KR20200038528A - Dctn1 단백질과 ret 단백질과의 융합 단백질 - Google Patents

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게이지 이시다
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다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
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Abstract

DCTN1 단백질의 일부와 RET 단백질의 일부가 융합한 신규 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 검출 방법, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 RET를 저해하는 화합물을 유효 성분으로 하는 의약 조성물.

Description

DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질
본 발명은 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질인 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 검출 방법, 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 한 화합물, 당해 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암은 일본에 있어서의 사인 제1위인 질환이며, 그 치료법의 개선이 요구되고 있다. 갑상선암의 이환자수는 증가하고 있지만, 많은 증례에서 진행이 느려 초기 단계에 적절한 치료를 하는 것으로 높은 생존율을 나타낸다. 반면에 자각 증상이 거의 없기 때문에 적절한 치료에는 조기의 진단이 불가결하다.
갑상선암은 조직형에 따라 유두암, 여포암, 수양암, 미분화암, 악성 림프종으로 나뉜다. 유두암은 갑상선암의 80% 정도를 차지하고 있고, 또한 미분화암은 저빈도이지만 예후가 매우 나쁜 것이 알려져 있다(비특허문헌 1).
유두암에 있어서, 대부분이 암 유전자의 활성화에 의해 발생하는 것이 알려져 있으며 BRAF 변이 유전자(50 내지 60%), RAS 변이 유전자(10 내지 20%), RET 융합 유전자(5 내지 10%) 등의 유전자 이상이 상호 배타적으로 발생하는 것이 명확해지고 있다. 또한 비소세포 폐암에 있어서도, RET 융합 유전자가 1 내지 2%의 빈도로 EGFR 변이 유전자 등의 다른 드라이버 변이 유전자와 상호 배타적으로 존재하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2 내지 5).
진행한 갑상선암에 있어서는 약물 치료가 주체가 되어, 다양한 멀티키나아제 저해제가 승인되었지만, 드라이버 변이 유전자 특이적으로 효과를 나타내는 약제는 아직 승인되지 않았다. 한편, 폐암에 있어서는 RET 융합 유전자 양성인 환자에서의 RET를 저해함으로써 효과를 나타내는 것이 보고되어 있으며(비특허문헌 6), 갑상선암에 있어서도 변이 유전자나 융합 유전자와 같은 약제 효과의 지표가 될 수 있는 유전자 이상을 동정할 필요가 있다.
암에 있어서, 드라이버가 되는 변이 유전자(변이 단백질)나 융합 유전자(융합 단백질) 등을 동정하는 것은, 암의 성질을 명백히 함과 함께, 이들 변이 유전자나 융합 유전자를 표적으로 한 새로운 암 치료약이나 검사 방법의 개발에 크게 기여하기 때문에, 강하게 요망되고 있다.
그러나, 암 발생의 드라이버가 될 수 있는 변이 유전자나 융합 유전자 등은 충분히 해명되지 않았으며, 약제의 치료 효과에 관련될 수 있는 유전자 이상을 동정하는 것은 매우 의미가 있다.
Cancer, 115(16), pp3801-7(2009) Oncogene, 22(29), pp4578-80(2003) Cell, 159(3), pp676-90(2014) Cancer Discov., 3(6), pp630-5(2013) Nature, 511(7511), pp543-50(2014) Lancet Respir Med., 5(1), pp42-50(2017)
본 발명은, RET 단백질의 적어도 일부를 포함하는 융합 단백질인 신규 폴리펩티드, 또는 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 검출 방법, 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 한 화합물, 당해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 갑상선암 환자 유래의 세포에 있어서, DCTN1 단백질의 일부와 RET 단백질의 일부가 융합한 신규 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동정했다. 또한, 암 세포에 있어서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 검출 방법, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 발견했다. 다종다양하게 있는 단백질 중, DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분과의 조합을 갖는 융합 단백질이 세포 내에서 자연스럽게 발생하는 것, 또한 DCTN1과 RET와의 융합 유전자가 암 드라이버로서 작용하기 때문에, 상기 융합 단백질이, 암 진단에 유효한 것은 신규의 지견이며 또한 종래 기술로부터 예상할 수 없는 사항이다. 또한 당해 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 암 환자를 치료하기 위한 RET를 저해하는 화합물을 유효 성분으로 하는 의약 조성물을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 양태를 제공하는 것이다.
항 1. DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드.
항 2. 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 항 1에 기재된 폴리펩티드.
(a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
항 3. 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 4. 이하의 (d) 내지 (f)에서 선택되는 항 3에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(e) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(f) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 5. 이하의 (g) 내지 (i)에서 선택되는 항 3에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(g) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(h) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드.
(i) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
항 6. 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
항 7. 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포.
항 8. 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
항 9. 시료 중 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법.
항 10. 시료 중 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서, 당해 프라이머 또는 프로브가 이하의 (j) 내지 (l)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드.
(j) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브 및 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오티드.
(k) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점에 하이브리다이징하는 프로브인 폴리뉴클레오티드.
(l) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점을 끼워넣도록 설계된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 세트인 폴리뉴클레오티드.
항 11. 시료 중 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법.
항 12. 항 9 또는 11에 기재된 검출 방법에 있어서, 시료 중 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, 시료의 유래가 되는 환자가 암이라고 판정하는 방법.
항 13. RET를 저해하는 화합물을 유효 성분으로 하는, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물.
항 14. 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법.
(1) 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드, 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포, 또는 항 7에 기재된 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
(2) 상기 공정 (1)에 있어서, 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제되는지 측정하는 공정, 또는 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
항 15. 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 지표로 하는 방법으로서, 항 9에 기재된 검출 방법에 의해 시료 중에서 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드를 검출한 경우, 및/또는 항 11에 기재된 검출 방법에 의해 시료 중에서 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효하다고 판정하는 방법.
항 16. DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 암을 검출하기 위한 바이오마커.
항 17. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자에게, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법을 행하는 공정을 포함하는, 암의 치료 방법.
항 18. 피험자 유래의 시료 중에서 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 것 및/또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 것을 행하는 공정, 그리고
항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 존재가 검출되고/되거나 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재가 검출된 경우에, 당해 피험자에 대하여, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법을 행하는 공정을 포함하는, 암의 치료 방법.
항 19. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자를 치료하기 위한, RET를 저해하는 화합물.
항 20. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자를 치료하기 위한 암 치료용 의약 조성물을 제조하기 위한, RET를 저해하는 화합물의 사용.
항 21. 시료 중 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 수단 및/또는 시료 중 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 수단의, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 판정약의 제조 방법.
항 22. 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 항DCTN1 항체 및 항RET 항체의 조합.
항 23. 항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드 또는 항 3 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 검출약을 제조하기 위한, 항 8에 기재된 항체, 항 22에 기재된 항체의 조합 또는 항 10에 기재된 프라이머 또는 프로브의 사용.
본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 암 세포에서 특이적으로 발현하고 있는 것이 나타났다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 당해 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 존재를 지표로 함으로써, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 대상 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성 대상의 검출을 행하는 것이 가능하다. 또한, RET를 저해하는 화합물은, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물로서 유용하다.
도 1은 액적 디지털(Droplet Digital) PCR(ddPCR)을 사용한 갑상선암 조직 중의 DCTN1-RET 융합 유전자 및 GAPDH의 발현 확인.
도 2는 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용한 정상 갑상선 조직 중의 DCTN1-RET 융합 유전자 및 GAPDH의 발현 확인.
도 3은 정상 갑상선 조직 및 갑상선암 조직 중의 DCTN1-RET 융합 유전자 전장의 발현 확인.
도 4는 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서의 DCTN1-RET 융합 단백질의 발현 확인. a) 항 인산화 RET 항체를 사용한 DCTN1-RET 융합 단백질의 검출, b) 항RET 항체를 사용한 DCTN1-RET 융합 단백질의 검출, c) 항DCTN1 항체를 사용한 DCTN1-RET 융합 단백질의 검출.
도 5는 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 3차원 배양에 있어서의 증식 확인. N=3, 평균+SD.
도 6은 생체 내(in vivo)에 있어서의 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 종양 형성성 확인.
도 7은 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서의 RET siRNA에 의한 인산화 RET의 발현 억제의 확인.
도 8은 RET siRNA에 의한 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 증식 억제 효과의 확인.
도 9는 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서의 RET를 저해하는 화합물에 의한 인산화 RET의 발현 억제의 확인.
본 발명은, 신규 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 당해 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 검출 방법, 당해 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 표적으로 한 화합물, 당해 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드(이하, 「본 발명의 폴리펩티드」라고도 칭한다)를 제공한다. 또한, 본 발명은, 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」라고도 칭한다)를 제공한다.
본 발명에 관한 「DCTN1(다이낙틴 서브유닛(Dynactin Subunit) 1) 단백질」은, 150 kDa 디네인-연관 폴리펩티드(dynein-associated polypeptide) 단백질, 또는 DAP-150 단백질이라고도 칭해지는 단백질이며, 인간 또는 비인간 포유 동물의 DCTN1 단백질을 포함하고, 바람직하게는 인간 DCTN1 단백질이다. 인간에 있어서 2p13.1에 좌승해 있는 유전자에 코딩되어 있는 단백질이다. 본 발명에 있어서, 「DCTN1 단백질」은, 그의 스플라이스 변이체인 이소형을 포함하고, 인간 유래의 것이면, 예를 들어 GenPept 액세션 번호 NP_004073, NP_075408, NP_001128512, NP_001128513, NP_001177765, 또는 NP_001177766으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 또는 서열번호 30으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 「DCTN1 단백질의 N 말단 부분」이란, 상기 DCTN1 단백질의 N 말단측에 있는 코일드-코일 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드이고, 바람직하게는 DCTN1 단백질의 N 말단측에 있는 코일드-코일 도메인의 전부를 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명에 관한 「RET 단백질」은, Ret 원종양유전자 단백질, RET 수용체 티로신 키나아제(Receptor Tyrosine Kinase) 단백질, 또는 형질감염 중 재배열(Rearranged During Transfection) 단백질이라고도 칭해지는 단백질이며, 인간 또는 비인간 포유 동물의 RET 단백질을 포함하고, 바람직하게는 인간 RET 단백질이다. 인간에 있어서 10q11.2에 좌승해 있는 유전자에 코딩되어 있는 단백질이다. 본 발명에 있어서, 「RET 단백질」은, 그의 스플라이스 변이체인 이소형을 포함하고, 인간 유래의 것이면, 예를 들어 GenPept 액세션 번호 NP_066124, 또는 NP_065681로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열번호 31, 또는 서열번호 32로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 「RET 단백질의 C 말단 부분」이란, 상기 RET 단백질의 C 말단측에 있는 키나아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명의 「DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드」로서는, 상기 DCTN1 단백질의 N 말단측에 있는 코일드-코일 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드와, 상기 RET 단백질의 C 말단측에 있는 키나아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 융합되어 있는 폴리펩티드이고, 바람직하게는 상기 DCTN1 단백질의 N 말단측에 있는 코일드-코일 도메인의 전부를 포함하는 폴리펩티드와, 상기 RET 단백질의 C 말단측에 있는 키나아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 융합되어 있는 폴리펩티드이고, 보다 바람직하게는 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 폴리펩티드이다. 이들 폴리펩티드는 키나아제 활성 및/또는 세포 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
보다 바람직하게는 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 폴리펩티드이다. 이들 폴리펩티드는 키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(b) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(c) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
본 발명의 「DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드」에는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(상기 (b))가 포함된다. 이러한 아미노산 서열을 포함하는 DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드로서는, 예를 들어 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드의 이소형을 들 수 있다. 이들 폴리펩티드는 키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 결실, 치환 또는 부가되는 수개의 아미노산이란, 예를 들어 1 내지 10개가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이다. 또한, 상기 부가에는, N 말단 또는 C 말단으로의 1 내지 수개의 아미노산의 부가, 또는 양 말단으로의 1 내지 수개의 아미노산의 부가가 포함된다.
상기 폴리펩티드의 아미노산이 치환된 폴리펩티드로서는, 예를 들어 GenPept 액세션 번호: NP_066124(서열번호 31) 또는 NP_065681(서열번호 32)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 RET 단백질의 게이트키퍼 부위인 804번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1325번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1191번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1300번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1186번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1283번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1318번째)의 발린이 류신, 메티오닌, 또는 글루탐산으로 치환된 폴리펩티드, 또는 806번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1327번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1193번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1302번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1188번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1285번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1320번째)의 티로신이 시스테인, 글루탐산, 세린, 히스티딘, 또는 아스파라긴으로 치환된 폴리펩티드를 들 수 있다.
또한, 게이트키퍼 부위 이외의 아미노산인 768번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1289번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1155번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1264번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1150번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1247번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1282번째)의 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 폴리펩티드, 883번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1404번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1270번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1379번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1265번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1362번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1397번째)의 알라닌이 페닐알라닌, 또는 세린으로 치환된 폴리펩티드, 884번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1405번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1271번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1380번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1266번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1363번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1398번째)의 글루탐산이 발린으로 치환된 폴리펩티드, 891번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1412번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1278번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1387번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1273번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1370번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1405번째)의 세린이 알라닌, 또는 류신으로 치환된 폴리펩티드, 또는 918번째(서열번호 2 및 서열번호 4에서는 1439번째, 서열번호 6 및 서열번호 8에서는 1305번째, 서열번호 10 및 서열번호 12에서는 1414번째, 서열번호 14 및 서열번호 16에서는 1300번째, 서열번호 18 및 서열번호 20에서는 1397번째, 서열번호 22 및 서열번호 24에서는 1432번째)의 메티오닌이 트레오닌으로 치환된 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드에는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 상당하는 서열을 적절하게 얼라인먼트했을 때, 상기 서열번호 중 어느 것에서 나타나는 아미노산 서열의 1개와 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(상기 (c))가 포함된다. 이들 폴리펩티드는 키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다.
여기서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성은, 바람직하게는 90% 이상이고, 보다 바람직하게는 95% 이상이고, 더욱 바람직하게는 98% 이상이다. 당해 아미노산 서열의 동일성은, 통상 관용의 방법으로 계산할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명에 관한 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열 이외에, 단백질 태그를 구성하는 아미노산을 갖고 있어도 된다. 태그의 예로서는, 발현 효율을 향상시키는 태그나, 정제 효율을 향상시키는 태그 등, 당업자에게 주지인 태그를 사용할 수 있고, His 태그, Myc 태그, FLAG 태그 등을 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 상기 DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 바람직하게는 이하의 (d) 내지 (i)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다. 이들 폴리뉴클레오티드는, 키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
(d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(e) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(f) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(g) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(h) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드.
(i) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
보다 바람직하게는 이하의 (d) 내지 (i)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다. 이들 폴리뉴클레오티드는, 키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
(d) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(e) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(f) 서열번호 18로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(g) 서열번호 17로 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(h) 서열번호 17로 나타나는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드.
(i) 서열번호 17로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 이중쇄 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄와 같은 각종 단일쇄 DNA나 RNA도 포함한다. 안티센스쇄는, 프로브 등으로서 이용 가능하다. DNA에는, 예를 들어 클로닝이나 화학 합성 기술 또는 그들의 조합으로 얻어지는 cDNA나 게놈 DNA가 포함된다. 또한, 본 발명에 관한 폴리뉴클레오티드에 대하여, 본 발명에 관한 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열 이외에, 비번역 영역(UTR)의 서열 등의 염기 서열이 부가되어 있어도 된다.
여기서, 엄격한 조건이란, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Second Edition, J.Sambrook et.al, 1989)에 기재된 조건을 들 수 있다. 즉, 6×SSC(1×SSC의 조성: 0.15M 염화나트륨, 0.015M 시트르산나트륨, pH7.0), 0.5% SDS, 5×덴하르트 및 100㎎/mL 청어 정자 DNA를 포함하는 용액에 프로브와 함께 65℃에서 8 내지 16시간 항온하고, 하이브리다이징시키는 조건 등을 들 수 있다.
또한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과의 동일성은, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상이다. 당해 염기 서열의 동일성은, 통상 관용의 방법으로 계산할 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는다」의 「키나아제 활성을 갖는다」란, 티로신을 인산화하는 효소로서의 활성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 「키나아제 활성 또는 세포 증식 효과를 갖는다」의 「세포 증식 효과를 갖는다」란, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 세포에 도입함으로써, 도입하지 않은 세포에 비하여, 도입한 세포의 증식능이 향상되는 효과이다. 이러한 효과는, 예를 들어 사이토카인 의존적으로 증식하는 세포주에 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 도입했을 때, 사이토카인 비의존적으로 증식했을 때, 세포 증식 효과를 갖는다고 확인할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자를 유지하는 갑상선암 등으로부터 조정한 cDNA 라이브러리나 게놈 DNA 라이브러리를 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열의 일부와 특이적으로 하이브리다이징하는 프라이머를 사용하여, 추출할 수 있다. 이러한 프라이머로서는, 본 발명에 관한 폴리뉴클레오티드 또는 그의 안티센스쇄의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리다이징하는 프라이머이면, 어떠한 서열 및 길이의 것을 사용해도 된다. 또한 인공적으로 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법을 들 수 있다(Nat. Methods, 11: 499-507, 2014).
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 사용하는 숙주에 따라서 적절히 선택한 공지된 발현 벡터에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 얻어지는 발현 벡터를 들 수 있다.
숙주로서는, 형질 전환이 가능한 생세포이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 대장균, 고초균 등의 세균, 효모나 사상균 등의 진균류, Sf9 세포 등의 곤충 세포, 누에 등의 곤충, 동물 세포, 식물 또는 식물 유래 세포를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 벡터는, 숙주 안에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 도입하는 숙주의 종류, 도입 방법 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, 바이러스 벡터를 들 수 있다. 발현 벡터의 구축에 사용되는 벡터 DNA는, 널리 보급되어 입수가 용이한 것이 사용된다. 예를 들어, pUC19(타카라 바이오), pTV118N(타카라 바이오), pMAMneo(클론 테크), pGEX(GE 헬스케어), pET160(Invitrogen), pDEST(Invitrogen), pIEx(머크 밀리포아), pBacPAK(클론 테크)를 들 수 있다. 또한, 바이러스 벡터로서는, 예를 들어 바큘로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 인간 면역 부전증 바이러스(HIV) 등의 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터(AAV 벡터), 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스, 센다이 바이러스, 시미안 바이러스-40(SV-40) 등의 DNA 바이러스나 RNA 바이러스를 들 수 있다.
당해 발현 벡터를 사용해서 숙주를 형질 전환하기 위해서는, 프로토플라스트 법, 적격 세포법, 일렉트로포레이션법 등을 사용해서 행할 수 있다. 얻어진 형질 전환체는, 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 금속염, 비타민 등을 포함하는 배지를 사용해서 적당한 조건 하에서 배양하면 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포는, 예를 들어 상기한 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 세포, 게놈 편집에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포를 들 수 있다. 여기서 사용할 수 있는 세포로서는, 상기한 숙주 세포를 들 수 있다. 세포가, 발현 벡터로 형질 전환된 세포인지 확인하는 방법으로서는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법을 들 수 있다.
「게놈 편집에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포」로서, 바람직하게는 각각 단독으로 존재하는 DCTN1 유전자와 RET 유전자를 게놈 편집에 의해 융합시킨 유전자를 갖는 세포이고, 보다 바람직하게는 각각 단독으로 존재하는 DCTN1 유전자와 RET 유전자의 DCTN1의 엑손 27과 RET의 엑손 12를 게놈 편집에 의해 융합시킨 유전자를 갖는 세포이다. 이러한 세포는 통상 관용의 방법으로 제작 가능하며, 예를 들어 Cell Rep., 9(4), pp1219-1227(2014), Nat.Commun., 5, 3728(2014)에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포가, 게놈 편집에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포인지 확인하는 방법으로서는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 세포를, 세포 배양에 적합한 배지를 사용하여, 적당한 조건 하에서 배양함으로써 얻어진 배양액 및/또는 세포로부터, 일반적인 방법에 의해 단백질의 채취, 정제를 행함으로써, 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 주형 RNA 또는 주형 DNA를 무세포 단백질 합성계(예를 들어, 인간 세포주 유래의 세포 추출액, 토끼 망상적혈구 추출액, 소맥 배아 추출액, 대장균 추출액)에 도입하고, 적당한 조건 하에서 인큐베이션함으로써 얻어진 반응액으로부터, 일반적인 방법에 의해 단백질의 채취, 정제를 행함으로써, 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는, DCTN1 단백질의 N 말단 부분과 RET 단백질의 C 말단 부분의 융합점에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다. 당해 항체는, DCTN1 단백질의 N 말단 부분과 RET 단백질의 C 말단 부분의 융합점에 특이적으로 결합하지만, 야생형의 DCTN1, 또는 야생형의 RET 단백질 중 어디에도 결합하지 않는 항체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 「DCTN1 단백질의 N 말단 부분과 RET 단백질의 C 말단 부분의 융합점」에 있어서의 「융합점」이란, DCTN1 단백질의 N 말단 부분 유래의 폴리펩티드와 RET 단백질의 C 말단 부분 유래의 폴리펩티드가 융합한 점을 의미한다. 서열번호 2에 있어서의 융합점은, 서열번호 2에 있어서의 1-1233번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 2에 있어서의 1234-1635번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 4에 있어서의 융합점은, 서열번호 4에 있어서의 1-1233번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 4에 있어서의 1234-1593번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 6에 있어서의 융합점은, 서열번호 6에 있어서의 1-1099번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 6에 있어서의 1100-1501번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 8에 있어서의 융합점은, 서열번호 8에 있어서의 1-1099번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 8에 있어서의 1100-1459번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 10에 있어서의 융합점은, 서열번호 10에 있어서의 1-1208번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 10에 있어서의 1209-1610번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 12에 있어서의 융합점은, 서열번호 12에 있어서의 1-1208번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 12에 있어서의 1209-1568번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 14에 있어서의 융합점은, 서열번호 14에 있어서의 1-1094번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 14에 있어서의 1095-1496번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 16에 있어서의 융합점은, 서열번호 16에 있어서의 1-1094번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 16에 있어서의 1095-1454번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 18에 있어서의 융합점은, 서열번호 18에 있어서의 1-1191번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 18에 있어서의 1192-1593번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 20에 있어서의 융합점은, 서열번호 20에 있어서의 1-1191번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 20에 있어서의 1192-1551번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 22에 있어서의 융합점은, 서열번호 22에 있어서의 1-1226번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 22에 있어서의 1227-1628번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다. 서열번호 24에 있어서의 융합점은, 서열번호 24에 있어서의 1-1226번째의 DCTN1의 N 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 24에 있어서의 1227-1586번째의 RET의 C 말단 부분 유래의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 융합한 점이다.
상기 항체는, 예를 들어 면역 글로불린(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY 등), Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, 단일쇄 항체 프래그먼트(scFv), 싱글 도메인 항체, 디아바디(Diabody) 등(Nat.Rev.I㎜unol., 6:343-357, 2006)을 들 수 있고, 이들은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 마우스 항체, 라마 항체, 닭 항체 등의 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체는, 다양한 공지된 방법을 사용해서 제작할 수 있고, 제작 방법은 특별히 한정되는 것이 아니다. 이러한 공지된 방법으로서는, 당해 발명의 폴리펩티드, DCTN1 단백질의 N 말단 부분과 RET 단백질의 C 말단 부분의 융합점을 포함하는 폴리펩티드 단편 등을 면역 동물에 접종하고, 당해 동물의 면역계를 활성화시킨 후, 당해 동물의 혈청을 회수하고, 폴리클로날 항체로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마법, 파지 디스플레이법 등에 의해 모노클로날 항체를 얻는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법은, 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다.
즉, 본 발명의 스크리닝 방법은,
(1) 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
(2) 상기 공정 (1)에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제되는지 측정하는 공정, 또는 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다.
보다 바람직하게는, 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는 방법이다.
(1) 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
(2) 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
또한, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법은, 이하의 (1) 내지 (3)의 공정을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다.
즉, 본 발명의 스크리닝 방법은,
(1) 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
(2) 상기 공정 (1)에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제되는지 측정하는 공정, 또는 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
(3) 상기 공정 (2)에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된 경우, 또는 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제된 경우, 시험 화합물이 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제한다고 판정하는 공정.
을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다.
보다 바람직하게는, 이하의 (1) 내지 (3)의 공정을 포함하는 방법이다.
(1) 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
(2) 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
(3) 상기 공정 (2)에 있어서, 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제된 경우, 시험 화합물이 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제한다고 판정하는 공정.
「본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포」는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 세포, 게놈 편집에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 초대 배양 세포, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 주화 세포, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 암 환자 유래의 세포 등을 들 수 있다. 세포가, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포인지 확인하는 방법으로서는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된다」 중에서, 「본 발명의 폴리펩티드의 발현, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된다」란, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉시킨 후, 당해 세포에 있어서의 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현량을, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법을 사용해서 평가했을 때, 시험 화합물을 접촉시키지 않은 세포와 비교하여, 시험 화합물을 접촉시킨 세포에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현량이 통계학상 유의미하게 저하되었을 때, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제되었다고 판단할 수 있다.
또한, 「본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된다」 중에서, 「본 발명의 폴리펩티드의 활성이 억제된다」란, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포를 사용하여, 시험 화합물을 접촉시키지 않은 경우와 비교하여, 시험 화합물을 접촉시킨 경우에, 티로신의 인산화의 비율이 통계학상 유의미하게 저하되었을 때, 본 발명의 폴리펩티드 활성이 억제되었다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포를 사용하여, 시험 화합물을 접촉시키지 않은 경우와 비교하여, 시험 화합물을 접촉시킨 경우에, 세포 증식이 통계학상 유의미하게 억제되었을 때, 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 억제되었다고 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「티로신의 인산화」란, RET 단백질(다른 단백질과 융합되어 있는 RET 단백질도 포함한다)의 티로신의 인산화뿐만 아니라, RET 하류 시그널 상의 단백질의 티로신의 인산화도 포함된다. RET 하류 시그널 상의 단백질로서는, 예를 들어 STAT, AKT, ERK를 들 수 있다. 바람직하게는, RET 단백질(다른 단백질과 융합되어 있는 RET 단백질도 포함한다)의 티로신의 인산화이다.
또한, 「티로신의 인산화의 비율」은, 예를 들어 인산화 RET 특이적 항체를 사용하여, 웨스턴 블로팅, 면역 침강, 면역 조직 화학, ELISA, 플로우 사이토메트리에 의해 측정 가능하다.
본 발명에 있어서 「시료」란, 생체 시료(예를 들어, 세포, 조직, 장기, 체액(혈액, 림프액 등), 소화액, 오줌)뿐만 아니라, 이들 생체 시료로부터 얻어지는 핵산 추출물(게놈 DNA 추출물, mRNA 추출물, mRNA 추출물로부터 제조된 cDNA 제조물이나 cRNA 제조물 등)이나 단백질 추출물도 포함한다. 또한, 상기 시료는, 포르말린 고정 처리, 알코올 고정 처리, 동결 처리 또는 파라핀 포매 처리가 실시되어 있는 것이어도 된다. 상기 생체 시료로서는, 생체로부터 채취한 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 암 환자 유래의 시료이고, 보다 바람직하게는 종양 세포를 포함하는 시료이다. 또한, 생체 시료의 채취 방법은, 생체 시료의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에는, 시료 중 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 포함된다.
본 발명에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법은, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 ELISA법, 웨스턴 블로팅법, 또는 면역 조직 화학 염색법, 또는 DCTN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 RET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer; 형광 공명 에너지 전달)법 등, 통상 관용의 검출법에 의해 검출하는 방법을 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 ELISA법, 웨스턴 블로팅법, 또는 면역 조직 화학 염색법이다.
DCTN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 RET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서는, DCTN1 단백질의 상기 융합점으로부터 N 말단 부분에 결합하는 항체 및 RET 단백질의 상기 융합점으로부터 C 말단 부분에 결합하는 항체가 바람직하고, 이들 항체는, 시판품을 사용하는 것, 또는 통상 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 DCTN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 RET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해서 본 발명의 폴리펩티드를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이고, 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해서 본 발명의 폴리펩티드를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 수단으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 DCTN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 RET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 조합; 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 등을 들 수 있다.
본 발명에는, 시료 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브가 포함된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 수단으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브 등을 들 수 있다.
당해 프라이머 또는 프로브로서는, (j) 내지 (l)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드;
(j) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브 및 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오티드.
(k) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점에 하이브리다이징하는 프로브인 폴리뉴클레오티드.
(l) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점을 끼워넣도록 설계된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 세트인 폴리뉴클레오티드.
를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점」에 있어서의 「융합점」이란, DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점을 의미한다. 서열번호 1에 있어서의 융합점은, 서열번호 1에 있어서의 1-3699번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 1에 있어서의 3700-4905번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 3에 있어서의 융합점은, 서열번호 3에 있어서의 1-3699번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 3에 있어서의 3700-4779번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 5에 있어서의 융합점은, 서열번호 5에 있어서의 1-3297번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 5에 있어서의 3298-4503번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 7에 있어서의 융합점은, 서열번호 7에 있어서의 1-3297번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 7에 있어서의 3298-4377번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 9에 있어서의 융합점은, 서열번호 9에 있어서의 1-3624번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 9에 있어서의 3625-4830번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 11에 있어서의 융합점은, 서열번호 11에 있어서의 1-3624번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 11에 있어서의 3625-4704번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 13에 있어서의 융합점은, 서열번호 13에 있어서의 1-3282번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 13에 있어서의 3283-4488번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 15에 있어서의 융합점은, 서열번호 15에 있어서의 1-3282번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 15에 있어서의 3283-4362번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 17에 있어서의 융합점은, 서열번호 17에 있어서의 1-3573번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 17에 있어서의 3574-4779번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 19에 있어서의 융합점은, 서열번호 19에 있어서의 1-3573번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 19에 있어서의 3574-4653번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 21에 있어서의 융합점은, 서열번호 21에 있어서의 1-3678번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 21에 있어서의 3679-4884번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다. 서열번호 23에 있어서의 융합점은, 서열번호 23에 있어서의 1-3678번째의 DCTN1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 23에 있어서의 3679-4758번째의 RET를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유래의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 융합한 점이다.
본 발명에 있어서, 프라이머 또는 프로브는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드로서, 통상 공지된 방법에 의해 제작된다. 당해 프라이머 또는 프로브의 염기수는, 10 내지 50 염기, 바람직하게는 15 내지 50 염기, 보다 바람직하게는 18 내지 35 염기이다.
당해 프라이머 또는 프로브는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리다이징하는 것이면, 완전히 상보적일 필요는 없다. 이러한 프라이머 또는 프로브는, 대응하는 염기 서열과 비교하여, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브로서는, 바람직하게는 (i) 서열번호 69, (ii) 서열번호 70, 또는 (iii) 서열번호 71로 표현되는 폴리뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는 (iv) 서열번호 69와 서열번호 70으로 표현되는 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 세트인 폴리뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는 (v) 서열번호 69, 서열번호 70 및 서열번호 71로 표현되는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브의 세트인 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에는, 시료 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법이 포함된다.
본 발명에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법은, 노던 블로팅법, 서던 블로팅법, RT-PCR법, 리얼타임 PCR법, 디지털 PCR법, DNA 마이크로어레이법, 계내(in situ) 하이브리다이제이션법, 시퀀스 해석법 등, 통상 관용의 검출법에 의해 검출하는 방법이다.
본 발명에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법에는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RET 융합 유전자의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 방법도 포함된다. 당해 방법으로서는, RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프라이머(예를 들어, RET 키나아제 도메인 이후의 3'측의 서열에 하이브리다이징하는 프라이머)를 사용하여, 5'RACE법에 의해 증폭시킨 PCR 산물을 시퀀스 해석하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 바람직하게는 본 발명의 프라이머 또는 프로브를 사용해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법이다.
본 발명에는, RET를 저해하는 화합물을 유효 성분으로 하는, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물이 포함된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 유효 성분으로 하는, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물이 포함된다.
본 발명에 있어서, 「DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암」에 있어서의 「DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성인 암」이란, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현하고 있는 암이고, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 검출된 암이다.
또한, 본 발명에 있어서, 「DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암」에 있어서의 「DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암」이란, 본 발명의 폴리펩티드가 발현하고 있는 암이고, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드가 검출된 암이다.
본 발명의 암 치료용 의약 조성물에 있어서의 유효 성분으로서는, RET를 저해하는 화합물이고, 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물이다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선택한 화합물을 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 공지된 RET를 저해하는 화합물을 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. RET를 저해하는 화합물로서는, RET의 발현 및/또는 활성을 저해할 수 있는 화합물이면, 다른 티로신 키나아제의 발현 및/또는 활성을 저해하는 화합물이어도 되고, 보다 바람직하게는 RET의 활성을 저해할 수 있는 화합물이며, 다른 티로신 키나아제의 발현 및/또는 활성을 저해하는 화합물이어도 된다. 이러한 화합물로서, 예를 들어, 반데타닙, 소라페닙, 수니티닙, 모테사닙, 카보잔티닙, 렌바티닙, 국제공개 제2016/127074호 팸플릿, 국제공개 제2017/043550호 팸플릿, 국제공개 제2017/011776호 팸플릿, 국제공개 제2017/146116호 팸플릿에 기재된 화합물을 들 수 있다.
DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서는, RET를 저해하는 화합물이고, 보다 바람직하게는 반데타닙, 카보잔티닙, 렌바티닙, 국제공개 제2017/043550호 팸플릿에 기재된 일반식 (1)로 나타나는 축합 피리미딘 화합물 또는 국제공개 제2017/146116호 팸플릿에 기재된 일반식 (1)로 나타나는 축합 피리미딘 화합물이고, 보다 바람직하게는, 반데타닙, 카보잔티닙, 렌바티닙, 국제공개 제2017/043550호 팸플릿에 기재된 실시예 화합물 1 내지 90 또는 국제공개 제2017/146116호 팸플릿에 기재된 실시예 화합물 1 내지 207이고, 더욱 바람직하게는 반데타닙, 카보잔티닙, 렌바티닙, 4-아미노-1-(tert-부틸)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-카르복사미드, 4-아미노-7-(tert-부틸)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-7-(1-플루오로-2-메틸프로판-2-일)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7-(1-메틸시클로프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-7-(2-시클로프로필프로판-2-일)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-(3-모르폴리노프로-1-핀-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-((테트라히드로-2H-피란-4-일)에티닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, (R)-4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-((테트라히드로푸란-2-일)메톡시)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드 또는 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-6-((1-메틸-1H-피라졸-4-일)에티닐)-7-(1-메틸시클로프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드이며, 특히 바람직하게는 4-아미노-1-(tert-부틸)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-카르복사미드, 4-아미노-7-(tert-부틸)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-7-(1-플루오로-2-메틸프로판-2-일)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7-(1-메틸시클로프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-7-(2-시클로프로필프로판-2-일)-N-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-(3-모르폴리노프로-1-핀-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-((테트라히드로-2H-피란-4-일)에티닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드, (R)-4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-7-(1-메틸시클로프로필)-6-((테트라히드로푸란-2-일)메톡시)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드 또는 4-아미노-N-[4-(메톡시메틸)페닐]-6-((1-메틸-1H-피라졸-4-일)에티닐)-7-(1-메틸시클로프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복사미드이다.
본 발명에 있어서, 「RET의 발현 및/또는 활성을 저해할 수 있는 화합물」 중에서, 「RET의 발현을 저해할 수 있다」란, 예를 들어 RET의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포에 시험 화합물을 접촉시킨 후, 당해 세포에 있어서의 RET의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현량을 검출했을 때, 시험 화합물을 접촉시키지 않은 세포와 비교하여, 시험 화합물을 접촉시킨 세포에 있어서, RET의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현량이 저하되었을 때, RET의 발현이 억제되었다고 판단할 수 있다. 이러한 화합물로서는, 상기와 같은 화합물, siRNA, miRNA, 핵산(DNA, RNA) 앱타머 등을 들 수 있다. siRNA로서는, 예를 들어 CACAUGUCAUCAAAUUGUATT(서열번호 74), GGAUUGAAAACAAACUCUATT(서열번호 75), GCUUGUCCCGAGAUGUUUATT(서열번호 76)을 들 수 있으며, 바람직하게는CACAUGUCAUCAAAUUGUATT(서열번호 74) 또는 GGAUUGAAAACAAACUCUATT(서열번호 75)이다.
또한, 「RET의 발현 및/또는 활성을 저해할 수 있는 화합물」 중에서, 「RET의 활성을 저해할 수 있다」란, 예를 들어 티로신의 인산화를 지표로 판단할 수 있다. 티로신의 인산화를 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 국제공개 제2017/043550호 팸플릿의 시험예 1에 기재된 방법을 들 수 있다.
또한, RET의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포를 사용하여, 세포 증식 억제 효과를 지표로 하여, 「RET의 활성을 저해할 수 있다」라고 판단할 수 있다. 세포 증식 억제 효과는, 예를 들어 국제공개 제2017/043550호 팸플릿의 시험예 3 및 시험예 4에 기재된 방법을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 대상이 되는 암은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 발현하고 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 두경부암, 갑상선암, 소화기암(식도암, 위암, 십이지장암, 간암, 담도암(담낭·담관암 등), 췌장암, 소장암, 대장암(결장직장암, 결장암, 직장암 등), 소화관 간질 종양 등), 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암), 유방암, 난소암, 자궁암(자궁경부암, 자궁체암 등), 신장암, 방광암, 전립선암, 피부암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 갑상선암, 또는 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암)이다. 부언하면, 여기에서 암에는, 원발소 뿐만 아니라, 다른 장기(간장 등)로 전이한 암도 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 유효 성분으로 하는 제제는, 약학적 담체를 배합하여, 다양한 투여 형태에 따른 의약 조성물로서 제조할 수 있다. 당해 형태로서는, 예를 들어 경구제, 주사제, 좌제, 연고제, 첩부제를 들 수 있다. 이들 투여 형태는, 각각 당업자에게 공지 관용인 제제 방법에 의해 제조할 수 있다.
약학적 담체로서는, 제제 소재로서 관용인 각종 유기 또는 무기 담체 물질이 사용되고, 고형 제제에 있어서의 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 코팅제 등, 액상 제제에 있어서의 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, pH 조절제·완충제, 무통화제 등으로서 배합된다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제, 착색제, 교미·교취제, 안정화제 등의 제제 첨가물을 사용할 수도 있다.
경구용 고형 제제를 제조하는 경우에는, 본 발명 화합물에 부형제, 필요에 따라 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미·교취제 등을 첨가한 후, 통상의 방법에 의해 정제, 피복 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등을 제조할 수 있다.
경구용 액체 제제를 제조하는 경우에는, 본 발명 화합물에 pH 조절제·완충제, 안정화제, 교미·교취제 등을 첨가해서 통상의 방법에 의해 내복 액제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 제조할 수 있다.
주사제를 제조하는 경우에는, 본 발명 화합물에 pH 조절제·완충제, 안정화제, 등장화제, 국소 마취제 등을 첨가하고, 통상의 방법에 의해 피하, 근육내 및 정맥내용 주사제를 제조할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법에 있어서, 시료 중 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, 암이라고 판정하는 방법이 포함된다. 본 발명에 의해 판정할 수 있는 암으로서는, 본 발명의 의약 조성물의 대상이 되는 암으로서 열거한 것 등을 들 수 있다. 상기한 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써, 암의 판정을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드는, 암을 검출하기 위한 바이오마커로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 지표로 하는 방법으로서, 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리펩티드를 검출한 경우, 및/또는 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효하다고 판정하는 방법이 포함된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 지표로 하는 방법으로서, 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리펩티드를 검출한 경우, 및/또는 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효하다고 판정하는 방법이 포함된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어진 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 지표로 하는 방법으로서, 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리펩티드를 검출한 경우, 및/또는 본 발명의 검출 방법에 의해 시료 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어진 화합물을 사용한 화학 요법이 유효하다고 판정하는 방법이 포함된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자(DCTN1-RET 융합 유전자)의 취득
<1-1 임상 검체 유래 RNA의 추출>
Asterand Bioscience에서 구입한 인간 갑상선암 조직으로부터, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용해서 이하의 방법에 의해 RNA를 추출했다. 갑상선암 조직에 완충제 RLT를 600μL 첨가하고, QIAshredder 스핀 칼럼에 어플라이한 후 원심하고 (16,000rpm, 2분, 실온), 여액을 회수했다. 회수한 여액에 동량의 70% 에탄올 수용액을 첨가하고 혼화한 후에, RNeasy 미니 칼럼에 어플라이하고 원심하였다(10,000rpm, 15초, 실온). RNeasy 미니 칼럼에 700μL의 완충제 RW1을 첨가하고 원심하였다(10,000rpm, 15초, 실온). 추가로 500μL의 완충제 RPE를 첨가하고 원심하였다(10,000rpm, 15초, 실온). 마찬가지로 다시 500μL의 완충제 RPE를 첨가하고 원심하였다(10,000rpm, 2분, 실온). 다시 RNeasy 미니 칼럼을 원심(16,000rpm, 1분, 실온)하고, 남은 완충제를 제거했다. RNeasy 미니 칼럼에 RNase 무함유 물을 40μL 어플라이한 후, 원심(10,000rpm, 1분, 실온)하고, 여액을 총 RNA(total RNA)로서 회수했다.
<1-2 임상 검체 유래 cDNA의 제작>
상기 1-1에서 얻어진 총 RNA로부터, 슈퍼스크립트(SuperScript) VILO cDNA 합성 키트(invitorgen)를 사용하여, 이하의 방법에 의해 cDNA를 합성했다. 500ng의 총 RNA를 용량이 14μL가 되도록 RNase 무함유 물로 제조하고, 4μL의 5×VILO 반응 믹스(Reaction Mix) 및 2μL의 10×슈퍼스크립트 효소 믹스(Enzyme Mix)를 첨가하고 혼화했다. 25℃에서 10분간 보온하고 그 후 42℃에서 60분 보온했다. 반응을 정지시키기 위해서 마지막으로 85℃에서 5분간 인큐베이트하여, cDNA를 얻었다.
<1-3 클로닝 벡터의 제작 및 정제>
DCTN1-RET 융합 유전자를 증폭시키기 위해서, 표 1에 나타낸 바와 같이, 센스 프라이머로서 프라이머 1(서열번호 33)과 안티센스 프라이머로서 프라이머 2(서열번호 34), 추가로 네스티드(nested) PCR에 사용하는 센스 프라이머로서 프라이머 3(서열번호 35)과 안티센스 프라이머로서 프라이머 4(서열번호 36)를 설계했다.
Figure pct00001
이들 프라이머를 사용해서 상기 1-2에서 합성한 cDNA를 주형으로 하여, KOD-Plus-Neo(TOYOBO)를 사용하고, 이하의 방법으로 DCTN1-RET 융합 유전자를 증폭시켰다. 2μL의 cDNA, 5μL의 10×KOD-Plus-Neo용 PCR 완충제, 5μL의 2mM dNTPs, 3μL의 25mM MgSO4, 1μL의 KOD-Plus-Neo, 1.5μL의 프라이머 1(10μM), 1.5μL의 프라이머 2(10μM) 및 31μL의 재증류수(DDW)를 혼화하여, PCR을 행하였다. 이어서 얻어진 PCR 산물을 100배로 희석하고, 2μL의 희석한 PCR 산물, 5μL의 10×KOD-Plus-Neo용 PCR 완충제, 5μL의 2mM dNTPs, 3μL의 25mM MgSO4, 1μL의 KOD-Plus-Neo, 1.5μL의 프라이머 3(10μM), 1.5μL의 프라이머 4(10μM) 및 31μL의 DDW를 혼화하여, 네스티드 PCR을 행하였다.
네스티드 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔(나카라이)을 사용한 전기 영동에 의해 분리하고, QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여, 겔로부터 PCR 산물을 정제했다.
제한 효소 SmaI(NEB)로 절단한 pUC18 DNA(타카라 바이오)와 정제한 PCR 산물과 T4 DNA 리가아제(ligase)(NEB)와 T4 DNA 리가아제 반응 완충제(NEB)를 혼화하고, 하룻밤 16℃에서 인큐베이트했다. 라이게이션 산물을 SmaI(NEB)로 처리하고, 이하의 방법으로 적격 세포로의 형질전환을 행하였다. 50μL의 대장균 DH5α 적격 세포(타카라 바이오)에 SmaI 처리를 한 라이게이션 산물을 첨가하여 30분 빙상에서 정치했다. 그 후 42℃에서 30초간 히트 쇼크를 가하고, 2분간 빙상에서 정치했다. SOC 배지(타카라 바이오)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 진탕 배양한 후, 암피실린 함유 LB 한천 배지 플레이트(UNITECH)에 배양액을 도포하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 대장균 콜로니를 암피실린 함유 LB 배지(InvivoGen)에 현탁하고 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 증식한 대장균으로부터 QIAquick 스핀 미니프렙 키트(Qiagen)를 사용하여, 첨부의 프로토콜에 준해서 DCTN1-RET 융합 유전자가 삽입된 플라스미드 DNA를 정제했다.
<1-4 서열의 결정>
상기 1-3에서 얻어진 플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 표 2에 나타낸 시퀀스용 프라이머의 프라이머 5 내지 프라이머 36을 사용하여, BigDye 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트를 사용하여 시퀀스 반응을 행하고, Applied Biosystems 3730xl DNA 애널라이저를 사용해서 시퀀스 해석을 실시했다. 시퀀스 해석의 결과, DCTN1-RET 융합 유전자는, DCTN1 변이체 5(GenBank 액세션 번호: NM_001190836)의 엑손 1 내지 엑손 27의 3'측의 하류에 RET 변이체 2(GenBank 액세션 번호: NM_020975)의 엑손 12 내지 엑손 20이 융합한 유전자(서열번호 17)였다.
Figure pct00002
실시예 2 DCTN1-RET 융합 유전자의 검출
Asterand Bioscience에서 구입한 인간 정상 갑상선 조직 유래 RNA와 상기 1-1에서 얻어진 인간 갑상선암 조직 유래 RNA로부터 슈퍼스크립트 VILO cDNA 합성 키트(invitorgen)를 사용하여, 이하의 방법에 의해 cDNA를 합성했다. 280ng의 총 RNA를 용량이 14μL가 되도록 RNase 무함유 물로 제조하고, 5×VILO 반응 믹스를 4μL, 10×슈퍼스크립트 효소 믹스를 2μL 각각 첨가하고 혼화했다. 25℃에서 10분간 보온하고 그 후 42℃에서 60분 보온했다. 반응을 정지시키기 위해서 마지막으로 85℃에서 5분간 인큐베이트했다.
DCTN1-RET 융합 유전자의 검출을 위해서, 표 3에 나타낸 바와 같이, DCTN-RET 융합 유전자 검출용 센스 프라이머로서 프라이머 37(서열번호 69)과 DCTN-RET 융합 유전자 검출용 안티센스 프라이머로서 프라이머 38(서열번호 70), DCTN1-RET 융합 유전자 검출용 프로브(프로브는 TaqMan MGB 프로브, 형광 색소는 FAM(Thermo Fisher Scientific))으로서 프라이머 39(서열번호 71)를 설계했다.
Figure pct00003
얻어진 cDNA를 10배 희석하고 1.1μL을 주형으로서 사용하고, 11μL의 프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(Bio-Rad), 2μL의 프라이머 37(10μM), 2μL의 프라이머 38(10μM), 0.6μL의 프라이머 39(10μM), 1.1μL의 GAPDH를 검출하는 20×HEX 검정(PrimePCR ddPCR 발현 프로브 검정(Expression Probe Assay): GAPDH, 인간, Bio-Rad)를 혼화시켜서, 자동화 액적 제너레이터(Bio-Rad)로 액적을 제작했다. 제작한 액적을 사용해서 PCR을 행하고, 액적 리더(Bio-Rad)로 DCTN1-RET 및 GAPDH 양성인 액적을 카운트했다. 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다.
또한, 상기에서 합성한 cDNA를 주형으로 하여, KOD-Plus-Neo(TOYOBO)를 사용하여 이하의 방법으로 DCTN1-RET 융합 유전자를 증폭시켰다. 2μL의 cDNA, 5μL의 10×KOD-Plus-Neo용 PCR 완충제, 5μL의 2mM dNTPs, 3μL의 25mM MgSO4, 1μL의 KOD-Plus-Neo, 1.5μL의 프라이머 1(10μM), 1.5μL의 프라이머 2(10μM) 및 31μL의 DDW를 혼화하여, PCR을 행하였다. 이어서 얻어진 PCR 산물을 100배로 희석하고, 2μL의 희석한 PCR 산물, 5μL의 10×KOD-Plus-Neo용 PCR 완충제, 5μL의 2mM dNTPs, 3μL의 25mM MgSO4, 1μL의 KOD-Plus-Neo, 1.5μL의 프라이머 3(10μM), 1.5μL의 프라이머 4(10μM) 및 31μL의 DDW를 혼화하여, 네스티드 PCR을 행하였다. 네스티드 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔(나카라이)을 사용한 전기 영동에 의해 분리하고 촬영을 행하였다. 결과를 도 3에 도시한다.
도 1, 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이, 인간 갑상선암 조직 유래의 RNA로부터 합성한 cDNA에 있어서는, DCTN1-RET 융합 유전자가 검출된 데 반해, 인간 정상 갑상선 조직 유래 RNA로부터 합성한 cDNA에 있어서는, DCTN1-RET 융합 유전자가 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, DCTN1-RET 융합 유전자는 암 바이오 마커로서 유용한 것이 나타났다.
실시예 3 DCTN1-RET 융합 유전자의 발현 벡터의 구축
발현 벡터 구축을 위해, 표 4에 나타낸 바와 같이, 센스 프라이머로서 프라이머 40(서열번호 72)과 안티센스 프라이머로서 프라이머 41(서열번호 73)을 설계했다.
Figure pct00004
이들 프라이머를 사용해서 상기 1-2에서 합성한 cDNA를 주형으로 하여, Prime STAR Max DNA 폴리머라아제(Polymerase)(TaKaRa)를 사용하여 이하의 방법으로 DCTN1-RET 융합 유전자를 증폭시켰다. 1μL의 cDNA, 25μL의 2×Prime STAR Max DNA 폴리머라아제, 1μL의 프라이머 40(10μM), 1μL의 프라이머 41(10μM) 및 22μL의 재증류수(DDW)를 혼화하여, PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔(나카라이)을 사용한 전기 영동에 의해 분리하고, GFX PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트(GE Healthcare)를 사용하여, 겔로부터 PCR 산물을 정제했다. 이어서 얻어진 정제 PCR 산물을 Gateway BP Clonase II 효소 믹스(ThermoFisher)를 사용해서 이하의 방법으로 Gateway pDONR221 벡터에 삽입하고, 엔트리 벡터를 제작했다. 구체적으로는, 5.0μL의 정제 PCR 산물, 3.5μL의 pDONR221(85ng/μL), 4.0μL의 BP Clonase II 효소 믹스, 7.5μL의 TE를 혼화하고, 25℃에서 90분간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후에 프로테이나아제(Proteinase) K(2㎎/mL)를 1μL 첨가하고, 37℃에서 10분간 인큐베이트함으로써 엔트리 벡터를 얻었다.
얻어진 엔트리 벡터를 50μL의 대장균 DH5α 적격 세포(타카라 바이오)에 첨가하여 30분 빙상에서 정치했다. 그 후 37℃에서 20초간 히트 쇼크를 가하여, 2분간 빙상에서 정치했다. SOC 배지(타카라 바이오)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 진탕 배양한 후, 카나마이신 함유 LB 한천 배지 플레이트에 배양액을 도포하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 대장균 콜로니를 카나마이신 함유 LB 배지에 현탁하고, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 증식한 대장균으로부터 DCTN1-RET 융합 유전자가 삽입된 플라스미드 DNA(엔트리벡터 크론)를 DNA 자동 분리 장치 GENE PREP STAR PI-480(구라보)에서 정제했다.
얻어진 플라스미드와 Gateway LR Clonase II 효소 믹스(ThermoFisher)를 사용하여, 이하의 방법으로, pJTI Fast DEST 벡터에 DCTN1-RET 융합 유전자를 삽입하여, 발현 벡터로 했다. 150ng의 엔트리 벡터 크론, 1μL의 pJTI Fast DEST 벡터(150ng/μL), 2μL의 LR Clonase II 효소 믹스 및 TE 완충제를 혼화하고, 전량을 10μL로 하고, 25℃에서 90분간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후에 프로테이나아제 K(2㎎/mL)를 1μL 첨가하고, 37℃에서 10분간 인큐베이트함으로써, DCTN1-RET 융합 유전자가 삽입된 pJTI Fast DEST 벡터(DCTN1-RET 융합 유전자 발현 벡터)를 얻었다. 얻어진 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 벡터를 50μL의 대장균 DH5α 적격 세포(타카라 바이오)에 첨가하여 30분 빙상에서 정치했다. 그 후 37℃에서 20초간 히트 쇼크를 가하여, 2분간 빙상에서 정치했다. SOC 배지(타카라 바이오)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 진탕 배양한 후, 암피실린 함유 LB 한천 배지 플레이트에 배양액을 도포하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 대장균 콜로니를 암피실린 함유 LB 배지에 현탁하고 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 증식한 대장균으로부터 DCTN1-RET 융합 유전자가 삽입된 플라스미드 DNA(DCTN1-RET 융합 유전자 발현 벡터)를 플라스미드 플러스 맥시 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제했다.
실시예 4 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포의 수립
<4-1 세포의 수립>
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포의 수립을 위한 숙주 세포로서, 마우스 태아 섬유아 세포 NIH/3T3 세포(American Type Culture Collection)를 선택하고, 상기에서 제작한 DCTN1-RET 융합 유전자가 삽입된 발현 벡터를 형질감염함으로써, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포를 수립했다. 상세한 방법은 이하에 나타내는 바와 같이 실시했다. NIH/3T3 세포는, 통상의 배양(2차원 배양)을 위해서, D-MEM(고글루코오스)(L-글루타민, 페놀레드, 피루브산나트륨, 1500㎎/L 탄산수소나트륨 함유)(WAKO)에 10%가 되도록 초생 송아지 혈청(Newborn Calf Serum; NBCS)(GIBCO)을 첨가한 것을 2차원 배양용 배지로서 사용하고, 37℃, 5% CO2로 배양한 것을 사용했다. 형질감염을 행하기 전날에, NIH/3T3 세포를 1.5×105cells/2mL에서, 6웰 플레이트(IWAKI)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로, 하룻밤 인큐베이트했다. 1.5μg의 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 벡터, 1.5μg의 pJTI phiC31 인테그라아제 벡터를 혼합한 혼합액에, 그 혼합액의 6배량의 ViaFect 형질감염 시약을 첨가한 후, 전량이 300μL가 되도록 Opti-MEM을 첨가하고, 실온에서 5분간 인큐베이트함으로써 형질감염 용액을 제작했다. NIH/3T3 세포가 파종되어 있는 웰로부터 배지를 300μL 제거하고, 상기에서 제작한 형질감염 용액을 300μL 첨가하고, 37℃, 5% CO2로, 하룻밤 인큐베이트했다. 다음날, 형질감염 용액을 제거하기 위해서, 배지를 교환했다. 배지를 교환 할 때, 새로운 배지에는, 하이그로마이신 B(나카라이테스크)를 500μg/mL가 되도록 첨가했다. 하이그로마이신 B에 의해, DCTN1-RET 융합 유전자 도입 발현 벡터가 도입되어 있지 않은 세포를 제거했다.
형질감염 후, 1주일에 2회 정도의 배지 교환을 하면서, 세포가 증식할 때까지, 배양을 행하였다. 형질감염 22일 후에, 세포를 트립신으로 회수하고, 이하의 방법으로 단세포 클로닝을 행하였다. 회수한 세포의 세포수를 측정하여, 1cell/200μL가 되도록 배지를 첨가했다. 96웰 플레이트(ThermoFisher)에 200μL/1웰이 되도록 세포를 파종했다. 파종 후, 매일 관찰을 행하여, 단세포로부터 증식해 온 세포를 취득하고, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포(DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포)로 했다.
<4-2 목적 단백질의 발현 확인>
얻어진 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서의 DCTN1-RET 융합 단백질의 발현을, 웨스턴 블로트법으로 확인했다. 즉, 배양 플라스크로부터 배지를 제거하고, PBS로 한번 세정했다. 배양 플라스크 내에 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitor)(로슈)와 프로테아제 저해제(protease inhibitor)(로슈)를 함유한 샘플 희석 농축물(Sample Diluent Concentrate) 2(R&D SYSTEMS)를 첨가하고, 스크레이퍼로 세포 용해액을 회수했다. 회수한 세포 용해액으로부터 원심 분리에 의해, 단백질 샘플을 얻었다. 단백질 샘플은, 단백질 정량을 행하여, 단백질 농도를 일정하게 했다. 일정 농도의 단백질 샘플에 대하여, SDS-PAGE용 환원 시약 함유 샘플 완충 용액(6x)(나카라이테스크)을 첨가하여, 95℃에서 5분간 인큐베이트함으로써, 단백질을 변성시켜서, 웨스턴 블로팅용 샘플을 얻었다. 또한, 네거티브 컨트롤용 샘플로서, 친주인 NIH/3T3 세포를 사용하여, 마찬가지 방법으로 웨스턴 블로팅용 샘플을 얻었다. 상기 샘플을 사용하여, 이하에 나타내는 방법으로, 단백질의 발현을 확인했다. 4 내지 15퍼센트 아크릴아미드 겔(BIO-RAD) 및 1×Tris/글리신/SDS 완충제를 사용하여, SDS-PAGE 전기 영동(200V에서 30분)에서, 단백질을 분리했다. Trans-Blot Turbo RTA 미디 PVDF 트랜스퍼 키트(BIO-RAD)와 Transblot Turbo 전사 시스템(BIO-RAD)을 사용해서 PVDF막에 단백질을 전사하고, PVDF막을 블로킹 원-피(Blocking One-P)에 1시간 침지했다. 블로킹 원-피가 10%가 되도록 TBS-T로 희석한 용액으로 1차 항체(포스포-Ret(Tyr905) 항체(CST), Ret(C31B4) 토끼 mAb(CST) 및 항-Dctn1 항체(ATLAS ANTIBODIES))를 1/1000 농도가 되도록 희석하고, PVDF막을 침지시켜서, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. TBS-T로 세정 후, 항-토끼 IgG, HRP-연결 항체(CST)를 1/2000 농도가 되도록 TBS-T로 희석한 2차 항체 희석액으로, PVDF막을 침지시켜서, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. TBS-T로 세정 후, SuperSignal 웨스트 듀라 연장 기간 기질(West Dura Extended Duration Substrate)(ThermoFisher) 및 루미노·이미지 애널라이저 Amersham Imager 600(GE 헬스케어)을 사용해서 단백질의 검출을 행하였다. 또한, 검출 단백질의 분자량은, 프리시전 플러스 프로테인 칼레이도스코프 스탠다드(BIORAD)에 의해 확인했다.
그 결과, 도 4의 a) 및 b)에 나타낸 바와 같이, 항pRET 항체와 항RET 항체를 사용한바 내재성의 RET(150 및 175kDa)는 검출되지 않았다. 한편, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서만, 175kDa 부근에 DCTN1-RET 융합 단백질이라고 추측되는 밴드를 확인할 수 있었다.
또한, 도 4의 c)에 나타낸 바와 같이 항DCTN1 항체를 사용한바, 150kDa 부근에 내재성의 DCTN1이 검출되었다. 한편, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서만, 내재성의 150kDa의 DCTN1의 밴드 상의 175kDa 부근에 밴드가 검출되었다. 즉, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 있어서만, RET에 대한 항체 및 DCTN1에 대한 항체의 양쪽에 175kDa 부근의 밴드가 검출된 점에서, 제작한 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에서는, DCTN1과 RET가 융합한 단백질이 발현하고 있는 것이 명확해졌다.
실시예 5 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 3차원 배양에 의한 증식 확인
NIH/3T3 세포는, 2차원 배양 조건에서는 양호한 증식을 나타내지만, 3차원 배양 조건에서는, 대부분 증식하지 않는다. 그 반면, NIH/3T3 세포에 암 유전자를 발현시킴으로써, 3차원 배양 조건에서도 증식하는 것이 알려져 있다. 그 성질을 이용하여, DCTN1-RET 융합 유전자가 암 유전자인지의 확인을 행하였다. 37℃, 5% CO2로, 2차원 배양으로 배양한 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포 및 NIH/3T3 세포를 트립신으로 회수하고, 세포수를 측정했다. 3차원 배양을 행하기 위해서, FCeM 시리즈 제조 키트(닛산 가가쿠 고교 가부시키가이샤)와 D-MEM(고글루코오스)(L-글루타민, 페놀레드, 피루브산나트륨, 1500㎎/L 탄산수소나트륨 함유)(WAKO)과 초생 송아지 혈청(NBCS)(GIBCO)을 사용하여, 3차원 배양용 배지를 제작했다. 제작한 3차원 배양용 배지에, 세포를 1000cells/90μL가 되도록 현탁하고, 96웰 투명 검정 둥근 바닥의 타원 마이크로플레이트(Corning)에 90μL/1well이 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO2로 인큐베이트했다. 파종 다음날(Day1) 및 파종 8일 후(Day8)에 세포 내 ATP 발광 검출 시약인 Celltiter-Glo 2.0 시약(Progema) 및 루미노미터(EnSpire, PerkinElmer)를 사용해서 발광량(counts per second: cps)을 측정하여, 생세포수의 지표로 했다. Day1에서의 측정 결과와 Day8에서의 측정 결과로부터 각 세포의 증식율을 산출했다(N=3).
그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, NIH/3T3 세포로는, Day8의 세포수는 Day1의 세포수와 비교해서 2.4배였던 데 비해, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에서는, 20.9배였다. 또한, NIH/3T3 세포는, 3차원 배양에 있어서 세포의 응집 덩어리는 형성되지 않지만, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에서는, 3차원 배양에 의해 세포의 응집 덩어리가 형성되어 있는 것이 확인되었다.
즉, DCTN1-RET 융합 유전자를 도입함으로써, 세포의 증식이 항진한 것이 명확해지고, DCTN1-RET 융합 유전자가 암 유전자인 것이 시사되었다.
실시예 6 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 생체 내에 있어서의 종양 형성성 확인
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 생체 내에 있어서의 종양 형성성을 확인하기 위해서, 누드마우스를 사용한 이식 실험을 행하였다. 부언하면, 친주인 NIH/3T3 세포는, 누드마우스의 피하에서는 증식하지 않는 것이, 일반적으로 알려져 있고, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포를 누드마우스의 피하에 이식함으로써, DCTN1-RET 융합 유전자가 종양 형성성에 기여하는지, 즉 암 유전자인지의 확인을 할 수 있다. 피이식 동물로서는, 누드마우스(BALB/cAJcl-nu/nu, 니혼 클레아)를 사용했다. DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포를 트립신으로 회수하고, 최종적으로 1×108cells/mL가 되도록 PBS에 현탁하고, 동량의 마트리겔 기저막 매트릭스(Corning)를 첨가하고, 5×107cells/mL로 한 것을 이식용 세포액으로 했다. 25G 주사 바늘과 1mL 시린지를 사용하여, 이식용 세포액을 누드마우스(N=10)의 우측 흉부의 피하에 0.1mL씩 이식했다. 전자 노기스(미츠토요)를 사용하여, 이식 후, 10, 13, 17일째에, 1마리씩 종양의 긴 직경 및 짧은 직경을 측정하고, 이하의 식을 사용해서 종양 체적을 산출했다.
종양 체적(㎣)=(긴 직경, ㎜)×(짧은 직경, ㎜)×(짧은 직경, ㎜)/2
종양 체적의 측정 결과를 도 6에 나타낸다. 그 결과, 누드마우스의 피하에 이식된 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포는, 종양을 형성하고, 양호하게 증식하는 것이 확인되고, 생체 내 실험에 있어서도 DCTN1-RET 융합 유전자가 암 유전자인 것이 시사되었다.
실시예 7 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포를 사용한 siRNA에 의한 DCTN1-RET 융합 단백질의 억제와 세포 증식 억제 효과의 확인
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 대한 siRNA 처리에 의한 영향을 확인했다. 사용한 siRNA는, 하기의 표 5에 나타낸 3종류의 RET siRNA와 네거티브 컨트롤로서 Silencer 셀렉트 네거티브 컨트롤 #1 siRNA(Ambion)를 사용했다. 또한, 3종류의 RET siRNA는, 모두 인간 RET를 표적으로 하는 siRNA이지만, RET siRNA1 및 RET siRNA2는 DCTN1-RET 융합 유전자 내의 RET 부분에 결합하는 서열을 포함하고, RET siRNA3은 DCTN1-RET 융합 유전자 내에 결합하는 서열을 포함하지 않는다. 즉, RET siRNA1 및 RET siRNA2는 DCTN1-RET 융합 유전자의 발현을 억제하지만, RET siRNA3은 DCTN1-RET 융합 유전자의 발현을 억제하지 않는 것이 상정되었다. 이하에 siRNA를 사용한 실험의 방법에 대해서 기재했다.
Figure pct00005
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포는, 2차원 배양용 배지를 사용하고, 37℃, 5% CO2에서 배양한 것을 사용했다. siRNA 처리를 행하기 전날에, 각 세포를 3×105cells/2mL로, 6웰 플레이트(IWAKI)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로, 하룻밤 인큐베이트했다. 사전에 물을 사용해서 20μM으로 제조한 각 siRNA를 12μL, 4μL의 리포펙타민(Lipofectamin) RNAiMAX 형질감염 시약(ThermoFisher) 및 384μL의 Opti-MEM을 혼합하고, 실온에서 15분 인큐베이트함으로써 siRNA 용액을 제작했다. 각 세포가 파종되어 있는 웰에 siRNA 용액을 400μL 첨가하고, 37℃, 5% CO2로, 하룻밤 인큐베이트했다.
다음날, 일부는, 단백질 발현 해석용으로 샘플링을 행하고, 일부에 대해서는, 세포 증식 확인용으로 재파종을 행하였다. 단백질 발현 해석용 샘플링 및 단백질 발현 해석은, 1차 항체로서, 포스포-Ret(Tyr905) 항체(CST), Ret(C31B4) 토끼 mAb(CST) 및 GAPDH(D16H11) XP 토끼 mAb(CST)를 사용한 것 이외에는, 상기 <4-2 목적 단백질의 발현 확인>과 마찬가지 방법으로 실시했다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, siRNA 처리하지 않은 세포(무처리)에 비해, 네거티브 컨트롤 siRNA(NC)를 처리한 세포에 있어서, DCTN1-RET 융합 단백질의 발현은 억제되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다. 한편, RET siRNA1 및 RET siRNA2를 처리한 경우, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 DCTN1-RET 융합 단백질의 발현이 억제되는 것이 확인되고, RET siRNA3에서는 억제되지 않는 것이 명확해졌다.
다음에 세포 증식 억제 효과의 확인을 위해, 무처리 또는 siRNA 처리된 웰로부터 트립신에 의해 세포를 회수하고, 세포수를 측정했다. 상기 실시예 5와 마찬가지 방법으로 3차원 배양을 행하고, 파종 당일(Day0) 및 파종 4일 후(Day4)에 실시예 5와 마찬가지 방법으로 생세포수를 측정했다. Day0에서의 측정 결과와 Day4에서의 측정 결과로부터 각 세포에 있어서의 증식율을 산출했다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, siRNA를 처리하지 않은 세포(무처리) 및 네거티브 컨트롤 siRNA(NC)를 처리한 세포에서는, Day4의 세포수는, Day0의 세포수와 비교하여, 4.9배 및 3.6배였던 데 비해, RET siRNA1 및 RET siRNA2로 처리한 세포에서는, 2.0배 및 2.4배 정도의 증식으로, 현저하게 증식율이 저하되었다. 한편, RET siRNA3로 처리한 세포에서는, 3.7배의 증식으로, 네거티브 컨트롤 siRNA와 동일 정도의 증식율이며, 증식율의 저하는 보이지 않았다. 이들 결과로부터, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 증식은, siRNA에 의해 RET의 발현을 저해한 경우에도 억제되는 것이 명확해졌다.
실시예 8 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포를 사용한 세포 증식 억제 효과
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 세포 증식 시험을 행하였다. 상기 실시예 5와 마찬가지 방법으로, 3차원 배양 및 파종을 행하였다. 파종 후 37℃, 5% CO2로 하룻밤 인큐베이트하였다(Day0). RET를 저해한다고 보고되어 있는 카보잔티닙, 반데타닙, 알렉티닙, 렌바티닙, 축합 피리미딘 화합물(화합물 1 내지 9; 표 6에 나타낸다)을 디메틸술폭시드로 10mmol/L의 농도로 용해하고, 추가로 3차원 배양용 배지를 사용하여, 이들 화합물의 최종 농도가 각각 1000, 333, 111, 37.0, 12.3, 4.12, 1.37, 0.457nmol/L가 되도록 희석을 행하였다. 이것을 먼저 설명한 세포가 파종된 플레이트의 각 웰에 0.01mL씩 첨가하여(Day1), 37℃, 5% CO2로 7일간 인큐베이트했다. 배양 후(Day8), 모든 웰에 세포 내 ATP 발광 검출 시약인 Celltiter-Glo 2.0 시약(Progema)를 첨가하고, 루미노미터(EnSpire, PerkinElmer)를 사용해서 발광량(counts per second: cps)을 측정했다. Tday8과 Cday1의 값의 크기에 따라, 이하의 식으로부터 화합물의 각 농도에 있어서의 Day1로부터의 증식율을 산출하고, 세포 증식을 50% 억제하는 피검 화합물의 농도(GI50(nM))를 구했다.
1) Tday8≥Cday1인 경우
증식율(%)=(Tday8-Cday1)/(Cday8-Cday1)×100
T: 피검 화합물을 첨가한 웰의 cps
C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 웰의 cps
Day1: 피검 화합물을 첨가한 날
Day8: 평가일
2) Tday8＜Cday1인 경우
증식율(%)=(Tday8-Cday1)/(Cday1)×100
T: 피검 화합물을 첨가한 웰의 cps
C: 피검 화합물을 첨가하지 않은 웰의 cps
Day1: 피검 화합물을 첨가한 날
Day8: 평가일
Figure pct00006
Figure pct00007
그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이, 카보잔티닙, 반데타닙, 렌바티닙 및 축합 피리미딘 화합물(화합물 1 내지 9)에 있어서, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 증식이 억제되었다.
Figure pct00008
이상의 결과로부터, 상기 RET 저해제는, DCTN1-RET 융합 유전자가 검출된 암에 대한 치료약으로서 유용할 가능성이 시사되었다. 또한, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포를 사용함으로써, DCTN1-RET를 억제하는 화합물의 스크리닝이 가능한 것이 시사되었다.
실시예 9 DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포를 사용한 RET의 인산화 저해
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 세포에 있어서의 RET의 인산화가, RET를 저해한다고 보고되어 있는 기존의 약제로 저해되는지에 대해서 이하의 방법으로 검토했다.
DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포는, 2차원 배양용 배지를 사용하고, 37℃, 5% CO2로 배양한 것을 사용했다. 약제 처리를 행하기 전날에, 각 세포를 3×105cells/2mL로, 6웰 플레이트(IWAKI)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로, 하룻밤 인큐베이트했다. 카보잔티닙, 반데타닙, 알렉티닙, 렌바티닙을 디메틸술폭시드로 10mmol/L의 농도로 용해하고, 추가로 PBS를 사용하여, 이들 화합물의 최종 농도가 각각 1000, 100, 10nmol/L가 되도록 희석을 행하였다. 이것을 먼저 설명한 세포가 파종된 플레이트의 각 웰에 20μL씩 첨가하여(Day1), 37℃, 5% CO2로 1시간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후, 상기 실시예 7에 기재되어 있는 방법과 마찬가지 방법으로 단백질 발현 해석용 샘플링을 행하여, 단백질 발현 해석을 실시했다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 인산화 RET 레벨이 카보잔티닙 및 렌바티닙에 의해 현저하게 감소하는 것이 확인되었다. 또한, 상기와 마찬가지 방법으로, 축합 피리미딘 화합물을 사용하여, RET의 인산화 저해를 평가한 결과, 축합 피리미딘 화합물에 있어서도 RET의 인산화가 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 인산화 RET 레벨을 현저하게 감소시키는 약제는, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 증식을 억제할 수 있는 화합물이며, DCTN1-RET 융합 유전자가 검출된 암에 대한 치료약으로서 유용할 가능성이 시사되었다. 또한, DCTN1-RET 융합 유전자 발현 NIH/3T3 세포의 인산화 RET 레벨을 사용함으로써 RET 저해제의 스크리닝이 가능한 것이 시사되었다.
서열번호 1은 DCTN1 변이체 1(v1)[서열번호 25의 일부]과 RET 변이체 2(v2)[서열번호 31의 일부]와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 DCTN1 v1과 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 DCTN1 v1과 RET 변이체 4(v4)[서열번호 32의 일부]와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 DCTN1 v1과 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 DCTN1 변이체 2(v2)[서열번호 26의 일부]와 RET v2와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 DCTN1 v2와 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 DCTN1 v2와 RET v4와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 DCTN1 v2와 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 DCTN1 변이체 3(v3)[서열번호 27의 일부]과 RET v2와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 DCTN1 v3과 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 DCTN1 v3과 RET v4와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 12는 DCTN1 v3과 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 DCTN1 변이체 4(v4)[서열번호 28의 일부]와 RET v2와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 14는 DCTN1 v4와 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 15는 DCTN1 v4와 RET v4와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 16은 DCTN1 v4와 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 17은 DCTN1 변이체 5(v5)[서열번호 29의 일부]와 RET v2와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 DCTN1 v5와 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 19는 DCTN1 v5와 RET v4와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 20은 DCTN1 v5와 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 21은 DCTN1 v6과 RET v2와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 22는 DCTN1 v6과 RET v2와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 DCTN1 v6과 RET v4와의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 24는 DCTN1 v6과 RET v4와의 융합 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 33은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 34는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 35는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 36은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 37은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 38은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 39는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 40은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 41은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 42는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 43은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 44는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 45는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 46은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 47은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 48은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 49는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 50은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 51은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 52는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 53은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 54는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 55는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 56은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 57은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 58은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 59는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 60은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 61은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 62는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 63은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 64는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 65는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 66은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 67은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 68은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 69는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 70은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 71은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 72는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 73은 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 74는 RET siRNA의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 75는 RET siRNA의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 76은 RET siRNA의 염기 서열을 나타낸다.
서열번호 77은 RET siRNA의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Fusion peptide of DCTN1 protein and RET protein <130> P17-158WO <150> JP 2017-158796 <151> 2017-08-21 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4908 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence of fusion peptide <400> 1 atggcacaga gcaagaggca cgtgtacagc cggacgccca gcggcagcag gatgagtgcg 60 gaggcaagcg cccggcctct gcgggtgggc tcccgtgtag aggtgattgg aaaaggccac 120 cgaggcactg tggcctatgt tggagccaca ctgtttgcca ctggcaaatg ggtaggcgtg 180 attctggatg aagcaaaggg caaaaatgat ggaactgttc aaggcaggaa gtacttcact 240 tgtgatgaag ggcatggcat ctttgtgcgc cagtcccaga tccaggtatt tgaagatgga 300 gcagatacta cttccccaga gacacctgat tcttctgctt caaaagtcct caaaagagag 360 ggaactgata caactgcaaa gactagcaaa ctgcggggac tgaagcctaa gaaggcaccg 420 acagcccgaa agaccacaac tcggcgaccc aagcccacgc gcccagccag tactggggtg 480 gctggggcca gtagctccct gggcccctct ggctcagcgt cagcaggtga gctgagcagc 540 agtgagccca gcaccccggc tcagactccg ctggcagcac ccatcatccc 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1440 acagaactgg agctgcggga gcagctggac atggcaggcg cgcgggttcg tgaggcccag 1500 aagcgtgtgg aggcagccca ggagacggtt gcagactacc agcagaccat caagaagtac 1560 cgccagctga ccgcccatct acaggatgtg aatcgggaac tgacaaacca gcaggaagca 1620 tctgtggaga ggcaacagca gccacctcca gagacctttg acttcaaaat caagtttgct 1680 gagactaagg cccatgccaa ggcaattgag atggaattga ggcagatgga ggtggcccag 1740 gccaatcgac acatgtccct gctgacagcc ttcatgcctg acagcttcct tcggccaggt 1800 ggggaccatg actgcgttct ggtgctgttg ctcatgcctc gtctcatttg caaggcagag 1860 ctgatccgga agcaggccca ggagaagttt gaactaagtg agaactgttc agagcggcct 1920 gggctgcgag gagctgctgg ggagcaactc agctttgctg ctggactggt gtactcgctg 1980 agcctgctgc aggccacgct acaccgctat gagcatgccc tctctcagtg cagtgtggat 2040 gtgtataaga aagtgggcag cctgtaccct gagatgagtg cccatgagcg ctccttggat 2100 ttcctcattg aactgctgca caaggatcag ctggatgaga ctgtcaatgt ggagcctctc 2160 accaaggcca tcaagtacta tcagcatctg tacagcatcc accttgccga acagcctgag 2220 gactgtacta tgcagctggc tgaccacatt aagttcacgc agagtgctct ggactgcatg 2280 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Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg 100 105 110 Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg 130 135 140 Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu 145 150 155 160 Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile 165 170 175 Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro 180 185 190 Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu 195 200 205 Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser 210 215 220 Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val 225 230 235 240 Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val 245 250 255 Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe 260 265 270 Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys 275 280 285 Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val 290 295 300 Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn 325 330 335 Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His 340 345 350 Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg 355 360 365 Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro 370 375 380 Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val 385 390 395 400 Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala 405 410 415 Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala 420 425 430 Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn 435 440 445 Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile 450 455 460 Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu 465 470 475 480 Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala 485 490 495 Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu 500 505 510 Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys 515 520 525 Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg 530 535 540 Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro 545 550 555 560 Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln 565 570 575 Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly 580 585 590 Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr 595 600 605 Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp 610 615 620 Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala 625 630 635 640 Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys 645 650 655 Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala 660 665 670 Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser 675 680 685 Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val 690 695 700 Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro 705 710 715 720 Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly 725 730 735 Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr 740 745 750 Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu 755 760 765 Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His 770 775 780 Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu 785 790 795 800 Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu 805 810 815 Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser 820 825 830 Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met 835 840 845 Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr 850 855 860 Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 865 870 875 880 Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser 885 890 895 Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg 900 905 910 Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr 915 920 925 Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 930 935 940 Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu 945 950 955 960 Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys 965 970 975 Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro 980 985 990 Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met 995 1000 1005 Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro 1010 1015 1020 Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr 1025 1030 1035 Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro 1040 1045 1050 Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Met Ser Asp Pro Asn 1055 1060 1065 Trp Pro Gly Glu Ser Pro Val Pro Leu Thr Arg Ala Asp Gly Thr 1070 1075 1080 Asn Thr Gly Phe Pro Arg Tyr Pro Asn Asp Ser Val Tyr Ala Asn 1085 1090 1095 Trp Met Leu Ser Pro Ser Ala Ala Lys Leu Met Asp Thr Phe Asp 1100 1105 1110 Ser <210> 32 <211> 1072 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser 20 25 30 Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr 35 40 45 Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro 50 55 60 Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu 65 70 75 80 His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg 100 105 110 Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg 130 135 140 Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu 145 150 155 160 Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile 165 170 175 Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro 180 185 190 Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu 195 200 205 Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser 210 215 220 Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val 225 230 235 240 Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val 245 250 255 Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe 260 265 270 Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys 275 280 285 Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val 290 295 300 Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn 325 330 335 Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His 340 345 350 Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg 355 360 365 Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro 370 375 380 Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val 385 390 395 400 Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala 405 410 415 Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala 420 425 430 Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn 435 440 445 Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile 450 455 460 Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu 465 470 475 480 Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala 485 490 495 Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu 500 505 510 Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys 515 520 525 Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg 530 535 540 Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro 545 550 555 560 Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln 565 570 575 Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly 580 585 590 Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr 595 600 605 Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp 610 615 620 Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala 625 630 635 640 Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys 645 650 655 Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala 660 665 670 Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser 675 680 685 Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val 690 695 700 Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro 705 710 715 720 Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly 725 730 735 Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr 740 745 750 Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu 755 760 765 Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His 770 775 780 Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu 785 790 795 800 Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu 805 810 815 Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser 820 825 830 Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met 835 840 845 Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr 850 855 860 Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 865 870 875 880 Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser 885 890 895 Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg 900 905 910 Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr 915 920 925 Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 930 935 940 Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu 945 950 955 960 Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys 965 970 975 Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro 980 985 990 Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met 995 1000 1005 Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro 1010 1015 1020 Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr 1025 1030 1035 Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro 1040 1045 1050 Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala 1055 1060 1065 Phe Thr Arg Phe 1070 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tgtccagctt tgtgcctgat tgatgt 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gctgggcact gaagagaaag gaatgc 26 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 agcaggatga gtgcggaggc aagc 24 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttaactatca aacgtgtcca ttaattttgc cgc 33 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 agtactgggg tggctggg 18 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cactttggac aaggagatg 19 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 acagaactgg agctgcgg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ggactggtgt actcgctg 18 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tcctagactg caggaaacac 20 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 catcgagaaa gtccagac 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gctgctggag acattgaa 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tcactgctgc tcagctca 18 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gaggatccaa agtgggaatt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 agtatctggc cgagatgaag 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gcaaagacct ggagaagatg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 aggacgttga actctgacag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cctttgcttc atccagaatc 20 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gattttgtgt ttctccagct ct 22 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 cctgcttctc tgaggaagaa 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gggccttagt ctcagcaaac 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gagcactctg cgtgaactta 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cagcttgttc atggtactga t 21 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 tggtgagtcc ttcaccag 18 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 cctagagttt ttccaagaac ca 22 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 catttaactg gaatccgacc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gactctctcc aggccagttc 20 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ggctatcaga agtaaaacca cc 22 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 cgagagctga tggcacta 18 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 cttcatcaca agtgaagtac ttcc 24 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 cgtactccac gatgaggag 19 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gattctggat gaagcaaagg 20 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 ggaagtactt cacttgtgat gaag 24 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 cccagccacc ccagtact 18 <210> 66 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gttttcccag tcacgac 17 <210> 68 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 caggaaacag ctatgac 17 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ctggagccac agtacccact 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 tccaaattcg ccttctccta 20 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ttcatcagcc ttcctcaggg aggat 25 <210> 72 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccaccagc a 41 <210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttaactatca aa 42 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET siRNA1 <220> <221> misc_feature <223> n stand for thymine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stand for thymine <400> 74 cacaugucau caaauuguan n 21 <210> 75 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET siRNA2 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stand for thymine <400> 75 ggauugaaaa caaacucuan n 21 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET siRNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stand for thymine <400> 76 gcuugucccg agauguuuan n 21 <210> 77 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET siRNA3 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stand for thymine <400> 77 ccacugcuac cacaaguuun n 21

Claims (23)

  1. DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 폴리펩티드.
    (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
    (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
    (c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 이하의 (d) 내지 (f)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드.
    (d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
    (e) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
    (f) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 또는 서열번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서, 이하의 (g) 내지 (i)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드.
    (g) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
    (h) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드.
    (i) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 또는 서열번호 23으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포.
  8. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  9. 시료 중 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법.
  10. 시료 중 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서, 당해 프라이머 또는 프로브가 이하의 (j) 내지 (l)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드.
    (j) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브 및 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이징하는 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오티드.
    (k) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점에 하이브리다이징하는 프로브인 폴리뉴클레오티드.
    (l) DCTN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RET 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 융합점을 끼워넣도록 설계된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 세트인 폴리뉴클레오티드.
  11. 시료 중 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법.
  12. 제9항 또는 제11항에 기재된 검출 방법에 있어서, 시료 중 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, 시료의 유래가 되는 환자가 암이라고 판정하는 방법.
  13. RET를 저해하는 화합물을 유효 성분으로 하는, DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 치료용 의약 조성물.
  14. 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법.
    (1) 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드, 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있는 세포, 또는 제7항의 세포에 시험 화합물을 접촉하는 공정.
    (2) 상기 공정 (1)에 있어서, 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제되는지 측정하는 공정, 또는 상기 공정 (1)에 기재된 세포의 증식이 억제되는지 측정하는 공정.
  15. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 지표로 하는 방법으로서, 제9항에 기재된 검출 방법에 의해 시료 중에서 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 검출한 경우, 및/또는 제11항에 기재된 검출 방법에 의해 시료 중에서 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출한 경우에, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효하다고 판정하는 방법.
  16. DCTN1 단백질의 N 말단 부분과, RET 단백질의 C 말단 부분이 융합되어 있는 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 암을 검출하기 위한 바이오마커.
  17. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자에게, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법을 행하는 공정을 포함하는, 암의 치료 방법.
  18. 피험자 유래의 시료 중에서 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 것 및/또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 것을 행하는 공정, 그리고
    제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 존재가 검출되고/되거나 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재가 검출된 경우에, 당해 피험자에 대하여, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법을 행하는 공정을 포함하는, 암의 치료 방법.
  19. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자를 치료하기 위한, RET를 저해하는 화합물.
  20. DCTN1 유전자와 RET 유전자와의 융합 유전자 양성 및/또는 DCTN1 단백질과 RET 단백질과의 융합 단백질 양성인 암 환자를 치료하기 위한 암 치료용 의약 조성물을 제조하기 위한, RET를 저해하는 화합물의 사용.
  21. 시료 중 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 수단 및/또는 시료 중 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 수단의, RET를 저해하는 화합물을 사용한 화학 요법이 유효한지 여부의 판정약의 제조 방법.
  22. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 항DCTN1 항체 및 항RET 항체의 조합.
  23. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 검출약을 제조하기 위한, 제8항에 기재된 항체, 제22항에 기재된 항체의 조합 또는 제10항에 기재된 프라이머 또는 프로브의 사용.
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