CN116808218A

CN116808218A - 生物标志物在头颈鳞癌治疗中的应用

Info

Publication number: CN116808218A
Application number: CN202310702814.9A
Authority: CN
Inventors: 赵苗青; 汝昆; 胡漫; 朱伟力; 武聪; 党琳琳
Original assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Current assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2023-06-14
Filing date: 2023-06-14
Publication date: 2023-09-29

Abstract

生物标志物在头颈鳞癌治疗中的应用，具体的，所述的标志物包括GNA13、或STRADB。本发明通过分离HNSCC细胞外泌体并与成纤维细胞共培养，证实GNA13可通过外泌体诱导成纤维细胞转化，促进成纤维细胞的增殖和迁移。通过体外实验证实了GNA13的miR‑26a‑5p/STRADB轴通过外泌体调控成纤维细胞的分子途径。利用共培养体系证实了高表达STRADB的成纤维细胞能够逆转GNA13缺乏对HNSCC细胞恶性表型的影响。体内实验证实了GNA13对裸鼠癌细胞生长的促进作用。本发明为头颈部肿瘤的诊断和治疗提供了新方法，具有良好的临床应用前景。

Description

生物标志物在头颈鳞癌治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及生物标志物在头颈鳞癌治疗中的应用。

背景技术

头颈部肿瘤是全球第六种最常见的恶性肿瘤。据2018年统计，新增病例近80万例，死亡约40万人。头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamouscell carcinoma，HNSCC)是头颈部恶性肿瘤中最主要的病理类型，约占所有头颈部肿瘤的90％。它起源于上呼吸道粘膜上皮，HPV感染、吸烟和酗酒是危险因素。目前，HNSCC的有效治疗方法包括手术切除和放射治疗。然而，由于治疗不理想、复发率高、预后差，其总5年生存率没有明显提高。因此，探索有效的诊断和预后生物标志物对于提高HNSCC患者的生存率至关重要。

外泌体(exosome)是由活细胞分泌的直径为30-150nm的双层类脂膜载体，并且存在于几乎所有的生物液体中。外来体可以携带多种蛋白质、核酸、mRNAs、微小RNA和其他小分子，如非编码RNAs。外泌体可以直接与细胞融合，释放各种小分子并激活靶细胞中的信号通路。有研究发现经缺氧处理的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞可以产生富含mir-21的外泌体，这些外泌体被递送到常氧细胞并诱导EMT，有助于肿瘤细胞的转移前微环境。另外，研究者们发现外泌体中的lncRNA，LJ22447诱导正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化，并在CAF中高表达，参与肿瘤微环境的形成，有助于肿瘤的生长和发展。因此，外泌体是肿瘤过程中不可忽视的关键因素，其对肿瘤微环境的影响是多方面的。

肿瘤间质作为肿瘤微环境的重要组成部分，对肿瘤的发生发展有重要影响，而成纤维细胞是肿瘤间质组织中最重要的细胞成分之一。它们可以通过分泌胶原和纤维分子来构建细胞外基质，或者通过释放蛋白质水解酶来降解这个网络，从而增强细胞外基质的细胞流动性。在几种生理或病理因素的刺激下，成纤维细胞可以被激活，并导致自身增殖或迁移能力增强，从而影响细胞外基质。这些特点和可能性使成纤维细胞成为肿瘤发生发展的一个趋势研究课题。

发明内容

本发明的目的是获得有效的用于头颈部肿瘤的诊断、治疗及预测预后的生物标志物，为头颈部肿瘤的诊疗提供新方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明第一方面提供了标志物的抑制剂在制备治疗头颈部肿瘤的药物中的应用，所述的标志物包括GNA13、或STRADB。

术语“标志物”是指以可用于预测个体的癌症状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。标志物可以是包含编码该标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的DNA。可用于本发明的标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的DNA和RNA。

在本发明中，标志物例如GNA13(Gene ID:10672)、STRADB(GeneID:55437)，包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

在本发明中，术语“抑制剂”是指任何可降低标志物的稳定性、减少标志物有效作用时间、或抑制标志物的转录的物质，这些物质均可用于本发明。

进一步，所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物。

进一步，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸。

进一步，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子。

术语“头颈部肿瘤”是指发生在头颈部的癌症，包括鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌。

进一步，所述的头颈部肿瘤为头颈部鳞状细胞癌。

进一步，所述的头颈部鳞状细胞癌为咽鳞癌。

本发明的药物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

本发明第二方面提供了一种筛选治疗头颈部肿瘤的药物的方法，所述的方法包括：

(1)用待测物质处理表达或含有GNA13、或STRADB的体系；

(2)检测步骤(1)所述的体系中GNA13、或STRADB的表达水平；

(3)选择可降低GNA13或STRADB表达水平、或不提高STRADB表达水平的待测物质为候选药物。

进一步，所述的体系包括成纤维细胞、或头颈部肿瘤细胞。

本发明第三方面提供了检测受试者样本中标志物表达水平的试剂在制备诊断头颈部肿瘤或预测头颈部肿瘤患者预后的产品中的应用，所述的标志物包括GNA13、或STRADB。

进一步，所述的头颈部肿瘤为头颈部鳞状细胞癌。

进一步，所述的头颈部鳞状细胞癌为咽鳞癌。

进一步，所述的试剂包括能够检测标志物的蛋白水平的试剂、或能够检测基因标志物的mRNA水平的试剂。

进一步，所述的检测基因标志物的蛋白水平使用选自多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析、MRM测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定或蛋白质芯片测量中的任何一种或多种来进行。

进一步，所述的检测基因标志物的mRNA水平使用选自聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法中的任何一种或多种来进行。

进一步，所述的试剂包括：

与所述的标志物的基因特异性结合的引物或探针；

或与所述的标志物的蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。

本文所使用的术语“引物”是指具有短游离3'-羟基的核酸序列，是可以与互补模板形成碱基对并充当模板链复制的起点的短核酸。在适当的缓冲溶液和温度下，在存在用于聚合的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的情况下，引物可以引发DNA合成。可以根据本领域已知的技术适当地选择PCR条件以及正义和反义引物的长度。

本文所使用的术语“探针”是指对应于可以特异性结合mRNA的几个碱基至数百个碱基的核酸片段(例如RNA或DNA)，并且可以通过标签来确认特定mRNA的存在与否以及表达水平。探针可以以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针的形式制备。可以根据本领域已知的技术适当地选择合适的探针和杂交条件。

本文所使用的术语“抗体”是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中的抗体是指与本发明的基因标志物蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。

本文所使用的术语“肽”具有与靶物质高度结合的能力，并且在热处理/化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，它可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。

本文所使用的术语“适配体”是指一种由特定类型的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。

进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

在本发明中，试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

高通量测序平台是一种特殊的诊断头颈部肿瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知基因标志物的异常与头颈部肿瘤相关也属于基因标志物的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明第四方面提供了如下所述的应用：

(1)过表达STRADB的成纤维细胞在促进头颈部肿瘤细胞的增殖、迁移或侵袭中的应用；

(2)外泌体在抑制成纤维细胞增殖或迁移中的应用，所述的外泌体为从抑制GNA13表达的头颈部肿瘤细胞中分离得到；

(3)GNA13在抑制成纤维细胞中miR-26a-5p的表达水平中的应用；

(4)成纤维细胞在制备治疗头颈部肿瘤的药物中的应用，所述的成纤维细胞中的STRADB被抑制表达。

进一步，所述的头颈部肿瘤为头颈部鳞状细胞癌。

进一步，所述的头颈部鳞状细胞癌为咽鳞癌。

本申请中的术语“外泌体”为从多种细胞分泌的膜结构的囊泡，通过与其他细胞及组织结合来起到递送膜组分、蛋白质、核糖核酸(RNA)等各种作用。

本发明涉及的“过表达”可以是蛋白质或mRNA水平，优选mRNA水平。因此，表述“表达水平”在本文中可以理解为“蛋白质表达水平”或“mRNA表达水平”。

进一步，所述的头颈部肿瘤细胞包括Detroit 562细胞、SCC-15细胞、SCC-25细胞、TU212细胞、TU686细胞、或Fadu细胞。

进一步，所述的头颈部肿瘤细胞为Fadu细胞。

本发明第五方面提供了一种调节成纤维细胞中miR-26a-5p/STRADB轴的表达的方法，所述的方法包括：

1)从GNA13敲除后的Fadu细胞中分离出外泌体；

2)将1)中获得的外泌体与成纤维细胞共培养。

本发明的有益效果：

本发明通过分离HNSCC细胞外泌体并与成纤维细胞共培养，证实GNA13可通过外泌体诱导成纤维细胞转化，促进成纤维细胞的增殖和迁移。通过体外实验证实了GNA13的miR-26a-5p/STRADB轴通过外泌体调控成纤维细胞的分子途径。利用共培养体系证实了高表达STRADB的成纤维细胞能够逆转GNA13缺乏对HNSCC细胞恶性表型的影响。体内实验证实了GNA13对裸鼠癌细胞生长的促进作用。本发明首次公开了GNA13是头颈部肿瘤的标志物，为头颈部肿瘤的诊断和治疗提供了新方法。

附图说明

图1是证明GNA13是一种新的预测HNSCC患者预后的癌基因的实验结果图，其中，图A是GSE6631基因芯片中DEGs的热图，图B是GSE6631基因芯片中DEGs的火山图，图C是TCGA数据库中HNSCC患者GNA13的表达水平统计图，图D是GNA13与肿瘤分级的相关性分析结果图，图E是GNA13与肿瘤分期的相关性分析结果图，图F是GNA13与淋巴结转移的相关性分析结果图，图G是HNSCC患者生存时间与GNA13的相关性分析结果图，图H是免疫组化检测肿瘤和正常组织中GNA13的表达结果图，图I是免疫组化检测肿瘤和正常组织中GNA13的统计图，图J是Westernblotting检测肿瘤组织和正常组织中GNA13的表达的结果图；

图2是证明GNA13调节HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭的结果图，其中，图A是通过Western blotting检测GNA13在NOK、TU686、TU212和Fadu细胞系中的表达的结果图，图B是qRT-PCR检测GNA13 mRNA在NOK、TU686、TU212和Fadu细胞系中的表达的结果图，图C是Western blotting检测小干扰RNA的作用的结果图，图D是qRT-PCR检测小干扰RNA的作用的结果图，图E是集落形成实验检测Fadu细胞的增殖的结果图，图F是CCK-8法检测Fadu细胞的活力的结果图，图G是通过细胞划痕试验检测Fadu细胞的迁移的结果图，图H是通过Transwell试验检测Fadu细胞的迁移和侵袭结果图，图I是通过Transwell试验检测Fadu细胞的迁移和侵袭的统计图，图J是Western blotting检测Fadu细胞中EMT标志蛋白的表达的结果图；

图3是证明外泌体-GNA13诱导成纤维细胞转化并促进成纤维细胞的增殖和迁移的结果图，其中，图A是电子显微镜显示外泌体的形态和大小的结果图，比例尺代表500纳米，图B是NTA量化外泌体的大小分布的结果图，图C是Western blotting检测外泌体中GNA13的表达和GW4869的抑制作用的结果图，图D是用共聚焦显微镜观察成纤维细胞摄取外泌体的图像，图E是Western blotting检测成纤维细胞中GNA13的表达的结果图，图F是采用qRT-PCR检测成纤维细胞中GNA13的表达的结果图，图G是Western blotting检测成纤维细胞中α-SMA、Vimentin、GNA13和外泌体标记蛋白的表达的结果图，图H是CCK-8法检测成纤维细胞活力的结果图，图I是用集落形成法检测成纤维细胞的增殖情况的结果图，图J是Transwell法检测成纤维细胞的迁移的结果图；

图4是证明外泌体-GNA13调节成纤维细胞中的miR-26a-5p/STRADB轴的结果图，其中图A是Western blotting检测GNA13在成纤维细胞中的表达的结果图，图B是qRT-PCR检测miR-26a-5p在成纤维细胞中的表达的结果图，图C是用qRT-PCR检测共培养成纤维细胞中miR-26a-5p的表达的结果图，图D是用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶载体的荧光素酶活性的结果图，图E是qRT-PCR检测miR-26a-5p在成纤维细胞中的表达的结果图，图F是Western blotting检测STRADB在成纤维细胞中的表达的结果图，图G是Western blotting检测共培养成纤维细胞中STRADB的表达的结果图，图H是qRT-PCR检测共培养成纤维细胞中STRADB的表达的结果图；

图5是证明过表达STRADB的成纤维细胞在共培养条件下促进HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭的结果图，其中，图A是Western blotting检测STRADB在成纤维细胞中的转染效率的结果图，图B是qRT-PCR检测STRADB在成纤维细胞中的转染效率的结果图，图C是Westernblotting检测成纤维细胞中α-SMA和Vimentin的表达的结果图，图D是CCK-8法检测成纤维细胞的活性的结果图，图E是通过集落形成试验检测成纤维细胞的增殖的结果图，图F是通过Transwell试验检测成纤维细胞的迁移的结果图，图G是通过集落形成试验检测Fadu细胞的增殖的结果图，图H是通过CCK-8试验检测Fadu细胞的生存力的结果图，图I是通过Transwell试验检测Fadu细胞的迁移和侵袭的结果图，图J是通过Western blotting检测Fadu细胞中EMT标记蛋白的表达的结果图，图中的NF表示正常成纤维细胞；

图6是证明GNA13调节裸鼠HNSCC的生长的结果图，其中，图A是在处死动物时测量的肿瘤大小的图像，图B是肿瘤生长曲线，图C是肿瘤重量统计图，图D是通过Ki-67的免疫组织化学评估增殖能力的结果图(200X，比例尺＝50m)，图E是通过Western blotting检测肿瘤组织中EMT标记蛋白的表达的结果图，图F是通过Western blotting检测肿瘤组织中特定蛋白质的表达的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验方法

差异表达基因分析与数据处理

本发明首先从GEO数据库下载基因表达数据集GSE6631，其中包含HNSCC患者的基因表达谱。使用Affy和Limma等R软件包对GSE6631数据集进行背景校正、归一化并计算表达式值。差异表达基因(DEGs)采用折叠变化(FC)和调整p值筛选。

UALCAN和Kaplan-Meier绘图仪分析

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是一个在线数据库，可用于分析来自TCGA数据库的临床肿瘤学数据。在本研究中，GNA13的表达水平将根据关键的临床特征进行检测。Kaplan-Meier Plotter工具(https://kmplot.com/analysis/)用于检测不同类型癌症患者的靶基因对生存的影响。本研究利用GNA13分析工具探讨GNA13在HNSCC患者中的预后意义。

临床组织样本

在征得患者知情同意后，本研究经山东大学附属山东省立医院伦理委员会批准。所选患者术前未接受任何治疗。临床组织标本置于液氮中即时冷冻，-80℃保存备用。

细胞培养和转染

人正常鳞状上皮细胞系NOK、HNSCC细胞TU686、TU212和Fadu购自上海ZeYe生物技术公司(中国上海)。原代培养获得人正常成纤维细胞(NF)。在含有10％胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle培养基中培养细胞，置于37℃,5％CO₂的细胞培养箱中培养。GNA13过表达pcDNA3.1质粒及其阴性对照，STRADB过表达pcDNA3.1质粒及其阴性对照购自中国上海Tolo Biotech公司。GNA13小干扰RNA和阴性对照购于中国上海GenePharma公司。miR-26-5p抑制剂和阴性对照购自RiboBio有限公司(中国广州)。质粒转染使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，美国)，按照制造商的说明进行。

外泌体分离、透射电镜(TEM)及外泌体摄取分析

处理后的Fadu细胞(si-GNA13和si-NC)在500×g离心10min，去除细胞，然后通过超离心和过滤去除较大的囊泡，得到外泌体。外泌体样品在铜网板上沉淀1min，然后用醋酸铀酰继续沉淀1min。干燥后，用电子显微镜(日立，日本)检查和成像。外泌体用PKH26膜染料标记。外泌体与正常成纤维细胞在15μg/ml浓度下37℃共培养24h,4％多聚甲醛固定，DAPI染色细胞核。最后，用共聚焦显微镜观察外泌体的摄取情况。

WesternBlotting

用RIPA缓冲液(Beyotime,Shanghai,China)获得细胞总蛋白裂解液。在12％SDS-PAGE凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在5％脱脂牛奶中封闭1h，与相应的一抗在4℃下孵育过夜。最后，使用ECL检测系统(ThermoFisher,美国)检测免疫反应蛋白。

实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

使用TRNzol通用总RNA提取试剂(TIANGEN,中国)从组织或细胞中提取总RNA。对于GNA13和STRADB的表达分析，使用FastKing RT KitWith gDNase(TIANGEN,中国)进行反转录。进行逆转录。qRT-PCR扩增95℃，扩增15min；95℃，持续10秒；60℃,30和40个循环。U6或β-肌动蛋白作为归一化对照。实验数据采用2^-ΔΔCT方法进行解析。

免疫组织化学(Immunohistochemistry)

将石蜡切片在二甲苯和梯度酒精中脱脂和再水化，然后置于柠檬酸盐缓冲液中并加热10分钟。切片在4℃下用兔抗GNA13和兔抗Ki67(Abcam，剑桥，英国)染色过夜。滴加山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30分钟。切片用DAB(Beyotime，上海，中国)处理显色、苏木精复染和梯度酒精脱水，最后用二甲苯透明和密封。

细胞活力测量和集落形成分析

细胞密度调整为5×10⁴/mL，每孔100μl。然后加入10μg CCK-8试剂并孵育2小时。使用酶标记物(ThermoFisher，美国)在450nm处测量吸光度。将细胞接种到6孔板中，常规孵育10d。4％多聚甲醛固定细胞30分钟，0.1％结晶紫染色10分钟。使用以下公式计算菌落形成率：菌落形成率(克隆数)/(接种细胞数)×100％。

细胞划痕实验

细胞消化，重悬，接种于6孔板，在培养箱中孵育过夜。当细胞密度达到90％时，用PBS冲洗细胞3次，用无菌的吸管尖在细胞表面画一条直线。分别于孵育0h和24h后拍摄细胞照片。

Transwell迁移和侵袭试验

上室加入200μl细胞悬液，下室加入含胎牛血清的培养液600μl。孵育48h后，用棉签擦拭位于上室膜上的细胞。4％多聚甲醛固定30min，苏木精染色10min，显微镜下计数。对于侵袭试验，Matrigel凝胶被稀释到1：7并添加到上室的底部，其余的遵循与迁移实验相同的步骤。

双荧光素酶报告基因检测

用含有STRADB mRNA的30个翻译区UTR以及miR-26a-5p模拟物或miR-NC的野生型或突变荧光素酶报告基因共转染细胞。24小时后收获细胞裂解物，并使用双荧光素酶报告系统检查荧光素酶活性。

裸鼠成瘤试验

裸鼠分为si-NC组和si-GNA13组，每组5只。用1ml注射器吸取0.2ml转染上述siRNA的Fadu细胞0.2ml，将肿瘤细胞接种到裸鼠的右前肢中，浓度为1×10⁶个细胞/ml。接种后每4天测量一次肿瘤体积。第20天处死裸鼠，取出皮下肿瘤组织，称量肿瘤组织重量。

统计分析

采用SPSS 21.0软件(Chicago,Chicago,IL,United States)进行统计分析。使用GraphPadPrism 5.0(GraphPad Inc.，La Jolla,CA,United States)进行绘图。统计分析采用学生t检验和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均至少进行三次，所有数据均以均数±标准差表示。

实施例1 GNA13在HNSCC中的高表达

GSE6631微阵列数据包含22例HNSCC患者的肿瘤样本和正常样本。用R软件对微阵列数据进行整理和分析。利用R软件包绘制了10℃的热图和火山图，结果显示GNA13在HNSCC组织中的表达与正常组织相比存在较高且显著的差异(图1A,图1B)。本发明利用UALCAN数据库分析了GNA13与HNSCC患者临床病理参数的相关性，结果显示GNA13在HNSCC样本中的表达明显高于正常样本(P<0.001)。肿瘤分级研究显示，GNA13在恶性肿瘤中的表达明显高于低恶性肿瘤(P<0.001)。肿瘤分期研究显示，GNA13在中晚期的表达明显高于早期(P<0.001)。GNA13在所有淋巴结转移阶段的表达也明显高于正常样本(P<0.001)。以上结果提示GNA13在HNSCC发展中的潜在功能(图1C、图1D、图1E、图1F)。通过这些实验，本发明通过Kaplan-Meier Plotter数据库检测GNA13的表达与HNSCC患者预后的相关性。Kaplan-Meier曲线显示，GNA13低表达患者的生存率明显高于GNA13高表达患者(P<0.05)。这些结果表明GNA13可能对HNSCC的进展起着重要作用(图1G)。本发明通过免疫组化和Western blotting检测GNA13在HNSCC组织中的表达，结果显示GNA13在HNSCC组织中的表达明显高于正常组织(P<0.01)(图1H、图1I、图1J)。

实施例2GNA13调控HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭

本发明首先检测了GNA13在NOK、TU212、TU686和Fadu细胞系中的表达，结果显示GNA13的表达水平明显较高，特别是在Fadu细胞系中(P<0.001)。因此，本发明选择Fadu细胞进行后续实验(图2A,图2B)。为了进一步证实GNA13对HNSCC细胞的功能作用，本发明以NOK细胞为对照，在Fadu细胞系中沉默GNA13，发现GNA13在Fadu细胞中显著降低(P<0.001)(图2C,图2D)。集落形成实验结果显示，与对照组相比，GNA13敲低也显著降低了Fadu细胞的增殖能力(P<0.001)(图2E)。接下来，本发明通过CCK-8法评估GNA13基因敲除后细胞活力的变化。与对照组相比，GNA13敲低显著降低了Fadu细胞活力(P<0.001)(图2F)。然后，通过伤口愈合实验评估GNA13对细胞愈合能力的影响，结果显示，与对照组相比，GNA13敲低也抑制了Fadu细胞的愈合能力(P<0.05)(图2G)。Transwell法检测GNA13对细胞迁移和侵袭能力的影响，类似结果证实，敲低GNA13可显著降低Fadu细胞的迁移和侵袭能力(P<0.001)(图2H,图2I)。最后，Western blotting结果显示，敲低GNA13可逆转Fadu细胞上皮间质转化(P<0.001)(图2J)。

实施例3外泌体-GNA13诱导成纤维细胞转化，促进成纤维细胞增殖和迁移

本发明进一步研究了GNA13和外泌体对成纤维细胞的影响。本发明首先从Fadu细胞分离出外泌体(si-NC Exo)和GNA13敲除后的Fadu细胞分离出外泌体(si-GNA13 Exo)。这些材料的TEM分析表明，分离的外泌体的形态是典型的椭圆形囊泡(图3A)。然后通过纳米颗粒示踪分析(NTA)追踪外泌体的大小分布，si-NC Exo的直径为70.77±18.45nm,si-GNA13Exo的直径为67.92±16.68nm(图3B)。然后，本发明通过Westernblotting检测外泌体标记蛋白的表达，结果显示两组外泌体均表达CD9、CD63和CD81蛋白。同时，Westernblotting结果显示，GW4869抑制剂显著抑制外泌体标记蛋白的表达(P<0.001)。此外，与si-GNA13 Exo相比，si-NC Exo的GNA13表达水平显著升高(P<0.001)，而添加GW4869抑制剂后si-NC Exo的GNA13表达水平显著降低(P<0.001)(图3C)。为了验证外泌体是否与成纤维细胞相互作用，本发明将PKH26标记的外泌体添加到成纤维细胞中，并在体外与成纤维细胞共培养24小时。在共聚焦显微镜下观察成纤维细胞对外泌体的摄取，结果显示成纤维细胞中有红色信号，表明外泌体被有效内化成纤维细胞(图3D)。通过Western blotting和qRT-PCR检测与外泌体共培养的成纤维细胞中GNA13的表达，结果表明si-NC Exo组细胞中GNA13的表达水平明显高于si-GNA13 Exo组(P<0.001)(图3E,图3F)。为了研究GNA13是否通过外泌体的产生作用于成纤维细胞，本发明对与外泌体共培养后的成纤维细胞进行了Western blotting。结果表明，si-NC Exo组细胞中α-SMA和Vimentin的表达水平明显高于si-GNA13 Exo组(P<0.001)。添加GW4869抑制剂后，si-NCExo+GW4869组细胞中α-SMA和Vimentin的表达水平显著降低(P<0.001)，提示GNA13可能通过外泌体诱导成纤维细胞转化为转移相关成纤维细胞(mats)(图3G)。然后，本发明探讨了成纤维细胞与外泌体共培养后增殖和迁移能力的变化。CCK-8实验结果显示，si-NC Exo组的成纤维细胞活力高于si-GNA13 Exo组(P<0.001)，但在si-NC Exo组中加入GW4869抑制剂后，成纤维细胞活力下降(P<0.001)(图3H)。集落形成实验结果显示，si-NC Exo组成纤维细胞的增殖能力明显高于si-GNA13 Exo组，添加GW4869抑制剂后si-NC Exo组细胞的增殖能力明显降低(P<0.001)(图3I)。Transwell实验结果显示，si-NC Exo组的成纤维细胞迁移能力明显高于si-GNA13 Exo组，添加GW4869抑制剂后，si-NC Exo组细胞的迁移能力明显降低(P<0.001)(图3J)。上述结果表明，GNA13可以通过Fadu细胞源性外泌体诱导成纤维细胞转化，促进成纤维细胞增殖和迁移。

实施例4外泌体-GNA13调节成纤维细胞中miR-26a-5p/STRADB轴

本发明结合miRCancer、TargetScan、PicTar三个生物信息学分析软件对HNSCC中GNA13高表达的预测和筛选结果，得到GNA13可能靶向调控的mirna。为了验证GNA13是否可以调节miR-26a-5p，本发明在成纤维细胞中过表达GNA13,Western blotting显示ov-GNA13组细胞中GNA13的表达明显高于对照组(P<0.001)(图4A)。通过qRT-PCR检测GNA13过表达后成纤维细胞中miR-26a-5p的表达，结果显示，处理后miR-26a-5p的表达明显降低(P<0.001)(图4B)。然后，本发明检测了miR-26a-5p在与外泌体共培养后的成纤维细胞中的表达，qRT-PCR结果显示，si-NC Exo组的细胞中miR-26a-5p的表达明显低于对照组(P<0.001)。

此外，加入GW4869抑制剂后，si-NC Exo组表达的细胞中miR-26a-5p的数量显著增加(P<0.001)，而si-GNA13 Exo组的表达无显著差异(图4C)。之后，本发明利用三个miRNA靶基因预测数据库(TargetScan、miRDB和starBase)的交叉预测miR-26a-5p的候选靶基因，确定miR-26a-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因检测显示，STRADB mRNA 3'-UTR包含一个高度保守的miR-26a-5p结合位点，miR-26a-5p损害STRADB-wt的荧光素酶活性(P<0.05)，但对STRADB-mut的荧光素酶活性没有影响(图4D)。本发明还在成纤维细胞中沉默miR-26a-5p以检测STRADB表达的变化。结果显示，沉默miR-26a-5p后，STRADB的表达显著增加(P<0.001)(图4E,图4F)。随后，本发明将各组外泌体与成纤维细胞共培养，以探索STRADB在成纤维细胞中的表达。Western blotting和qRT-PCR显示，与si-GNA13 Exo组相比，si-NC Exo组细胞中STRADB的表达显著升高(P<0.001)，在添加外泌体抑制剂后再添加外泌体抑制剂，si-NCExo组细胞中STRADB的表达显著降低(P<0.001)(图4G,图4H)。综上所述，本发明的实验证实了GNA13通过外泌体调节成纤维细胞中miR-26a-5p/STRADB轴的表达。

实施例5在共培养条件下，过表达STRADB的成纤维细胞促进HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭

研究STRADB在成纤维细胞中的生物学作用的第一步是通过Westernblotting和qRT-PCR检测STRADB在成纤维细胞中的过表达效率。结果显示，ov-STRADB组细胞中STRADB的表达明显高于对照组(P<0.001)(图5A,图5B)。为了检验STRADB过表达后是否诱导成纤维细胞转化，本发明通过Westernblotting证实，与对照组相比，STRADB过表达后成纤维细胞中MAFs的标记蛋白α-SMA和Vimentin显著升高(P<0.001)(图5C)。CCK-8实验和集落形成实验证实了STRADB过表达对成纤维细胞活力和增殖的影响，结果显示与对照组相比，STRADB过表达显著促进了成纤维细胞的活力和增殖(P<0.001)(图5D，图5E)。此外，Transwell迁移实验证实了过表达STRADB对成纤维细胞迁移的影响，证实过表达STRADB显著促进成纤维细胞的迁移(P<0.01)(图5F)。为了进一步证实过表达STRADB的成纤维细胞对HNSCC细胞生物学行为的影响，本研究利用条件培养液和建立共培养系统对其进行了探索。集落形成和CCK-8检测结果表明，Fadu细胞(si-NC/si-GNA13)与表达STRADB的成纤维细胞共培养后，其增殖能力和细胞活力均显著高于对照组(P<0.001)(图5G，图5H)。Transwell实验结果显示，Fadu细胞(si-NC/si-GNA13)与高表达STRADB的成纤维细胞共培养后，其迁移和侵袭能力明显高于对照组(P<0.001)(图5I)。Western blotting结果显示，Fadu细胞(si-NC/si-GNA13)与高表达STRADB的成纤维细胞共培养后，其上皮间充质转化能力明显高于对照组(图5J)。综上所述，在共培养条件下，高表达STRADB的成纤维细胞促进了Fadu细胞的增殖、迁移和侵袭，并可以逆转GNA13缺失对Fadu细胞生物学行为的影响。

实施例6GNA13对HNSCC裸鼠移植瘤生长的调控作用

为了检测GNA13对HNSCC体内生长的影响，本发明将基因敲除的GNA13Fadu细胞和对照Fadu细胞分别移植到裸鼠体内。测定小鼠肿瘤体积和重量，监测移植瘤的生长情况。结果显示，与对照组相比，基因敲除GNA13对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用(P<0.001)(图6A、图6B、图6C)。随后对移植瘤细胞进行Ki67染色和EMT标志物蛋白检测，以反映细胞增殖和EMT状态。结果显示，GNA13基因敲除细胞Ki67阳性细胞的平均光密值(P<0.001)和细胞的EMT能力(P<0.05)均显著低于对照组(图6D，图6E)。最后，本发明还检测了标记蛋白GNA13、STRADB和MAFS在肿瘤组织中的表达。结果显示，GNA13基因敲除的细胞中上述蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.001)(图6)。综上所述，已证实GNA13在体内可以影响HNSCC的生长并调节特定蛋白的表达。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.标志物的抑制剂在制备治疗头颈部肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的标志物包括GNA13、或STRADB。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的头颈部肿瘤为咽鳞癌。

4.一种筛选治疗头颈部肿瘤的药物的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)用待测物质处理表达或含有GNA13、或STRADB的体系；

(2)检测步骤(1)所述的体系中GNA13、或STRADB的表达水平；

5.检测受试者样本中标志物表达水平的试剂在制备诊断头颈部肿瘤或预测头颈部肿瘤患者预后的产品中的应用，其特征在于，所述的标志物包括GNA13、或STRADB。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括：

与所述的标志物的基因特异性结合的引物或探针；

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

8.如下所述的应用：

(3)GNA13在抑制成纤维细胞中miR-26a-5p的表达水平中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的头颈部肿瘤细胞包括Fadu细胞。

10.一种调节成纤维细胞中miR-26a-5p/STRADB轴的表达的方法，其特征在于，所述的方法包括：

1)从GNA13敲除后的Fadu细胞中分离出外泌体；

2)将1)中获得的外泌体与成纤维细胞共培养。