CN113025614B

CN113025614B - 一种胶质瘤诊断和/或预后评估标志物及其应用

Info

Publication number: CN113025614B
Application number: CN202110304242.XA
Authority: CN
Inventors: 钟金晶
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN113025614A

Abstract

本发明提供了一种胶质瘤诊断和/或预后评估标志物paRNA GLI1‑NC1，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，能够调控GLI1的表达。本发明还提供了一种胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒，包括任选的用于检测paRNA GLI1‑NC1和/或GLI1表达水平的试剂，可以高度有效地对胶质瘤进行诊断和预后评估。进一步地，paRNA GLI1‑NC1还可作为胶质瘤疾病治疗的靶标，paRNA GLI1‑NC1抑制剂可以抑制paRNA GLI1‑NC1、GLI1的表达，抑制胶质瘤细胞增殖，可应用于胶质瘤治疗药物中，具有优异的临床应用价值。

Description

一种胶质瘤诊断和/或预后评估标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种胶质瘤诊断和/或预后评估标志物及其应用。

背景技术

胶质肿瘤(glioma)是人中枢神经系统中常见的原发性肿瘤，其中具有侵袭/恶性生物学特征的弥漫浸润性胶质肿瘤(diffusely infiltrating gliomas) 约占70％，主要包括弥漫型星形细胞瘤(WHO II级)、间变型星形细胞瘤(WHO III级)和胶质母细胞瘤(WHOIV级)、少突胶质瘤(WHO II级)、间变型少突胶质瘤(WHO III级)等。以胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)恶性程度最高。尽管外科手术、放疗和化疗等方面的进步使治疗效果有提高，但总体治疗效果仍不理想。探索胶质肿瘤发生发展机理，寻找有效的治疗靶点，是近年来胶质肿瘤研究的主要方向。

GLI1是Hedgehog信号通路最关键的激活因子，其异常活化可导致胶质瘤的恶性生物学行为生成。在胶质母细胞瘤中，GLI1过表达与肿瘤血管生成、增殖和局部侵袭有关，可促进干细胞标志物如NANOG的表达促进胶质瘤细胞球形成。而且，研究发现GLI1的表达与肿瘤复发正相关。然而，在胶质瘤中GLI1的表达调控机制不明确，目前已有调控机制有：Hedgehog通路中 PTCH突变激活GLI1、转录激活因子c-Myc、TWIST、USF、SP1和P65等激活GLI1转录。表观遗传调控主要是负调控GLI1表达，如Menin募集组蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5，介导H3R8和H3R4甲基化抑制GLI1表达。 MiR361、miR150和miR873在转录后水平调控GLI1。至今，其它ncRNA 是在转录水平还是表观遗传水平对GLI1进行调控尚不清楚。

近年来，转录组学发现大量来源于启动子区的非编码小RNA (promoter-associated RNAs,paRNAs)可对自身或者临近基因转录进行顺式 (in cis)调控，参与细胞增殖、周期、迁移、分化及干细胞维持等生物学过程。

然而目前针对paRNA在胶质瘤领域中的研究仍处于起步阶段，GLI1启动子区转录出的paRNA对GLI1的表达调控作用也尚未见报道。因此，探寻胶质瘤中paRNAs的分子基础具有重大意义。

发明内容

发明人前期研究借助全基因组水平筛选的方法，通过大量的研究实验，发现GLI1启动子区转录出长度为196nt的RNA(paRNA GLI1-NC1)，不具备编码蛋白的能力，因此是来源于启动子区的非编码小RNA (promoter-associated RNAs,paRNAs)，发明人研究了该paRNAs可作为胶质瘤诊断和/或预后评估的标志物的可能性，探寻了其对GLI1基因转录的调控机制以及对胶质瘤的影响，并且基于此提供了一种胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒。

本发明提供了一种调控GLI1基因转录的非编码小RNA：paRNA GLI1-NC1，它具有SEQ ID NO:1所示序列。

本发明还提供了一种胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒，它包括任选的用于检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂。

进一步地，上述检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂是检测paRNA GLI1-NC1所转录的RNA的试剂，优选为PCR方法用试剂或原位杂交探针，更优选为原位杂交探针。

进一步地，上述的试剂盒还包括任选的用于检测GLI1表达水平的试剂。

更进一步地，上述检测GLI1的表达水平的试剂是检测GLI1蛋白表达水平的试剂，优选为免疫组织化学检测方法用试剂，更优选为Western Blot或 ELISA检测方法用试剂。

本发明还提供了检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂在制备胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂和/或试剂盒中的应用。

本发明还提供了paRNA GLI1-NC1抑制剂在制备治疗胶质瘤疾病的药物中的用途。

进一步地，上述药物是抑制GLI1表达的药物；优选地，为抑制GLI1启动子区活性的药物。

更进一步地，上述药物是抑制胶质瘤细胞增殖的药物。

本发明还提供了一种治疗胶质瘤的药物，它含有paRNA GLI1-NC1抑制剂；优选地，它是抑制胶质瘤细胞增殖的药物。

实验结果表明，paRNA GLI1-NC1可以促进GLI1基因转录，进而促进胶质瘤的发生发展；因此，本发明检测paRNA GLI1-NC1的表达水平或联合检测GLI1及paRNA GLI1-NC1的表达水平的试剂盒可以高度有效地对胶质瘤进行诊断和预后评估。进一步地，paRNA GLI1-NC1还可作为胶质瘤疾病治疗的靶标，paRNA GLI1-NC1抑制剂可以抑制paRNA GLI1-NC1、GLI1的表达，抑制胶质瘤细胞增殖，具有优异的临床应用价值。

具体而言，本发明的有益效果包括：

1、本发明在浸润性胶质瘤和非肿瘤脑组织(non-neoplastic brain,NBT) 中特异性检测paRNA GLI1-NC1，提示胶质瘤患者肿瘤增殖、抗凋亡、侵袭能力及预后指标，有利于更好的随访。

2、本发明具有特异性强，切实的临床使用价值。除单独检测paRNA GLI1-NC1表达水平实现对胶质瘤的检测和预后评估外，还可通过paRNA GLI1-NC1 RNA及GLI1的双重检测增加临床应用的可行性和可信度，能够直接用于临床，具有直观、准确、高效性的优点。

3、本发明通过paRNA GLI1-NC1及GLI1表达谱分析、生物信息学、细胞实验及病例分析(79例弥漫浸润性胶质瘤病例和34例肺肿瘤脑组织)研究发现paRNA GLI1-NC1与GLI1的基因表达正相关，且在弥漫浸润性胶质瘤中高表达。paRNA GLI1-NC1与GLI1高表达的胶质瘤患者预后差。证实了paRNA GLI1-NC1可促进GLI1转录，在胶质瘤增殖、抗凋亡和迁移侵袭生成中发挥重要作用。paRNA GLI1-NC1可通过结合GLI1启动子区促进GLI1 转录，且荧光素酶报告基因验证了该结果，由此发现paRNA GLI1-NC1通过结合GLI1启动子促进GLI1转录，进而促进胶质瘤的发生发展。本发明可以高度有效的评估和预测诊断早期胶质瘤和预后，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

本发明所述GLI1是指：gene ID：ENSG00000111087。

本发明所述paRNA GLI1-NC1是GLI1启动子区转录出的，不具备编码蛋白的能力的非编码小RNA(promoter-associated RNAs,paRNAs)。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为paRNA GLI1-NC1转录示意图。5’非编码区：5’untranslated region,5’UTR；编码区：coding sequence，CDS；转录起始位点：transcription start site，TSS。

图2为核浆分离后显示NC1主要分布于核。对肿瘤细胞核浆分离后检测胞核(Nucleus，N)和胞浆(Cytoplasm，C)组分中NC1含量。左图为 RT-PCR结果，右图为Q-PCR结果。

图3为NC1和GLI1在胶质瘤中高表达。Q-PCR检测显示NC和GLI1 在胶质瘤中高表达；RNA-ISH检测显示NC1(紫蓝色杂交信号)在弥漫浸润性胶质瘤(glioma)中的表达明显高于胶质增生组织(gliosis)。甲基绿复染。 RNA-ISH，AP-NBT/BCIP。免疫组织化学检测显示GLI1蛋白(棕褐色阳性信号)在弥漫浸润性胶质瘤组织中表达高于胶质增生(gliosis)。苏木素复染。免疫组织化学，Envision法。大图×400，小图×1000。

图4为DSS和PFS单因素生存分析曲线

图5为NC1促进GLI1表达。选取干扰效果最好的si-NC1-2作为si-NC1 转染胶质瘤细胞，以一条无关序列作为对照(si-Con)。以pVAX1为载体的表达质粒转染胶质瘤细胞，以无插入片段的空载质粒作为对照(pVAX-Con)。 RT-PCR和Q-PCR检测NC1和GLI1 mRNA表达水平。Q-PCR柱状图显示 NC1和GLI1的相对拷贝数，Western blot柱状图是GLI1蛋白表达的半定量结果(以Blank组为1)，显示相对表达水平。si-NC1介导的NC1表达下调，明显抑制GLI1mRNA(RT-PCR和Q-PCR)和蛋白表达(Western blot和免疫细胞化学)；人工过表达NC1后，GLI1 mRNA(RT-PCR和Q-PCR)和蛋白表达回升(Western blot和免疫细胞化学)。免疫细胞化学，Envision法，×400。

图6为双荧光素酶报告基因实验显示NC1与GLI1启动子区相互作用

图7为干扰NC1抑制胶质瘤细胞增殖。siRNA下调NC1可抑制胶质瘤细胞生长；通过pVAX-NC1人工过表达NC1后，细胞增殖活力恢复。上图显示细胞克隆形成实验；中图显示EdU掺入实验，阳性信号为红色荧光，定位于细胞核(×400)；下图显示细胞生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

石蜡包埋组织样本：2013-2014年四川大学华西医院病理科存档石蜡包埋组织，包括弥漫浸润性胶质肿瘤75例，正常/胶质增生的非肿瘤脑组织 (non-neoplastic braintissue,NBT)34例。

本研究限定研究对象为弥漫浸润性胶质肿瘤中的弥漫型星形细胞瘤 (WHO II级)、间变型星形细胞瘤(WHO III级)和GBM(WHO IV级)。按WHO 2007诊断标准诊断。75例弥漫浸润性胶质肿瘤均行手术切除。患者年龄平均46.3±16.3岁。包括弥漫浸润性星形细胞瘤(WHO II级)26例 (34.7％)，间变型星形细胞瘤(WHO III级)25例(33.3％)，GBM(WHO IV级)24例(24.32％)。截止2017年10月1日，对所有病例均进行了随访，其中35例因本病死亡，43例发生进展。本研究中“肿瘤进展”定义为治疗后出现下列事件之一：临床/影像资料显示局部病灶扩大、出现新的病灶、因本病死亡。

本发明paRNA GLI1-NC1的序列是发明人通过全基因组水平筛选的方法，通过大量研究实验所得。

实施例1、本发明胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒

含有检测paRNA GLI1-NC1的RNA-ISH相关试剂：

1.蛋白酶K：Roche Diagnostics(Mannheim,Germany)。

2.甲酰胺：Sigma(St.Louis,MO,USA)。

3.酵母tRNA：5mg/ml(绵阳天泽)，-20℃保存。

4.杂交液：含50％甲酰胺，5×SSC，0.1％Tween-20，9.2mM柠檬酸调节pH为6.0，50μg/ml肝素钠，分装后4℃保存，使用前加入500μg/ml酵母RNA。

5.杂交探针：生物素标记的NC1寡核苷酸探针(Invitrogen,Shanghai, China)。NC1探针序列：5’-TCACCTCCCTTCTATTTCCCTCCC TCTTGCCGTTCT-3’；

6.抗体封闭液：用PBS/T配制，含2％羊血清，2mg/ml BSA。分装后4 ℃保存。

7.抗地高辛抗体：Anti-DIG-AP购自Roche Diagnostics(Mannheim, Germany)。

8.检测缓冲液：1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml，5M NaCl 2ml，1M MgCl2 5ml，加去离子水定容到100ml。

9.硝基四氮唑/五溴四氯三吲哚磷酸盐(NBT/BCIP)显色液：Roche Diagnostics(Mannheim,Germany)。

10.甲基绿：Sigma(St.Louis,MO,USA)。

实施例2、本发明胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒

含有检测paRNA GLI1-NC1的RNA-ISH相关试剂：同实施例1。

还含有检测GLI1蛋白的IHC相关试剂：

1.第一抗体：GLI1(rabbit polyclonal,sc-20687；Santa Cruz Biotechnology,CA)，稀释度1:200。

2.EnVisionTM试剂盒：DakoCytomation(Glostrup,Denmark)。

以下通过实验例说明本发明的有益效果。

实验例1、对人体中paRNA GLI1-NC1序列的确认

实验方法：

为了研究paRNA GLI1-NC1的功能，我们首先要确认在人体中是否存在 paRNAGLI1-NC1这个分子以及其具体序列。为了检测paRNA GLI1-NC1的 5’和3’的末端终序列，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)分析未知RNA转录本起始位点和序列信息，包括5’RACE和3’RACE分别鉴定RNA的5’端和3’端。

1、根据RACE原理设计引物的原则，设计RACE的特异性引物如下：

3’RACE for paRNA GLI1-NC1的PCR引物如下：

NC1 FP1:5’-CTTCTCTTGCTTCCAGCTACC-3’；

T20:5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)20-3'(后面连续的20个T)。

5’RACE for paRNA GLI1-NC1逆转录和PCR引物如下：

RT-primer:5’-GGAGGTGGATATGTGAGC-3’；RP1(outer primer): 5’-GTTGCTATGCCCAGCGGTAC-3’；RP2(inner primer): 5’-GGTACTGCCTGACAGGGAAG-3’。

2、3’RACE具体操作步骤如下：

细胞总RNA提取、

基因组DNA消化及oligo-dT逆转录得到cDNA。以cDNA为模版，以 NC1 FP1和T20为引物扩增NC1 3’端片段，测序获取NC1 3’端序列信息。

3、5’RACE具体操作步骤如下：

3.1、基因组DNA消化

3.2、使用基因特异性引物(NC1 RT-Primer)作为逆转录引物，特异性逆转录NC15’端cDNA。反应体系见下表，52℃反应45min。反应体系经柱式DNA纯化试剂盒(CWbiotech)，溶于30μl ddH2O。

3.3、末端脱氧核糖核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)介导下，在NC1特异性逆转录cDNA产物末端进行polyA加尾，反应体系见下表，37℃反应15min。反应产物经柱状DNA纯化试剂盒纯化，溶于30μl TE buffer，-20℃保存。

3.4、以上述带polyA尾的NC1 cDNA作为模版，以T20作为引物，行半巢式PCR(NC1RP1和RP2)扩增NC1目的片段。PCR产物测序获取NC1 5’端序列信息。

实验结果：

通过3’RACE和5’RACE确认，在人的胶质瘤细胞系中存在paRNA GLI1-NC1，且paRNAGLI1-NC1位于染色体12q13位上的一个196nt的 paRNA。paRNA GLI1-NC1位于GLI1转录起始点上游，起自-344bp(以GLI1 转录起始位点为1)，终止于-148bp(图1)。

数据库分析显示，该转录本无开放阅读框(ORF)，不编码蛋白，说明其为一个新的ncRNA。

实验例2、paRNA GLI1-NC1的分布检测

实验方法：

胶质瘤细胞转染siRNA的设计合成：

调节paRNA GLI1-NC1的si-NC1的合成，该方法为：

通过siRNA设计软件，设计并合成三条靶向paRNA GLI1-NC1的siRNA，其中si-NC1-2下调paRNA GLI1-NC1效果较好，因此以si-NC1-2进行后续实验(图5A)。si-NC1-2的序列为：AAGAGGGAGGGAAATAGAA。

对照设置：

空白组：未进行处理的胶质瘤细胞T98G和U251；

对照组(si-Con)：用不会干扰paRNA GLI1-NC1表达的siRNA处理的胶质瘤细胞T98G和U251；

实验组：用si-NCl干扰paRNA GLI1-NC1，抑制paRNA GLI1-NC1表达的胶质瘤细胞T98G和U251。

为明确paRNA GLI1-NC1在细胞中的定位，我们用PARISTM试剂盒 (AM1921；Ambion,Carlsbad,CA)对胶质瘤细胞T98G和U251进行核浆分离。具体操作步骤如下：

1、细胞核浆分离裂解液的制备

1.1、将细胞接种于6孔板中，继续培养至80％融合。将si-NC1转染至细胞内，48h后收集细胞。

1.2、胰酶消化，收集新鲜的细胞，用预冷的PBS轻柔吹打细胞，4℃ 800-1000G离心5min，洗尽上清液。将细胞沉淀置于冰上。

1.3、配置适当含RNAase Inhibitor的Cell Fractionation Buffer，每106个加入300μl细胞裂解液，混匀，轻弹EP管混匀，轻柔重悬细胞沉淀，冰浴 10min裂解细胞，待细胞裂解液澄清，即裂解完全。

1.4、待细胞裂解液澄清后，4℃500g离心5min，将上清液转移至新的 DEPC处理的EP管中。重新加入100μl细胞裂解液，4℃500g离心5min，将上清液转移至上述EP管中，为细胞胞浆裂解成分。沉淀部分为胞核成分。

1.5、配置提前预冷的含RNAase Inhibitor的Cell Disruption Buffer，用量与Cell Fraction Buffer一致，与胞核成分混匀，直至核呈现均质状态，置于冰上。

2、核浆分离组分RNA的提取

2.1、分别向胞浆/胞核组分中加入2×Lysis/Binding Solution后，反复吹打3-4次直至完全混匀。

2.2、提取胞核组分RNA可选步骤：用微量注射器反复吹吸粘稠的胞核组分，4℃10,000g离心1min，收集上清至新的EP管中。

2.3、加入等体积的100％乙醇至上清中，轻柔吹打混匀。将上述所得溶液分别加入到已装有收集管的Filter Cartridge中，室温放置2ming，10,000g离心1min。

2.4、向Filter Cartridge中加入700μl Wash Solution 1，10,000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将Filter Cartridge放回收集管中。

2.5、将Filter Cartridge放入一个新的收集管中，向Filter Cartridge中间位置滴加40-60μl已预热至95-100℃的Elution Buffer，室温放置2min。 10,000g离心1min，搜集RNA溶液。-80℃保存RNA。

3、RNA进行DnaseI消化后逆转录，其NC1的PCR引物、胞核标志物 SNORA41引物和胞浆标志物GAPDH的引物序列如下：

NC1 FP：5’-AGTATAGGGTCCCTCAAGGGA-3’，NC1 RP： 5’-TGCAAAAACTTTTTCTCTCTCCAGC-3’；SNORA41 FP: ACTGGTCTGCAGCTGTTCTTA，SNORA41 RP： GTGTCTGTCACACATATATACCCAC；GAPDH FP： GCGAGATCCCTCCAAAATC，GAPDH RP： GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

实验结果：

在空白组(Blank)和对照组(si-Con)中，paRNA GLI1-NC1富集在胞核(N)，抑制paRNA GLI1-NC1(si-NC1)后paRNA GLI1-NC1减少。 SNORA41和GAPDH分别是胞核和胞浆组分标志(图2)。

以上实验说明paRNA GLI1-NC1定位于细胞核。

上述两例实验例说明，发明人所筛选出的非编码小RNA：paRNA GLI1-NC1存在于人体胶质瘤细胞中，并且定位于细胞核内。

实验例3、paRNA NC1-GLI1在浸润性胶质瘤组织中的表达水平检测

1、利用Q-PCR检测paRNA GLI1-NC1在胶质瘤中的表达情况，该方法为：

1.1、取四川大学华西医院提供的新鲜组织样本10例，包括弥漫浸润性胶质肿瘤6例，非肿瘤脑组织(non-neoplastic brain tissue,NBT)4例。标本取下后立即液氮速冻，-80℃保存，所有病例均经常规HE染色切片确定诊断。提取其中的RNA，再逆转为cDNA，反应体系如下：

1.2、PCR扩增：95℃，30s；95℃，10s，55℃，10s，72℃，25s (收集荧光信号)，40个循环。以0.1℃/0.2s，从65℃持续升温到95℃作熔点曲线(Melting Curve)。

1.3、数据分析：记录Ct(cycle threshold)值及熔点温度，数据分析采用荧光定量分析软件：iCycler IQ 3.1(BIO-RAD)。用2-△△Ct方法计算目的基因相对拷贝数(以ACTIN为参照)。ΔΔCt＝ΔCtexp-ΔCtcon＝ (Ctexp-target-Ctexp-actin)-(Ctcon-target-Ctcon-actin)。

实验结果

Q-PCR检测结果显示，paRNA GLI1-NC1在弥漫浸润性胶质瘤组织中高表达，在非肿瘤脑组织(non-neoplastic brain tissue,NBT)中表达水平低(图 3A上)。

2、利用RNA-ISH检测paRNA GLI1-NC1在弥漫浸润性胶质瘤中的表达，该方法为：

2.1、石蜡包埋组织样本：2013-2014年四川大学华西医院病理科存档石蜡包埋组织，包括弥漫浸润性胶质肿瘤75例，正常/胶质增生的非肿瘤脑组织(non-neoplasticbrain tissue,NBT)34例。

2.2、设计杂交探针：生物素标记的NC1寡核苷酸探针(Invitrogen, Shanghai,China)。NC1探针序列：5’-TCACCTCCCTTCTATTTCCCTCCC TCTTGCCGTTCT-3’。

2.3、石蜡切片脱蜡至水：二甲苯，2×5min；100％乙醇，2×5min；85％乙醇，5min；70％乙醇，5min；DEPC水，1min。PBS，2×5min。

2.4、蛋白酶K消化：20μg/ml，37℃，30min。

2.5、0.2％甘氨酸，30sec。PBS，2×5min。

2.6、后固定：4％多聚甲醛，室温，30min。PBS，2×5min。

2.7、梯度冷酒精4℃脱水：80％、90％、95％、100％各2min，空气干燥5min。

2.8、滴加杂交液进行预杂交，37℃，2小时。

2.9、杂交：甩掉预杂交液，加入NC1杂交探针(杂交液配)，探针终浓度为20nmol/l，53℃，18小时。

2.10、杂交后洗涤：2×SSC，5min；含50％甲酰胺的2×SSC，3×30min； PBS/T，3×5min。

2.11、加入抗体封闭液37℃，1小时。

2.12、甩掉封闭液，滴加SP-AP(1:200)(封闭液配)，37℃孵育1小时，4℃过夜孵育。

2.13、PBS/T，5×5min。

2.14、滴加检测缓冲液，37℃孵育10min。

滴加NBT/BCIP(检测缓冲液配，1:50)，显微镜下37℃避光显色。

自来水洗终止反应，1％甲基绿复染。57℃烤干，树胶封片。

对照设置：以RNA酶消化样本或不加探针组作为阴性对照。

结果判定：paRNA GLI1-NC1的阳性信号定位于细胞核。paRNA GLI1-NC1的胞核染色(NC1-N)评价标准为：光镜下观察，胞核淡染或者无着色评为阴性(0分)，胞核染为蓝紫色或者深紫色为阳性(1分)。从阳性细胞最密集的视野开始，连续10个高倍视野，计算1000个瘤细胞中阳性细胞数，NC1-N＝(阳性肿瘤细胞数/1000)×100％。根据预实验结果确定评价阈值：NC1-N>60％为阳性，≤60％为阴性。

实验结果

paRNA GLI1-NC1阳性信号定位于胞核，在胶质瘤组织细胞(glioma) 中表达较强，阳性率为64％(48/75)。NBT细胞(gliosis)的NC1低表达或无表达，阳性率为23.5％(8/34)，表达具有明显差异(P<0.001)(图3B上，表1)。

上述实验结果可以得到以下结论：paRNA GLI1-NC1在浸润性胶质瘤组织中高表达，在非肿瘤脑组织中低表达或无表达，且表达量具有明显差异。说明paRNA GLI1-NC1可作为胶质瘤诊断的标志物。

实验例4、GLI1在浸润性胶质瘤组织中的表达水平检测

1、利用Q-PCR检测paRNA GLI1-NC1在胶质瘤中的表达情况，方法参照实施例3中paRNA GLI1-NC1的检测。

实验结果

GLI1 mRNA水平在非肿瘤脑组织中表达水平低，在胶质瘤组织GLI1 mRNA表达水平明显增高，与paRNA GLI1-NC1表达一致(图3A下)。

2、免疫组织化学显示GLI1蛋白在胶质瘤中高表达，该方法为：

2.1、切片经二甲苯10min×2次、100％、95％、85％梯度乙醇3min脱蜡，蒸馏水洗，5min×2次，PBS(pH 7.0)洗涤，5min×2次。

2.2、3％H₂O₂封闭20min，蒸馏水洗，5min×2次。

2.3、0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压锅抗原修复3min，自然冷却至室温。PBS洗涤，5min×2次。

2.4、滴加PBS稀释的GLI1(rabbit polyclonal,sc-20687；Santa CruzBiotechnology,CA)，使其完全覆盖切片上组织，置湿盒内，37℃孵育1小时，4℃过夜。

2.5、PBS洗去未结合第一抗体，5min×3次。

2.6、滴加EnVision试剂(Glostrup,Denmark)，37℃孵育1h。

2.7、滴加新鲜配制的DAB底物液显色，显微镜下观察显色强度，适时终止，流水冲洗。

2.8、苏木素复染2-5min，盐酸酒精分色，流水冲洗10min返蓝。

2.9、85％、95％、100％、100％梯度酒精各5min脱水，二甲苯透明，加拿大树胶封片。

2.10、结果判定：GLI1的阳性信号主要定位于核。GLI1的胞核染色 (GLI1-N)评价标准为：光镜下观察，以胞核染为深棕色为阳性，从阳性细胞最密集的视野开始，连续10个高倍视野，计数1000个肿瘤细胞中阳性细胞数，GLI1-N＝(阳性肿瘤细胞数/1000)×100％，预实验确定阈值： GLI1-N>50％者为阳性。

实验结果

GLI1阳性信号主要定位于胞核，部分病例可见胞浆阳性信号(图3B下)。弥漫浸润性胶质瘤GLI1蛋白阳性表达率为69.3％(52/75)；非肿瘤脑组织 (胶质增生组织)中为20.6％(7/34)(表1)，具有显著差异(P<0.001)。

上述实验结果可以得到以下结论：GLI1在浸润性胶质瘤组织中高表达，在非肿瘤脑组织中低表达，且表达量具有明显差异。说明GLI1可作为胶质瘤诊断的标志物。

表1.paRNA GLI1-NC1和GLI1的表达与胶质瘤进展的关系

NC1-N(+)指核评分>60％，GLI1-N(+)指胞核计数>50％。*：所列数据为paRNAGLI1-NC1或GLI1表达的阳性病例数/总例数(阳性率)。 Gliosis：胶质增生组织。Glioma：弥漫浸润性胶质瘤病例。Glioma with progression：进展型胶质瘤病例。Glioma withoutprogression：非进展型胶质瘤病例。P values采用Fisher精确概率法计算。

实验例5、paRNA GLI1-NC1与GLI1基因表达的关系

(1)胶质瘤中paRNA GLI1-NC1与GLI1的表达正相关，该方法为：

采用SPSS10.0(SPSS Inc,Chicago,USA)分析软件处理，Spearman秩相关分析胶质瘤组织和非肿瘤脑组织的GLI1免疫组织化学染色和NC1的 RNA-ISH检测结果。

实验结果

paRNA GLI1-NC1核表达(NC1-N)与GLI1蛋白的核表达(GLI1-N) 明显正相关(rs.＝0.646,P<0.01)。胶质瘤组织的paRNA GLI1-NC1和GLI1 的表达水平与患者的WHO分级呈正相关(rs.＝0.271,P<0.05；rs.＝0.366, P<0.01)，与患者的年龄、IDH1突变状态未见明显相关(表2)。

表2.NC1和GLI1及临床病理指标的相关性分析

NC1-N：NC1胞核染色评分；GLI1-N：GLI1胞核染色计数；Grade： WHO分级(2016版)r_s：Spearman秩相关系数。**:P<0.01.*:P<0.05。

(2)paRNA GLI1-NC1促进GLI1基因表达

1、胶质瘤细胞转染过表达载体pVAX1^TM(Carlsbad,CA)的设计合成，该方法为：

1.2、真核表达载体pVAX-NC1构建，该方法为：

1.2.1、克隆目的基因

①以T98G cDNA为模版，PCR扩增NC1全长。扩增全长引物为：

FP:5’-GGTACCAGTATAGGGTCCCTCAAGGGA-3’；RP: 5’-TCTAGATGCAAAAACTTTTTCTCTCTCCAGC-3’。

②使用胶回收试剂盒(CWbiotech)胶回收PCR产物。

③将胶回收产物与pMD19-T载体连接，反应体系如下，16℃孵育过夜。

④连接产物转化感受态细菌：冻存的感受态细菌JM109 100μl冰上融化，与10μl连接产物混合，冰浴30min。42℃热处理1min，冰浴2min，加入预热至37℃的SOC培养基800μl，37℃150rpm振荡培养1h。取适量菌液均匀涂于含Amp+的LB琼脂培养板。37℃培养12-16h，可见白色单克隆菌落。

⑤挑选阳性克隆，进行测序分析(Invitrogen，Shanghai，China)。

⑥选取正确序列的阳性克隆，使用Omega小量质粒提取试剂盒提取重组质粒。

⑦使用Kpn I/Xba I双酶切目的基因片段和载体pVAX1。胶回收目的基因片段和载体，使用T4 DNA ligase将二者连接，16℃孵育过夜。将连接产物转化至感受态细菌BJ5183，Amp+抗生素平板筛选。挑选阳性克隆，提取重组质粒，PCR和酶切鉴定。结果显示亚克隆重组真核表达载体pVAX1-NC1 构建成功。

2、在胶质瘤细胞中干扰/过表达paRNA GLI1-NC1验证paRNA GLI1-NC1 对GLI1的调控

将细胞分为5组，分别进行转染，为：

①空白组(mock组)：未做处理；

②干扰阴性组(si-Con)：用不干扰paRNA GLI1-NC1的siRNA处理；

③干扰paRNA GLI1-NC1阳性组(si-NC1)：用实施例2所述的si-NC1-2 处理；

④干扰paRNA GLI1-NC1后过表达阴性组(si-NC1+pVAX-Con)：：用实施例2所述的si-NC1-2处理后使用不会使paRNA GLI1-NC1过表达的pVAX1 载体处理。

⑤干扰paRNA GLI1-NC1后过表达paRNA GLI1-NC1的阳性组 (si-NC1+pVAX-NC1)：用实施例2所述的si-NC1-2处理后使用以pVAX1 载体构建的真核表达质粒pVAX1-NC1过表达paRNA GLI1-NC1。

2.1、细胞转染方法为：

将培养的细胞接种于6孔板中，10⁵个/孔，继续培养至细胞融合约80％。转染前，洗尽培养基，用PBS轻柔清洗2次，更换为无血清无抗生素培养基，置于细胞培养箱中继续培养30min。使用NanoJuice transfection Kit(Merck) 转染细胞。取无血清无抗生素培养基500μl，加入core reagent和booster(6 孔板每孔用core reagent 1.5μl和booster 3μl)，室温静置5min，加入si-RNA (6孔板每孔250pmol)，混匀后室温孵育20min，使脂质体和质粒形成复合物。针对si-NC1+pVAX-Con和si-NC1+pVAX-NC1组，在转染si-NC1后12h 在转染质粒(6孔板每孔1.5μg)。将转染试剂加入细胞培养基中，轻轻混匀，保持2％血清条件下继续培养72h，收取细胞。

2.2、收取细胞提取RNA后逆转录为cDNA进行Q-PCR，方法同前。

2.3、收取细胞提取蛋白进行western blot，该方法为：

①将适当的细胞裂解液及蛋白酶抑制剂加入收集的细胞中，充分混匀。冰上放置30min，4℃离心，12000rpm，15min，吸取上清即为蛋白液。取标准BSA(2mg/ml)，依次稀释成1.5mg/ml、1mg/ml、750μg/ml、500μg/ml、 250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml和0μg/ml，96孔板每孔加入25μl稀释好的标准品或样本，再加入200μlAB(A:B＝1:50)混合液，37℃孵育30min，测定波长为590nm处吸光度值，通过标准曲线，计算样本浓度。定量后的蛋白质样本加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃水浴5min，-20℃保存。

②SDS-PAGE电泳凝胶10％分离胶(8ml)，如下表

SDS-PAGE电泳凝胶5％积层胶(3ml)，如下表

③灌胶、上样(每孔50-100μg总蛋白)。

④电泳：使用1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液进行垂直电泳。积层胶电压为 80V，分离胶电压120V。电泳结束后，取出凝胶，标记方向，蒸馏水洗5min ×2次，将凝胶泡在1×CAPS转移缓冲液中15min。

⑤PVDF膜：甲醇激活10秒后浸泡在1×CAPS转移缓冲液中15min。

⑥装电转装置(凝胶面近负极，避免气泡产生)，1×CAPS转移缓冲液恒流300mA转移1.5h。将凝胶置0.25％的考马斯亮蓝染液中染色，以检查蛋白质转移是否完全。

⑦封闭液(5％non-fat milk，0.1％Tween 20，溶于1×TBS)浸泡PVDF 膜，室温封闭2h。1×TBS/T洗膜，5min×3。

⑧加入适量稀释于封闭液的第一抗体，37℃孵育2h。1×TBS/T洗膜， 5min×3。

⑨加入适量稀释于封闭液的第二抗体，37℃孵育1.5h。1×TBS/T洗膜，5min×3。

⑩ECL化学发光试剂显色，X光胶片曝光或DAB显色。

2.4、免疫细胞化学染色检测paRNA GLI1-NC1调控GLI1表达

将细胞接种于6孔培养板(孔底放置清洗消毒后的盖玻片供细胞贴附)， 105个细胞/孔。培养至60％时进行上述5组转染(转染方法同前)，培养至 80％融合。

弃培养液，4％多聚甲醛室温固定30min。PBS清洗2次。

0.1％Triton X-100处理，4℃，30min。

3％H2O2封闭室温20min，蒸馏水洗，5min×3次。

滴加PBS稀释的相应浓度第一抗体，使其完全覆盖切片上组织，置湿盒内，37℃孵育1小时，再4℃过夜。

PBS洗，5min×3次。

滴加新鲜配制的DAB底物液显色，显微镜下观察显色强度，适时终止，流水冲洗。

苏木素复染2-5min，盐酸酒精分色，流水冲洗10min返蓝。

85％、95％、100％、100％梯度酒精脱水，各5min；二甲苯透明；加拿大树胶封片。

实验结果

si-NC1干扰paRNA GLI1-NC1后，GLI1 mRNA水平明显下降。在干扰 paRNA GLI1-NC1的胶质瘤细胞中重新人工过表达paRNA GLI1-NC1可使 GLI1的mRNA水平回升(图5B)。Western blot和细胞免疫化学(immunocytochemistry)检测结果显示，将paRNA GLI1-NC1重新导入已下调paRNA GLI1-NC1的胶质瘤细胞后，GLI1蛋白水平亦回升(图5C和D)。结果表明paRNA GLI1-NC1促进GLI1表达。

根据实验例3和实验例4的结果，paRNA GLI1-NC1和GLI1均可作为胶质瘤诊断的标志物，而实验例5进一步证实了paRNA GLI1-NC1与GLI1 的表达正相关，因此说明paRNAGLI1-NC1和GLI1可以作为胶质瘤诊断的联合标志物。下述实验例更进一步地从临床水平验证了paRNA GLI1-NC1与 GLI1表达的相关性，并探讨了paRNA GLI1-NC1对GLI1的调控机制。

实验例6、paRNA GLI1-NC1和GLI1表达水平的临床意义：

1、NC1和GLI1与胶质瘤进展的关系，该方法为：

1.1、样本临床数据收集：75例弥漫浸润性胶质肿瘤均行手术切除。患者年龄平均46.3±16.3岁。包括弥漫浸润性星形细胞瘤(WHO II级)26例 (34.7％)，间变型星形细胞瘤(WHO III级)25例(33.3％)，GBM(WHO IV 级)24例(24.32％)。截止2017年10月1日，对所有病例均进行了随访，其中35例因本病死亡，42例发生进展。本研究中“肿瘤进展”定义为治疗后出现下列事件之一：临床/影像资料显示局部病灶扩大、出现新的病灶、因本病死亡。

1.2、算法分析：样本率的比较采用Fisher精确概率检验(Fisher exact test)。

实验结果

75例胶质瘤患者中42例在本研究随访期内发生进展。进展型和非进展型胶质瘤paRNA GLI1-NC1和GLI1的核表达水平与胶质增生组织均有显著差异。对进展型和非进展型病例进行比较，结果显示，进展型胶质瘤组织的 paRNA GLI1-NC1阳性率为78.5％(33/42)，非进展型胶质瘤组织的paRNA GLI1-NC1为45.2％(15/33)(表1、表3)，差异显著(P＝0.004)。进展型胶质瘤GLI1阳性率为85.7％(36/42)，非进展型胶质瘤阳性表达率为48.5％(16/33)，差异显著(P＝0.001)(表1)。以上结果显示，paRNA GLI1-NC1 和GLI1表达水平，与弥漫浸润性胶质瘤发生进展密切相关。

2、paRNA GLI1-NC1和GLI1与弥漫浸润性胶质瘤的单因素生存分析，该方法为：

算法分析：单因素(Kaplan-Meier和log-rank检验)评价各指标与胶质瘤患者预后(生存期和疾病进展)的关系。

实验结果

单因素生存分析显示，paRNA GLI1-NC1和GLI1高表达(截断值分别为60％和50％)是胶质瘤患者特异性生存时间(disease-specific survival,DSS) 以及无疾病进展生存时间(progression-free survival，PFS)的影响因素(表3，图4)。

表3.paRNA GLI1-NC1和GLI1与弥漫浸润性胶质瘤预后的单因素分析

NC1:paRNA GLI1-NC1；DSS：疾病特异性生存。PFS：无疾病进展生存。n：病例数。P：Kaplan-Meier生存分析的Log Rank检验P值。

3、paRNA GLI1-NC1与GLI1与弥漫浸润性胶质瘤的多因素生存分析，该方法为：

算法分析：将NC1-N与GLI1-N与IDH1mut、WHO分级(Grade)和年龄纳入胶质瘤肿瘤特异性生存(DSS)和无进展生存(PFS)的Cox比例风险模型分析。

实验结果：

paRNA GLI1-NC1和GLI1表达水平是胶质瘤患者DSS和PFS的独立预后指标(表4)。paRNA GLI1-NC1表达水平高者，发生胶质瘤演进的风险较高。paRNA GLI1-NC1表达水平高者DSS缩短的相对风险度(relative risk， RR)＝2.617，95％置信区间(confidenceinterval，CI)＝1.064-5.974(P＝0.022)； NC1表达水平高者PFS缩短的RR＝2.205，95％CI＝1.037-4.690(P＝0.040)。 GLI1表达水平高者DSS缩短的RR＝3.545，95％CI＝1.194-10.256(P＝0.023)； GLI1表达水平高者PFS缩短的RR＝2.467，95％CI＝1.015-5.996(P＝0.046)。

表4.胶质瘤中NC1-N与临床病理指标的多因素生存分析

NC1：paRNA GLI1-NC1；加粗字体表示P<0.05

实验例7、paRNA GLI1-NC1促进GLI1转录的机制

1、报告基因载体构建，该方法为：

构建报告基因质粒pGL3-pro。提取T98G细胞基因组DNA。PCR扩增 GLI1启动子242bp片段(-175-+67，以GLI1转录起始位点为+1)，扩增引物为GLI1-KpnI-FP1(5’-GGTACCCGGCTGGAGAGAGAAAAAG-3’)和GLI1-Hind III-RP1(5’-AAGCTTCTCTGTCTGGGCGCTGGGCT-3’)；包含 NC1转录区的启动子411bp片段(-344-+67)，扩增引物为GLI1-KpnI-FP2 (5’-GGTACCAGTATAGGGTCCCTCAAGGGA-3’)和GLI1-Hind III-RP1 (5’-AAGCTTCTCTGTCTGGGCGCTGGGCT-3’)。将以上扩增产物TA克隆至pMD19-T载体，克隆得到-175/+67和-344/+67，测序鉴定正确。将酶切后的启动子载体和载体质粒共同孵育，在T4DNA连接酶作用下使二者重新连接成环状质粒。转染感受态细菌JM109，挑选阳性克隆，酶切和测序鉴定，即得到插入GLI1不同启动子区的报告基因质粒pGL3-pro--175/+67和 -344/+67。对照质粒包括无启动子的报告基因质粒pGL3-basic和海肾荧光素酶内参质粒pRL-CMV。

2、细胞转染

U251细胞接种至24孔板，常规培养至70～80％的细胞融合密度，转染前一天更换至无血清无抗生素培养基。

用脂质体分别转染带萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-basic、 GL3-pro--175/+67和pGL3--344/+67，同时转染带海肾荧光素酶报告基因的内参质粒pRL-CMV。

在报告基因载体转染U251细胞24小时后，分别转染si-Con、si-NC1、 pVAX-Con和pVAX-NC1。48h后收集细胞进行荧光素酶活性检测。

3、检测荧光素酶活性

每一培养孔中加入100μl 1×Passive Lysis Buffer(PLB)，吹打孔内细胞，置于冰上裂解30min后，将液体转移至1.5ml EP管中，13200rpm× 10min，小心吸取蛋白上清，取20μl加至96孔板中。

准备含萤火虫荧光素酶底物的Luciferase Assay Reagent II，将LuciferaseAssay Substrate溶解于10ml Luciferase Assay Buffer II，并于室温平衡30min。

准备含荧光素终止剂和海肾素底物的Stop&Glo Reagent：将1体积50 ×Stop&GloSubstrate溶于50体积Stop&Glo Buffer，室温平衡30min。

上机：按照每孔50μl的量先后注入Luciferase Assay Reagent II和Stop& GloReagent，记录萤火虫荧光素酶活性(luciferase activity)和海肾素酶活性 (renillaactivity)，并记录二者比值即相对荧光素酶活性。

实验结果

无外源性插入片段时相对荧光素酶活性很低(约为0.6)，当插入 GLI1-pro～-1126/+67后荧光素酶活性明显上升(约为16)，siRNA干扰paRNA GLI1-NC1后荧光素酶活性降低(约为10)，过表达paRNA GLI1-NC1后荧光素酶活性显著上调(约为30)。

上述实验结果说明：paRNA GLI1-NC1对GLI1启动子区具有激活活性 (图6)。paRNAGLI1-NC1促进GLI1启动子区活性从而促进转录。

根据实验例6和实验例7的结果，进一步证实了paRNA GLI1-NC1与 GLI1的基因表达正相关，并在弥漫浸润性胶质瘤中高表达。并证实了paRNA GLI1-NC1对GLI1的遗传调控机制：paRNA GLI1-NC1通过激活GLI1转录，从而促进胶质瘤的发生发展。

而且，paRNA GLI1-NC1与GLI1是胶质瘤患者预后评估的独立指标。 paRNA GLI1-NC1与GLI1高表达的胶质瘤患者预后差。因此，paRNA GLI1-NC1与GLI1还可独立作为胶质瘤预后评估的标志物。而基于paRNA GLI1-NC1与GLI1表达相关性的证实以及对GLI1的遗传调控机制的确认，说明联合检测paRNA GLI1-NC1与GLI1的表达水平可以进一步增强临床应用的可行性和可信度。

实验例8、paRNA GLI1-NC1对胶质瘤细胞增殖活性的影响

1、平板克隆形成实验检测paRNA GLI1-NC1对细胞克隆形成能力的影响，该方法为：

1.1、将处于对数生长期的T98G和U251细胞分别接种于6孔板中，接种数目分别为2000/孔和4000/孔。将细胞分为5组，分别进行转染，为空白组(mock组)、干扰阴性组(si-Con)、干扰NC1阳性组(si-NC1)、干扰NC1 后过表达阴性组(si-NC1+pVAX-Con)和干扰NC1后过表达NC1阳性组 (si-NC1+pVAX-NC1)。转染步骤如前。

1.2、2周后观察形成的细胞克隆(每3天换液并重新转染)，当培养皿内出现肉眼可见的细胞克隆时中止培养。

1.3、PBS洗涤细胞2次，10％福尔马林固定细胞15min后加入0.005％结晶紫室温染色30min，用1×PBS反复清洗，直至背景清亮，镜下拍照观察。

实验结果

与对照组Blank和si-Con组相比，si-NC1介导的paRNA GLI1-NC1表达下降，可降低胶质瘤细胞(T98G，U251)克隆形成能力；通过pVAX-NC1 人工过表达paRNA GLI1-NC1，胶质瘤细胞克隆形成能力恢复(图7A)。

2、EdU掺入实验检测NC1对细胞增殖能力的影响，该方法为：

2.1、取对数生长期细胞，以每孔4×10³～1×10⁵细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

2.2、待细胞正常生长至80％融合时，将细胞分为5组，分别进行转染，为空白组(mock组)、干扰阴性组(si-Con)、干扰NC1阳性组(si-NC1)、干扰NC1后过表达阴性组(si-NC1+pVAX-Con)和干扰NC1后过表达NC1 阳性组(si-NC1+pVAX-NC1)。转染步骤如前。

2.3、用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基。

2.4、每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。

2.5、1×PBS清洗细胞1～2次，5min/次。

2.6、每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育 30分钟，弃固定液。

2.7、每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液。

2.8、每孔加入100μL 1×PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。

2.9、每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育 10分钟，1×PBS清洗1次。

2.10、每孔加入100μL的

染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。染色反应液配方见下表(以配置500μL 为例)。

2.11、加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3 次，每次10分钟，弃渗透剂。

2.12、用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1× Hoechst33342反应液，避光保存。

2.13、每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液。

2.14、每孔每次加入100μL 1×PBS。倒置显微镜550nm～565nm波长观察。

实验结果

与对照组Blank和si-Con组相比，si-NC1介导的paRNA GLI1-NC1表达下降，可降低胶质瘤细胞(T98G，U251)增殖；通过pVAX-NC1人工过表达paRNA GLI1-NC1，胶质瘤细胞增殖能力恢复(图7B)。

3、CCK-8试剂盒检测细胞增殖与细胞活性，该方法为：

3.1、将T98G及U251细胞按照3000～4000细胞/孔密度均匀铺于96孔板后，将培养板放在培养箱中预培养过夜(37℃，5％CO2)，细胞贴壁后进行si-NC1转染和/或pVAX-NC1感染。

3.2、细胞分别处理0h，24h，36h，48h，96h后，按照10μl/孔量加入 CCK8，37℃孵育2h。

3.3、在460nm波长下测定各孔吸光度值。

实验结果

siRNA干扰paRNA GLI1-NC1，细胞活力明显降低(60％-80％)，生长受到明显抑制。人工过表达paRNA GLI1-NC1后，细胞增殖能力随之恢复(图 7C)。

上述结果说明，抑制paRNA GLI1-NC1的表达可以抑制胶质瘤细胞的克隆、增殖，paRNA GLI1-NC1可作为胶质瘤治疗的靶点。

综上所述，paRNA GLI1-NC1可以促进GLI1基因转录，进而促进胶质瘤的发生发展；因此，本发明检测paRNA GLI1-NC1的表达水平或联合检测 GLI1及paRNA GLI1-NC1的表达水平的试剂盒可以高度有效地对胶质瘤进行诊断和预后评估。进一步地，paRNA GLI1-NC1还可作为胶质瘤疾病治疗的靶标，paRNA GLI1-NC1抑制剂可以抑制paRNA GLI1-NC1、GLI1的表达，抑制胶质瘤细胞增殖，具有优异的临床应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种胶质瘤诊断和/或预后评估标志物及其应用

<130> GYKH1885-2021P0112707CC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 196

<212> DNA

<213> paRNA GLI1-NC1的核苷酸序列

<400> 1

agtatagggt ccctcaaggg agggggagga tcctgggggt cctgggggtg caataagccc 60

ggcacccctt ctcttgcttc cagctacccc gcctcatcct ccagaacggc aagagggagg 120

gaaatagaag ggaggtgagg ggcgagcggg aagagcggcg gcgcgccagc ggctggagag 180

agaaaaagtt tttgca 196

Claims

1.一种调控GLI1基因转录的非编码小RNA，其特征在于，它是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的paRNA GLI1-NC1。

2.一种胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒，其特征在于，它包括任选的用于检测权利要求1所述的paRNA GLI1-NC1的表达水平的试剂。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂是检测paRNA GLI1-NC1所转录的RNA的试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂是Northern blot检测方法用试剂、PCR方法用试剂、测序用试剂或原位杂交探针。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测paRNA GLI1-NC1表达水平的试剂是原位杂交探针。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，它还包括任选的用于检测GLI1表达水平的试剂。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测GLI1的表达水平的试剂是检测GLI1蛋白表达水平的试剂。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测GLI1的表达水平的试剂是免疫组织化学检测方法用试剂、Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测GLI1的表达水平的试剂是免疫组织化学检测方法用试剂。

10.检测试剂在制备胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂和/或试剂盒中的应用；所述检测试剂包括检测权利要求1所述的paRNA GLI1-NC1的表达水平的试剂。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括任选的用于检测GLI1表达水平的试剂。

12.权利要求1所述的paRNA GLI1-NC1的抑制剂在制备治疗胶质瘤疾病的药物中的用途；所述paRNA GLI1-NC1的抑制剂是序列为AAGAGGGAGGGAAATAGAA的siRNA。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制胶质瘤细胞增殖的药物。

14.如权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制GLI1表达的药物。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物为抑制GLI1启动子区活性的药物。

16.一种治疗胶质瘤的药物，其特征在于，它含有权利要求1所述的paRNA GLI1-NC1的抑制剂；所述paRNA GLI1-NC1的抑制剂是序列为AAGAGGGAGGGAAATAGAA的siRNA。