CN106467914A - 靶向人TSPAN8基因的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药与基因治疗领域，本发明提供了一种可以特异性抑制TSPAN8基因表达的siRNA或shRNA，并且提供了siRNA或shRNA在制备TSPAN8基因表达抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。

Description

靶向人TSPAN8基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药及基因治疗领域，具体涉及一种靶向人TSPAN8基因的siRNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

TSPAN8的英文全称是tetraspanin 8(四跨膜蛋白8)，又称为CO-029，TM4SF3，位于12号染色体上(Genebank Accession：NM_004616)。TSPAN8是四跨膜超家族重要成员之一。TSPAN8通过影响吞噬细胞糖蛋白1(phagocyticglycoprotein 1，CD44)(Guo Q.ect,Tetrasoanin CO-029inhibitcolorectal cancer cell movement by deregulationg cell-matrix and cell-celladhensions,PloS One.2012；7(6)e:38464),或是影响局部粘着斑激酶(FocalAdhesion Kinase,FAK)，或是影响桩蛋白(Paxilin)(Shijing Yue等，Tspan8and CD151promote metastasis by distinct mechanisms.European Journal ofCancer(2013)49,2934–2948),进而影响层粘连蛋白整合素(laminin-bindingintergrinα3β1)和成纤维粘连蛋白整合素(fibronectin-intergrinα5β1)的表达，降低细胞的迁移和黏附能力。TSPAN8在细胞表面与整合素、生长因子受体以及其他四跨膜超蛋白形成四跨膜网络，并对整合素、生长因子受体的功能产生影响。目前研究表面其参与细胞的黏附、迁移及增殖等众多病理生理过程。(Wu Jin-cai等，The influence of down-regulation of Tspan8by shRNAon metastasis and invasion of hepatocellular carcinomas,China J HepatobiliarySurg,February 2012,Vol.18,No.2)。

肿瘤是威胁人类健康的疾病之一，至今缺少理想的治疗手段和药物，开发新的药物迫在眉睫。基因治疗是非常有前景的，在不久的将来或许会成为肿瘤治疗的一个有效手段。RNA干扰技术是一种沉默基因表达的技术，两名美国科学家Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因对此项技术的贡献于2006年被授予诺贝尔生理学奖。RNA干扰技术的原理是较长双链RNA被特异核酸酶Dicer切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。小干扰RNA随后形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)解旋成单链。反义链引导该沉默复合体通过碱基配对特异性结合到目标mRNA上，使mRNA分解。

小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一种形成急转弯结构的RNA序列，可以经由RNA干扰使基因沉默。

胶质瘤是一种发生于脑或脊髓的肿瘤，最常发生部位为脑，因其来源神经胶质细胞而被称为胶质瘤。胶质瘤占脑和中枢神经系统肿瘤的30％、占脑恶性脑肿瘤的80％，是人类健康的严重威胁。脑胶质瘤的治疗通常采用手术，放疗和化疗相结合。胶质瘤常发生于脑，手术需要开颅，手术时间长。胶质瘤和正常神经组织交错生长，边界不清，瘤组织不易清理干净，胶质瘤易复发。对于化疗，由于血脑屏障的存在，使普通的抗肿瘤药物疗效不佳。对于放疗，也存在定位困难和对神经损伤的担心。目前胶质瘤仍是医学界的一个难题。

当前有关TSPAN8的研究主要集中在肝癌消化道癌领域，在胶质瘤基因治疗领域还是一片空白。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种靶向人TSPAN8基因的siRNA，本发明的另一目的在于提供该siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明人经实验证明恶性程度较高的胶质瘤，TSPAN8的表达量也较高，调节TSPAN8的表达能影响胶质瘤细胞的增殖。

本发明结合TSPAN8分子在瘤细胞中的功能，利用RNA干扰技术开发新的治疗药物。

本发明设计靶向TSPAN8基因的siRNA，特异性抑制TSPAN8基因的表达，从而抑制胶质瘤的增殖。进一步地本发明提供了包含该siRNA的shRNA分子，也具有抑制TSPAN8的表达的作用，可能成为治疗胶质瘤的药物。

本发明的第一方面，是提供一种靶向人TSPAN8基因，并特异性抑制TSPAN8基因表达的siRNA或shRNA。

本发明提供了一种靶向人TSPAN8基因并特异性抑制TSPAN8基因表达的siRNA，包括正义链和反义链，siRNA的序列如下：

正义链：5’-GCAAUGACUCUCAAGCAA-3’ (SEQ ID NO.1)

反义链:5’-CGUUACUGAGAGUUCGUU-3’ (SEQ ID NO.2)

本发明提供了一种包含上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正义链和反义链，此shRNA序列为：

正义链：

5’-CCGGGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.3)

反义链：

5’-AAUUCAAAAAAGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.4)

进一步地，本发明提供了一种转录上述的shRNA的DNA序列，DNA序列为：

转录正义链DNA:5’-CCGGGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.5)

转录反义链DNA:5’-AATTCAAAAAAGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.6)

本发明的第二方面，提供了一种重组载体，含有如上所述的靶向人TSPAN8基因的siRNA或shRNA。

所述的重组载体，载体可选自质粒、慢病毒载体、腺病毒载体等，优选为质粒pLKD-CMV-GFP-U6。

本发明的第三方面，是提供上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备TSPAN8基因表达抑制剂中的应用。

进一步地，本发明还提供了上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为胶质瘤。

本发明主要技术方案是：

1.siRNA的设计和干扰载体的制备；

2.干扰慢病毒颗粒的包装；

3.干扰效率在蛋白水平的验证；

4.MTT法检测干扰TSPAN8后细胞系增殖的影响；

5.克隆形成检测干扰TSPAN8后对细胞系增殖的影响。

本发明涉及的干扰RNA能在信使RNA水平和蛋白水平有效抑制人TSPAN8基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞系U87和U251的增殖，为胶质瘤的治疗提供了新的途径。

附图说明

图1采用Western blot检测TSPAN8干扰慢病毒感染U87细胞，对目的基因蛋白表达的敲减效果

图2为MTT法检测干扰TSPAN8抑制U87和U251细胞系生长的折线图；

图3为Transwell法检测TSPAN8抑制U87和U251细胞侵袭的照片图；

图4为克隆形成法检测干扰TSPAN8抑制U87和U251形成克隆的照片图。

图2-4中含有空载体的病毒(Negative control)和干扰TSPAN8的病毒(shTSPAN8)，Blank是指没有经过病毒处理的细胞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。以下实施方式只是较佳的实施方式中的一种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1TSPAN8siRNA序列设计与干扰质粒构建

在ensembl网站(http://www.ensembl.org/index.html)搜索并下载TSPAN8的cDNA序列，使用Life technologies公司的BLOCK-iT RNA Designer软件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaexpress/)在线设计与TSPAN8cDNA互补的siRNA序列肆条。选取得分最高的siRNA序列，如下：

siRNA1～4的序列如下：

siRNA1

正义链：5’-GCAAUAUGGGUACGAGUAA-3’ (SEQ ID NO.7)

反义链:5’-UUACUCGUACCCAUAUUGC-3’ (SEQ ID NO.8)

siRNA2

正义链：5’-GCAAUGACUCUCAAGCAA-3’ (SEQ ID NO.1)

反义链:5’-CGUUACUGAGAGUUCGUU-3’ (SEQ ID NO.2)

siRNA3

正义链：5’-GGAAGCCAUAAUUGUGUUU-3’ (SEQ ID NO.9)

反义链:5’-AAACACAAUUAUGGCUUCC-3’ (SEQ ID NO.10)

siRNA4

正义链：5’-GAGUUUAAAUGCUGCGGUU-3’ (SEQ ID NO.11)

反义链:5’-AACCGCAGCAUUUAAACUC-3’ (SEQ ID NO.12)

输入到NCBI网站的Standard Nuceotide BLAST界面，与人的转录序列比对，确认目的基因与除TSPAN8以外的转录本无高度同源性(16个碱基以上)，排除偏靶效应。然后按照“AgeI酶切位点粘性末端-正义链-茎环-反义链-编码终止序列-EcoRI酶切位点粘性末端”的顺序，将siRNA1～4组装入shRNA1～4(Y2037，Y2038，Y2039，Y2040)正义链和反义链。

shRNA1(Y2037):

转录正义链DNA:5’-CCGGGCAATATGGGTACGAGTAATTCAAGAGATTACTCGTACCCATATTGCTTTTTTG-3’ (SEQ ID NO.13)

转录正义链DNA:5’-AATTCAAAAAAGCAATATGGGTACGAGTAATCTCTTGAATTACTCGTACCCATATTGC-3’ (SEQ ID NO.14)

shRNA2(Y2038):

转录正义链DNA:5’-CCGGGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.5)

反义链DNA:5’-AATTCAAAAAAGCAATGACTCTCAAGCAACTCGAGTTGCTTGAGAGTCATTGC-3’(SEQ ID NO.6)

shRNA3(Y2039):

转录正义链DNA:5’-CCGGGGAAGCCATAATTGTGTTTCTCAAGAGAAAACACAAT TATGGCTTCCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.15)

转录正义链DNA:5’-AATTCAAAAAAGGAAGCCATAATTGTGTTTTCTCTTGAGAAACACAATTATGGCTTCC-3’(SEQ ID NO.16)

shRNA4(Y2040):

转录正义链DNA:5’-CCGGGAGTTTAAATGCTGCGGTTCTCAAGAGAAACCGCAGCATTTAAACTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.17)

转录正义链DNA:5’-AATTCAAAAAAGAGTTTAAATGCTGCGGTTTCTCTTGA GAACCGCAGCATTTAAACTC-3’(SEQ ID NO.18)

把以上信息交invitrogen公司合成得到DNAOligo。

DNA Oligo加入ddH₂O溶解，浓度10mM。各别取22.5μl的DNA Oligo与5μl的10×退火缓冲液(成分为100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM EDTA，1mMNaCl)混合，95℃水浴12min后拿出，在室温下冷却至室温。

25℃下，用T4连接酶(日本TAKARA公司生产)将互补双链与AgeI、EcoRI酶切的载体连接30min，体系按说明书配制(DNA 4μl,载体2μl,PEG40002μl,10×T4buffer 2μl,T4连接酶1μl,ddH2O 9μl)。取连接产物加入装有大肠杆菌DH5α感受态细胞的1.5ml规格离心管使其混合，置于冰上30分钟，然后放入42℃水浴90秒，再放回冰上2分钟后加入800μl不含抗生素的培养基，置37℃细菌培养箱中摇1小时。4500转/分离心收集得到的细菌后涂固体LB培养基平板，37℃细菌培养箱过夜培养至长出菌落。

挑取菌落溶于含20μl抗性培养基的离心管中，进行菌落PCR鉴定，鉴定所用的引物为：

PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO.19)

PLKD-R：GAAATACGGTTATCCACGCG(SEQ ID NO.20)

转化成功的取样送测序(华大基因有限公司提供测序服务),测序使用的引物是：PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO.21)。测序结果比对正确后，应将菌液加入含15ml氨苄青霉素LB培养基的50ml离心管中。将离心管放入37℃摇床培养20小时。用质粒小提中量试剂盒(天根公司)抽取质粒，测定DNA浓度后备用。

实施例2：干扰慢病毒颗粒的包装

在37℃5％CO₂的细胞培养箱中培养HEK 293T细胞(下简称293T,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，培养基使用添加了10％胎牛血清(美国纽约Gibco公司生产)的DMEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基.传代培养293T细胞于直径为10cm的培养皿中，当细胞长到汇合度为50％左右，用无血清的培养基培养4小时。

按Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司生产)说明书操作，准备好22.5g上面得到的pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA质粒(或不含shRNA的空载体质粒)、7.9g病毒外壳质粒psPAX2(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)、14.6g包装质粒pMD2.G(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)的转染混合物。

把混合物添加到已经饥饿培养过的细胞中进行转染，4-6小时后更换为正常的培养基。分别在换液培养24和48小时后收集培养基，经0.22μm孔径的膜过滤后，再用CP 80MX离心机(日本日立公司生产)经4℃、100000g超速离心2小时，得到病毒沉积块。用OPTI-MEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基重悬收集得到慢病毒。

通过以上方法包装得到含有空载体的病毒(control)和干扰TSPAN8的病毒(shTSPAN8：Y2037，Y2038，Y2039，Y2040)。慢病毒的滴度测定采用稀释计数法,把293T细胞铺96孔板，每孔约5000个细胞，过夜培养。准备好用培养基10倍梯度稀释的病毒共10份，即最低、最高浓度分别为原液的1/10^-10、1/10^-1,每份100μl换掉对应孔的培养基培养过夜后更换正常培养基。换掉新鲜培养基再培养两天后，置荧光显微镜下观察最后两个有荧光的孔的荧光细胞的克隆数，用以下公式计算病毒滴度：滴度(TU/ml)＝(X+Y*10)*10/(2*Z)其中X是指倒数第二个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Y是指倒数第一个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Z是指X对应孔所加病毒的稀释率。

实施例3：干扰效率在蛋白水平的验证

蛋白样品的制备：

在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30％汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰TSPAN8的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。实验分为5组，分别为：阴性对照病毒感染组(Control),Y2037病毒感染组，Y2038病毒感染组，Y2039病毒感染组和Y2040病毒感染组。收细胞时先转移培养基至空的15ml规格离心管，用PBS漂洗两次细胞，每次用PBS 3ml，然后用2ml 0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞都变圆漂浮后把之前吸走的培养基倒回培养皿。把消化下来的细胞随培养基转移到15ml规格离心管中，1200转/分离心5分钟收集细胞。弃掉上清，加入含有1×PMSF(中国南通碧云天公司生产)和1×蛋白酶抑制剂cocktail(美国ThermoScientific公司生产)的RIPA细胞裂解液(中国南通碧云天公司生产)。吹打混匀细胞和裂解液，放于冰上裂解1小时，每20分钟用漩涡混合器振荡混匀。最后离心，离心机设置为：4℃、13000转/分、15分钟。吸取离心后的上清液至洁净的离心管中即为提得的蛋白样品。把蛋白样品和等体积的2×蛋白上样缓冲液(二硫苏糖醇(DTT)：0.1572g,溴酚蓝；0.01g,Tris-HCl(1MpH 6.8)：0.5ml,10％SDS：2ml,甘油：1ml,H₂O：定容至10ml)混合煮沸5分钟，完成样品制备。

Tris(1M pH 6.8)缓冲液的配制方法：称取Tris Base 24.228g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至6.8，同时用超纯水定容至200ml。

Western Blot方法检测蛋白表达：

准备好配制凝胶需要的试剂：

30％acrylamide mix的配制方法：称取丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，用超纯水溶解并定容至100ml。

Tris(1.5M pH 8.8)配制方法：称取Tris Base 36.342g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至8.8，同时用超纯水定容至200ml。

Tris(0.5M pH 6.8)缓冲液的配制方法：称取Tris Base 12.114g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至6.8，同时用超纯水定容至200ml。

10％SDS的配制方法：称取5g十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)，溶于超纯水至50ml。

10％APS的配制方法：称取5g过硫酸铵(Ammonium persulfate，APS)，溶于超纯水至50ml。

TEMED是指N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，中文名N,N,N',N'-四甲基二乙胺。

准备好电泳装置(中国上海天能科技有限公司生产的VE-180型垂直电泳槽)和配制1.5mm厚凝胶的玻璃板(中国上海天能科技有限公司生产)。把玻璃板用洗洁精、清水洗涤干净，再用去离子水冲洗一遍，放入电热鼓风干燥箱中烘干。待玻璃板全干后组装好配胶装置，配制10％分离胶(ddH₂O：4.0ml,30％acrylamide mix：3.3ml,Tris(PH 8.8 1.5M)：2.5ml,10％SDS：100μl,10％APS：100μl,TEMED：4μl)，将其注入至玻璃板，加入后用300μl超纯水封住上表面。

室温放置30分钟以上，待水和凝固的分离胶两相界面变清晰，准备好5％浓缩胶(ddH₂O：2.7ml,30％acrylamide mix：0.67ml,Tris(PH 6.8 0.5M)：0.5ml,10％SDS：40μl,10％APS：40μl,TEMED：4μl)，倒掉玻璃板中的水，注入浓缩胶，插上梳子，室温放置20分钟待其凝固后即可使用。

电泳：

配制10×电泳液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,SDS：10.0g,去离子水：定容至1000ml)，将50ml 10×电泳液与450ml H₂O₂混合即得到500ml 1×电泳液。

安装好电泳装置并用清水冲洗干净，拔掉梳子。倒上500ml电泳液，保持电泳槽内槽充满电泳液，样品在6000转/分条件下离心1s收集后加入泳道，邻近样品放的其中一个空白孔加入预染marker(加拿大Fermentas公司生产，货号SM0671)。电泳时电源限定条件：恒流15-20mA。待指示剂显示样品接近凝胶下边界时停止电泳。

转膜：

配制10×转膜液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,H₂O：定容至：1000ml)。

接下来配制好1×转膜液(10×转膜液：80ml,甲醇：160ml,H₂O：定容至800ml)。准备好转膜装置，两组9×8cm规格滤纸，每组三张。把PVDF膜先浸泡在甲醇中约20秒待其浸透无白点，再放入转膜液中平衡后，转移至装有转膜液的小盒中备用。然后用塑料片轻轻切去浓缩胶，再切割分离胶两端和与玻璃接触的面。用塑料片蘸少许转膜液，塞入分离胶下使其松动，然后将其倒扣至装有转膜液的塑料盆中轻轻摇晃，分离胶即从玻璃上脱离到转膜液中。

打开转膜用的塑料板，浸没到转膜液中，在转膜液中按如下顺序组装：负极板(黑)放上海绵→一组滤纸(三张)→分离胶→PVDF膜→一组滤纸(三张)→海绵→正极板。然后夹持好装置，倒上转膜液，确保转膜的三明治样结构完全浸没在转膜液中，盖上带有电源线的盖子，整个电泳装置置于塑料盆中，电泳盒外围加上冰水混合物即可开始转膜。转膜时电源限定条件：U＝100V；I＝350mA；t＝75min。

封闭：

配制好10×TBS缓冲液(1L含Tris 24.23g、NaCl 80.06g，HCl调pH至7.6)，然后用去离子水稀释10倍得到1×TBS，再加入0.5％(v/v)的吐温-20配制成TBST。准备好5％脱脂奶，将5g脱脂牛奶(中国内蒙古伊利实业集团股份有限公司)溶于100ml TBST溶液中。转膜完毕后，取出PVDF膜装入自封袋，倒入20ml的5％脱脂牛奶，用封口机封牢，置于脱色摇床上摇20分钟，再转至4℃冰箱过夜存放。

一抗孵育：

从冰箱取出PVDF膜后，先用1×TBST洗涤3次，每次5分钟。按1：1000稀释率取用抗体TSPAN8(英国Abcam公司生产，ab22453)及1：8000稀释率取用抗体HRP偶联的GAPDH(上海康成公司生产，KC-5G5)，加入到5ml TBST中，摇匀即得到抗体工作液。把洗涤后的膜装入自封袋，倒入配好的抗体工作液，中速运转的脱色摇床上孵育120分钟。一抗孵育完后，若一抗上已经有辣根过氧化物酶标记(如内参蛋白GAPDH的抗体)，则直接跳至显影步骤，若没有，则需要二抗孵育。

二抗孵育：

先用1×TBST洗涤3次，每次5分钟。吸取辣根过氧化物酶标记的兔免疫球蛋白抗体(即二抗，美国Cell Signaling Technology公司生产，稀释率为1:2000)，加入到5ml 1×TBST中摇匀。把洗涤后的膜装入自封袋，倒入配好的二抗工作液，封口机封住，摇床上摇120分钟。

显影：

二抗孵育结束后，用1×TBST洗涤6次，前3次每次10分钟，后3次每次5分钟。在此期间准备好显影液、定影液、自来水、胶片、显影暗匣，剪刀，卫生纸。以下操作在显影暗室中红光灯辅助下完成。分别吸取400μl显影底物A和B(中国天根生化科技有限公司生产)混匀，平衡至室温。把PVDF膜放在洁净的剪开的自封袋内表面上。迅速加上显影底物，孵育1-5分钟,若肉眼可见明显条带，则终止孵育。弃掉显影底物液体，把膜转移至三面剪开的自封袋中，合上自封袋，用卫生纸小心吸掉多余的液体，放入显影暗匣，用绝缘胶带固定。放上胶片，胶片曝光一定时间(5～30秒)后，依次放入显影液、定影液各20秒，然后把胶片放在清水中。最后在自来水下洗净胶片，晾干，扫描至计算机，得到检测结果。

显影后的膜用1×TBST洗10分钟后，可放入有抗体洗脱缓冲液的自封袋中，密封后放入50～60℃的水浴锅中孵育30分钟。再用1×TBST洗2次，每次10分钟。洗完后用脱脂奶封闭即可重复上面的步骤检测其它蛋白如内参蛋白GAPDH。

Western Blot的结果如图1所示，表明本发明用到的干扰RNA(Y2038)能显著降低TSPAN8的蛋白水平。

经实验发现：siRNA2的干扰效果最好。shRNA2(Y 2038)的干扰效果最好。

上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正义链和反义链，此shRNA序列为：

正义链：5’-CCGGGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.3)

反义链：5’-

AAUUCAAAAAAGCAAUGACUCUCAAGCAACUCGAGUUGCUUGAGAGUCAUUGC-3’(SEQ ID NO.4)

实施例4：MTT法检测干扰TSPAN8后对U87和U251细胞系增殖的影响

胶质瘤U87细胞系、胶质瘤U251细胞系，购自中科院细胞所。

在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30％汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒(标记为Negative control组)和干扰TSPAN8的病毒感染颗粒(标记为Y2038组，感染复数为10)，以未加入病毒的细胞培养为空白对照组(标记为Blank组)，继续培养细胞4天。后用96孔板(美国Corning公司生产)培养，每孔约1500个细胞，每孔培养基150μl。分别在如图3所示的时间点，每孔加入15μl浓度为5mg/ml的MTT(上海生工生物工程公司生产)继续孵育4小时。然后吸掉培养物，每孔加入150μl DMSO，在酶标仪(美国Bio-Rad公司生产，iMark168-1130型)的490nm波长下测定吸光度。

结果如图2所示，表明干扰TSPAN8能明显抑制U87、U251细胞的生长。

实施例5：Transwell法检测干扰TSPAN8后对U87和U251细胞系侵袭的影响

Transwell侵袭实验使用Matrigel Invasion Chamber(8μm，24-well cellculture inserts)(BD Biosience公司)。预先用无菌镊子将侵袭小室夹持悬挂在24孔培养板上，室温下放置30分钟，使基质胶凝固。在小室上方加入500μl无血清培养基，37℃孵育2小时，以水化基质胶。消化细胞，通过细胞计数，用无血清培养基配置1x10⁵个细胞/ml的细胞悬液。吸去侵袭小室上方的无血清培养基，加入500μl血清培养基。培养22个小时后，用棉签擦尽小室中膜正面的细胞，用甲醇固定膜背面的细胞15分钟，再用0.5％结晶紫染色15分钟。对于U87和U251细胞，在100x镜下随机拍摄9个视野；对于C6细胞，在200x镜下随机拍摄9个视野。得到9个视野中细胞数的平均值。

迁移实验结果如图3所示，表明干扰TSPAN8能明显抑制U87和U251细胞侵袭结果。

实施例6：Transwell法检测干扰TSPAN8后对U87和U251细胞系迁移的影响

Transwell侵袭迁移实验使用孔径8μm的24孔细胞培养池(BD Biosience公司)。与侵袭实验的区别在于无基质胶包被，无凝固和水化步骤。用无血清培养基配置5x10⁵个细胞/ml的细胞悬液，在小室上方加入100μl悬液，即5x10⁴个细胞，并在小室下方加入500μl血清培养基。培养4小时后结束实验。后续处理同Transwell侵袭实验。实验结果如图4所示，表明干扰TSPAN8能明显抑制U87和U251细胞的迁移。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种靶向人TSPAN8基因并特异性抑制TSPAN8基因表达的siRNA，包括正义链和反义链，siRNA的序列如下：

正义链：如SEQ ID NO.1所示；

反义链：如SEQ ID NO.2所示。

2.一种靶向人TSPAN8基因并特异性抑制TSPAN8基因表达的shRNA序列，包括正义链和反义链，此shRNA序列为：

正义链：如SEQ ID NO.3所示；

反义链：如SEQ ID NO.4所示。

3.一种转录权利要求2所述的shRNA的DNA序列，DNA序列为：

转录正义链DNA:如SEQ ID NO.5所示；

转录反义链DNA:如SEQ ID NO.6所示。

4.一种靶向人TSPAN8基因的重组载体，含有如权利要求1所述的siRNA或如权利要求2所述的shRNA。

5.如权利要求4所述的靶向人TSPAN8基因的重组载体，其特征在于，所述载体选自质粒、慢病毒载体或腺病毒载体。

6.如权利要求5所述的靶向人TSPAN8基因的重组载体，其特征在于，所述质粒pLKD-CMV-GFP-U6。

7.一种如权利要求1所述的siRNA在制备TSPAN8基因表达抑制剂中的应用。

8.一种如权利要求2所述的shRNA在制备TSPAN8基因表达抑制剂中的应用。

9.一种如权利要求3所述的DNA序列在制备TSPAN8基因表达抑制剂中的应用。

10.一种如权利要求1所述的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

11.一种如权利要求2所述的shRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

12.一种如权利要求3所述的shRNA DNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。