TW201915027A - Dctn1蛋白質與ret蛋白質之融合蛋白質 - Google Patents

Dctn1蛋白質與ret蛋白質之融合蛋白質 Download PDF

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Abstract

本發明關於一種DCTN1蛋白質的一部分與RET蛋白質的一部分經融合而成的新穎的多肽、一種編碼上述多肽的聚核苷酸、一種上述聚核苷酸或多肽的檢測方法、一種篩選方法，該方法篩選會抑制上述聚核苷酸的表現或多肽的表現及/或活性的化合物，及一種以會抑制RET的化合物作為有效成分的醫藥組成物。

Description

DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質
發明領域 本發明關於一種為DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質的多肽、一種編碼該多肽的聚核苷酸、一種該多肽或聚核苷酸的檢測方法、一種以該多肽或聚核苷酸作為標靶的化合物，以及一種篩選該化合物的方法。
發明背景 在日本癌症是死因第一位的疾病，現尋求其治療法的改善。甲狀腺癌罹患者數增加，不過許多病例因進展緩慢且在初期階段進行妥適的治療，而顯示高的生存率。另一方面，由於幾乎沒有自覺症狀，因此妥適的治療來說，早期診斷是不可或缺的。
甲狀腺癌依組織型態可分為乳突狀癌(papillary cancer)、濾泡癌、髓質癌、未分化癌、惡性淋巴瘤。乳突狀癌佔甲狀腺癌的80%左右，又，未分化癌雖是低頻率但已知預後非常差(非專利文獻1)。
在乳突狀癌中，已知大部分是因癌症基因的活化而發生，已經清楚BRAF突變基因(50至60%)、RAS突變基因(10至20%)、RET融合基因(5至10%)等基因異常是互斥地發生。又，在非小細胞肺癌來說，亦已經報告：RET融合基因以1至2%的頻率和EGFR突變基因等其他驅動突變(driver mutations)基因是互斥地存在(非專利文獻2至5)。
進展的甲狀腺癌是以藥物治療為主體，儘管已批准種種的多激酶抑制劑，但驅動突變基因專一性地顯示效果的藥劑尚未受到批准。另一方面，在肺癌而言，已經報告：在RET融合基因陽性的患者，藉由抑制RET會顯示效果(非專利文獻6)；在甲狀腺癌亦需要鑑定突變基因或融合基因等等能夠成為藥劑效果指標的基因異常。
在癌症，鑑定會成為驅動物的突變基因(突變蛋白質)及融合基因(融合蛋白質)等，是揭明癌症的性質，同時大大地有助於開發以該等突變基因或融合基因為標靶的新的癌症治療藥及檢查方法，因此強烈受到期待。 惟，可能成為癌症產生之驅動物的突變基因及融合基因等未被充分地闡明，因此鑑定可與藥劑的治療效果相關聯的基因異常是非常有意義的。 先行技術文獻 非專利文獻
非專利文獻1：Cancer, 115(16), pp3801-7 (2009) 非專利文獻2：Oncogene,22(29),pp4578-80(2003) 非專利文獻3：Cell,159(3),pp676-90(2014) 非專利文獻4：Cancer Discov.,3(6),pp630-5(2013) 非專利文獻5：Nature,511(7511),pp543-50(2014) 非專利文獻6：Lancet Respir Med.,5(1),pp42-50(2017)
發明概要 發明欲解決的課題 本發明課題在於提供一種新穎的多肽，該新穎的多肽是包含RET蛋白質之至少一部分的融合蛋白質、或一種編碼該多肽的聚核苷酸、一種該多肽或聚核苷酸的檢測方法、一種以該多肽或聚核苷酸為標靶的化合物、一種篩選該化合物的方法。 用以解決課題之手段
本發明人等為了解決上述課題，進行了深入探討的結果，在來自甲狀腺癌症患者的細胞中，鑑定出：DCTN1蛋白質的一部分與RET蛋白質的一部分是經融合而成的新穎的多肽，及編碼該多肽的聚核苷酸。又，發現了：一種在癌細胞中之本發明聚核苷酸或多肽的檢測方法、一種篩選化合物的方法，該化合物會抑制前述聚核苷酸的表現或多肽的表現及/或活性。各種各樣的蛋白質之中，具有DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分之組合的融合蛋白質會自然地在細胞內產生一事，進而DCTN1與RET的融合基因作為癌症驅動物發揮作用，因而上述融合蛋白質對診斷癌症有效一事，是新穎的知識，並且是從習知技術無法預料的事項。進一步，發現一種醫藥組成物而至完成本發明；該醫藥組成物是用以治療有表現該多肽及/或聚核苷酸的癌症患者，且是以會抑制RET的化合物作為有效成分。
即，本發明提供以下態樣。
項1.一種多肽，其係DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起。
項2.如項1之多肽，其選自以下(a)至(c)：
(a)一多肽，其由以下所示胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24；
(b)一多肽，其由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24；
(c)一多肽，其由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
項3.一種聚核苷酸，其編碼如項1或2之多肽。
項4. 如項3之聚核苷酸，其選自以下(d)至(f)：
(d)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24；
(e)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24；
(f)一聚核苷酸，其編碼由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性之胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
項5.如項3之聚核苷酸，其選自以下(g)至(i)：
(g)一聚核苷酸，其由以下所示鹼基序列構成：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23；
(h)一聚核苷酸，其在嚴苛條件下，會與由和以下所示鹼基序列互補之鹼基序列構成的聚核苷酸進行雜交：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23；
(i)一聚核苷酸，其與以下所示鹼基序列具有90%以上同一性：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23。
項6.一種表現載體，包含如項3至5中任一項之聚核苷酸。
項7.一種細胞，其已導入如項3至5中任一項之聚核苷酸。
項8.一種抗體，其會專一性地結合於如項1或2之多肽。
項9.一種檢測方法，其檢測試料中之如項1或2之多肽的存在。
項10. 一種引子或探針，其係用以檢測試料中之如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在，且該引子或探針係選自以下(j)至(l)的聚核苷酸：
(j)一聚核苷酸，其係選自於由下述構成之群組的至少1個探針：與編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸雜交的探針，及與編碼RET蛋白質的聚核苷酸雜交的探針；
(k)一聚核苷酸，其係雜交於編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點之探針；
(l)一聚核苷酸，其係正意引子與反意引子的組，且係設計成夾入編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點。
項11.一種檢測方法，其檢測試料中之如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。
項12.一種判定方法，在如項9或11之檢測方法中，當檢測到試料中之如項1或2之多肽或如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則判定為試料來源的患者罹癌。
項13.一種DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物，其以抑制RET的化合物作為有效成分。
項14.一種包含以下(1)及(2)之步驟之篩選化合物的方法，該化合物會抑制如項1或2之多肽的表現及/或活性，或抑制如項3至5中任一項之聚核苷酸的表現：
(1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於如項1或2之多肽、有表現如項1或2之多肽或如項3至5中任一項之聚核苷酸的細胞，或如項7的細胞；
(2)測定步驟：測定在上述步驟(1)中，如項1或2之多肽的表現及/或活性、或如項3至5中任一項之聚核苷酸的表現是否受到抑制，或測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
項15.一種判定方法，其係將如項1或2之多肽或如項3至5中任一項之聚核苷酸，設為使用有會抑制RET之化合物的化學療法是否有效的指標；當藉由如項9之檢測方法，從試料中檢測出如項1或2之多肽的情況，及/或藉由如項11之檢測方法，從試料中檢測出如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則判定使用有會抑制RET之化合物的化學療法是有效的。
項16.一種生物標記物，其係用以檢測癌症，且係選自於由下述構成之群組之至少1種：DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽，及編碼該多肽的聚核苷酸。
項17.一種癌症的治療方法，包含下述步驟：對DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者，進行使用有會抑制RET之化合物的化學療法。
項18.一種癌症的治療方法，其包含下述步驟：進行檢測步驟：從來自受試者的試料中，檢測如項1或2之多肽的存在及/或檢測如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在； 以及，進行化學療法的步驟：當檢測出如項1或2之多肽的存在，或者，且/或檢測出如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則對該受試者進行使用有會抑制RET之化合物的化學療法。
項19.一種抑制RET的化合物，其係用以治療DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者。
項20.一種抑制RET之化合物用以製造癌症治療用醫藥組成物的用途，該癌症治療用醫藥組成物是用以治療DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者。
項21. 一種判定藥的製造方法，該判定藥是用以檢測試料中之如項1或2之多肽的存在的手段，及/或用以檢測試料中之如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的手段，且判定使用有會抑制RET的化合物的化學療法是否有效。
項22.一種抗DCTN1抗體及抗RET抗體的組合，其係用以檢測如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。
項23.一種如項8之抗體、如項22之抗體的組合或如項10之引子或探針的用途，其係用以製造檢測藥，該檢測藥是用以檢測如項1或2之多肽或如項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。 發明效果
依據本發明，顯示了：本發明之聚核苷酸及/或多肽在癌細胞會專一性地表現。又，本發明之聚核苷酸、多肽及有表現該聚核苷酸及/或多肽的細胞，是能夠使用於下述篩選方法：篩選會抑制本發明之聚核苷酸的表現或多肽的表現及/或活性的化合物。又，藉由把本發明之聚核苷酸及/或多肽的存在作為指標，能夠進行：DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性對象及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性對象的檢測。又，作為DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物，會抑制RET的化合物是有用的。
較佳實施例之詳細說明 用以實施發明的形態 本發明關於一種新穎的聚核苷酸或多肽、一種該聚核苷酸或多肽的檢測方法、一種以該聚核苷酸或多肽作為標靶的化合物，以及一種篩選該化合物的方法。
本發明提供一種DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽(以下亦稱為「本發明之多肽」)。又，本發明提供一種編碼該多肽的聚核苷酸(以下亦稱為「本發明之聚核苷酸」)。
本發明涉及之「DCTN1(動力蛋白活化蛋白次單元1(Dynactin Subunit 1))蛋白質」是亦稱為150 kDa 動力蛋白-相關的多肽(Dynein-associated polypeptide)蛋白質，或DAP-150蛋白質的蛋白質，包含人類或非人類哺乳動物的DCTN1蛋白質，較佳為人類DCTN1蛋白質。在人類中是被編碼在位於2p13.1之基因的蛋白質。在本發明中，「DCTN1蛋白質」包含為其之剪接變體(splice variant)的亞型(isoform)，是來自人類者的話，例如，可舉由以下所示胺基酸序列構成的多肽：GenPept登錄編號NP_004073、NP_075408、NP_001128512、NP_001128513、NP_001177765，或NP_001177766。又，更具體而言，例如，可舉由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29，或序列編號30。進一步，在本發明中，所謂「DCTN1蛋白質的N末端部分」，是包含位在前述DCTN1蛋白質N末端側之捲曲螺旋結構域(coiled-coil domain)的一部分或全部的多肽，較佳為包含位在DCTN1蛋白質N末端側之捲曲螺旋結構域的全部的多肽。
本發明涉及之「RET蛋白質」，是亦稱為Ret 原致癌基因(Proto-Oncogene)蛋白質、RET 受體酪胺酸激酶(RET Receptor　Tyrosine　kinase)蛋白質，或在轉染期間重新排列(Rearranged During Transfection)蛋白質的蛋白質，包含人類或非人類哺乳動物的RET蛋白質，較佳為人類RET蛋白質。在人類中是被編碼在位於10q11.2之基因的蛋白質。在本發明中，「RET蛋白質」包含為其之剪接變體的亞型，是來自人類者的話，例如，可舉由以下所示胺基酸序列構成的多肽：GenPept登錄編號NP_066124、或NP_065681。又，更具體而言，例如，可舉由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號31，或序列編號32。進一步，在本發明中，所謂「RET蛋白質的C末端部分」，是包含位在前述RET蛋白質C末端側之激酶結構域的多肽。
又，作為本發明之「DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽」，是包含位在前述DCTN1蛋白質N末端側之捲曲螺旋結構域的一部分或全部的多肽，與包含位在前述RET蛋白質C末端側之激酶結構域的多肽融合在一起的多肽，較佳為包含位在前述DCTN1蛋白質N末端側之捲曲螺旋結構域的全部的多肽，與包含位在前述RET蛋白質C末端側之激酶結構域的多肽融合在一起的多肽，更佳為選自以下(a)至(c)的多肽。該等多肽較佳為具有激酶活性及/或細胞增生效果。
(a)一多肽，其由以下所示胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
(b)一多肽，其由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
(c)一多肽，其由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
更佳為選自以下(a)至(c)的多肽。該等多肽較佳為具有激酶活性或細胞增生效果。
(a)一多肽，其由以下所示胺基酸序列構成：序列編號18。
(b)一多肽，其由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成：序列編號18。
(c)一多肽，其由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成：序列編號18。
在本發明之「DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽」，是包含一多肽(前述(b))，該多肽由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。作為由這般之胺基酸序列構成的，DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽，例如可舉：具有以下所示胺基酸序列之DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽的亞型：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。該等多肽較佳為具有激酶活性或細胞增生效果。於此處所謂刪除、取代或附加數個胺基酸，例如較佳為1至10個，更佳為1至5個胺基酸。又，上述附加而言，含：對N末端或C末端附加1至數個胺基酸，或對兩末端附加1至數個胺基酸。
作為前述多肽的胺基酸經取代而成的多肽，例如，可舉：具有GenPept登錄編號：NP_066124(序列編號31)或NP_065681(序列編號32)所示胺基酸序列之RET蛋白質的守門(gatekeeper)部位，即第804號(在序列編號2及序列編號4是第1325號、在序列編號6及序列編號8是第1191號、在序列編號10及序列編號12是第1300號、在序列編號14及序列編號16是第1186號、在序列編號18及序列編號20是第1283號、在序列編號22及序列編號24是第1318號)的纈胺酸，經取代為白胺酸、甲硫胺酸，或麩胺酸而成的多肽，或第806號(在序列編號2及序列編號4是第1327號，在序列編號6及序列編號8是第1193號，在序列編號10及序列編號12是第1302號，在序列編號14及序列編號16是第1188號，在序列編號18及序列編號20是第1285號，在序列編號22及序列編號24是第1320號)的酪胺酸，經取代為半胱胺酸、麩胺酸、絲胺酸、組胺酸，或天冬醯胺酸(asparagine)而成的多肽。
又，可舉：守門部位以外的胺基酸，即第768號(在序列編號2及序列編號4是第1289號、在序列編號6及序列編號8是第1155號、在序列編號10及序列編號12是第1264號、在序列編號14及序列編號16是第1150號、在序列編號18及序列編號20是第1247號、在序列編號22及序列編號24是第1282號)的麩胺酸，經取代為天冬胺酸(aspartic acid)而成的多肽；第883號(在序列編號2及序列編號4是第1404號、在序列編號6及序列編號8是第1270號、在序列編號10及序列編號12是第1379號、在序列編號14及序列編號16是第1265號、在序列編號18及序列編號20是第1362號、在序列編號22及序列編號24是第1397號)的丙胺酸經取代為苯丙胺酸，或絲胺酸而成的多肽；第884號(在序列編號2及序列編號4是第1405號、在序列編號6及序列編號8是第1271號、在序列編號10及序列編號12是第1380號、在序列編號14及序列編號16是第1266號、在序列編號18及序列編號20是第1363號、在序列編號22及序列編號24是第1398號)的麩胺酸，經取代為纈胺酸而成的多肽；第891號(在序列編號2及序列編號4是第1412號、在序列編號6及序列編號8是第1278號、在序列編號10及序列編號12是第1387號、在序列編號14及序列編號16是第1273號、在序列編號18及序列編號20是第1370號、在序列編號22及序列編號24是第1405號)的絲胺酸，經取代為丙胺酸，或白胺酸而成的多肽；或第918號(在序列編號2及序列編號4是第1439號、在序列編號6及序列編號8是第1305號、在序列編號10及序列編號12是第1414號、在序列編號14及序列編號16是第1300號、在序列編號18及序列編號20是第1397號、在序列編號22及序列編號24是第1432號)的甲硫胺酸經取代為蘇胺酸而成的多肽，但未被限定於該等。
又，本發明之DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽而言，在將相當序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24所示胺基酸序列中的序列妥適地排列時，包含一多肽(前述(c))，該多肽(前述(c))是由與前述序列編號之任一者所示胺基酸序列的1個具有90%以上同一性的胺基酸序列構成。該等多肽較佳為具有激酶活性或細胞增生效果。
於此處，與序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24所示胺基酸序列之同一性，較佳為90%以上，更佳為95%以上，進一步較佳為98%以上。該胺基酸序列之同一性可利用通常慣用的方法來計算。
在構成本發明涉及之多肽的胺基酸序列以外，本發明之多肽亦可具有構成蛋白質標籤的胺基酸。作為標籤之例，可使用：使表現效率提升的標籤，及使精製效率提升的標籤等，該技術領域之人士周知的標籤，可舉：His標籤、Myc標籤、FLAG標籤等。
本發明之聚核苷酸是編碼以下多肽的聚核苷酸：前述DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽，較佳為選自以下(d)至(i)的聚核苷酸。該等聚核苷酸較佳為編碼具有激酶活性或細胞增生效果之多肽的聚核苷酸。
(d)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
(e)一種聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
(f)一聚核苷酸，其編碼由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
(g)一聚核苷酸，其由以下所示鹼基序列構成：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23。
(h)一聚核苷酸，其在嚴苛條件下會與由和以下所示鹼基序列互補之鹼基序列構成的聚核苷酸進行雜交：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23。
(i)一聚核苷酸，其與以下所示鹼基序列具有90%以上同一性：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23。
更佳為選自以下(d)至(i)的聚核苷酸。該等聚核苷酸較佳為編碼具有激酶活性或細胞增生效果的多肽的聚核苷酸。
(d)一種聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號18。
(e)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成的多肽：序列編號18。
(f)一聚核苷酸，其編碼由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成的多肽：序列編號18。
(g)一聚核苷酸，由以下所示鹼基序列構成：序列編號17。
(h)一聚核苷酸，其在嚴苛條件下，會與由和以下所示鹼基序列互補之鹼基序列構成的聚核苷酸進行雜交：序列編號17。
(i)一聚核苷酸，其與以下所示鹼基序列具有90%以上同一性：序列編號17。
本發明之聚核苷酸不單是雙股DNA，亦包含：構成其之正意股及反意股等的各種單股DNA及RNA。反意股是可利用來作為探針等。在DNA而言，包含例如：可藉著選殖(cloning)或化學合成技術或該等的組合獲得般的cDNA及基因組DNA。進一步，對於本發明涉及之聚核苷酸，除了編碼本發明涉及之多肽的鹼基序列以外，亦可附加非轉譯區(UTR)的序列等鹼基序列。
於此處，所謂嚴苛條件，例如可舉：記載於Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子選殖：實驗指南)(Second Edition, J.Sambrook et.al,1989)的條件。即，可舉：在包含6×SSC(1×SSC之組成：0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)、0.5%SDS、5×丹哈特溶液(Denhardt)及100mg/mL鯡魚精子DNA之溶液，與探針一併在65℃下恆溫8至16小時，使之進行雜交的條件等。
又，與序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23所示鹼基序列之同一性，較佳為90%以上，更佳為95%以上，進一步較佳為98%以上。該鹼基序列之同一性可利用通常慣用的方法來計算。
在本說明書中，所謂「具有激酶活性或細胞增生效果」之「具有激酶活性」，是意味具有作為將酪胺酸予以磷酸化之酵素的活性。又，「具有激酶活性或細胞增生效果」之「具有細胞增生效果」是，藉由將本發明之聚核苷酸及/或多肽導入至細胞，與未導入之細胞相比，已導入的細胞的增生能力會提升的效果。這般效果，例如，在細胞介素依賴性增生的細胞株已導入聚核苷酸及/或多肽之際，在有細胞介素非依賴性增生時，可確認具有細胞增生效果。
本發明之聚核苷酸，例如，能夠使用從攜帶DCTN1基因與RET基因之融合基因的甲狀腺癌等調整出的cDNA庫或基因組DNA庫，並使用會與本發明聚核苷酸之鹼基序列的一部分專一性地雜交的引子，而進行萃取。作為這樣的引子，只要是會專一性地雜交於本發明涉及之聚核苷酸或其反意股之至少一部分的引子，可使用任何序列及長度。又可舉：人工地合成聚核苷酸的方法 (Nat.Methods,11:499-507,2014)。
本發明的表現載體只要是包含本發明之聚核苷酸，且會使本發明之多肽表現，則無被特別限定。例如，可舉：藉著將本發明之聚核苷酸插入至視使用的宿主而適宜選擇出的公知表現載體而可獲得的表現載體。
就宿主而言，只要是能夠轉形的活細胞，則無被特别限定，例如，可舉：大腸菌、枯草菌等細菌，酵母及絲狀菌等真菌類，Sf9細胞等昆蟲細胞，蠶等昆蟲、動物細胞，植物或源自植物的細胞。
用以插入本發明之聚核苷酸的載體，只要是能在宿主中複製者，則無被特别限定，可因應導入之宿主的種類、導入方法等而適宜選擇。例如，可舉：質體DNA、噬菌體DNA、病毒載體。可用於構建表現載體的載體DNA是可使用廣泛普及之易取得者。例如，可舉：pUC19(Takara Bio)、pTV118N(Takara Bio)、pMAMneo(Clontech)、pGEX(GE healthcare)、pET160(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)、pIEx(Merck Millipore)、pBacPAK(Clontech)。又，作為病毒載體，例如，可舉：桿狀病毒載體、反轉錄病毒載體、人類免疫不全症病毒(HIV)等慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體(adeno-associated virus vector)(AAV載體)、疱疹病毒、痘瘡病毒(vaccinia virus)、痘病毒、脊髓灰白質炎病毒、辛德畢斯病毒(sindbis virus)、仙台病毒、猴病毒-40(SV-40)等DNA病毒及RNA病毒。
就使用該表現載體而將宿主進行轉形而言，可使用：原生質體法、勝任細胞(Competent cell)法、電穿孔法等來進行。所獲得之轉形體，是使用包含可同化之碳源、氮源、金屬鹽、維生素等的培養基，在適當的條件下進行培養即可。
已導入本發明聚核苷酸的細胞，例如，可舉：經以前述本發明表現載體所轉形過的細胞、藉由基因組編輯而導入有本發明聚核苷酸的細胞。作為可於此處使用之細胞，可舉：前述宿主細胞。作為確認細胞是否為經以表現載體所轉形過的細胞的方法，例如，可舉：用以檢測本發明多肽的方法，或用以檢測本發明聚核苷酸的方法。
作為「藉由基因組編輯而導入有本發明之聚核苷酸的細胞」，較佳為藉由基因組編輯而具有以下基因的細胞：使各自單獨存在的DCTN1基因與RET基因融合而成的基因，更佳為藉由基因組編輯而具有以下基因的細胞：使各自單獨存在的DCTN1基因與RET基因之DCTN1的外顯子27(exon27)與RET的外顯子12(exon12)融合而成之基因。這樣的細胞是可利用通常慣用的方法製作，例如，可舉：記載於Cell Rep., 9(4), pp1219-1227(2014), Nat.Commun., 5,3728(2014)的方法。作為確認細胞是否為藉由基因組編輯而導入有本發明聚核苷酸之細胞的方法，例如，可舉：用以檢測本發明多肽的方法，或用以檢測本發明聚核苷酸的方法。
本發明之多肽可藉由下述而獲得：藉著把經以本發明表現載體所轉形過的細胞，使用適合於細胞培養的培養基在適當的條件下進行培養，並從所獲得之培養液及/或細胞，藉由通常的方法進行蛋白質的收取、精製。又，本發明之多肽可藉由下述而獲得：藉著把具有本發明聚核苷酸的表現載體、或編碼本發明聚核苷酸的模板RNA或模板DNA，導入至無細胞蛋白質合成體系(例如，來自人類細胞株的細胞萃取液、兔網狀紅血球萃取液、小麥胚芽萃取液、大腸菌萃取液)，在適當的條件下進行培育(incubation)，並從所獲得之反應液，藉由通常的方法進行蛋白質的收取、精製。
在本發明中，專一性地結合於本發明多肽的抗體，可舉以下抗體：專一性地結合於DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分之融合點的抗體。是意味：該抗體專一性地結合於DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分之融合點，但與野生型DCTN1，或野生型RET蛋白質之任一者均不結合的抗體。
在本發明中，所謂在「DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分的融合點」中的「融合點」，是意味來自DCTN1蛋白質的N末端部分的多肽，與來自RET蛋白質的C末端部分的多肽融合而成的點。在序列編號2中之融合點是：在序列編號2中第1-1233號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號2中第1234-1635號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號4中之融合點是：在序列編號4中第1-1233號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號4中第1234-1593號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號6中之融合點是：在序列編號6中第1-1099號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號6中第1100-1501號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號8中之融合點是：在序列編號8中第1-1099號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號8中第1100-1459號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號10中之融合點是：在序列編號10中第1-1208號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號10中第1209-1610號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號12中之融合點是：在序列編號12中第1-1208號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號12中第1209-1568號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號14中之融合點是：在序列編號14中第1-1094號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號14中第1095-1496號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號16中之融合點是：在序列編號16之第1-1094號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號16中第1095-1454號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號18中之融合點是：在序列編號18中第1-1191號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號18中第1192-1593號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號20中之融合點是：在序列編號20中第1-1191號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號20中第1192-1551號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號22中之融合點是：在序列編號22中第1-1226號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號22中第1227-1628號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。在序列編號24中之融合點是：在序列編號24中第1-1226號之具有來自DCTN1的N末端部分之胺基酸序列的多肽，與在序列編號24中第1227-1586號之具有來自RET的C末端部分之胺基酸序列的多肽融合而成的點。
前述抗體，例如，可舉：免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY等)、Fab片段(Fab fragment)、F(ab')2 片段、單鏈抗體片段(scFv)、單結構域抗體(single domain antibody)、雙鏈抗體(Diabody)等(Nat.Rev.Immunol.,6:343-357,2006)；該等可舉：人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、小鼠抗體、駱馬抗體、雞抗體等單株抗體或多株抗體，但並非被限定於此等。
前述抗體可使用種種公知方法來製作，製作方法並非被特別限定。作為這樣的公知手法，可舉下述方法：將該發明的多肽、包含DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分之融合點的多肽片段等接種於免疫動物，並活化該動物的免疫系統後，回收該動物的血清，以多株抗體的形式獲得的方法、或藉由融合瘤法、噬菌體展示(phage display)法等獲得單株抗體的方法等。
篩選方法是可藉由包含以下(1)及(2)之步驟的方法進行，篩選會抑制本發明多肽之表現及/或活性，或會抑制本發明聚核苷酸之表現的化合物。
即，本發明的篩選方法是可藉由包含下述步驟的方法進行： (1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於本發明之多肽，或有表現本發明之多肽及/或聚核苷酸的細胞。
(2)測定步驟：測定在上述步驟(1)中，本發明之多肽的表現及/或活性、或本發明之聚核苷酸的表現是否受到抑制，或測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
更佳為包含以下(1)及(2)之步驟的方法。
(1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於有表現本發明之多肽及/或聚核苷酸的細胞。
(2)測定步驟，測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
又，篩選會抑制本發明多肽的表現及/或活性，或本發明之聚核苷酸的表現的化合物的篩選方法，是可藉由包含以下(1)至(3)之步驟的方法進行。
即，本發明之篩選方法可藉由包含下述的方法進行： (1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於本發明之多肽，或有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的細胞。
(2)測定步驟：測定在上述步驟(1)中，本發明多肽的表現及/或活性、或本發明聚核苷酸的表現是否受到抑制、或測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
(3)判定步驟：在上述步驟(2)中，當本發明多肽的表現及/或活性、或本發明聚核苷酸的表現受到抑制的情況，或當上述步驟(1)記載之細胞的增生受到抑制的情況，則判定試驗化合物會抑制本發明多肽的表現及/或活性、或本發明聚核苷酸的表現。
更佳為包含以下(1)至(3)之步驟的方法。
(1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的細胞。
(2)測定步驟：測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
(3)判定步驟：在上述步驟(2)中，當上述步驟(1)記載之細胞的增生受到抑制的情況，則判定試驗化合物會抑制本發明多肽的表現及/或活性、或本發明聚核苷酸的表現。
「有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的細胞」，可舉：經以本發明表現載體所轉形過的細胞、已藉由基因組編輯而導入本發明聚核苷酸的細胞、有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的初代培養細胞、有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的株化細胞、有表現本發明多肽及/或聚核苷酸之來自癌症患者的細胞等。作為確認細胞是否為有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的細胞的方法，例如，可舉：用以檢測本發明多肽的方法，或用以檢測本發明聚核苷酸的方法。
在本發明中，在「本發明多肽的表現及/或活性、或本發明聚核苷酸的表現受到抑制」之中，所謂「本發明多肽的表現、或本發明聚核苷酸的表現受到抑制」，例如是使試驗化合物接觸於有表現本發明多肽及/或聚核苷酸的細胞之後，在使用檢測本發明多肽或聚核苷酸的存在的方法，把在該細胞中之本發明多肽或聚核苷酸的表現量進行評價之際，與未使試驗化合物接觸的細胞相比較，在使試驗化合物接觸過的細胞中，本發明多肽或聚核苷酸的表現量在統計學上有意義地降低之際，能夠判斷為本發明多肽或聚核苷酸的表現受到抑制。
又，在「本發明多肽的表現及/或活性、或本發明之聚核苷酸的表現受到抑」之中，所謂「本發明多肽的活性受到抑制」，例如是與未使試驗化合物接觸的情況相比較，使用本發明多肽、或有表現本發明多肽的細胞，使試驗化合物接觸過的情況，酪胺酸磷酸化的比例在統計學上有意義地降低之際，可判斷為本發明多肽的活性受到抑制。
又，與不使試驗化合物接觸的情況相比較，使用有表現本發明多肽的細胞，在使接觸過試驗化合物的情況，在細胞增生是在統計學上有意義地受到抑制之際，可判斷為本發明多肽的活性受到抑制。
在本發明中，所謂「酪胺酸磷酸化」，不單只是RET蛋白質(亦包含與其他蛋白質融合在一起的RET蛋白質)的酪胺酸磷酸化，亦包含RET下游訊號上蛋白質的酪胺酸磷酸化。作為RET下游訊號上的蛋白質，例如，可舉：STAT、AKT、ERK。較佳為RET蛋白質(亦包含與其他蛋白質融合在一起的RET蛋白質)的酪胺酸磷酸化。
又，「酪胺酸磷酸化的比例」，例如能夠使用磷酸化RET專一性抗體，並藉由西方印漬術(Western blotting)、免疫沉澱、免疫組織化學、ELISA、流動式細胞測量術(flow cytometry)而測定。
在本發明中，所謂「試料」，不單是生物試料(例如：細胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、尿)，亦包含可從該等生物試料獲得的核酸萃取物(基因組DNA萃取物、mRNA萃取物、從mRNA萃取物所調製出的cDNA調製物及cRNA調製物等)及蛋白質萃取物。又，前述試料亦可為施行過福馬林固定處理、醇固定處理、凍結處理或石蠟包埋處理者。作為前述生物試料可使用收取自生物者。較佳為來自癌症患者的試料，更佳為包含腫瘤細胞的試料。又，生物試料的收取方法能夠因應生物試料的種類而適宜選擇。
在本發明而言包含檢測試料中本發明多肽的存在的方法。
在本發明中，檢測試料中本發明多肽的存在的方法，可舉藉由以下通常慣用的檢測法來進行檢測的方法：使用有專一性地結合於本發明多肽的抗體的ELISA法、西方印漬術法、或免疫組織化學染色法、或使用有專一性地結合於DCTN1蛋白質的抗體及專一性地結合於RET蛋白質的抗體的FRET(螢光共振能量轉移，Fluorescence Reasonance Energy Transfer)法等。較佳為：使用有專一性地結合於本發明多肽的抗體的ELISA法、西方印漬術法，或免疫組織化學染色法。
就專一性地結合於DCTN1蛋白質的抗體及專一性地結合於RET蛋白質的抗體而言，較佳為：結合於從DCTN1蛋白質之前述融合點之N末端部分的抗體及結合於從RET蛋白質之前述融合點之C末端部分的抗體，該等抗體能使用市售品，或能以通常公知的方法來製作。
在本發明中，作為檢測試料中本發明多肽的存在的方法，較佳為一種檢測本發明多肽的存在的方法，其特徵在於包含下述步驟：使用專一性地結合於本發明多肽的抗體或專一性地結合於DCTN1蛋白質的抗體及專一性地結合於RET蛋白質的抗體而檢測本發明多肽的步驟；更佳為一種檢測本發明多肽的存在的方法，其特徵在於包含下述步驟：使用專一性地結合於本發明多肽的抗體而檢測本發明多肽。因此，作為用以檢測本發明多肽的存在的手段，未被特別限定，例如，可舉：專一性地結合於DCTN1蛋白質的抗體及專一性地結合於RET蛋白質的抗體的組合；專一性地結合於本發明多肽的抗體等。
在本發明而言，包含：用以檢測試料中之本發明聚核苷酸的存在的引子或探針。在本發明中，作為用以檢測本發明多肽的存在的手段未被特別限定，例如，可舉：用以檢測本發明聚核苷酸的存在的引子或探針等。
作為該引子或探針，可舉選自(j)至(l)的聚核苷酸： (j)一聚核苷酸，其係選自於由下述構成之群組的至少1個探針：與編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸雜交的探針，及與編碼RET蛋白質的聚核苷酸雜交的探針。
(k)一聚核苷酸，其係雜交於編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點之探針。
(l)一聚核苷酸，其係正意引子與反意引子的組，且係設計成夾入編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點。
在本發明中，「編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸與編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點」中所謂的「融合點」是意味：編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸與編碼RET蛋白質的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號1中之融合點是：在序列編號1中第1-3699號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號1中第3700-4905號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號3中之融合點是：在序列編號3中第1-3699號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號3中第3700-4779號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號5中之融合點是：在序列編號5中第1-3297號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號5中第3298-4503號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號7中之融合點是：在序列編號7中第1-3297號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號7中第3298-4377號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號9中之融合點是：在序列編號9中第1-3624號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號9中第3625-4830號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號11中之融合點是：在序列編號11中第1-3624號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號11中第3625-4704號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號13中之融合點是：在序列編號13中第1-3282號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號13中第3283-4488號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號15中之融合點是：在序列編號15中第1-3282號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號15中第3283-4362號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號17中之融合點是：在序列編號17中第1-3573號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號17中第3574-4779號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號19中之融合點是：在序列編號19中第1-3573號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號19中第3574-4653號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號21中之融合點是：在序列編號21中第1-3678號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號21中第3679-4884號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。在序列編號23中之融合點是：在序列編號23中第1-3678號之具有來自編碼DCTN1的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸，與在序列編號23中第3679-4758號之具有來自編碼RET的聚核苷酸之鹼基序列的聚核苷酸融合而成的點。
在本發明中，引子或探針是基於本發明聚核苷酸的序列資訊，藉由通常公知的手法來製作作為會與本發明之聚核苷酸專一性地雜交的聚核苷酸。該引子或探針的鹼基數為10至50鹼基，較佳為15至50鹼基，更佳為18至35鹼基。
該引子或探針是會與本發明聚核苷酸專一性地雜交者，則不需是完全的互補的。這樣的引子或探針，與對應的鹼基序列相比較是具有70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，更佳為95%以上，更佳為98%以上同一性的聚核苷酸。
作為本發明之引子或探針，較佳為(i)序列編號69、(ii)序列編號70，或(iii)序列編號71所示之聚核苷酸；更佳為(iv)一聚核苷酸，其係序列編號69與序列編號70所示之正意引子與反意引子的組；更佳為(v)一聚核苷酸，其係序列編號69、序列編號70及序列編號71所示之正意引子、反意引子及探針的組。
在本發明而言包含檢測試料中之本發明聚核苷酸的存在的方法。
在本發明中，檢測試料中之本發明聚核苷酸的存在的方法，是藉由以下通常慣用的檢測法而進行檢測的方法：北方印漬術法(northern blotting method)、南方印漬術法、RT-PCR法、即時PCR法、數位PCR(digital PCR)法、DNA微陣列法、原位雜交法、序列分析法(sequence analysis method)等。
在本發明中，檢測試料中之本發明聚核苷酸的存在的方法，亦包含用以檢測下述聚核苷酸的存在的方法：含有本發明聚核苷酸之RET融合基因的聚核苷酸。作為該方法，可舉：使用會雜交於編碼RET蛋白質的聚核苷酸的引子(例如，會雜交於RET激酶結構域以後的3'側序列的引子)，並把藉由5'RACE法而使放大過的PCR產物進行序列分析(sequence analysis)的方法等。
在本發明中，作為檢測試料中之本發明聚核苷酸的存在的方法，較佳為係一種檢測本發明聚核苷酸的存在的方法，其特徵在於包含下述步驟：使用本發明引子或探針而檢測本發明聚核苷酸的步驟。
在本發明而言包含一種DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物，其以抑制RET的化合物作為有效成分。
更佳是包含一種DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物，其以抑制本發明多肽的表現及/或活性，或抑制本發明聚核苷酸的表現的化合物作為有效成分。
在本發明中，在「DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症」中所謂「DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性的癌症」，是有表現本發明聚核苷酸的癌症，較佳為使用檢測本發明聚核苷酸的存在的方法，而檢測出本發明聚核苷酸的癌症。
又，在本發明中，在「DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症」中所謂「DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症」，是有表現本發明多肽的癌症，較佳為使用檢測本發明多肽的存在的方法，而檢測出本發明多肽的癌症。
作為本發明之癌症治療用醫藥組成物中的有效成分，是會抑制RET的化合物，更佳為會抑制本發明多肽的表現及/或活性，或抑制本發明聚核苷酸的表現的化合物。又，可把藉由本發明篩選方法而選擇出的化合物作為有效成分使用。例如，能夠把公知會抑制RET的化合物作為在本發明之醫藥組成物中的有效成分來使用。作為抑制RET的化合物，是能夠抑制RET的表現及/或活性的化合物的話，亦可為其他會抑制酪胺酸激酶的表現及/或活性的化合物，更佳為能夠抑制RET的活性的化合物，且亦可為其他會抑制酪胺酸激酶的表現及/或活性的化合物。作為這樣的化合物，例如，可舉：凡德他尼(Vandetanib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、莫特塞尼(Motesanib)、卡博替尼(Cabozantinib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、記載於國際公開第2016/127074號說明書、國際公開第2017/043550號說明書、國際公開第2017/011776號說明書、國際公開第2017/146116號說明書的化合物。 作為DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物的有效性成分，是會抑制RET的化合物，更佳為凡德他尼、卡博替尼、樂伐替尼、記載於國際公開第2017/043550號說明書之通式(1)所示之稠合嘧啶化合物或記載於國際公開第2017/146116號說明書之通式(1)所示之稠合嘧啶化合物，更佳為凡德他尼、卡博替尼、樂伐替尼、記載於國際公開第2017/043550號說明書之實施例化合物1至90或記載於國際公開第2017/146116號說明書之實施例化合物1至207，進一步較佳為凡德他尼、卡博替尼、樂伐替尼、4-胺基-1-(三級丁基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-甲醯胺、4-胺基-7-(三級丁基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-7-(1-氟-2-甲基丙烷-2-基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7-(1-甲基環丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-7-(2-環丙基丙烷-2-基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-(3-[]啉基丙-1-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-((四氫-2H-吡喃-4-基)乙炔基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、(R)-4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-((四氫呋喃-2-基)甲氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺或4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-7-(1-甲基環丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺，特佳為4-胺基-1-(三級丁基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-甲醯胺、4-胺基-7-(三級丁基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-7-(1-氟-2-甲基丙烷-2-基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7-(1-甲基環丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-7-(2-環丙基丙烷-2-基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-(3-[]啉基丙-1-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-((四氫-2H-吡喃-4-基)乙炔基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺、(R)-4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-7-(1-甲基環丙基)-6-((四氫呋喃-2-基)甲氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺或4-胺基-N-[4-(甲氧基甲基)苯基]-6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-7-(1-甲基環丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醯胺。
在本發明中，在「能夠抑制RET的表現及/或活性的化合物」之中，所謂「能夠抑制RET的表現」，例如是使試驗化合物接觸於有表現RET的多肽及/或聚核苷酸的細胞後，檢測了在該細胞中RET的多肽或聚核苷酸的表現量之際，與未使試驗化合物接觸的細胞相比較，在使接觸過試驗化合物的細胞中，RET的多肽或聚核苷酸的表現量降低之際，能夠判斷為RET的表現受到抑制。作為這樣的化合物，可舉：如前述般的化合物、siRNA、miRNA、核酸(DNA、RNA)適配體等。作為siRNA，例如，可舉：CACAUGUCAUCAAAUUGUATT(序列編號74)、GGAUUGAAAACAAACUCUATT(序列編號75)、GCUUGUCCCGAGAUGUUUATT(序列編號76)，較佳為CACAUGUCAUCAAAUUGUATT(序列編號74)或GGAUUGAAAACAAACUCUATT(序列編號75)。
又，在「能夠抑制RET的表現及/或活性的化合物」之中，所謂「能夠抑制RET的活性」，例如，能夠以酪胺酸磷酸化作為指標而進行判斷。作為測定酪胺酸磷酸化的方法，例如，可舉：記載於國際公開第2017/043550號說明書之試驗例1的方法。
又，使用有表現RET的多肽及/或聚核苷酸的細胞，以細胞增生抑制效果作為指標，而能夠判斷「能夠抑制RET的活性」。細胞增生抑制效果，例如，可舉：記載於國際公開第2017/043550號說明書的試驗例3及試驗例4的方法。
成為本發明醫藥組成物對象的癌症，只要是有表現本發明聚核苷酸及/或多肽則未被特別限制，例如，可舉：頭頸部癌(Head and Neck cancer)、甲狀腺癌、消化器癌(食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臟癌、膽道癌(膽囊/膽管癌等)、胰臟癌、小腸癌、大腸癌(結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌等)、胃腸道間質瘤(Gastrointestinal stromal tumor)等)、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、乳癌、卵巢癌、子宮癌(子宮頸癌、子宮體癌(endometrial cancer)等)、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌等，較佳為甲狀腺癌，或肺癌(非小細胞肺癌，小細胞肺癌)。再者，於此處，在癌症來說不僅是原發灶，亦包含已經轉移到其他臟器(肝臟等)的癌症。
以抑制本發明多肽的表現及/或活性，或抑制本發明聚核苷酸的表現的化合物作為有效成分的製劑，能夠摻合藥學上的載體，並且作成因應種種投藥形態的醫藥組成物而製造。作為該形態，例如，可舉：口服劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、貼劑。該等投藥形態能夠藉由每個該技術領域之人士公知慣用的製劑方法而製造。
作為藥學上的載體，可使用作為製劑原料慣用的各種有機或無機載體物質，在固形製劑中作為賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、塗覆劑等而被摻合；在液狀製劑中作為溶劑、助溶劑、懸浮劑、張力劑、pH調節劑/緩衝劑、無痛化劑等而被摻合。又，因應需要亦可使用：防腐劑、抗氧化劑、著色劑、矯味/矯臭劑、穩定化劑等製劑添加物。
當調製口服用固形製劑時，可在本發明化合物添加了賦形劑，並因應需要添加了賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味/矯臭劑等之後，依常法而製造錠劑、包覆錠劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等。
當調製口服用液體製劑時，可在本發明化合物添加pH調節劑/緩衝劑、穩定化劑、矯味/矯臭劑等並依常法製造內服液劑、糖漿劑、酏劑等。
當調製注射劑時，可在本發明化合物添加pH調節劑/緩衝劑、穩定化劑、張力劑、局部麻醉劑等，並依常法製造皮下、肌肉內及靜脈內注射劑。
在本發明而言包含下述判定方法：在用以檢測本發明多肽的方法或用以檢測本發明聚核苷酸的方法中，當檢測到試料中之本發明多肽或本發明聚核苷酸的存在的情況，則判定為罹癌的方法。作為可依本發明判定的癌症，可舉：作為會成為本發明醫藥組成物之對象的癌症而列挙出者等。如上述般，可藉由使用本發明多肽或聚核苷酸，進行癌症的判定。因此，本發明多肽、聚核苷酸，亦能夠使用來作為用以檢測癌症的生物標記物。
本發明包含一種判定方法，其係將本發明之多肽或本發明之聚核苷酸，設為使用有會抑制RET之化合物的化學療法是否有效的指標的方法，當藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明之多肽的情況，及/或藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明之聚核苷酸的存在的情況，則判定使用有會抑制RET之化合物的化學療法是有效的。
本發明更佳為包含一種判定方法，其係將本發明之多肽或本發明之聚核苷酸，設為使用有會抑制本發明多肽的表現及/或活性，或本發明聚核苷酸的表現之化合物的化學療法是否有效的指標的方法，當藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明多肽的情況，及/或藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明聚核苷酸的存在的情況，則判定使用有會抑制本發明多肽的表現及/或活性，或本發明聚核苷酸的表現之化合物的化學療法是有效的。
本發明更佳為包含一種判定方法，其係將本發明之多肽或本發明之聚核苷酸，設為使用有利用本發明篩選方法所獲得之化合物的化學療法是否有效的指標的方法，當藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明多肽的情況，及/或藉由本發明之檢測方法，從試料中檢測出本發明聚核苷酸的存在的情況，則判定使用有利用本發明之篩選方法所獲得之化合物的化學療法是有效的。
以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並非受該等實施例所限定。 [實施例]
實施例1 DCTN1基因與RET基因的融合基因(DCTN1-RET融合基因)的取得 ＜1-1萃取來源於臨床檢體的RNA＞ 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)藉由以下方法從購入自Asterand Bioscience之人類甲狀腺癌組織萃取出RNA。對甲狀腺癌組織添加600μL的緩衝液 RLT(Buffer RLT)，並上樣至QIAshredder旋轉管柱之後進行離心(16,000 rpm、2分、室溫)，並回收了濾液。於回收的濾液加入同量的70%乙醇水溶液並進行了混合之後，上樣至RNeasy Mini管柱並進行了離心 (10,000 rpm、15秒、室溫)。在RNeasy Mini管柱添加700μL的緩衝液 RW1(Buffer RW1)並進行了離心 (10,000 rpm、15秒、室溫)。進一步加入500μL的緩衝液 RPE(buffer RPE)並進行了離心(10,000 rpm、15秒、室溫)。同樣地再度加入500μL的緩衝液 RPE(buffer RPE)並進行了離心(10,000 rpm、2分、室溫)。再度將RNeasy Mini管柱進行離心(16,000 rpm、1分、室溫)，除去了留滯的緩衝液(buffer)。將40μL的無RNase的水(RNase free water)上樣至RNeasy Mini管柱之後，進行離心(10,000 rpm、1分、室溫)，回收濾液作為總RNA(total RNA)。
＜1-2製作來源於臨床檢體的cDNA＞ 使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(invitorgen)藉由以下方法，從在上述1-1所獲得之總RNA，合成了cDNA。利用無RNAse的水(RNAse free water)調製500ng的總RNA使得容量成為14μL，並加入4μL的5× VILO反應混合物(VILO Reaction Mix)及2μL的10× SuperScript酶混合物(SuperScript Enzyme Mix)並進行了混合。在25℃下保溫10分鐘，其後在42℃下保溫60分。為了使反應停止，最後在85℃下培育5分鐘，獲得了cDNA。
＜1-3製作及精製選殖載體＞ 為了使DCTN1-RET融合基因放大，如表1所示般，設計引子1(Primer1)(序列編號33)作為正意引子，並設計引子2(序列編號34)作為反意引子，進一步設計引子3(序列編號35)作為使用於巢式PCR(nested PCR)的正意引子與設計引子4(序列編號36)作為使用於巢式PCR的反意引子。
[表1]
使用該等引子並將在上述1-2合成出的cDNA作為模板，並使用KOD -Plus- Neo(TOYOBO)利用以下方法使DCTN1-RET融合基因進行了放大。混合下述：2μL的cDNA、5μL的10× 用於KOD -Plus- Neo的PCR緩衝液(PCR Buffer for KOD -Plus- Neo)、5μL的2mM dNTPs、3μL的25mM MgSO4 、1μL的KOD -Plus- Neo、1.5μL的引子1(10μM)、1.5μL的引子2(10μM)，及31μL的再蒸餾水(double distilled water)(DDW)，並進行了PCR。接著將所獲得之PCR產物稀釋為100倍，並混合了下述：2μL之經稀釋的PCR產物、5μL的10×用於KOD -Plus- Neo的PCR緩衝液、5μL的2mM dNTPs、3μL的25mM MgSO4 、1μL的KOD -Plus- Neo、1.5μL的引子3(10μM)、1.5μL的引子4(10μM)及31μL的DDW，進行了巢式PCR(nested PCR)。
藉由使用了1%瓊脂糖凝膠(Nacalai)的電泳而分離巢式PCR產物，並使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)，從凝膠精製出PCR產物。
混合下述：已利用限制酶SmaI(NEB)切斷而得之pUC18 DNA(Takara Bio)與已精製過的PCR產物、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase)(NEB)、T4 DNA 連接酶反應緩衝液(T4　DNA　Ligase　Reaction　Buffer)(NEB)，並在16℃下過夜培育。利用SmaI(NEB)來處理連接產物(Ligation産物)，利用以下方法來進行了對勝任細胞的轉形(transformation)。在50μL的E.coli DH5α 勝任細胞(E.coli DH5α Competent Cells)(Takara Bio)加入經SmaI處理過的連接產物，並靜置於冰上30分。其後在42℃下施加30秒鐘熱震，並靜置於冰上2分鐘。加入SOC培養基(Takara Bio)，並在37℃下進行了1小時振盪培養之後，將培養液塗布至含有安比西林的LB寒天培養基平板(UNITECH)，在37℃下靜置過夜。將大腸菌菌落懸浮於含有安比西林的LB培養基(InvivoGen)，並在37℃下過夜振盪培養。使用QIAquick Spin Miniprep Kit(Qiagen)從增生的大腸菌，準據所附的方案精製出已組入DCTN1-RET融合基因的質體DNA。
＜1-4確定序列＞ 將上述1-3所獲得之質體DNA設為模板，並使用表2所示之定序用引子引子5至引子36，使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行定序反應，並使用Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer來實施了序列分析。序列分析的結果，DCTN1-RET融合基因是在DCTN1變體 5(GenBank登錄編號：NM_001190836)的外顯子1至外顯子27的3'側下游融合有RET 變體 2(RET variant 2)(GenBank登錄編號：NM_020975)的外顯子12至外顯子20而成的基因(序列編號17)。
[表2]
實施例2 檢測DCTN1-RET融合基因 使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (invitorgen)，從購入自Asterand Bioscience之人類正常甲狀腺組織來源的RNA與在前述1-1所獲得之人類甲狀腺癌組織來源的RNA，藉由以下方法合成了cDNA。利用無RNAse的水來調製280ng的總RNA使得容量成為14μL並分別加入4μL的5× VILO 反應混合物(5× VILO Reaction Mix)、2μL的10× SuperScript 酶混合物(10× SuperScript Enzyme Mix)並進行了混合。在25℃下保溫10分鐘，其後在42℃下保溫60分。為了使反應停止，在最後在85℃下培育5分鐘。
為了檢測DCTN1-RET融合基因，如表3所示，設計引子37(序列編號69)作為DCTN-RET融合基因檢測用正意引子與設計引子38(序列編號70)作為DCTN-RET融合基因檢測用反意引子，並且設計引子39(序列編號71)作為DCTN1-RET融合基因檢測用探針(探針是TaqMan MGB探針，蛍光色素是FAM(Thermo Fisher Scientific))。
[表3]
所獲得之cDNA進行10倍稀釋並將1.1μL使用來作為模板，並使下述混合：11μL的用於探針的ddPCR Supermix(ddPCR Supermix for probe)(Bio-Rad)、2μL的引子37(10μM)、2μL的引子38(10μM)、0.6μL的引子39(10μM)、1.1μL之檢測GAPDH的20× HEX assay(PrimePCR ddPCR Expression Probe Assay：GAPDH，Human，Bio-Rad)，並利用Automated Droplet Generator(Bio-Rad)製作了小滴(droplet)。使用製作出的小滴來進行PCR，利用Droplet Reader(Bio-Rad)來計數了DCTN1-RET及GAPDH陽性的小滴。將結果顯示於圖1及圖2。
又，將在上述合成出的cDNA設為模板，使用KOD -Plus- Neo(TOYOBO)並利用以下方法使DCTN1-RET融合基因進行了放大。混合下述：2μL的cDNA、5μL的10× 用於KOD -Plus- Neo的PCR 緩衝液、5μL的2mM dNTPs、3μL的25mM MgSO4 、1μL的KOD -Plus- Neo、1.5μL的引子1(10μM)、1.5μL的引子2(10μM)，及31μL的DDW，並進行了PCR。接著將所獲得之PCR產物稀釋為100倍，並混合下述：2μL的經稀釋過的PCR產物、5μL的10×用於KOD -Plus- Neo的PCR 緩衝液、5μL的2mM dNTPs、3μL的25mM MgSO4 、1μL的KOD -Plus- Neo，1.5μL的引子3(10μM)、1.5μL的引子4(10μM)及31μL的DDW，進行了巢式PCR。藉由使用有1%瓊脂糖凝膠(Nacalai)的電泳將巢式PCR產物予以分離，並進行了攝影。將結果顯示於圖3。
如圖1、圖2及圖3所示般，從人類甲狀腺癌組織來源的RNA合成出的cDNA來說，被檢測出DCTN1-RET融合基因，相對於此，從人類正常甲狀腺組織來源的RNA合成出的cDNA而言，未檢測出DCTN1-RET融合基因。從以上結果，顯示出DCTN1-RET融合基因作為癌症生物標記物是有用的。
實施例3 構建DCTN1-RET融合基因之表現載體 為了構建表現載體，如表4所示般，設計了引子40(序列編號72)作為正意引子並設計引子41(序列編號73)作為反意引子。
[表4]
使用該等引子並以上述1-2合成出的cDNA作為模板，使用Prime STAR Max DNA 聚合酶(Prime STAR Max DNA Polymerase)(TaKaRa)利用以下方法使DCTN1-RET融合基因進行了放大。混合下述：1μL的cDNA、25μL的2× Prime STAR Max DNA 聚合酶(2× Prime STAR Max DNA Polymerase)、1μL的引子40(10μM)、1μL的引子41(10μM)、及22μL的再蒸餾水(DDW)，進行了PCR。藉由使用了1%瓊脂糖凝膠(Nacalai)的電泳將所獲得之產物PCR產物予以分離，並使用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GE Healthcare)，從凝膠精製了PCR產物。接著將所獲得之精製PCR產物，使用Gateway BP Clonase II酶混合物(Gateway BP Clonase II Enzyme　mix)(ThermoFisher)並利用以下方法組入至Gateway pDONR221 Vector，製作出入門載體(entry vector)。具體而言，混合下述：5.0μL的精製PCR產物、3.5μL的pDONR221(85ng/μL)、4.0μL的BP Clonase II酶混合物、7.5μL的TE，並在25℃下培育了90分鐘。在培育後添加1μL的蛋白酶 K(Proteinase K)(2mg/mL)，並在37℃下培育10分鐘，藉此獲得了入門載體。
將所獲得之入門載體加入至50μL的E.coli DH5α Competent Cells(Takara Bio)，並靜置於冰上30分。其後在37℃下施加20秒鐘熱震，並靜置於冰上2分鐘。添加SOC培養基(Takara Bio)，並在37℃下進行1小時振盪培養之後，將培養液塗布至含有康黴素(kanamycin)的LB寒天培養基平板，並在37℃下靜置過夜。將大腸菌菌落懸浮於含有康黴素的LB培養基，並在37℃下過夜振盪培養。利用DNA自動分離裝置 GENE PREP STAR PI-480(Kurabo)，從已增生的大腸菌精製出組入有DCTN1-RET融合基因的質體DNA(入門載體純系(entry vector clone))。
使用所獲得之質體與Gateway LR Clonase II 酶混合物(ThermoFisher)，利用以下方法，將DCTN1-RET融合基因組入至pJTI Fast DEST載體(pJTI Fast DEST vector)，作成了表現載體。混合下述：150ng的入門載體純系、1μL的pJTI Fast DEST載體(150ng/μL)、2μL的LR Clonase II 酶混合物，以及TE 緩衝液(TE buffer)，並將總量作成10μL，並在25℃下培育了90分鐘。在培育後添加1μL的蛋白酶 K(2mg/mL)，在37℃下培育10分鐘，藉此獲得了組入有DCTN1-RET融合基因的pJTI Fast DEST載體(DCTN1-RET融合基因表現載體)。將所獲得之DCTN1-RET融合基因表現載體加入50μL的E.coli DH5α Competent Cells(Takara Bio)並靜置於冰上30分。其後在37℃下施加熱震20秒鐘，靜置於冰上2分鐘。添加SOC培養基(Takara Bio)，並在37℃下進行1小時振盪培養之後，將培養液塗布至含有安比西林的LB寒天培養基平板，並在37℃下靜置過夜。將大腸菌菌落懸浮於含有安比西林的LB培養基並在37℃下振盪培養過夜。使用plasmid plus Maxi kit(QIAGEN)，從已增生的大腸菌，精製出組入有DCTN1-RET融合基因的質體DNA(DCTN1-RET融合基因表現載體)。
實施例4 建立表現DCTN1-RET融合基因的細胞 ＜4-1 建立細胞＞ 選擇小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞(American Type Culture Collection)作為用以建立表現DCTN1-RET融合基因的細胞的宿主細胞，並且透過把利用上述製作出之組入有DCTN1-RET融合基因的表現載體進行轉染，而建立了表現DCTN1-RET融合基因的細胞。詳細的方法是如以下所示般地實施。為了一般的培養(2維培養)，NIH/3T3細胞是使用了：把在D-MEM(高葡萄糖)(含有L-麩醯胺(L-glutamine)、酚紅、丙酮酸鈉、1500mg/L碳酸氫鈉)(WAKO)以使得成為10%的方式，添加有新生小牛血清(Newborn Calf Serum)(NBCS)(GIBCO)而得者，將其使用來作為2維培養用的培養基，以37℃、5%CO2 進行培養而得者。在進行轉染前一天，以1.5×105 cells/2mL將NIH/3T3細胞播種於6孔盤(6well plate)(IWAKI)，並以37℃、5%CO2 過夜培育。在已混合1.5μg的DCTN1-RET融合基因表現載體、1.5μg的pJTI phiC31 integrase vector而得的混合液，添加了該混合液6倍量的ViaFect Transfection Reagent之後，添加Opti-MEM使得總量成為300μL，並在室溫下培育5分鐘，藉此製作出轉染溶液。從被播種有NIH/3T3細胞的孔(well)除去300μL培養基，並添加300μL上述製作出的轉染溶液，以37℃、5%CO2 過夜培育。次日，為了除去轉染溶液，更換了培養基。在更換培養基之際，在新的培養基來說，是添加潮黴素B(Nacalai Tesque)使得成為500μg/mL。藉由潮黴素B除去了未導入已導入DCTN1-RET融合基因的表現載體的細胞。 轉染後，1週進行2次左右的培養基更換，邊進行培養直至細胞增生。轉染22日後，利用胰蛋白酶回收細胞，並利用以下方法進行了單細胞選殖。測定回收之細胞的細胞數，添加培養基使得成為1cell/200μL。以成為200μL/1孔(μL/1well)的方式將細胞播種至96孔盤(ThermoFisher)。播種後，每日進行觀察，取得從單細胞(single cell)增生而來的而來的細胞，令為表現DCTN1-RET融合基因的細胞(表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞)。
＜4-2確認目標蛋白質的表現＞ 利用西方印漬術法來確認在所獲得之表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中DCTN1-RET融合蛋白質的表現。即，從培養燒瓶除去培養基，利用PBS洗淨1次。在培養燒瓶內添加含有磷酸酶抑製劑(Phosphatase inhibitor)(Roche)與蛋白酶抑製劑(Protease inhibitor)(Roche)的Sample Diluent Concentrate 2(R＆D SYSTEMS)，利用刮刀來回收了細胞溶解液。藉由離心分離，從回收之細胞溶解液，獲得了蛋白質樣品。蛋白質樣品是進行蛋白質定量，並使蛋白質濃度固定。對固定濃度的蛋白質樣品，添加用於SDS-PAGE之含還原試劑的緩衝液樣品(6x)(Sample　Buffer　Solution　with　Reducing　Reagent (6x) for SDS-PAGE) (Nacalai Tesque)，並在95℃下培育5分鐘，藉此使蛋白質變性，並獲得了西方印漬術用的樣品。再者，使用為親株之NIH/3T3細胞作為負控制用樣品，利用同樣的方法獲了西方印漬術用的樣品。使用上述樣品並以以下所示方法，確認了蛋白質的表現。使用4-15%丙烯醯胺凝膠(Acrylamide gel)(BIO―RAD)及1×Tris/甘胺酸/SDS緩衝液(1×Tris/Glycine/SDS Buffer)，利用SDS-PAGE電泳(以200V30分)來分離了蛋白質。使用Trans-Blot Turb RTA Midi PVDF Transfer Kit(BIO―RAD)與Transblot Turbo 轉印系统(BIO―RAD)將蛋白質轉印至PVDF膜，將PVDF膜浸漬於Blocking One-P中1小時。利用經以TBS-T稀釋使得Blocking One-P成為10%而得的溶液將一次抗體(Phospho-Ret (Tyr905) Antibody(CST)、Ret (C31B4) Rabbit mAb(CST)及Anti-Dctn1 Antibody(ATLAS ANTIBODIES))稀釋成為1/1000濃度，並浸漬PVDF膜，在4℃下過夜培育。利用TBS-T進行洗淨後，利用TBS-T稀釋Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody(CST)使得成為1/2000濃度而得之2次抗體稀釋液，使PVDF膜浸漬於其中，並在室溫下培育1小時。利用TBS-T洗淨後，使用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(ThermoFisher)及Lumino/影像分析儀(lumino image　analyzer)Amersham Imager 600(GE healthcare)來進行了蛋白質的檢測。再者，檢測蛋白質的分子量是透過Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards(BIORAD)而確認。 其結果，如圖4a)及b)所示般，當使用抗pRET抗體與抗RET抗體時，未檢測出內源性的RET(150及175kDa)。另一方面，只有在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中，可在175kDa附近確認到被推測為DCTN1-RET融合蛋白質的條帶。 又，如圖4c)所示般，當使用了抗DCTN1抗體時，在150kDa附近檢測出內源性的DCTN1。另一方面，只有在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中，在內源性之150kDa的DCTN1條帶之上的175kDa附近檢測到條帶。即，因為只有在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中，利用針對RET的抗體及針對DCTN1的抗體兩者檢測到175kDa附近的條帶，因而已經清楚的是在作成的表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞來說，有表現DCTN1與RET經融合的蛋白質。
實施例5 確認表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞透過三維培養的增生 NIH/3T3細胞雖在2維培養條件是顯示良好的增生，但在三維培養條件是幾乎不增生。在另一方面，已知藉由使NIH/3T3細胞表現癌症基因，即使在三維培養條件亦會增生。利用該性質，進行了DCTN1-RET融合基因是否為癌症基因的確認。利用胰蛋白酶回收：以37℃、5%CO2 ，在2維培養培養出的表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞及NIH/3T3細胞，並測定了細胞數。為了進行三維培養，使用FCeM series Preparation kit(日產化學工業股份有限公司)與D-MEM(高葡萄糖)(含有L-麩醯胺、酚紅、丙酮酸鈉、1500mg/L碳酸氫鈉)(WAKO)與新生小牛血清(NBCS)(GIBCO)而製作出三維培養用的培養基。以成為1000cells/90μL的方式將細胞懸浮於製作出之三維培養用的培養基，以成為90μL/1孔的方式播種至96 Well Clear Black Round Bottom,Spheroid Microplate(Corning)，並以37℃、5%CO2 進行了培育。在播種次日(Day1)及播種8日後(Day8)使用為細胞內ATP發光檢測試劑的Celltiter-Glo 2.0Reagent(Progema)及光度計(EnSpire, PerkinElmer)而測定發光量(counts per second：cps)並作為活細胞數的指標。從Day1的測定結果與Day8的測定結果算出了各細胞的增生率(N=3)。 其結果，如圖5所示般，在NIH/3T3細胞，與Day1的細胞數相比較，Day8的細胞數是2.4倍，相對於此，在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞是20.9倍。又，確認到：NIH/3T3細胞是在三維培養不形成細胞的凝集塊，但在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞而言，是因三維培養而有形成細胞的凝集塊。 即，已經清楚的是，因導入DCTN1-RET融合基因而細胞的增生會亢進，暗示了DCTN1-RET融合基因是癌症基因。
實施例6 確認表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞在活體內的致腫瘤性 為了確認表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞在活體內的致腫瘤性，進行使用了裸鼠的移植實驗。再者，一般已知：親株的NIH/3T3細胞，在裸鼠的皮下不增生，但藉由把表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞移植至裸鼠的皮下，能夠確認：DCTN1-RET融合基因是否有助於致腫瘤性，即是否為癌症基因。使用了裸鼠(BALB/cAJcl-nu/nu，日本CLEA(CLEA Japan.Inc.))作為被移植動物。利用胰蛋白酶回收：表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞，並以使得最終會成為1×108 cells/mL的方式懸浮於PBS，添加同量的Matrigel基底膜基質(Corning)，並將作成為5×107 cells/mL者作為移植用細胞液。使用25G注射針與1mL注射器各移植0.1mL移植用細胞液至裸鼠(N=10)之右側胸部的皮下。使用電子游標卡尺(Mitutoyo)，在移植後、第10日、第13日、第17日，逐隻測定腫瘤的長軸及短軸，並使用以下之式算出了腫瘤體積。 腫瘤體積(mm3 )=(長軸，mm)×(短軸，mm)×(短軸，mm)/2 將腫瘤體積的測定結果顯示於圖6。其結果，確認：被移植至裸鼠的皮下之表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞是形成腫瘤，且良好地增生，在活體內實驗亦暗示DCTN1-RET融合基因是癌症基因。
實施例7 確認使用了表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞之基於siRNA所致之DCTN1-RET融合蛋白質的抑制與細胞增生抑制效果 確認了針對表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞之基於siRNA處理所致之影響。使用之siRNA是使用了下述表5所示之3種類的RET siRNA與作為負控制之Silencer Select Negative Control ＃1 siRNA(Ambion)。再者，3種類的RET siRNA皆是以人類RET為標靶的siRNA，但RET siRNA1及RET siRNA2是包含會結合於DCTN1-RET融合基因內RET部分的序列，RET siRNA3是不含會結合於DCTN1-RET融合基因內的序列。即，是想定：RET siRNA1及RET siRNA2是會抑制DCTN1-RET融合基因的表現，但RET siRNA3是不抑制DCTN1-RET融合基因的表現。於以下針對使用了siRNA之實驗的方法進行了記載。
[表5]
表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞是使用了：使用2維培養用的培養基並以37℃、5%CO2 進行培養而得者。在進行siRNA處理的前一天，以3×105 cells/2mL將各細胞播種至6孔盤(IWAKI)，並以37℃、5%CO2 進行過夜培育。混合下述：12μL在事前使用水而調製為20μM的各siRNA、4μL的Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent(ThermoFisher)及384μL的Opti-MEM，在室溫下進行15分培育，藉此製作出siRNA溶液。在播種有各細胞的孔(well)中添加400μL的siRNA溶液，並以37℃、5%CO2 進行過夜培育。 次日，一部分進行取樣用於蛋白質表現分析用，針對一部分是進行再播種用於確認細胞增生。蛋白質表現分析用的取樣及蛋白質表現分析，除了是使用Phospho-Ret (Tyr905) Antibody(CST)、Ret (C31B4) Rabbit mAb(CST)及GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb(CST)作為一次抗體以外，是以與上述＜4-2 確認目標蛋白質的表現＞同樣的方法來實施。該結果，如圖7所示般，與未進行siRNA處理的細胞(無處理)相比，在處理了負控制siRNA(NC)的細胞，可確認到DCTN1-RET融合蛋白質的表現是未受到抑制。另一方面，確認：處理了RET siRNA1及RET siRNA2的情況，表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的DCTN1-RET融合蛋白質之表現受到抑制，且已經清楚的是：RET siRNA3來說是不被抑制。 其次為了確認細胞增生抑制效果，藉由胰蛋白酶從無處理或受過siRNA處理的孔回收細胞，並測定了細胞數。以與上述實施例5同樣的方法進行三維培養，在播種當日(Day0)及播種4日後(Day4)利用與實施例5同樣的方法來測定了活細胞數。從Day0的測定結果與Day4的測定結果算出了在各細胞中的增生率。 該結果，如圖8所示般，在未處理siRNA的細胞(無處理)及處理過負控制siRNA(NC)的細胞而言，與Day0的細胞數相比較，Day4的細胞數是4.9倍及3.6倍，相對於此，在利用RET siRNA1及RET siRNA2處理過的細胞而言，是2.0倍及2.4倍左右的增生，增生率顯著地降低。另一方面，在利用RET siRNA3處理過的細胞來說，是3.7倍的增生，是與負控制siRNA相同程度的增生率，未見增生率的降低。從該等結果來看，已經清楚的是：在藉由siRNA抑制了RET表現的情況，表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的增生是亦受到抑制。
實施例8 使用了表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞之細胞增生抑制效果 進行了對於表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞之體外細胞增生試驗。以與上述實施例5同樣的方法，進行了三維培養及播種。播種後以37℃、5%CO2 進行了過夜培育(Day0)。利用二甲亞碸把被報告會抑制RET的卡博替尼、凡德他尼、艾樂替尼(Alectinib)、樂伐替尼、稠合嘧啶化合物(從化合物1至9；顯示於表6)溶解為10 mmol/L的濃度，並進一步使用三維培養用培養基，進行稀釋使得該等化合物的最終濃度分別成為1000、333、111、37.0、12.3、4.12、1.37、0.457nmol/L。將其各0.01mL添加至先前所述的被播種有細胞的平板的各孔(Day1)，並以37℃、5%CO2 進行7日培育。培養後(Day8)，把為細胞內ATP發光檢測試劑的Celltiter-Glo 2.0Reagent(Progema)添加至全部的孔，並使用光度計(EnSpire，PerkinElmer)來測定了發光量(counts per second：cps)。因應Tday8 與Cday1 之値的大小，藉由以下之式算出化合物之各濃度時自Day1起的增生率，並求出了抑制細胞增生50%之受試化合物的濃度(GI50 (nM))。 1)當Tday8 ≧Cday1 的情況 增生率(%)=(Tday8 -Cday1 )/(Cday8 -Cday1 )×100 T：添加了受試化合物之孔的cps C：無添加受試化合物之孔的cps Day1：添加了受試化合物之日 Day8：評價日 2)當Tday8 ＜Cday1 的情況 增生率(%)=(Tday8 -Cday1 )/(Cday1 )×100 T：添加了受試化合物之孔的cps C：無添加受試化合物之孔的cps Day1：添加了受試化合物之日 Day8：評價日
[表6]
如表7所示般，該結果在卡博替尼、凡德他尼、樂伐替尼及稠合嘧啶化合物(從化合物1至9)而言，表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的增生受到抑制。
[表7]
從以上結果，暗示了以下之可能性：上述RET抑制劑，作為對於檢測出DCTN1-RET融合基因之癌症的治療藥是有用的。又，暗示了：藉由使用表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞，而篩選抑制DCTN1-RET的化合物是可能的。
實施例9 使用了表現DCTN1-RET融合基因的細胞之抑制RET的磷酸化 針對在表現DCTN1-RET融合基因的細胞中RET的磷酸化，是否會受被報告為會抑制RET之已有的藥劑所抑制，以以下方法進行了探討。 表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞，是使用了：使用2維培養用培養基，以37℃、5%CO2 進行培養而得者。在進行藥劑處理的前一天，將各細胞以3×105 cells/2mL播種至6孔盤(IWAKI)，並以37℃、5%CO2 進行了過夜培育。利用二甲亞碸將卡博替尼、凡德他尼、艾樂替尼、樂伐替尼溶解為10mmol/L的濃度，並進一步使用PBS進行稀釋使得該等化合物的最終濃度分別成為1000、100、10nmol/L。並其各20μL添加至先前所述的播種有細胞的平板的各孔(Day1)，並以37℃、5%CO2 進行了1小時培育。培育後，以與上述實施例7所記載之方法同樣的方法進行蛋白質表現分析用的取樣，實施了蛋白質表現分析。 如圖9所示，該結果確認到：較之卡博替尼及樂伐替尼，表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的磷酸化RET水平是顯著地減少。又，以與上述同樣的方法，使用稠合嘧啶化合物來評價抑制RET的磷酸化的結果，在稠合嘧啶化合物亦能夠確認到：RET的磷酸化是顯著地減少。 由以上結果，使磷酸化RET水平顯著地減少的藥劑，是能夠抑制表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞增生的化合物，且暗示了以下可能性：作為對於檢測出DCTN1-RET融合基因的癌症的治療藥是有用的。又，暗示了：藉由使用表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的磷酸化RET水平，是能夠進行RET抑制劑的篩選。 [序列表之非關鍵詞文字(Sequence Listing Free Text)]
序列編號1表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列是編碼DCTN1變體1(DCTN1 variant 1)(v1)[序列編號25的一部分]與RET變體2(v2)[序列編號31的一部分]的融合胜肽。 序列編號2表示DCTN1 v1與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號3表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v1與RET變體4(v4)[序列編號32的一部分]的融合胜肽。 序列編號4表示DCTN1 v1與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號5表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1變體2(v2)[序列編號26的一部分]與RET v2的融合胜肽。 序列編號6表示DCTN1 v2與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號7表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v2與RET v4的融合胜肽。 序列編號8表示DCTN1 v2與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號9表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1變體3(v3)[序列編號27的一部分]與RET v2的融合胜肽。 序列編號10表示DCTN1 v3與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號11表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v3與RET v4的融合胜肽。 序列編號12表示DCTN1 v3與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號13表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1變體4(v4)[序列編號28的一部分]與RET v2的融合胜肽。 序列編號14表示DCTN1 v4與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號15表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v4與RET v4的融合胜肽。 序列編號16表示DCTN1 v4與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號17表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1變體5(v5)[序列編號29的一部分]與RET v2的融合胜肽。 序列編號18表示DCTN1 v5與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號19表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v5與RET v4的融合胜肽。 序列編號20表示DCTN1 v5與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號21表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v6與RET v2的融合胜肽。 序列編號22表示DCTN1 v6與RET v2之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號23表示聚核苷酸的鹼基序列，該聚核苷酸的鹼基序列編碼DCTN1 v6與RET v4的融合胜肽。 序列編號24表示DCTN1 v6與RET v4之融合胜肽的胺基酸序列。 序列編號33是表示引子的鹼基序列。 序列編號34是表示引子的鹼基序列。 序列編號35是表示引子的鹼基序列。 序列編號36是表示引子的鹼基序列。 序列編號37是表示引子的鹼基序列。 序列編號38是表示引子的鹼基序列。 序列編號39是表示引子的鹼基序列。 序列編號40是表示引子的鹼基序列。 序列編號41是表示引子的鹼基序列。 序列編號42是表示引子的鹼基序列。 序列編號43是表示引子的鹼基序列。 序列編號44是表示引子的鹼基序列。 序列編號45是表示引子的鹼基序列。 序列編號46是表示引子的鹼基序列。 序列編號47是表示引子的鹼基序列。 序列編號48是表示引子的鹼基序列。 序列編號49是表示引子的鹼基序列。 序列編號50是表示引子的鹼基序列。 序列編號51是表示引子的鹼基序列。 序列編號52是表示引子的鹼基序列。 序列編號53是表示引子的鹼基序列。 序列編號54是表示引子的鹼基序列。 序列編號55是表示引子的鹼基序列。 序列編號56是表示引子的鹼基序列。 序列編號57是表示引子的鹼基序列。 序列編號58是表示引子的鹼基序列。 序列編號59是表示引子的鹼基序列。 序列編號60是表示引子的鹼基序列。 序列編號61是表示引子的鹼基序列。 序列編號62是表示引子的鹼基序列。 序列編號63是表示引子的鹼基序列。 序列編號64是表示引子的鹼基序列。 序列編號65是表示引子的鹼基序列。 序列編號66是表示引子的鹼基序列。 序列編號67是表示引子的鹼基序列。 序列編號68是表示引子的鹼基序列。 序列編號69是表示引子的鹼基序列。 序列編號70是表示引子的鹼基序列。 序列編號71是表示引子的鹼基序列。 序列編號72是表示引子的鹼基序列。 序列編號73是表示引子的鹼基序列。 序列編號74是表示RET siRNA的鹼基序列。 序列編號75是表示RET siRNA的鹼基序列。 序列編號76是表示RET siRNA的鹼基序列。 序列編號77是表示RET siRNA的鹼基序列。
圖1是確認使用了微滴式數位PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)之甲狀腺癌組織中DCTN1-RET融合基因及GAPDH的表現。 圖2是確認使用了微滴式數位PCR(ddPCR)之正常甲狀腺組織中DCTN1-RET融合基因及GAPDH的表現。 圖3是確認正常甲狀腺組織及甲狀腺癌組織中DCTN1-RET融合基因全長的表現。 圖4是確認在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中之DCTN1-RET融合蛋白質的表現。a)使用了抗磷酸化RET抗體之DCTN1-RET融合蛋白質的檢測，b)使用了抗RET抗體之DCTN1-RET融合蛋白質的檢測，c)使用了抗DCTN1抗體之DCTN1-RET融合蛋白質的檢測。 圖5確認在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞在三維培養的增生。N=3，平均＋SD。 圖6確認在活體內(in vivo)之表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞的致腫瘤性。 圖7確認在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中，基於RET siRNA進行之抑制磷酸化RET的表現。 圖8確認基於RET siRNA進行之增生抑制效果，其抑制表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞增生。 圖9確認在表現DCTN1-RET融合基因的NIH/3T3細胞中，基於會抑制RET之化合物進行的，抑制磷酸化RET的表現。

Claims (23)

  1. 一種多肽，其係DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起。
  2. 如請求項1之多肽，其選自以下(a)至(c)： (a)一多肽，其由以下所示胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24； (b)一多肽，其由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24； (c)一多肽，其由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性的胺基酸序列構成：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
  3. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1或2之多肽。
  4. 如請求項3之聚核苷酸，其選自以下(d)至(f)： (d)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24； (e)一聚核苷酸，其編碼由以下所示胺基酸序列中，經取代、刪除、或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24； (f)一聚核苷酸，其編碼由與以下所示胺基酸序列具有90%以上同一性之胺基酸序列構成的多肽：序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12、序列編號14、序列編號16、序列編號18、序列編號20、序列編號22，或序列編號24。
  5. 如請求項3之聚核苷酸，其選自以下(g)至(i)： (g)一聚核苷酸，其由以下所示鹼基序列構成：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23； (h)一聚核苷酸，其在嚴苛條件下，會與由和以下所示鹼基序列互補之鹼基序列構成的聚核苷酸進行雜交：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23； (i)一聚核苷酸，其與以下所示鹼基序列具有90%以上同一性：序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21，或序列編號23。
  6. 一種表現載體，包含如請求項3至5中任一項之聚核苷酸。
  7. 一種細胞，其已導入如請求項3至5中任一項之聚核苷酸。
  8. 一種抗體，其會專一性地結合於如請求項1或2之多肽。
  9. 一種檢測方法，其檢測試料中之如請求項1或2之多肽的存在。
  10. 一種引子或探針，其係用以檢測試料中之如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在，且該引子或探針係選自以下(j)至(l)的聚核苷酸： (j)一聚核苷酸，其係選自於由下述構成之群組的至少1個探針：與編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸雜交的探針，及與編碼RET蛋白質的聚核苷酸雜交的探針； (k)一聚核苷酸，其係雜交於編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點之探針； (l)一聚核苷酸，其係正意引子與反意引子的組，且係設計成夾入編碼DCTN1蛋白質的聚核苷酸和編碼RET蛋白質的聚核苷酸的融合點。
  11. 一種檢測方法，其檢測試料中之如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。
  12. 一種判定方法，在如請求項9或11之檢測方法中，當檢測到試料中之如請求項1或2之多肽或如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則判定為試料來源的患者罹癌。
  13. 一種DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症治療用醫藥組成物，其以抑制RET的化合物作為有效成分。
  14. 一種包含以下(1)及(2)之步驟之篩選化合物的方法，該化合物會抑制如請求項1或2之多肽的表現及/或活性，或抑制如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的表現： (1)接觸步驟：將試驗化合物接觸於如請求項1或2之多肽、有表現如請求項1或2之多肽或如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的細胞，或如請求項7的細胞； (2)測定步驟：測定在上述步驟(1)中，如請求項1或2之多肽的表現及/或活性、或如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的表現是否受到抑制，或測定上述步驟(1)記載之細胞的增生是否受到抑制。
  15. 一種判定方法，其係將如請求項1或2之多肽或如請求項3至5中任一項之聚核苷酸，設為使用有會抑制RET之化合物的化學療法是否有效的指標；當藉由如請求項9之檢測方法，從試料中檢測出如請求項1或2之多肽的情況，及/或藉由如請求項11之檢測方法，從試料中檢測出如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則判定使用有會抑制RET之化合物的化學療法是有效的。
  16. 一種生物標記物，其係用以檢測癌症，且係選自於由下述構成之群組之至少1種：DCTN1蛋白質的N末端部分與RET蛋白質的C末端部分融合在一起的多肽，及編碼該多肽的聚核苷酸。
  17. 一種癌症的治療方法，包含下述步驟：對DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者，進行使用有會抑制RET之化合物的化學療法。
  18. 一種癌症的治療方法，其包含下述步驟：進行檢測步驟：從來自受試者的試料中，檢測如請求項1或2之多肽的存在及/或檢測如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在； 以及，進行化學療法的步驟：當檢測出如請求項1或2之多肽的存在，或者，且/或檢測出如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的情況，則對該受試者進行使用有會抑制RET之化合物的化學療法。
  19. 一種抑制RET的化合物，其係用以治療DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者。
  20. 一種抑制RET之化合物用以製造癌症治療用醫藥組成物的用途，該癌症治療用醫藥組成物是用以治療DCTN1基因與RET基因的融合基因陽性及/或DCTN1蛋白質與RET蛋白質之融合蛋白質陽性的癌症患者。
  21. 一種判定藥的製造方法，該判定藥是用以檢測試料中之如請求項1或2之多肽的存在的手段，及/或用以檢測試料中之如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在的手段，且判定使用有會抑制RET的化合物的化學療法是否有效。
  22. 一種抗DCTN1抗體及抗RET抗體的組合，其係用以檢測如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。
  23. 一種如請求項8之抗體、如請求項22之抗體的組合或如請求項10之引子或探針的用途，其係用以製造檢測藥，該檢測藥是用以檢測如請求項1或2之多肽或如請求項3至5中任一項之聚核苷酸的存在。
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