CN115232874B - 长链非编码rna在调控卵巢癌进展中的应用 - Google Patents

长链非编码rna在调控卵巢癌进展中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于卵巢癌治疗和诊断的新型生物标志物LncOVM。本发明提供LncOVM在评估卵巢癌发病进展中的应用，其表达量可用于判断卵巢癌的转移和预测卵巢癌患者生存与预后情况。

Description

长链非编码RNA在调控卵巢癌进展中的应用
.本申请要求2021年09月24日提交的中国发明专利申请【202111119416.1】、名称为“长链非编码RNA在调控卵巢癌进展中的应用”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入
技术领域
.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于卵巢癌治疗和诊断的新型生物标志物。
背景技术
.卵巢癌是全球妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。在北美晚期确诊患者中5年生存率低至47％，超过75％的患者由于无临床症状和在卵巢癌早期缺乏有效的筛查方法而使他们确诊时发现多处于晚期(III/IV期)。因此，建立卵巢癌早期诊断系统，探索和开发阻断卵巢癌进展的新型靶向药物至关重要。
.研究参与卵巢癌进展的关键调控因子是必要的。长链非编码RNA(Longnoncoding RNAs,LncRNA)是非编码RNA的一个亚类，它由200个以上核苷酸组成，没有编码蛋白质的能力。LncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而目前的研究表明，数量可观的LncRNA参与了包括发育、免疫反应和肿瘤发生在内的各种生理和病理过程，并在调控异常癌细胞的信号通路中发挥重要的功能作用，且大部分LncRNA具有组织特异性。但是目前很少有研究探讨LncRNA如何调节卵巢癌进展。
.RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。利用质粒、病毒或细菌载体将短发夹RNA(shRNA)导入细胞，经细胞内加工处理后可形成与靶基因mRNA互补结合的短序列RNA分子，进而抑制靶基因蛋白质翻译，持续性地、特异性地干扰靶基因的表达。
.综上，本发明揭示了LncRNA在调控卵巢癌进展中的作用，提供一种诊断和辅助治疗的技术方案，以期缓解现有技术的不足。
发明内容
.有鉴于此，本发明的目的在于提供LncOVM在评估卵巢发病进展中的应用，具体技术特征如下。
.LncOVM在评估卵巢癌发病进展中的应用，所述LncOVM作为一种生物标志物，所述LncOVM的表达量可用于判断卵巢癌的转移和预测卵巢癌患者生存与预后情况。
.进一步，所述LncOVM的高表达可用于提示卵巢癌的正向进展。
.进一步，所述LncOVMH的高表达提示处于卵巢癌FIGOⅢ期或Ⅳ期。
.一种检测卵巢癌发病进展的试剂盒，所述试剂盒可用于检测卵巢癌患者交界组织和癌组织中的LncOVM表达；所述试剂盒包含合成LncOVM分子的引物，所述引物包括SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示的全长或片段。
Seq ID NO.1 LncOVM-F1 TGACGCGAACCTAGAGAAGC
Seq ID NO.2 LncOVM-R1 CAAGCCCGGATCTATTCCCC
Seq ID NO.3 LncOVM-F2 ACTGCACTGTGGGACAATCC
Seq ID NO.4 LncOVM-R2 ATCACCCTGAGTTTGCGGAG
Seq ID NO.5 LncOVM-F3 GGGGAATAGATCCGGGCTTG
Seq ID NO.6 LncOVM-R3 ATTCAGGACCAGTGACGGTG
.所述交界组织(borderline tissue)即为交界性肿瘤组织，其恶性程度更低，没有间质浸润。
.进一步，所述试剂盒还包含qRT-PCR试剂。
.靶向LncOVM的小干扰RNA在制备卵巢癌靶向治疗药物中的应用，所述小干扰RNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和/或SEQ ID NO.10所示的全长或片段。
Figure BDA0003663504940000031
.进一步，所述药物通过所述小干扰RNA靶向敲低LncOVM基因的表达来抑制卵巢癌细胞对周边组织的侵袭。
.进一步，所述药物通过所述小干扰RNA靶向敲低LncOVM基因的表达来抑制卵巢癌细胞的迁移。
.一种治疗卵巢癌的药物，所述药物包含如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和/或SEQ ID NO.10所示的全长或片段的小干扰RNA和药学上可接受的载体或助剂。
.进一步，所述卵巢癌为卵巢上皮癌。
.有益技术效果
.本发明揭示了长链非编码RNA分子LncOVM在卵巢癌转移过程中的生物学功能及应用。其在卵巢癌患者(特别是晚期患者)肿瘤组织中(高)表达，以及调控下游关键分子及信号通路。本发明提出LncOVM作为新型卵巢癌治疗靶标在临床应用中具有价值。本发明揭示的重点包括：
.1)LncOvM与卵巢癌转移及卵巢癌患者生存与预后具有相关性；
.2)LncOvM在卵巢癌侵袭和转移过程中具有重要意义；
.3)LncOvM相互作用蛋白解析及生物学功能验证对卵巢癌发生发展有显著影响。
附图说明
.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
.图1a：LncRNA在人转移性卵巢癌原始病灶和转移病灶之间的表达情况(黑点表示具有统计学意义上调(右)和下调(左)的lncRNA)；
.图1b：LncRNA阵列分析和RT-qPCR数据显示了参与卵巢癌进展的前10位上调的LncRNAs；
.图1c：LncOVM在卵巢癌患者正常组织、交界性肿瘤组织和普通肿瘤组织中的相对表达量(各部分组织的病理判定来自四川大学华西第二医院病理科专家的病理结果，交界组织通常恶性潜能更低)；
.图1d：卵巢癌患者(每组n＝20)总生存期和无进展生存期Kaplan-Meier生存曲线；
.图1e：根据FIGO分期、疾病进展(PD)和肿瘤直径的进行卵巢癌患者分析；
.图2a：LncOVM在人上皮卵巢癌细胞A2780s和SKOV3中的相对表达水平；
.图2b：转染siLncRNA(siLncOVM-1和siLncOVM-2)或阴性对照(siNC)的A2780s细胞中LncOVM的相对表达水平；
.图2c：Transwell试验原理图；
.图2d：siLncRNAs或siNC处理的A2780S和SKOV3细胞Transwell实验；
.图2e：A2780s和SKOV3细胞划痕实验；
.图2f：A2780s和SKOV3细胞克隆形成实验；
.图3a：腹腔内接种模型腹水体积；
.图3b：腹腔内接种模型腹腔内转移结节(转移灶)的数量；
.图3c：裸鼠腹腔接种A2780s细胞后的Kaplan-Meier生存曲线；
.图3d：A2780s皮下接种模型小鼠肿瘤生长曲线；
.图3e：皮下接种小鼠模型肿瘤组织的重量；
.图3f：LncOVM敲除组裸鼠皮下移植瘤组织免疫组化染色及统计分析。
具体实施方式
.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围
Figure BDA0003663504940000071
的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
.实施例一
.实验方法
.1.LncRNA芯片分析
.人类LncRNA芯片V3.0(Arraystar Inc.)由中国上海康晨生物科技有限公司(KangChen Bio-Tech，China)开发。使用安捷伦扫描仪G2505B(安捷伦科技)对阵列进行扫描，使用安捷伦特征提取软件(版本10.7.3.1；安捷伦科技)。使用Gene Spring GX v11.5.1软件包(安捷伦科技)进行分位数归一化和后续数据处理。微阵列数据在基因表达综合数据库(GEO)的登录号:GSE82059
.2.实时荧光定量PCR
.用TaKaRa试剂盒按照说明书提取细胞总RNA。逆转录采用PrimeScript逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)，qRT PCR采用iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美国)，CFX96 Touch Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad，美国)。数据采用2-ΔΔCt法进行分析。
.3.细胞培养
.从ATCC中获得人卵巢癌细胞系SKOV3、A2780s和人正常细胞系293T。小鼠卵巢癌细胞株ID8由四川大学生物治疗国家重点实验室赠送。细胞系保持在Dulbecco’s ModifiedEagle培养基(DMEM,Gibco,USA)中，含10％胎牛血清，100U/mL青霉素G,100mg/mL链霉素，5％CO2,37℃中培养。
.4.动物实验
.所有动物实验均经四川大学机构伦理委员会审核批准。采用5-6周龄、16-20g的雌性无胸腺BALB/c裸鼠，腹腔内建立人卵巢癌异种移植瘤模型,在试验周期结束后，处死小鼠，统计转移结节的数目和腹水体积。在皮下肿瘤模型中，将1×107A2780s细胞接种于裸鼠(雌性，5-6周龄，各16-20g)的右侧，将1×107ID8细胞接种于C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄，各18-20g)的右侧。
.5.临床样本
.选取四川大学华西第二医院、华西妇幼医院的45例卵巢癌患者的组织样本及配对组织。所有样本均由妇科医生获得，并经病理学家检查，确证临床样本的诊断。新鲜的组织被冷冻在液氮中，以保护蛋白质或RNA不被降解。本发明的研究获得四川大学伦理委员会批准。所有患者在分析前均获得知情同意。
.6.细胞转染
.根据制造商协议，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,USA)在细胞中转染siRNA或质粒。LncOVM全长质粒和片段购自青岛青岛生物科技有限公司，siRNAs购自中国广州RiboBio有限公司。sh-LncOVM、Lentiviral shPPIP5K2、ole-ppip5k2质粒购自上海综合生物技术有限公司。
.7.细胞增殖实验
.将等量的细胞接种于96孔板，培养24小时或48小时。MTT试剂测定细胞活力。5mg/ml MTT在37℃孵育箱中孵育4小时，590nm处测定吸光度。
.8.集落形成实验
.将细胞接种到6孔板(100、200或500个细胞/孔)中进行集落形成实验。在37℃培养箱中培养7天。随后，将集落在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用5％结晶紫染色10分钟。使用ImageJ对集落数量进行计数。
.9.Transwell实验
.原理：主要材料是Transwell小室，底层是一张有通透性的膜，该实验中孔径为8.0μm。上室种入数量合适的肿瘤细胞，下室加入10％FBS，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁徙，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
.收集A2780s和SKOV3细胞(每孔1×104个细胞)，用无血清DMEM接种到细胞悬液(24孔，PET，8um，Millipore)中，细胞悬液置于24孔板上腔室。底部腔室含有10％胎牛血清的DMEM。细胞在37℃孵育24小时后，侵袭性细胞附着在膜的下表面。拭子除去上层细胞和培养基，4％多聚甲醛室温固定15min,5％结晶紫室温染色10min。使用ImageJ对细胞数进行计数。
.10.细胞划痕试验
.将细胞以相似的密度接种于6孔板中。在空白培养基中培养24小时后，用10μl移液管尖端产生一个模拟伤口的直划痕。细胞用培养基冲洗两次以去除任何漂浮的细胞，然后在培养基中培养。观察各时间点创面愈合情况，并拍摄抓痕部位。每种条件下设置3个复孔，每个实验进行3次。
.11.Western Blot
.在4℃的条件下，用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞内蛋白。从条件培养基中收集细胞外蛋白，用30K超滤离心装置(Thermo Scientific Pierce)在4000rpm下离心100倍浓缩。每个条件培养基样品为无血清的DMEM-flex培养基，与A2780s细胞(3×108)孵育48小时。蛋白质点入10％的SDS-PAGE凝胶中，并转移到硝化纤维素膜上。细胞膜与一抗在4℃状态下孵育过夜，并与二抗在室温下孵育2小时。β-Tubulin的表达作为负载对照。
.抗体信息如下：PPIP5K2(1:1000,Abcam,ab204374),β-Tubulin(1:1000,Proteintech,11224-1-ap),C5(1:500,Santa Cruz,SC-70476)。
.12.RNA pull-down实验(下拉实验)和质谱分析
.使用RiboTM RNAmax-T7生物素标记转录试剂盒(R11074,RiboBio Co.，Ltd,Guangzhou,China)体外转录和纯化生物素标记的LncOVM和反义RNA。RNA在pull-down之前需要在结构缓冲液(10mM Tris,0.1M KCl,10mM MgCl2)中90℃再折叠2分钟，冰敷2分钟，然后室温下保存30分钟。将抗RNase、蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物加入裂解液中制备用于pull-down实验的细胞裂解缓冲液，并与生物素标记的RNA(50pmol)在4℃条件下孵育过夜。按照说明书制备Dynabeads MyOneTM Streptavidin C1(Invitrogen,65002)。立即将磁珠加入混合物中，然后在4℃孵育过夜。经磁珠分选出的蛋白质进一步进行质谱分析。
.13.体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术(Isobaric tags for relativeand absolute quantitation,iTRAQ)
.通过iTRAQ分析来自对照和PPIP5K2缺失细胞的条件培养基中的分泌蛋白。A2780s细胞(5×107)在无血清的DMEM-Flex培养基中培养48小时，收集条件培养基。采用ABSCIEX TripleTOF 5600plus在武汉基因创生物工程有限公司进行蛋白鉴定。
.14.免疫组化
.4％多聚甲醛室温固定小鼠ID8肿瘤组织24小时。使用一抗E-cadherin(1:100,ZSGB-BIO,za-0565)，Ki-67(1:100,ZSGB-BIO,zm-0167)和Vimentin(1:100,ZSGB-BIO,za-0511)在石蜡切片上对目标分子进行免疫组化染色，并分析。
.15.透射电镜
.2.5％戊二醛室温固定细胞30分钟。用电子显微镜(TEM Hitachi H-7650)进行图像采集，使用ImageJ对高尔基体结构进行定量分析。
.16.免疫荧光
.6孔板培养的A2780s和293T细胞在4％多聚甲醛中室温固定30分钟。小鼠ID8肿瘤组织在室温下4％多聚甲醛固定24小时，在30％蔗糖中脱水48小时以上。将准备好的组织置于-80℃冷冻保存，在-25℃条件下将组织包埋于OCT，切成8.0mm的切片，晾干30分钟。切片和细胞在含0.5％Tritonx-100的PBS中浸泡15分钟，并用PBST(0.1％Tween 20的PBS)洗涤。在室温下用5％山羊血清封闭30分钟。一抗抗体信息主要包括:P230(Biolegend,611280,1:100)，Golph3(Abcam,ab91492,1:100)，PPIP5K2(Abcam,ab204374,1:100)，C5aR(Proteintech,21316-1-AP)，Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(Biolegend,108401,1:100)，CD45(Biolegend,103132,1:100)，CD11c(BD,553801,1:100)，F4/80(Biolegend,123116,1:100)，SMA(ZSGB-BIO,zm-0003,1:100)4℃孵育过夜。使用适当的Alexa fluor标记的二抗(Invitrogen,1:500)来检测一抗。洗片后DAPI孵育5分钟。
.17.荧光原位杂交(FISH)
.PPIP5K2过表达A2780s细胞和293T在1×PBS中短暂冲洗，室温下4％多聚甲醛固定10分钟。细胞在含0.5％Triton X-100的1×PBS中，于4℃保持5分钟打孔，然后用1×PBS洗5分钟，加入200μL预杂交缓冲液于37℃保持30分钟。将混合液加入RiboTMLncRNA FISH试剂盒(C10910,RiboBio有限公司、广州、中国)的FISH探针，放于湿盒中，37℃过夜杂交。用Wash Buffer I(含0.1％Tween-20的4×SSC)，Wash Buffer II(2×SSC)，Wash Buffer III(1×SSC)于42℃湿盒中清洗玻片3次，每次5分钟，后用1×PBS在室温下洗涤1次。LncOVM-Cy3 FISH探针由RiboBio公司设计合成，所有图像均由LSM710共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss)获得。
.18.流式细胞术
.以C57BL/6小鼠ID8肿瘤组织为原料制备单细胞悬液。使用灭菌眼科剪手动剪碎组织，然后加入含2.0mg/ml胶原酶A(Roche)和50U/ml DNase I(Roche)的无血清DMEM，使用连续旋转仪器(Invitrogen)进行37℃60分钟的酶解，肿瘤消化液通过70毫米尼龙过滤器(BD Biosciences)过滤。随后，细胞用100ml荧光偶联抗小鼠抗体孵育30分钟:C5aR(1:100,proteintech,21316-1-AP)，PE-Ly-6G/Ly-6C(GR1,1:100,BD,553128)，FITC-CD11b M1/70(1:100,BD,553310)。然后用PBS清洗细胞一次。清洗后，使用FACS Diva软件(BDBiosciences)在BD Fortessa上采集数据。使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)进行分析。
.19.数据分析
.采用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)对所有数据进行正态分布和等方差评估。相关分析采用线性回归分析。两组间比较采用学生t检验，多组间比较采用单因素方差分析。不同治疗组的生存率采用Kaplan-Meier分析。澳大利亚卵巢癌研究(AOCS)数据集(n＝285)、癌症基因组图谱(TCGA)数据集(n＝565)采用在线数据库(www.kmplot.com)进行Kaplan-Meier生存分析。根据数据库中自动选择的最佳截断值，将患者分为“低”和“高”表达。这两个数据集患者的临床分期从FIGO阶段I到阶段IV。p值采用log-rank(Mantel-Cox)检验计算，将患者按中位数分为“低”和“高”表达。
.对于数据集分析，一般的阈值是差异倍数>1.5或差异倍数<0.7,p值<0.5。当*p值<0.05时，所有数据均被认为具有显著性。
.实施例二
.实验内容
.1.LncOvM与卵巢癌转移及卵巢癌患者生存与预后的相关性
.为了探索可能参与卵巢癌进展的LncRNA候选基因，本发明使用LncRNA芯片分析了卵巢癌高转移性组织和亲代卵巢癌组织中LncRNA的表达。通过火山图分析(图1a)，本发明筛选出10个上调程度最高的LncRNAs(RP11-149I23.3、LncOvM、RP11-90D4.2、XLOC_011826、AC073135.3、AC010226.4、PLAC2、BC039356、RP11-333E1.2、RP11-313F23.3)。在这些LncRNAs中，通过qRT-PCR分析发现，LncOVM的表达在高转移性组织中比亲代组织中显著升高(图1b)。
.为了进一步研究LncOVM在卵巢癌患者中的临床重要性，根据临床病理判断收集了15例卵巢癌患者的正常、交界和癌组织，采用qRT-PCR检测LncOVM的表达水平。结果发现，卵巢癌患者的交界性组织中LncOVM的表达明显高于正常组织(P＝0.0001)，癌组织中LncOVM的表达也明显高于交界性组织(P＝0.0005)(图1c)。结果提示LncOVM的表达可能与卵巢癌的进展呈正相关。值得注意的是，LncOVM在交界性组织中表达上调，提示LncOVM高表达的卵巢癌影响肿瘤周围环境，提示LncOVM与卵巢癌转移相关。此外，本发明还分析了另外40例卵巢癌患者的信息，将其分为LncOVM高表达队列(LncOVMHigh,n＝20)和LncOVM低表达队列(LncOVMLow,n＝20)。患者Kaplan-Meier分析显示，LncOVMHigh组与LncOVMLow组相比，总体生存分析显示生存率(Overall survival,上图)极低[P＝0.0018,HR＝4.2(1.5-11.06)，图1d]。同样，LncOVM水平较低的患者无进展生存期(progression-free survival,下图)更长[P＝0.0067,HR＝5.09(1.41-26.24)，图1d]。
.同时根据卵巢癌患者的临床数据，本发明发现高LncOVM与较差的临床表现相关(图1e)。即，在LncOVMHigh队列中，大多数患者处于卵巢癌晚期(FIGOⅢ期和Ⅳ期)，提示肿瘤有严重转移或扩散(P＝0.0014)。此外，高LncOVM水平也与疾病进展(PD,P＝0.0221)和大块肿瘤(肿瘤直径＞5cm,P＝0.033，图1e)相关。
.以上结果表明LncOVM在卵巢癌组织中过表达，与卵巢癌预后不良相关。因此，本发明将重点研究LncOVM在卵巢癌中的作用机制。
.2.LncOVM促进卵巢癌细胞的发展
.由于LncOVM对患者的显著影响，本发明预测LncOVM在卵巢癌中可能与转移相关。因此本发明设计了两种靶向LncOVM的siRNA,分别是LncOVM-1(5’-GGCUCCUUGAGAGAGAAAUTT-3’)和LncOVM-2(5’-GGACUGACUUUGUGACUUUTT-3’)，并分别转染人卵巢癌细胞系A2780s和SKOV3，这两种细胞系均为侵袭性上皮细胞，其LncOVM的表达水平相似(图2a)。两种siRNA都能够有效地敲低LncOVM的表达(图2b)。Transwell侵袭实验显示，LncOVM表达下降显著降低了A2780s和SKOV3细胞的侵袭能力(图2c和2d)。同时，本发明通过细胞划痕实验证实，在两种细胞系中，LncOVM被抑制的细胞的迁移率均显著低于对照组细胞(siNC)(图2e)。因此，LncOVM表达的下调降低了人卵巢癌的转移能力(图2f)。
.3.LncOVM调控卵巢癌转移和肿瘤发生因为LncOVM在转移级联中触发多个步骤，诱导肿瘤微环境重塑，与预后不良密切相关。腹腔广泛播散和转移引起肠梗阻，弥漫性腹膜增厚，严重腹水。本发明接下来研究了LncOVM在体内的作用，裸鼠腹腔内接种LncOVM敲除或对照的A2780s细胞培养3周。在实验周期结束时，与对照组相比，本发明提供的LncOVM敲除组的小鼠体内产生更少的腹水(P＜0.01)和转移性结节(P＜0.001)(图3a和3b)。此外，另外12只小鼠腹腔内接种了LncOVM敲除的A2780s细胞，相比接种了对照细胞的小鼠，其存活率更高(图3c)。这些结果与上述结果一致，提示LncOVM可促进卵巢癌腹膜转移。另外，将敲除LncOVM的A2780s细胞和对照细胞分别接种到裸鼠的右侧皮下，通过测量肿瘤体积和重量(P＜0.01，图3d和3e)，LncOVM敲除组的肿瘤体积和重量比对照组更低，与上述结果一致。通过免疫组化染色，LncOVM敲除组裸鼠皮下移植瘤组织显示E-cadherin表达增加，vimentin表达降低(图3f)。这些结果表明，LncOVM可能通过促进肿瘤转移和肿瘤增殖来促进人卵巢癌的发生发展。
.E-cadherin在细胞连接中扮演重要角色，保证了细胞在组织中彼此结合。癌症的发展和转移牵涉了E-cadherin功能或表达的缺失。E-钙黏素下调降低了一个组织内细胞黏附的强度，导致细胞活动性(motility)增加。这可以转而允许癌细胞穿过基底膜入侵周围组织。而vimentin是一种中间丝蛋白，是间质细胞骨架的主要组成部分。大量研究表明vimentin与肿瘤的发生、发展和侵袭转移密切相关。
.结论
.在本发明中，经过大量卵巢癌临床样本信息分析后，发现一个LncRNA,即LncOVM，其在卵巢癌患者不同组织中表达水平不同，并且与卵巢癌患者的进展、预后显著相关。本发明通过生物信息学分析，发现LncOVM的表达量越高，预后越差，呈显著负相关。在此基础上进行多种体外实验验证，发现降低卵巢癌细胞中LncOVM的表达可以显著抑制肿瘤细胞的生长和转移。
.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
.参考文献
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SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西第二医院
<120> 长链非编码RNA在调控卵巢癌进展中的应用
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Claims (5)

1.靶向LncOVM的小干扰RNA在制备卵巢癌靶向治疗药物中的应用，其特征在于，所述小干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过所述小干扰RNA靶向敲低LncOVM基因的表达来抑制卵巢癌细胞对周边组织的侵袭。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过所述小干扰RNA靶向敲低LncOVM基因的表达来抑制卵巢癌细胞的迁移。
4.一种治疗卵巢癌的药物，其特征在于，所述药物包含如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示的小干扰RNA和药学上可接受的载体或助剂。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，所述卵巢癌为卵巢上皮癌。
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