trop-2は、前立腺癌の前駆体細胞のマーカーでもある(Goldstein、 Stoyanovaら2010年; Trerotola、Rathoreら2010年)。
本発明者らは、ヒトにおける大多数の腫瘍および腫瘍細胞系によってTrop-2が高レベルで発現されることを以前に実証した(Trerotola、 Cantanelliら2013年)。具体的には、本著者らは、Trop-2をすでに発現している起源の組織と比較した場合でさえ、癌細胞においてそれが過剰発現されることを実証し(S. Alberti、「Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors」PCT/IT2009/000035)、発現の増加により腫瘍細胞に選択的利益が与えられることを示した(Trerotola、Cantanelliら2013年)。
本発明者らは、in vitroとin vivoの両方で、腫瘍の発生におけるTrop-2の刺激の機能を以前に実証した。Trop-2の過剰発現は、不死化細胞と腫瘍細胞両方の増殖を刺激し、細胞周期のS期の細胞の割合が増加する。一方、Trop-2に対する低分子干渉(si)RNAの使用により、Trop-2を発現する乳癌および大腸癌細胞系の増殖は無効になる。同様の結果は、実験的腫瘍においても得られ: Trop-2の発現は、腫瘍増殖を劇的に高め、この増殖は発現レベルに正比例する。
増殖刺激にはTrop-2の細胞質内尾部の完全性が必要であり:尾部全体またはHIKEドメインの欠失、セリン303(PKCαによってリン酸化される)および322の点突然変異、α-ヘリックスの片側全体に沿って負電荷を与える4個のグルタミン酸残基のリシン正残基での置きかえは、全てTrop-2刺激活性の消失を引き起こす(図1)。
in vitroとin vivoの両方で、正常なTrop-2の過剰発現によって細胞増殖の刺激が得られた。これと一致して、本発明者らは、コード領域ならびに5'および3'非翻訳領域(UTR)またはプロモータに近位の領域のいずれにおいても、腫瘍のTROP2遺伝子に変異または構造変化を同定しなかった(Trerotola、Cantanelliら2013年)。
これらの結果は、変異がない場合、Trop-2発現の増加が癌細胞の増殖を刺激するのに必要十分であることを示している(Trerotola、Cantanelliら2013年)。したがって、Trop-2は「非癌遺伝子」であり、その過剰発現に、腫瘍細胞は増殖を依存している(Trerotola、Cantanelliら2013年)。この増殖刺激は、ヒストタイプ(histotype)(癌、肉腫)および種(ヒト、マウス)に非依存性であり、Trop-2が機能するシグナル伝達ネットワーク(Guerra、Trerotolaら2013年)が高度に保存されている(Trerotola、Cantanelliら2013年)ことを示している(S. Alberti「Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors」PCT/IT2009/000035)。
Trop-2を発現する腫瘍において特異的かつ差次的に活性化されるエフェクター分子を同定するために、このシグナル伝達ネットワークは本著者らによってここでさらに定義され、Trop-2依存性抗癌療法に対する標的として使用される。
本著者らによって実施された電子顕微鏡分析は、Trop-2が、細胞の先端表面の大繊毛(macrovilli)、細胞間に伸びる絨毛および膜の別個の領域の凝集体に局在していることを示している(図2)。さらなる調査により、シグナル伝達タンパク質間の相互作用の分子ネットワークを作ることができる膜中の構造的なプラットフォームであるテトラスパニンネットワークとして、これらの凝集体が同定された。Trop-2とこれら巨大分子プラットフォームに対する特異的マーカー(Barreiro、Zamaiら2008年)との相互作用の共焦点顕微鏡による系統的分析から、完全な細胞(図3a)および「細胞痕跡(cell footprints)」(Hakomori 2002年) (図3c)の両方において、Trop-2とテトラスパニンおよびそれらと関連する分子(CD9)との共局在が明らかになった。共キャッピング(co-capping)および共免疫沈降の技術を使用して、ヒトおよびマウス細胞におけるTrop-2とCD9、CD81、CD82、CD151との直接的物理的相互作用も実証された(図3b、図3e)。一方で、Trop-2は、脂質ラフトの特徴的マーカーであるカベオリンと共局在しなかった(図3a〜図3c)。
テトラスパニンのその相手との結合がコレステロール依存性であることは公知であり(Hakomori 2002年):それぞれ細胞膜からコレステロールを除去および沈殿して(Hakomori 2002年、Charrin、2003年 #17269)、培地へのTrop-2の放出および細胞膜溶解物からBRIJへのTrop-2の沈殿を誘導することができる(Le Naour、Andreら2006年)メチル-β-シクロデキストリンおよびジギトニンの能力によって、Trop-2がテトラスパニンプラットフォームの不可欠な成分であるという事実のさらなる確証が得られる(図3f)。
テトラスパニンネットワークは、脂質、タンパク質キナーゼおよび細胞内エフェクターを活性化する多様な細胞表面受容体の土台を提供する(Hemler 2003年; Le Naour、 Andreら2006年)。したがって、本発明者らは、Trop-2が、膜貫通チロシン-キナーゼ受容体(PDGFR、Met、Ret、VEGFR)、チロシンおよびセリン/スレオニンキナーゼ、ホスファターゼ、細胞周期およびアポトーシスの調節分子の発現をモジュレートさせうることをすでに示した(Guerra、Trerotolaら2013年) (S. Alberti「Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors」PCT/IT2009/000035)。これらの結果は、新たなプロテオーム分析と共にここで拡張される(図4)。タンパク質-タンパク質接触の統計分析用(Minguez、Gotzら2009年)および経路分析用の生物情報学ツール(Ingenuity Pathways Analysis software)の適用により、Trop-2の主要なシグナル伝達ネットワークを定義することが可能になった(Guerra、Trerotolaら2013年)(図5)。Trop-2によって駆動される分子には、シグナル伝達物質(膜貫通受容体、細胞質チロシンおよびセリン/スレオニンキナーゼ、ホスファターゼ)、タンパク質の合成、折りたたみおよび分解の成分、核酸の合成および炭水化物の代謝に関与する酵素がある。Trop-2によってモジュレートされる全タンパク質の2/3超 (114/165)(図4)は、タンパク質-タンパク質接触によって接続されている(図5a)。タンパク質-タンパク質接触のこのネットワークは、癌増殖に重要なシグナル伝達経路として同定され(図5b)、PKC、Akt/Gsk3β/S6KおよびERK経路ならびにエフェクターNF-kB、Jun、CREB1、STAT、Rbおよびp53を含む(Guerra、Trerotolaら2013年)。
したがってこれらのデータにより、本発明者らは、PKCがTrop-2のシグナル伝達ネットワークにおける重要な媒介物質であることを実証することが可能になった。全体として、Trop-2は、7個のPKC基質および55個のPKCの基質/調節分子をモジュレートさせる(図4および図5)。PKCαは、Trop-2を発現している細胞中でその活性化部位S657に対するリン酸化において最高の増加を示し(図4a)、このことはPKCαの活性化がTrop-2依存性であることを示している。これは、ERKシグナル伝達経路の活性化ならびにTrop-2によって誘導されるPP2A(PKCαの不活性化に関与するホスファターゼ)およびPDK1(活性化部位においてPKCαをリン酸化する)のモジュレーションと一致する。PKCαは、腫瘍において頻繁に過剰発現され、癌に関与するシグナル伝達過程を導く。PKCαも、CD9の主要なエフェクターの1つであり(Zhang、Bontragerら2001年)、テトラスパニン複合体に集められ(Zhang、Bontragerら2001年; Rosse、Linchら2010年)、ジアシルグリセロール(DAG)によって活性化される(Parekh、Zieglerら2000年)。
これらの指標に基づいて、本発明者らは、CD9ミクロドメインが、PKCαとTrop-2の間のコネクタとして機能することを示し: PKCαは、CD81およびCD151テトラスパニンと、およびさらに強くCD9と共免疫沈降した(図3e)。同様の様式で、Trop-2は、CD9、CD81、CD82およびCD151と共免疫沈降する(図3e)。さらに、CD9、Trop-2およびPKCαは別の膜サブドメインに共局在し、この共局在はリン酸化依存性であり(図3c、図3d)、したがってCD9との相互作用を介してTrop-2とPKCαの両方がテトラスパニンミクロドメインに集められることを実証している。
次いで、このシグナル伝達ネットワークの生物情報学分析により、Trop-2による細胞増殖の刺激に重要な経路として、mTORではなくGSK3およびS6Kアームを通るAktシグナル伝達経路が同定された(図6)。Aktは、PI3Kの主要な下流エフェクターである。Akt T308およびS473活性化部位は、リン酸化の標的である。rictor-mTOR複合体は、ILK(Koul、Shenら2005年)と共に、S473でAktをリン酸化する(Sarbassov、Guertinら2005年)が、T308のリン酸化ならびにGSK3およびS6Kエフェクターの活性化における役割はない(Jacinto、Facchinettiら2006年)。これと一致して、Trop-2は、Akt-T308のリン酸化を誘導するが、Akt-S473のそれはせず(図6b)、GSK3およびS6Kのリン酸化をモジュレートさせる(図4a)が、mTORのそれはしない。以前に本発明者らによりプロテオームチップで実証されたILKの下方制御、およびPMAによってさらに強まるTrop-2によるAkt-S473のリン酸化の低下(図6b)は、ILKの、およびPKCに誘導されるAkt-S473リン酸化の下方制御と一致する(Wen、Huangら2003年)。一方で、Trop-2は、Akt-T308のリン酸化を誘導し(図6b)、その誘導はPDK1の誘導とは一致せず、以前にプロテオームチップでも実証されたPP2Aの触媒および調節サブユニット(PPAは、T308に作用するCa2+依存性ホスファターゼである)の化学量論的な低下と一致する(Freeley、Parkら2007年)(図4a)。PKCα-非依存性機序と一致して、PMAは、Akt-T308のリン酸化レベルに全く効果がない(図6b)。
Trop-2とテトラスパニン膜複合体、特にCD9との相互作用は、重要な成分としてAktシグナル伝達経路を有する複雑な下流のシグナル伝達ネットワークを活性化し、細胞増殖を刺激する。
次いで、本発明者らは、Trop-2を発現している増殖中の細胞におけるCD9およびAktの選択的阻害の効果を研究した。siRNAによって媒介されるCD9の下方制御(図7a、図7b)は、Trop-2発現MTE 4-14細胞の増殖を著しく低下させるが、Trop-2陰性細胞に対しては基本的に影響がない(図7d)。この低下は、Trop-2のサイレンシング(図7d)によって引き起こされる低下と同等であり、癌細胞の増殖におけるTrop-2の不可欠な役割と一致する。さらに、CD9の発現がTrop-2に影響されない(図7c)ことを考えれば、これらの結果は、CD9は、Trop-2による腫瘍増殖の刺激に必要であるが、一方で基本的な細胞増殖に対して不活性であることも示している。サイレンシングまたは特定の薬物のいずれかによるAktの阻害は、対照細胞に対しては全く効果がないが、Trop-2を発現している細胞の細胞増殖には用量依存性様式で著しい減少を誘導する(図8)。これと一致して、動物モデルにおいて皮下に注入されたTrop-2を発現している腫瘍は、Akt活性を阻害する特定の薬物での処理後に著しい増殖低下を示す(図9)。したがって、Aktは、Trop-2依存性増殖刺激の媒介において中心的な機能的役割を有し、前臨床モデルにおいてこの分子の薬理学的阻害には、抗癌療法効果が有る。
PCT/IT2009/000035
cubic.bioc.columbia.edu D.L. No.1 16、G.U.、 補足 40、2月18日、1992年 D.L. No. 8、G.U.、 6月、1994年 UKCCCR Guidelines for the Welfare of Animals in Experimental Neoplasia EEC Council Directive 86/609、OJ L 358. 1、12月12日、1987年 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、United States National Research Council、1996年 www.kodak.com rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/ sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/ http://us.expasy.org/ch2d/protocols/ www.york.ac.uk/depts/biol/tf/proteomics/ snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi www.ingenuity.com
本発明者らは、腫瘍の増殖を刺激し、CD9との相互作用およびAktシグナル伝達経路の活性化を通してTrop-2により特異的に活性化される新規なシグナル伝達ネットワークを同定した。Trop-2の過剰発現は、Trop-2を発現する細胞の増殖を選択的に停止できるAktおよびCD9阻害剤に対する感受性を決定づける。これらの結果は、個人化抗癌療法のオリジナルな形式に道を開く。
したがって、Trop-2シグナル伝達ネットワークの成分の活性を阻害する薬物を用いる抗癌療法の予後をin vitroで予測する方法であって、前記成分がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子からなる群から選択され、前記方法が生体サンプル中のTrop-2タンパク質または対応するmRNAの発現レベルを決定する工程を含むまたはこの工程から成り、対応する正常組織におけるレベルと比較して、Trop-2タンパク質または対応するmRNAの発現レベルの増加が検出される場合に有効な予後が生じる方法が、本発明の特定の実施形態である。
テトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子は、本発明者らによって同定された通り、Trop-2ネットワークに属しておりテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの部分でもある分子、特に、上皮増殖因子受容体(EGFR)、チロシンタンパク質キナーゼMet、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼc-RAF、プロトオンコジーンチロシンタンパク質キナーゼSrc、低分子量GTP結合タンパク質CDC42、チロシンタンパク質キナーゼJAK2、cAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットα(PKA C-α)、非受容体11型チロシンタンパク質ホスファターゼ(SHP2)、インシュリン受容体基質1(IRS1)、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼPAK 1、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(JNK)である。
一実施形態において、生物学的マーカーTrop-2陽性とは、同じ対象の対応する正常組織と比較して、腫瘍中のTrop-2のmRNAまたはタンパク質の10%以上の増加を意味する。一実施形態において、前記陽性を使用して、臨床試験を含む治療目的で抗癌薬を使用する患者を選択し、前記薬物は、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むがこれに限定されない、Trop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に対するものである。したがって、本発明は、新規な生物学的マーカーを教示し、前記マーカーはTrop-2の過剰発現によって特徴づけられる。これは、特定の療法に対する応答の予測マーカーであり、潜在的に応答性がある患者のサブグループを同定することができ、Trop-2によって駆動される分子、特に限定されないが、CD9およびAktに対する薬物の臨床試験に採用することができる強化マーカーである。前記バイオマーカーは、単独で使用することも他のバイオマーカーと組み合わせて使用することもできる。
別の実施形態において、本発明は、癌の治療もしくは予防または癌細胞増殖の阻害のための候補薬物をin vitroスクリーニングするための方法であって、そのような薬物がTrop-2シグナル伝達ネットワークの成分に対するものであり、前記成分がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子、すなわち、本発明者らによって同定された通り、Trop-2ネットワークに属しておりテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの部分でもある分子、特に、上皮増殖因子受容体(EGFR)、チロシンタンパク質キナーゼMet、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼc-RAF、プロトオンコジーンチロシンタンパク質キナーゼSrc、低分子量GTP結合タンパク質CDC42、チロシンタンパク質キナーゼJAK2、cAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットα(PKA C-α)、非受容体11型チロシンタンパク質ホスファターゼ(SHP2)、インシュリン受容体基質1(IRS1)、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼPAK 1、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(JNK)からなる群から選択される方法を提供する。この方法は、Trop-2を発現している細胞およびTrop-2を発現していない細胞に滅菌食塩水中の試験しようとする化合物を投与する工程と;並行して、Trop-2を発現している細胞およびTrop-2を発現していない細胞に滅菌食塩水を単独で投与する工程とを含む。化合物と接触しており発現していない細胞は、化合物自体の作用の特異性の対照になり得、一方で滅菌食塩水単独と接触しているTrop-2を発現しているおよび発現していない細胞は、化合物自体の活性の対照になり得る。続いて、化合物の生物活性を測定する、すなわち、処理を施したTrop-2を発現していない細胞ならびに処理を施していない、すなわち食塩水単独と接触させたTrop-2を発現しているおよび発現していない細胞と比較して、Trop-2を発現している細胞の増殖を測定する。最終的に、Trop-2を発現しておらず処理を施した細胞および処理を施していない細胞の増殖と比較して、Trop-2を発現し処理を施した細胞において少なくとも10%細胞増殖を低下させることができる化合物が選択される。
本発明は、癌の治療もしくは予防または癌細胞増殖の阻害のための候補薬物をin vivoスクリーニングするための方法であって、前記薬物がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むがこれに限定されないTrop-2シグナル伝達ネットワークの成分に対する方法も提供する。この方法は、前臨床および臨床モデルにおいて、生物学的マーカーTrop-2に関して陽性(すなわち、過剰発現している)または陰性(すなわち過剰発現していない)の腫瘍に滅菌食塩水中の試験しようとする化合物を投与する工程と;並行して、Trop-2を過剰発現しているまたはしていない腫瘍に滅菌食塩水を単独で投与する工程とを含む。化合物と接触しており過剰発現していない腫瘍は、化合物自体の作用の特異性の対照になり得、一方で滅菌食塩水単独と接触しているTrop-2を過剰発現しているまたはしていない腫瘍は、化合物自体の活性の対照になり得る。続いて、化合物の生物活性を測定する、すなわち、処理を施したTrop-2を過剰発現していない腫瘍ならびに処理を施していない、すなわち食塩水単独と接触させたTrop-2を過剰発現しているまたはしていない腫瘍と比較して、Trop-2を過剰発現している腫瘍の増殖を測定する。最終的に、処理したおよび処理していない対照の腫瘍増殖と比較して、Trop-2を過剰発現し処理を施した腫瘍において少なくとも10%腫瘍増殖を低下させることができる化合物が選択される。
加えて、本発明は、Trop-2シグナル伝達ネットワークの成分の活性を阻害する化合物であって、前記成分が、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子からなる群から選択され、Trop-2タンパク質または対応するmRNAを正常組織より高いレベルで発現している腫瘍の治療で使用する化合物に関する。上述の通り、テトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子は、本発明者らによって同定された通り、Trop-2ネットワークに属しておりテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの部分でもある分子、特に、上皮増殖因子受容体(EGFR)、チロシンタンパク質キナーゼMet、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼc-RAF、プロトオンコジーンチロシンタンパク質キナーゼSrc、低分子量GTP結合タンパク質CDC42、チロシンタンパク質キナーゼJAK2、cAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットα(PKA C-α)、非受容体11型チロシンタンパク質ホスファターゼ(SHP2)、インシュリン受容体基質1(IRS1)、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼPAK 1、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(JNK)である。
すでに公知のいくつかの阻害性分子は: MK-2206、A6730、ペリホシン、GSK690693、GSK2110183、GDC-0068、AT7867、ARQ092、AZD5363、A-674563、PHT-427、PF-04691502、SureCN1078972、842148-40-7、AC1NX3D3、MLS002702033、SureCN10005574、SureCN1559590、SureCN570829、SH-5、SH-6、ホノキオール（Honokiol）、ミルテホシン、トリシリビンホスフェート(Akt阻害剤)、K00598a、DAPH2、SureCN238877(EGFR阻害剤)、SureCN4269573(EGFR、c-RAF、Srcの阻害剤)、ダサチニブ(Src阻害剤)、SureCN1518805、1,9-ピラゾロアントロン、AS-601245、アミノピリジン誘導体2(JNK阻害剤)である。
場合によっては、上記の化合物は、化学療法、アルキル化剤(メクロレタミンクロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ニトロソ尿素、ブスルファン、ダカルバジン(DTIC)、テモゾロマイド、チオテパおよびアルトレタミンなど)、代謝拮抗物質(5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メルカプトプリン(6-MP)、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、水酸化尿素、メトトレキセート、ペメトレキセド、ペントスタチン、チオグアニンなど)、抗腫瘍抗生物質(アントラサイクリン、アクチノマイシンD、ブレオマイシン、マイトマイシンCなど)、トポイソメラーゼ阻害剤(トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロンなど)、細胞分裂阻害剤(パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、エストラムスチンなど)、副腎皮質ステロイド(プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなど)、分化剤（differentiating agents）(レチノイド、トレチノイン/ATRA、ベキサロテンおよび三酸化ヒ素など)、ホルモン療法、標的化キナーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤ボルテゾミブなど他の療法と組み合わせて使用することができる。
本発明に従って使用する本発明による化合物は、オリゴヌクレオチド、「ドミナントネガティブ」分子として機能するCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子に対応する改変分子、モノクローナル抗体、薬理学的阻害剤、小分子化合物またはそれらの組み合わせからなる群から選ぶことができる。
上述の通り、上記分子の活性阻害は、非限定的な例として、対応する改変分子によって得ることができ、その分子は「ドミナントネガティブ」、すなわち正常分子と類似しているが生物活性を欠く分子として機能し;これらのドミナントネガティブ分子は、正常分子と置きかわり、細胞過程におけるその機能を無効にする。生物活性の阻害は、正常分子の触媒および/または調節部位に結合し、その活性を阻害する特異的モノクローナル抗体で得ることもできる。生物活性の阻害は、薬理学的阻害剤で得ることもできる。主な例の1つは、Aktの薬理学的阻害剤であるMK-2206およびA6730であり、Trop-2の発現が本発明による抗癌使用に対する指標を構成する。
本発明は、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むがこれに限定されないTrop-2のシグナル伝達経路成分の発現を阻害することによって、患者の腫瘍の増殖を阻害することができるオリゴヌクレオチド(RNAまたはDNA、二本鎖または一本鎖)にも関し、これらの腫瘍は生物学的マーカーTrop-2について陽性である。一例として、CD9発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の標的配列がCD9のmRNA(GenBank受託番号: NM_007657.3)中に含有される、CD9を標的とするサイレンシングRNA(siRNA)を構成し、サイレンシングRNAは、以下の配列を含むがこれに限定されない。
これらのサイレンシング標的配列を他の配列に融合して、一例として、以下の配列(センスおよびアンチセンス方向の標的配列に下線を引いた)を有する、適当なベクターに挿入した場合にヘアピンRNAに転写されるオリゴヌクレオチドを得ることもできる。
一例として、AKT発現を阻害する方法は、センス鎖中の標的配列は、AKTのmRNA(NM_009652.3)中に含有されている、AKTを標的とするsiRNAにあり、siRNAは、以下の配列:
およびヘアピンRNAに転写するための対応するオリゴヌクレオチド:
または
およびヘアピンRNAに転写するための対応するオリゴヌクレオチド:
を含むがこれに限定されない。
本発明による配列、配列番号1〜配列番号12は、一本鎖オリゴヌクレオチドとしてまたは二本鎖オリゴヌクレオチドとして使用することができる。前記配列は、クローニングベクターに挿入することができる。
産業用途および実装様式
本発明は、Trop-2を過剰発現する腫瘍の診断およびそのような腫瘍がある患者の治癒のためにクリニックに適用することができ、Trop-2の過剰発現が、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むがこれに限定されないTrop-2のシグナル伝達ネットワークの成分を標的にした化合物および/または治療へと治療法の採択を導く生物学的マーカーを構成する。本発明の別の適用は、Trop-2を過剰発現しており、Trop-2のシグナル伝達ネットワークに属している分子中に同定される標的、特にCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子に対する物質、ならびに/またはin vitroおよびin vivoで処理に感受性の細胞や腫瘍を使用する、癌療法のための新薬のスクリーニングおよび治療である。
対応する対照細胞と比較した、腫瘍細胞におけるTROP2のmRNAの増加は、新鮮なまたは凍結した細胞および組織からなる培養細胞ならびに生検細胞において定量化することができる。mRNAは、利用可能な技術を適用することにより当業技術者によって抽出し、精製することができる。抽出および精製用のキットならびに測定器は、市販品から入手することができる。cDNA合成およびPCRまたはリアルタイム定量的PCRによるTROP2のmRNAの検出ならびに定量化は、本発明に記載の通り、当技術分野において公知の技術によって実施することができる。リアルタイム定量的RT-PCR用の試薬および測定器は、市販されている。
対応する対照細胞と比較した、腫瘍細胞におけるTrop-2タンパク質の増加は、免疫組織化学、ELISAアッセイ、ウェスタンブロッティングまたは当技術分野において公知の他の同等の技術により、新鮮な、凍結したまたはホルマリン固定した細胞および組織からなる培養細胞ならびに生検細胞において定量化することができる。これらの試験および測定の実行のためのTrop-2反応性抗体、キットおよび装置は、市販されている。
不死化マウス細胞系MTE 4-14(Naquet、Lepesantら1989年)は、当技術分野において公知の技術によりトランスフェクトすることができる。Trop-2用発現ベクターを、および空のベクターをトランスフェクトしたMTE 4-14細胞をin vitroで増殖させ、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子の阻害剤を含む、Trop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に標的した化合物のスクリーニングに使用することができる。当技術分野において公知の技術による細胞構成要素の直接計数もしくは染色または代謝アッセイによって、細胞増殖を測定することができる。
CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子の阻害剤を含む、Trop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に対する化合物のin vivoスクリーニングに使用する前臨床モデルは、Trop-2を過剰発現している細胞または過剰発現していない細胞を皮下注射した(異種移植)免疫不全マウス、および当技術分野において公知の方法による類似モデルからなる。
詳細な実施例および添付の図面の図を具体的に参照しながら、限定されない、好ましい実施形態のいくつかによる例示および例の様式によって本発明を記載する。
増殖刺激に関与するTrop-2細胞質内尾部決定因子を示す図である。(a) Trop-2のC末端部分(aa 275〜323)の二次構造予測;負に荷電したアミノ酸に下線を引く。使用した予測ソフトウェアを左に示す。h(濃い灰色で強調してある):α-へリックス、e(黒で強調してある):β-ストランド; c(薄い灰色で強調してある):接続領域(ループ)。予測による共通二次構造を、1〜10のスケールの残基毎のスコアと共に下に示す。予測精度スコアは、≧80%である(cubic.bioc.columbia.edu)。(b) Trop-2細胞質内尾部変異体の配列;正常配列(wt)を上に示す。HIKEドメインを灰色の四角で強調してある;推測されるセリンのリン酸化部位の位置を、白で強調してある。S303A、S322A:それぞれ、セリン303および322のアラニンへの変換を含む点突然変異; E→K:グルタミン酸310、313、316および320のリシンへの変換を含む点突然変異;ΔHIKE: HIKE領域の欠失;Δcyto:全細胞質内尾部の欠失。(c) Trop-2依存性増殖に対するTrop-2細胞質内尾部変異の効果。示した通り、空のベクターまたはwt Trop-2もしくは変異体Trop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞の増殖曲線。wtと変異体Trop-2との差異: P < 0.0001(2元配置ANOVA)。星印は、個々の時点に対する統計的有意差を示す(多重比較用のBonferroni検定):****≦0.0001。バー:平均の標準誤差。 Trop-2シグナル伝達クラスタを示す図である。Trop-2発現の電子顕微鏡分析。 (a)金ナノスフェアにコンジュゲートした抗Trop-2抗体で染色したMCF7乳癌細胞(黒い点)。Trop-2は、細長い繊毛突出部および大絨毛(矢印)ならびに個別の膜ドメインに同定される。白い円(直径30nm)を、個々の金粒子を中心にして置き、Trop-2に結合している抗体分子を最高の確率で見つけるための領域を囲む。バー: 50nm。(b)免疫ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗Trop-2抗体で染色したTrop-2を発現している細胞(暗い粒状堆積物)。Trop-2をトランスフェクトした293細胞(i)、OVCA-432卵巣癌細胞(ii)、MCF-7乳癌細胞(iii)。Trop-2は、細胞-細胞接触の個別の膜ドメイン(矢印)(i 差し込み図:拡大した接触領域)、繊毛突起(ii)および個別の膜ドメイン(iii)に局在する。Trop-2の存在は、細胞質内小胞(矢印)のレベルでも検出される。 Trop-2およびPKCαとテトラスパニン分子およびCD9との相互作用を示す図である。(a〜d)蛍光分子とコンジュゲートした、抗Trop-2と抗CD9(テトラスパニンウェブのメンバー)もしくは抗カベオリン(陰性対照)(a〜c)とで同時にまたは抗CD9と抗PKCα(d)とで同時に染色した、Trop-2(a〜c、d上)または空のベクター(d下)をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞の、完全な細胞膜(a)、共キャッピングを示す膜領域(b)、細胞膜の痕跡(c、d)の共焦点顕微鏡分析。共局在の領域を矢印によって示す。 (e)Trop-2、PKCα、CD9およびテトラスパニンの共免疫沈降(IP)。マウスCD9、CD81およびCD151(MTE 4-14細胞)またはヒトCD9、CD82およびCD151(MCF7細胞)に対する一次抗体を使用して免疫沈降を実行した;免疫沈降物中のTrop-2およびPKCαの存在を、ウェスタンブロットによって検出した。抗Trop-2とのIP:陽性対照。(f) Trop-2/コレステロール会合。メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)による処理後の培地へのTrop-2の放出(左)。ジギトニンによるBRIJ溶解物からのTrop-2の沈殿(右)。Trop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞に処理を実行し、可溶性および不溶性画分中のTrop-2の存在をウェスタンブロットで評価した。 Trop-2プロテオームを示す図である。(a)ウェスタンブロットによって測定した、MTE 4-14形質転換体におけるシグナル伝達分子の量およびリン酸化。V:ベクター単独; T2: Trop-2。4本のバンドがあるパネルは、独立した2対の測定を示す。(b)ベクター単独(左)またはTrop-2(右)をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞からのタンパク質抽出物の2Dゲル;円は、Trop-2発現によって抑制された(R、左)または誘導された(I、右)タンパク質を示す。 Trop-2シグナル伝達ネットワークを示す図である。Trop-2によって引き起こされるタンパク質-タンパク質相互作用のネットワーク(SNOW分析)。円:互いに物理的に相互作用することができるTrop-2によってモジュレートされた全タンパク質(同定されたタンパク質165個のうちの114個)。矩形: 2つのタンパク質間の「コネクタ」。線(「エッジ」)は、タンパク質-タンパク質接触を表す。 Trop-2によって引き起こされる癌シグナル伝達ネットワークを示す図である。プログラムIngenuity Pathway Analysisを使用して、Trop-2によってモジュレートされたタンパク質(黒)をマップした。六角形:キナーゼ;台形:低分子量Gタンパク質およびその相互作用体; 矩形:アポトーシス因子;長円形:転写因子/クロマチンリモデリングタンパク質;二重丸:タンパク質複合体。タンパク質ではないシグナル伝達分子を、灰色で強調する。濃い灰色の線:細胞膜;灰色の四角:核およびミトコンドリア部分。P = 6.19x10-45。 Trop-2によるAktシグナル伝達ネットワークの制御を示す図である。(a) Trop-2/Aktシグナル伝達ネットワークの地図。Ingenuity Pathway Analysisソフトウェアを使用して、Trop-2によってモジュレートされたタンパク質(黒)をマップした。六角形:キナーゼ; 矩形:アポトーシス因子;ひし形:ホスファターゼ;長円形:転写因子/クロマチンリモデリングタンパク質;二重丸:タンパク質複合体。タンパク質ではないシグナル伝達分子を、灰色で強調する。濃い灰色の線:細胞膜。(b) Trop-2によるAktトレオニン308およびセリン473のリン酸化レベルのモジュレーション。PMAの存在もしくは非存在下でベクター単独またはTrop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞のウェスタンブロット分析;各バンドについて、対照に対して標準化した強度を示す。 Trop-2が、CD9阻害剤に対する感受性を決定づけることを示す図である。(a、b) MTE 4-14/ベクターおよびMTE 4-14/Trop-2におけるCD9サイレンシング効率の制御。(a)効果のないsiRNA(対照)または特異的抗CD9siRNAをトランスフェクションした24時間後のCD9のmRNAレベルの定量的リアルタイムRT-PCRによる測定。バー:測定の標準偏差。(b)効果のないsiRNA(対照)または特異的抗CD9 siRNAをトランスフェクションした48時間後のCD9のレベルのフローサイトメトリ分析。白いプロファイル:対照抗体、無染色;灰色のプロファイル: Alexa-488にコンジュゲートした抗CD9抗体。(c) Trop-2(MTE 4-14/Trop-2、IGROV/Trop-2、KM12-SM/Trop-2)を安定的にトランスフェクトしたまたは内因性にTrop-2を発現しているマウスもしくはヒト細胞(HCT116U5.5、MCF7、HT29)におけるCD9レベルのフローサイトメトリ分析。白いプロファイル:対照抗体、無染色;灰色のプロファイル: Alexa-488にコンジュゲートした抗CD9抗体。(d)効果のないsiRNA(対照)または特異的抗CD9もしくは抗Trop-2 siRNAをトランスフェクトしたMTE 4-14/ベクター(左)およびMTE 4-14/Trop-2(右)の増殖曲線。バー:平均の標準誤差。 Trop-2が、Akt阻害剤に対する感受性を決定づけることを示す図である。ベクター単独またはTrop-2をトランスフェクトし、効果のないsiRNA(対照)もしくは特異的抗AKT siRNA(左)で、あるいは400nMの用量または指示した異なる用量を用いて溶剤単独もしくはAktの薬理学的阻害剤(中央、右)で処理したMTE 4-14細胞の増殖曲線。バー:平均の標準誤差。 Aktの阻害による、Trop-2を発現している腫瘍の増殖の阻害を示す図である。溶剤単独でもしくはAktの薬理学的阻害剤MK-2206で処理した、Colo205大腸癌細胞(上段)またはTrop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞(下段)のin vivo増殖曲線。空のベクターをトランスフェクトしたMTE 4-14対照細胞は、このモデルにおいて腫瘍形成能がない。対照と処理した腫瘍との差異: P < 0.0001(2元配置ANOVA)。星印は、個々の時点に対する統計的有意差を示す(多重比較用のBonferroni補正): *≦ 0.05、**≦0.01、***≦0.001≦0.0001 ****。バー:平均の標準誤差。差し込み図、腫瘍細胞および形質転換体におけるTrop-2発現のフローサイトメトリ分析:白いプロファイル:対照抗体、無染色;灰色のプロファイル、Alexa-488にコンジュゲートした抗Trop-2。
細胞培養
ヒトMCF-7およびOVCA-432細胞系を、RPMI 1640培地(GibcoBRL、Paisley、スコットランド)において増殖させた。ヒト293およびKM12SCならびにマウス不死化MTE 4-14(Naquet、Lepesantら1989年)およびL細胞系を、DMEM中で維持した。全ての培地に、10%ウシ胎仔血清(GibcoBRL)、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン(Euroclone、Milano、イタリア)を補充した。
DNAトランスフェクション
製造者の説明書に従って、Lipofectamine 2000またはLTX(Invitrogen、Carlsbad、CA)中のDNAを細胞にトランスフェクトした。安定的な形質転換体を、G-418含有培地で選択した。
免疫蛍光分析
ガラスカバースリップに播種した細胞を、指示したAlexa Fluor-488/546/633にコンジュゲートした抗体で、またはAlexa Fluor-488/546/633にコンジュゲートした二次抗体によって検出される同じ非コンジュゲート抗体で染色した。細胞を、固定する前に10% FBSを含む培地中で、37℃で5分間、生きた状態で染色するか、または固定後にPBS中の関連する抗体と室温で30分間インキュベーションすることにより染色した。細胞を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。膜透過処理および非特異的相互作用のブロッキングを、10%FCS、0.1%サポニンで実行した。次いで、スライドをPBS中で洗浄し、封入して、LSM-510 META共焦点顕微鏡(Zeiss、Oberkochen、ドイツ)で分析した。
細胞痕跡
「細胞痕跡」とは、EDTAで細胞を剥がした後の組織培養ディッシュ上にある膜残留物のことである(Hakomori 2002年)。実質的に記載されている通りに、細胞処理および免疫蛍光分析を実行した(Hakomori 2002年)。
共免疫沈降アッセイ
BRIJ緩衝液(150mM NaCl、50mM トリス-HCl、pH 7.5、1mM MgC12、1mM CaC12、1%BRIJ、プロテアーゼ阻害剤)に細胞を溶解した。プロテイン-Gセファロース(GE Healthcare、Piscataway、NJ)と4℃で1時間インキュベーションすることによって、細胞溶解物を清澄化した。清澄化した溶解物を、推測されるTrop-2相互作用体に対する一次抗体と4℃で、2時間インキュベートし、次にプロテインGセファロースとインキュベーションした(4℃、1時間)。0.1Mグリシン、pH 2.5を用いて樹脂からタンパク質複合体を溶出し、指示した特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより調べた。
細胞膜からのコレステロールの除去および沈殿
コレステロールが入った細胞膜を除去するために、完全な細胞をPBS中で3回洗浄して、血清を除去し、10mMメチル-β-シクロデキストリンを含むDMEM中で、37℃で45分間インキュベートした。並行して、メチル-β-シクロデキストリンの非存在で対照細胞を処理した。サンプルを2000gで遠心分離して、細胞および細胞残屑を除去した。上清中のタンパク質を、トリクロロ酢酸に沈殿させ、ウェスタンブロッティングで分析した。
細胞を擦り取ることによっても回収し、1%BRIJを含む緩衝液に溶解した。上清を、1/10(vol/vol)メタノール(対照)または1/10(vol/vol)10%ジギトニンメタノールのいずれかと混合し、氷上で10分間インキュベートした。12,000gで15分間の遠心分離により、細胞膜を回収した。ペレットを、冷アセトンで洗浄し、Laemmli緩衝液に再懸濁し、ウェスタンブロッティングにより分析した。
免疫電子顕微鏡
免疫金電子顕微鏡観察(EM)のために、記載(Polishchuk、Polishchukら2000年)の通り、細胞を、4%ホルムアルデヒド、0.05%グルタルアルデヒド、0.15M HEPES、pH 7.3中で、37℃で10分間固定し、4%パラホルムアルデヒド、0.15M HEPES、pH 7.3中で、室温で50分間後固定した。カチオン化した金、プロテインA-金、および金コンジュゲートした抗ウサギ抗体(10nmコロイド金粒子)は、British BioCell(Cardiff、英国)製であった。記載(BrownおよびFarquhar 1989年)の通り、免疫ペルオキシダーゼEMを実行した。抗体分子の平均長を11nmと仮定して、最小の標識領域の推定を実行した。
in vitro細胞増殖アッセイ
空のベクターまたはTrop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞を、96ウェルプレートに1.5〜3 x 103個細胞/ウェルで播種した(データポイント当たり5個の複製ウェル)。MTT比色アッセイ(Roche Molecular Biochemicals、Mannheim、ドイツ)によって、またはクリスタルバイオレットで染色することによって細胞数を定量化した。段階希釈した細胞サンプルの参照標準曲線に対して細胞数を標準化した。
抗体
細菌で作製した組換えTrop-2を皮下免疫化することによって、ウサギポリクローナル抗Trop-2抗血清を生成した(Fornaro、Dell'Arcipreteら1995年)。NHS-セファロースカラム(Pharmacia、Uppsala、スウェーデン)に固定した組換えTrop-2に結合させ、0.2Mグリシン、pH2.5を用いて溶出することによって、Trop-2反応性抗体を精製した。ヤギ抗Trop-2ポリクローナル抗体AF650を、R&D Systems, Inc. (Minneapolis、MN)から入手した。マウス分子に対する追加の抗体は:ラットモノクローナル抗CD9(sc-18869);ウサギモノクローナル抗Akt(ser473)(D9E)(Cell Signal Technology、MA);ヤギポリクローナル抗CD151(sc-18753)、抗ホスホ-PKCα(S657)(sc-12356)、抗Akt(sc-1618);ウサギポリクローナル抗カベオリン-1(sc-894)、抗PKCα(sc-208)、抗ホスホ-Akt(Thr 308)(sc-16646-R)(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA);ハムスターポリクローナル抗CD81(GTX75430)(GeneText、Irvine、CA)であった。対応するヒト分子に対するマウスモノクローナル抗体は:抗CD9(14-0098)、抗CD98(14-0982)(eBioscience、San Diego、CA)、抗CD151 (H00000977-M02)(Abnova、Taiwan、中国)および抗CD81(TS81)( Dr. F. Lanzaにより好意で提供された)であった。Alexa Fluor-488/546/633にコンジュゲートした二次抗体は、Invitrogen製であった。
薬理学的阻害剤
細胞を、50-100-200-400nM A6730_SIGMA(Sigma Technical Company、St Louis、MO 63178-9916)または400nM MK-2206(Selleck Chemicals、Houston、TX)で処理して、Aktを阻害した。DMSOおよびエタノールの最終濃度がそれぞれ0.1%および1%を決して超えないように、保存溶液をDMSO中に調製し、エタノールまたは水に希釈した。対照細胞には溶媒のみを与えた。播種の24時間後に2回目の処理を実行した。
in vivoモデル:無胸腺ヌードマウスにおける異種移植
ヌードマウス群(8週齢、雌、CD1-Foxn1 nu/nuマウス(Charles River Laboratories、Calco、Lecco、イタリア))に、Trop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14不死化細胞系(Alberti、Nutiniら1994年)、またはTrop-2を内因性に発現しているColo205大腸癌細胞を皮下注入した(4x106個細胞/注入)。Trop-2をトランスフェクトしたMTE 4-14細胞を、マトリゲル1:3vol/vol(増殖因子を低下させた基質、BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ、米国)と一緒に注入した。使用時に、DMSO中のM-2206保存溶液を0.7mg/mLの最終濃度になるように無発熱性食塩水に希釈し、その薬物を0.35mg/マウスの用量で腫瘍が触診可能になった時間から開始して毎日腹膜内投与した。対照群マウスを溶媒単独で処理した。5〜7日毎にマウスを視覚的に検査し、実験腫瘍の大径および小径を測定した。楕円体容積の式(Dxd2/2)を使用して、腫瘍容積を算出した。空のベクターをトランスフェクトしたMTE 4-14細胞は、このモデルにおいて腫瘍形成性ではなかった。動物およびそれらの管理に関する手順は、組織ガイドライン、国内法令および国際協約に従って実行した(D.L. No.1 16、G.U.、補足 40、2月18日、1992年; No. 8、G.U.、6月、1994年; UKCCCR Guidelines for the Welfare of Animals in Experimental Neoplasia; EEC Council Directive 86/609、OJ L 358. 1、 12月12日、1987年; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、 United States National Research Council、1996年)。
抗体媒介共キャッピング
トリプシンを使用して、細胞を培養プレートから剥がし、抗Trop-2一次抗体(T16)(Alberti、Miottiら1992年)と氷上で20分間インキュベートした。洗浄後に、細胞をAlexa Fluor488にコンジュゲートした二次抗体と37℃で10分間インキュベートして、標的分子を架橋し、それによって抗原-抗体複合体のキャッピングを誘導した(LevyおよびShoham 2005年)。「キャップした」細胞を、1%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。FBSを用いてパラホルムアルデヒドを失活させ、対象の膜タンパク質に対する抗体で細胞を染色した。
ウェスタンブロット分析
前述の通りにウェスタンブロッティングを実行した(El Sewedy、Fornaroら1998年)。要約すると、細胞溶解物を、変性ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)での電気泳動によって分析し、ニトロセルロースフィルタに転写した。フィルタを、5%脱脂粉乳を含むTBS中で、関連する一次抗体(AbcamCambridge、英国; Santa Cruz)とインキュベートした。ハイブリダイズしたフィルタを、TBS中、0.1% Tween-20で洗浄した。抗体結合を、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体(Calbiochem、La Jolla、CA)を使用して、化学発光(ECL、Amersham、Aylesbury、UK)によって明らかにした。Kodakグレイスケール標準検出力曲線(www.kodak.com)を参照として使用して、シグナル強度をNIH-image 1.62で定量化した。
プラスミド
pEYFP発現ベクターを、Clontech(Palo Alto、CA)から入手した。EYFPのコード配列を欠いた対応するベクターを使用して、野生型または突然変異させたTrop-2 cDNAを発現させた。野生型ヒトTROP2のコード配列を、フォワードプライマー
およびリバースプライマー
を用いるPCRにより増幅し、pEYFP-Nlベクターにサブクローニングした。発現ベクターpCMV-SPORT6およびCD316 pCMV-SPORT6を、Imagenes(Berlin、ドイツ)から入手した。CD9(EcoRI/BamHI)、 CD316(EcoRI/Agel)とmCherry間のキメラタンパク質を、標準的な手順に従って構築した。
siRNA。
Tuschl基準(Elbashir、Harborthら2001年): Invitrogen (rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)、Whitehead Institute web site (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) (Semizarov、Frostら2003年); Sonnhammer(sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/)(Chalk、Wahlestedtら2004年)による手順に従って、4つの設計戦略を使用した。選んだsiRNAは、上記方法のうちの2つ以上によって同定された、または少なくとも1つによって最適であると見なされたものであった。対象遺伝子に対して特異的な、対応するsiRNAから得られるヘアピンRNA(shRNA)(Elbashir、Harborthら2001年)のコード配列を、RNAポリメラーゼ-III HI遺伝子のプロモータ制御下で、pSUPERベクターにサブクローニングした(Brummelkamp、Bernardsら2002年)。CD9阻害は、標的センス配列
およびアンチセンス配列
を持つ抗CD9 siRNAによって得られ、上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列(センスおよびアンチセンス方向の標的配列に下線を引いた)に含まれる。
Aktの阻害は、標的センス配列
およびアンチセンス配列
を持つ抗AKT siRNAによって得られ、上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列に含まれ、
または、標的センス配列
、アンチセンス配列
を持つ抗AKT siRNAによって得られ、上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列に含まれる。
対応する構築物を、MTE 4-14細胞に一過性にトランスフェクトし、細胞増殖に対するそれらの効果を評価した。サイレンシング後の転写産物のレベルを、リアルタイムRT-PCRによって定量化した。細胞増殖に対する疑似効果がないことを綿密に確認した後に選んだ、無関係な標的に対するsiRNAを陰性対照として使用した。対応する配列は下記の通りであり;各siRNAに関して、対応する遺伝子をRefSeqデータベース(GenBank)による識別コードと共に示す。
ヒト細胞に対する陰性対照として使用した、標的センス配列
、アンチセンス配列
を有する、マウスCo-029/Tspan8(NM l46010.2)に対するsiRNA。上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列に含まれる。
マウス細胞に対する陰性対照として使用した、標的センス配列
、アンチセンス配列
を有する、ヒトCD133(NM_006017.2)に対するsiRNA。上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列に含まれる。
マウス細胞に対する陰性対照として使用した、標的センス配列
、アンチセンス配列
を有する、ヒトCD316(NM_052868.2)に対するsiRNA。上記配列は、一例として、ヘアピンRNAの転写のための以下の配列に含まれる。
前述したように、TROP2サイレンシングを得た(TrerotolaCantanelliら2013年)。
Trop-2の細胞質ドメインの突然変異生成
Trop-2の細胞質ドメインの変異体を、以下のプライマーを用いるPCRによって得た:
Trop-2 Δcyto
Trop-2 E→K
Trop-2 ΔHIKE
Trop-2 S303A
Trop-2 S322A
増幅された領域全てを完全に配列決定して、Taqポリメラーゼによって誘導される変異がないことを確認した。
リアルタイム定量RT-PCR。
製造者の説明書に従って、指示した細胞系からの全RNAをTrizol(Invitrogen)で抽出した。標準的な手順に従ってImProm-II逆転写酵素(Promega)を使用して、各逆転写(RT)反応に1μgの全RNAを使用した。製造者の説明書に従って、ABI-PRISM 7900HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して、特異的プライマー(Hs99999905; CD9: Mm00514275_gl; B2M: Mm00437762_ml) (Applied Biosystems)および対応するTaqMan(登録商標)(Roche)蛍光プローブを用いて、リアルタイム定量的PCR反応を実行した(Giulietti、Overberghら2001年)。各サンプルを3つ組でアッセイし、2-ΔΔCT法を使用して、遺伝子発現の相対変化を算出した(LivakおよびSchmittgen2001年)。増幅材料が2倍になるのに1.1サイクルが必要なので、より正確な基数1.834を使用した(Guerra、Trerotolaら2008年)。GAPDHおよびB2Mハウスキーピング遺伝子を、内部対照として使用した。各cDNAについて、ΔCT(CT、標的遺伝子-CT、GAPDH/B2M)を算出し:最小二乗法一次回帰分析を使用した。使用したRNA量の範囲全体で増幅効率がリニアであったので、増幅曲線を使用して、siRNA処理したサンプルの交点値を算出した。PCR反応の鋳型としてレトロ転写していないRNAを使用することにより、各サンプルをゲノムのDNA混入について常法通り評価した。
2Dゲルおよび質量分析。
全ゲノムにわたる画像を、(Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) http://us.expasy.org/ch2d/protocols/)に記載の通り実行した2D-PAGEにより入手した。質量分析は、York大学(www.york.ac.uk/depts/biol/tf/proteomics/)で実行した。
経路分析およびTrop-2シグナル伝達ネットワークの同定
SNOW(snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi)およびIngenuity Pathways Analysis (IPA、Ingenuity Systems、www.ingenuity.com)生物情報学ツールを使用して、Trop-2のプロテオームを分析した。SNOW(snow.bioinfo.cipf.es/cgi-bin/snow.cgi)は、タンパク質-タンパク質相互作用のネットワークを構築し、参照インタラクトーム上にタンパク質をマップする。参照インタラクトームとは、一組のペアワイズでの直接的なタンパク質相互作用のことであり、ノードはタンパク質自体であり、接続エッジは相互作用イベントである。HPRD (Human Protein Reference Database)、IntAct、BIND (Biomolecular Interaction Network Database)、DIP (Database of Interacting Proteins)およびMINT (Molecular Interaction Database)データベースを使用して、Trop-2依存性インタラクトームを構築した。これらを使用して、最小接続ネットワーク(MCN)を構築した。トポロジカルネットワークを、ノード接続の程度(すなわち、各ノードのエッジの数);中間(すなわち、ノードおよびその分布の中心的位置の程度);クラスタリング係数分布(すなわち、各ノードの近傍の接続性);ネットワーク成分(すなわち、ネットワーク分析において生成されるノードの異なる群)の数;バイコンポーネント(bicomponents)(すなわち、単一エッジによって別のノード群に接続されているノード群の数)および連結点(すなわち、ネットワークにおいてバイコンポーネントを接続するエッジ)に基づいて評価した。分析する入力タンパク質の任意のペアの間に、外部コネクタタンパク質の導入を1つしか許容しない厳しい選択幅を適用するダイクストラアルゴリズムを使用して、MCNを同定した。この方法で、分析に供したTrop-2によってモジュレートされた165個のタンパク質のうちの114個と、22個のコネクタとを結合する単一のネットワークを得ることができた。全参照インタラクトームにわたって生成されたネットワークに対しておよびランダムな組成を持つネットワークに対して、統計的有意性を確認した。Ingenuity Pathways Analysisソフトウェアを使用する分析の場合に、Trop-2と対照形質転換体との間の標準化した平均シグナル強度の比として表されるタンパク質発現値は、倍率変化値に変換され、0〜1の値については負の逆数(-1/x)が取られる。データセットをフィルタ処理したので、閾値カットオフは行わなかった。フォーカスポイントとして、全ての分子(Swiss-Prot identifiers)をIngenuity Knowledge Baseにマップした。Ingenuity Knowledge Baseは、公開されている実験結果から手作業のキュレーションによって抽出されるように、タンパク質相互作用をオントロジーフォーマットに組織する。フォーカス分子のネットワークは、特定の接続性、すなわちKnowledge Baseにおける全分子での分子間相互連絡に対して実際のものを最大化することによって生成された。ネットワーク中の好適な分子の数およびその最終サイズならびに入力データセットのサイズおよびネットワークに含まれるIngenuity Knowledge Base中の分子の合計数を考慮するスコア(フィッシャーの右側正確確率検定によって算出されるp値の負の対数)によって、ネットワークをランク付けした。スコアが高いほど、確率的相互作用ネットワークの機会は低い。次いで、フォーカス分子を、Ingenuity Canonical Pathwaysにマップした。
統計分析
2元配置ANOVA検定を使用して、腫瘍増殖曲線を比較した(Rossi、Di Lenaら2008年)。
(参考文献)

Claims (10)

  1. Trop-2シグナル伝達ネットワークの成分の活性を阻害する薬物を用いる抗癌療法の予後をin vitroで予測する方法であって、前記成分がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子からなる群から選択され、前記方法が生体サンプル中のTrop-2タンパク質のまたは対応するmRNAの発現レベルを決定する工程を含むまたはこの工程から成り、対応する正常組織におけるレベルと比較して、Trop-2タンパク質のまたは対応するmRNAの発現レベルの増加が検出される場合に有効な予後が生じる、方法。
  2. RT-PCRまたはリアルタイム定量的RT-PCRを用いて定量化される場合に、対応する正常組織と比較して、腫瘍組織中のTrop-2のmRNAの増加が10%以上である、請求項1に記載の方法。
  3. 免疫組織化学、ELISAアッセイ、ウェスタンブロッティングを用いて定量化される場合に、対応する正常組織と比較して、腫瘍組織中のTrop-2タンパク質の増加が10%以上である、請求項1に記載の方法。
  4. 癌の治療もしくは予防または癌細胞増殖の阻害のための候補薬物をin vitroスクリーニングするための方法であって、そのような薬物がTrop-2シグナル伝達ネットワークの成分に対するものであり、前記成分がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子からなる群から選択され、前記方法が:
    a. Trop-2を発現している細胞およびTrop-2を発現していない細胞に滅菌食塩水中の試験しようとする化合物を投与する工程であって、前記発現していない細胞が、特異性の対照として機能する、投与する工程と;並行して、Trop-2を発現している細胞およびTrop-2を発現していない細胞に滅菌食塩水を単独で投与する工程であって(無処理の対照)、滅菌食塩水単独が、活性の対照として機能する、投与する工程と;
    b. Trop-2を発現していない処理した対照ならびにTrop-2を発現しているおよび発現していない処理していない対照と比較して、Trop-2を発現している細胞に対する工程(a)の化合物の生物活性を検出する工程であって、前記生物活性が、Trop-2を発現していない処理した対照細胞と比較した、ならびにTrop-2を発現しているおよび発現していない処理していない対照細胞と比較した、Trop-2を発現している細胞における細胞増殖の低下である、検出する工程と;
    c. Trop-2を発現していない処理した細胞におけるならびにTrop-2を発現しているおよび発現していない処理していない細胞における細胞増殖と比較して、Trop-2を発現している処理した細胞において、細胞増殖を少なくとも10%低下させる工程(a)の化合物を選択する工程と
    を含むまたはこれらの工程から成る、方法。
  5. 正常組織よりも高いレベルのTrop-2タンパク質または対応するmRNAを発現している腫瘍の治療における使用のための、Trop-2シグナル伝達ネットワークの成分の活性を阻害する化合物であって、前記成分が、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子からなる群から選択される、化合物。
  6. 前記化合物が、オリゴヌクレオチド、「ドミナントネガティブ」分子として機能するCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子に対応する改変分子、モノクローナル抗体、薬理学的阻害剤、小分子化合物またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項5に記載の使用のための、請求項5に記載の化合物。
  7. 前記化合物が、MK-2206、A6730、ペリホシン、GSK690693、GSK2110183、GDC-0068、AT7867、ARQ092、AZD5363、A-674563、PHT-427、PF-04691502、SureCN1078972、842148-40-7、AC1NX3D3、MLS002702033、SureCN10005574、SureCN1559590、SureCN570829、SH-5、SH-6、ホノキオール、ミルテホシン、トリシリビンホスフェート(Akt阻害剤)、K00598a、DAPH 2、SureCN238877(EGFR阻害剤)、SureCN4269573(EGFR、c-RAF、Srcの阻害剤)、ダサチニブ(Src阻害剤)、SureCN1518805、1,9-ピラゾロアントロン、AS-601245、アミノピリジン誘導体2(JNK阻害剤)からなる群から選ばれる、請求項5または6に記載の使用のための、請求項5または6に記載の化合物。
  8. 化学療法薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞分裂阻害剤、副腎皮質ステロイド、分化剤、ホルモン療法、標的化キナーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤ボルテゾミブからなる群から選ばれる薬物と組み合わせる、請求項5から7のいずれか一項に記載の使用のための、請求項5から7のいずれか一項に記載の化合物。
  9. テトラスパニンシグナル伝達ネットワークの前記分子が、上皮増殖因子受容体(EGFR)、チロシンタンパク質キナーゼMet、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼc-RAF、プロトオンコジーンチロシンタンパク質キナーゼSrc、低分子量GTP結合タンパク質CDC42、チロシンタンパク質キナーゼJAK2、cAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットα(PKA C-α)、非受容体11型チロシンタンパク質ホスファターゼ(SHP2)、インシュリン受容体基質1(IRS1)、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼPAK 1、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(JNK)からなる群から選択される、請求項5から8のいずれか一項に記載の使用のための、請求項5から8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 癌の治療もしくは予防または癌細胞増殖の阻害のための候補薬物をin vivoスクリーニングするための方法であって、そのような薬物がCD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むTrop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に対するものであり、前記方法が:
    a.前臨床および臨床モデルにおいて、請求項1に記載のTrop-2生物学的マーカーについて陽性または陰性である腫瘍に、CD9、Aktおよびテトラスパニンシグナル伝達ネットワークの分子を含むTrop-2のシグナル伝達ネットワークの成分に対する、滅菌食塩水中の試験しようとする化合物を投与する工程であって、陰性腫瘍が特異性の対照として機能する、投与する工程と;並行して、Trop-2生物学的マーカーについて陽性または陰性である腫瘍に滅菌食塩水を単独で投与する工程であって(無処理の対照)、滅菌食塩水単独が活性の対照として機能する、投与する工程と;
    b. Trop-2生物学的マーカーについて陰性の処理した対照ならびにTrop-2生物学的マーカーについて陽性および陰性の処理していない対照と比較して、Trop-2生物学的マーカーについて陽性である腫瘍に対する工程(a)の化合物の生物活性を検出する工程であって、前記生物活性が、Trop-2生物学的マーカーについて陰性の対照腫瘍と比較した、ならびにTrop-2生物学的マーカーについて陽性および陰性の処理していない対照腫瘍と比較した、Trop-2生物学的マーカーについて陽性の腫瘍における腫瘍成長の低下である、検出する工程と;
    c. Trop-2生物学的マーカーについて陰性の処理した対照腫瘍ならびにTrop-2生物学的マーカーについて陽性および陰性の処理していない対照腫瘍と比較して、Trop-2生物学的マーカーについて陽性である腫瘍において、腫瘍成長を少なくとも10%低下させる工程(a)の化合物を選択する工程と
    を含む、方法。
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