CN116492366B - 生物标志物muc21在胰腺癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物标志物MUC21在胰腺癌诊断和治疗中的应用，本发明提供了一种诊断胰腺癌的手段，所述手段为检测MUC21的表达水平。本发明同时提供了一种治疗胰腺癌的药物组合物和手段，所述药物组合物包括MUC21功能性表达的抑制剂。

Description

生物标志物MUC21在胰腺癌诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物MUC21在胰腺癌诊断和治疗中的应用。
背景技术
胰腺癌是一组主要起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，恶性程度极高，起病隐匿，早期诊断困难，进展迅速，生存时间短，是预后最差的恶性肿瘤之一，被称为"癌中之王”。
目前主要根据胰腺癌的组织来源对其进行分类，常见的为导管上皮发生的导管腺癌、起源于腺泡细胞的腺泡细胞癌和胰岛细胞发生的胰岛细胞癌，导管腺癌约占90%，腺泡细胞癌占9%，其余占1%左右。
由于胰腺癌生长部位隐蔽，且缺乏特征性临床表现，因而早期诊断至今仍比较困难。因此，长期以来许多学者一直在致力于敏感性、特异性更高的胰腺癌诊断技术的研究，以期提高早诊、早治率，进一步改善疗效。但目前对于大多数胰腺癌的诊断仍需赖于临床症状及体征并结合相应的影像学方面的检查。目前胰腺癌的治疗主张手术、放疗、化疗、内镜治疗、生物治疗、对症及支持等综合治疗。
近年来有许多涉及胰腺癌转移鉴别的研究，为上述领域的探索提供了很有前景的研究策略，如专利CN217536021U（一种鉴别胰腺癌转移患者外泌体差异表达的试剂盒）。还有许多专利关于MUC21基因在肿瘤方面的作用的研究，如专利CN105734147B、CN108114283A、CN105132550B，就对骨肉瘤、垂体瘤、骨关节炎诊治进行研究。但是迄今为止报道的胰腺癌的生物标志物仍然较少，不能满足临床诊断和治疗的需要，因此寻找新的有效的生物标志物，对于实现胰腺癌的个体化精准诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与胰腺癌发生发展相关的生物标志物，进而应用于胰腺癌的临床诊断和治疗，实现患者的精淮医疗，提高患者的生活和生存质量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种MUC21基因的用途，用于制备预防或治疗胰腺癌的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括MUC21功能性表达的抑制剂。所述抑制剂选自：以MUC21或其转录本为靶序列、且能够抑制MUC21基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA（小发夹RNA）、小干扰RNA（siRNA）、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与MUC21编码的蛋白结合的结合分子（如能够抑制MUC21蛋白活性的抗体或配体）。
进一步，所述的抑制剂为siRNA。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5~8所示。
本发明提供了一种用于预防或治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括MUC21功能性表达的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。
进一步，所述抑制剂选自：
核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调MUC21基因或其编码的蛋白的表达或活性。
在本发明中，所述MUC21的抑制剂还可用于抑制胰腺癌细胞的迁移侵袭。
本发明提供了一种MUC21基因的用途，用于筛选预防或治疗胰腺癌的候选化合物。
进一步，筛选预防或治疗胰腺癌的候选化合物的步骤包括：
测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中MUC21的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中MUC21的表达量和/或活性：
其中，如果测试组中细胞的MUC21的表达量和/或活性低于对照组，就表明该测试化合物是对MUC21的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。
在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选化合物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选化合物中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗胰腺癌有用的物质。
在本发明中，筛选预防或治疗胰腺癌的候选化合物的体系不限于细胞体系，还包括细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系等，所述体系不局限于上述形式，只要所述体系可以检测测试化合物可以降低MUC21的表达和/活性即可。
所述候选化合物包括但不限于：针对MUC21基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子（如抗体或配体）、小分子化合物等。
本发明提供了一种检测MUC21基因表达水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。所述产品包括 （但不限于）芯片、制剂或试剂盒。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别MUC21的探针；或
特异性扩增MUC21的引物；或
特异性结合MUC21编码的蛋白的抗体或配体。
进一步，所述特异性扩增MUC21的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了一种胰腺癌的新的分子标记物-MUC21基因，通过检测受试者胰腺组织中MUC21的表达水平，可以判断受试者是否患有胰腺癌以及判断转移风险，预测患者预后，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；利用分子标记物来实现疾病的诊断和治疗，相比传统手段，更具有及时性、特异性。
附图说明
图1是利用在线数据库分析黏蛋白MUC21在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达情况、预后分析。
图2是利用免疫组化实验检测MUC21蛋白在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达情况图。
图3是利用Qpcr检测MUC21基因在胰腺癌细胞及胰腺细胞中的表达情况图。
图4是利用Qpcr检测siRNA转染对胰腺癌细胞中MUC21基因表达的影响图。
图5是利用siRNA沉默MUC21的表达，并检测MUC21基因对胰腺癌细胞迁移的影响图。
图6是利用siRNA沉默MUC21的表达，并检测MUC21基因对胰腺癌细胞侵袭的影响图。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过对在线数据库的数据分析，分析了黏蛋白家族在胰腺癌标本中肿瘤组织和癌旁组织的表达情况，发现其中具有明显表达差异的基因，并分析其与预后不良的相关性，探讨其与胰腺癌的发生之间的关系，从而为胰腺癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了在胰腺癌中MUC21的表达上调，高表达MUC21的胰腺癌患者生存率低，且MUC21为胰腺癌预后不良的独立因素。实验证明，在人胰腺癌标本中，MUC21在癌组织的表达比正常组织明显升高，MUC21在胰腺癌细胞系中的表达也显著高于正常胰腺细胞HPDE。通过降低MUC21的表达水平，能够有效地抑制胰腺癌细胞的迁移侵袭。提示检测MUC21基因的表达水平可成为胰腺癌诊断的辅助诊断指标之一，干扰MUC21基因表达可成为预防或治疗胰腺癌的新途径。
标志物
标志物（单独使用或与其他定性术语组合例如胰腺癌标志物、胰腺癌特异性标志物、对照标志物、外源标志物、内源标志物） 指可测量、可计算或可以其他方式获得的，与任何分子或分子组合相关，可用作生物和/或化学状态的指示物的参数。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数（即“生物标志物”）例如天然或人工合成产生的核酸（即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA）和蛋白（例如肽、多肽）。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。
胰腺癌标志物指可以用作（单独或与其他标志物组合）受试者中胰腺癌指示物的特定类型的标志物，在本发明的具体实施方式中，胰腺癌标志物可用于提供（单独或与其他标志物组合）受试者中胰腺癌临床评估的标志物。
内源标志物”指源自与待分析样品相同的受试者的标志物（例如核酸或多肽）。更具体地，“内源对照标志物”指可用作对照标志物（单独或与其他对照标志物组合），与待分析样品源自相同受试者的标志物。在一个实施方案中，内源对照标志物可包括一个或多个内源基因（即“对照基因”或“参比基因”），其表达相对稳定，例如在胰腺癌与非胰腺癌样品中，和/或在受试者之间。
“外源标志物”指源自与待分析样品不同的受试者的标志物（例如核酸或多肽）。更具体地，“外源对照标志物”指可用作对照标志物（单独或与其他对照标志物组合），未源自与待分析样品相同的受试者的标志物。在本发明中，一方面该外源标志物或外源对照标志物看从不同的受试者分离，或可合成地生产，可添加至待分析的样品。另一方面，该外源对照标志物可以是添加或加标至待分析样品中用作内部阳性或阴性对照物的分子。外源对照标志物可与一个或多个胰腺癌标志物的检测共同使用以区分“真阴性”结果（例如非胰腺癌诊断）和“假阴性”或“不提供信息的”结果（例如由于扩增反应的问题）。
“对照标志物”或“参比标志物”指用于（单独或与其他对照标志物组合）对照可能的干扰因素和/或提供关于样品质量、有效样品制备和/或适当的反应组合 /进行（例如RT-PCR反应）的一个或更多指标的具体类型的标志物。在一些实施方案中，对照标志物可以是如本文中所述的内源对照标志物、外源对照标志物和/或胰腺癌特异性对照标志物。对照标志物可与本发明的胰腺癌标志物共检测或分别检测。对照标志物可以是一个或多个内源基因，例如管家基因或胰腺癌特异性对照标志物或基因的组合。
MUC21基因
在本发明中，MUC21是位于人6号染色体短臂2区1带上的基因，MUC21包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的MUC21基因具有数据库GeneBank中NC_000006. 12所表示的核苷酸序列或氨基酸序列。
本发明的人MUC21核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸（或其互补链）最佳比对时（具有适当的核苷酸插入或缺失），在至少大约60%的核苷酸碱基、通常至少大约70%、更通常至少大约80%、优选至少大约90%、及更优选至少大约95-98%核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”（或者基本相似的）。
或者，当核酸或其片段与另一核酸（或其互补链）、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或（相同性）。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55%相同性、优选至少大约65%、更优选至少大约75%及最优选至少大约90%相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。
抑制剂和药物组合物
基于本发明人的发现，本发明提供了一种MUC21的抑制剂的用途，用于制备抑制胰腺癌的药物组合物。如本文所用，所述的MUC21的抑制剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
所述的MUC21基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低MUC21蛋白的活性、降低MUC21基因或蛋白的稳定性、下调MUC21蛋白的表达、减少MUC21蛋白有效作用时间、或抑制MUC21基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调MUC21有用的物质，从而可用于预防或治疗胰腺癌。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调MUC21蛋白或其编码基因的表达。
作为本发明的一种选择方式，所述的MUC21的抑制剂是一种特异性与MUC21结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用MUC21蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达MUC21或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。抗体的“特异性”。是指抗体能结合于MUC21基因产物或片段。较佳地，指那些能与MUC21基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员己知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’ 或（Fab）2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。抗MUC21蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的MUC21蛋白含量，还可以作为用于预防胰腺癌的特异性治疗剂。血样或尿液中的MUC21蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过ELISA、WesternBlot印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。
作为本发明的一种优选方式，所述MUC21的抑制剂是一种MUC21特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰（RNAinterference）过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染胰腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的两个siRNA，它们分别具有SEQIDNO.5~8所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。
作为本发明的一种可选方式，所述的MUC21的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA（SmallhairpinRNA，shRNA）”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA（或类似物）相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA（ShortHairpin） 结构。所述的“shRNA表达载体”目前己经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的MUC21的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制胰腺癌。任何前述的MUC21的抑制剂均可用于组合物的制备。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述的MUC21基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿刘或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞（宿主细胞）转染试剂。
本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将MUC21的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带MUC21的抑制剂的表达单位（比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA）递送到靶点上，并使之表达活性的MUC21抑制剂，具体情況需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
术语“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。 如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明中的药物组合物包括MUC21的抑制剂、和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的药物组合物还可与其他治疗胰腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
药物筛选
本发明提供了一种筛选预防或治疗胰腺癌药物的方法，即：
在实验组中，向细胞培养体系中加入待测化合物，并测定MUC21的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定MUC21的表达水平；其中，如果实验组中MUC21的表达水平大于对照组，则说明该候选化合物为MC21的抑制剂。
在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选化合物进一步测试其抑制胰腺癌的效果，若测试化合物对胰腺癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗胰腺癌的潜在物质。
检测方法
本发明可以利用本领域内己知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本领域已知的定量样品中RNA表达的示例性方法包括但不限于Southern印迹、Northern印迹、微阵列、聚合酶链式反应（PCR）、NASBA、TMA、RT-PCR、实时荧光定量PCR。
在本发明中，术语“上调”或“过表达”指在癌组织（例如在胰腺癌组织）中以相对于其他相应的组织中的水平高的表达（例如RNA和/或蛋白表达）基因。在癌中上调的基因以比其他相应的组织（例如正常或非癌性胰腺组织）中的表达水平高至少10%，优选地至少25%，更优选地至少50%，更优选地至少100%，更优选地至少200%，最优选地至少300%的水平表达。
芯片、试剂盒
本发明的所述的基因芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于MUC21所示的部分或全部序列。
具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置（即以区别性的，可访问的地址为特征的位置）的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
“探针”意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交，从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接（即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生）或间接（即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生）的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。“充分地互补”的序列允许探针序列与靶标序列稳定杂交，即使该两个序列不完全互补。探针可被标记或不标记。探针可通过具体DNA序列的分子克隆生产，也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体（抗原）形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
所述的MUC21芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测MUC21基因或蛋白的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针简或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：Cold SpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1与胰腺癌相关的基因标志物的筛选
1、数据获取
GSE数据库中的GSE28735数据集包含来自45名胰腺导管腺癌患者的45对匹配的胰腺肿瘤和邻近非肿瘤组织的微阵列基因表达谱。TCGA数据库中包含172例胰腺癌组织及4例癌旁组织的微阵列基因表达谱及临床相关信息。
2、分析数据
将GSE28735数据集进行聚类分析，筛选出的差异基因进一步在TCGA数据库的数据集中进行Kaplan-Meier生存分析、单因素及多因素分析。
3、结果
如图1所示，与邻近的非肿瘤组织相比，MUC21表达上调，且MUC21高表达的胰腺癌患者生存率较低。
实施例2在人胰腺癌切片上通过免疫组化染色检测MUC21蛋白表达情况
1、样品收集
各收集42例胰腺癌组织及28例癌旁病理切片样本，样本的取得通过组织伦理委员会的同意。
2、免疫组化染色检测MUC21蛋白表达情况。
1）将玻片放在烤片机上65℃烤片2小时。
2）烤片结束后立即将玻片放入二甲苯内浸泡脱蜡20分钟。
3）水化：脱蜡结束后放入酒精中梯度水化，即依次在100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡5分钟。
4）抗原修复：将EDTA修复液置于高压锅中煮沸，再将玻片完全浸泡入修复液中，高压煮3分钟后于室温下自然冷却，PBS洗3次，每次5分钟。
5）灭活内源性过氧化物酶：滴加适量3% H2O2完全覆盖在组织上，室温下孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
6）使用免疫组化笔在组织外画圈，PBS洗3次，每次5分钟。
7）封闭：滴加BSA于组织上，37℃孵育30分钟。
8）孵育一抗：用力甩去抗原封闭液，将按说明稀释后的一抗完全覆盖在组织上，置于湿盒中（防干片），于4℃冰箱孵育过夜。
9）PBS洗去多余的一抗，3次，每次5分钟。
10）孵育二抗：滴加二抗，于37℃孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
11）DAB显色：将DAB试剂按说明配制后，在避光的情况下滴加于组织上，于显微镜下观察显色情况，约数分钟，待出现棕色阳性染色后用自来水冲洗玻片1分钟以终止染色。
12）苏木素复染：滴加10%苏木素，约30s后放入PBS，显微镜下观察复染情况，自来水冲洗1分钟终止。
13）PBS返蓝：复染后于PBS中返蓝5分钟，自来水冲洗2分钟终止。
14）脱水，透明及封片。
3、统计学分析
染色结果的判读是由3位病理医生完成的。阳性评分如下：1+，高达10%的肿瘤细胞显示阳性免疫染色；2+，10-50%的肿瘤细胞显示阳性免疫染色；和3+、>50%的肿瘤细胞显示阳性免疫染色。采用SPSS17.0计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图2所示，与癌旁组织相比，MUC21蛋白在胰腺癌组织中表达上调。
实施例3 Qpcr实验检测胰腺癌细胞及胰腺细胞中MUC21基因的差异表达
1、细胞培养
人胰腺细胞株HPDE，胰腺癌细胞株PANC-1、HPAFII、ASPC1、BXPC-3，以含10%胎牛血清和1%P/S的DMEM培养基在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、Qpcr检测MUC21基因的转录水平
2.1细胞总RNA的提取
采用ESscience的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。
利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。
2.2采用TAKARA剂盒（货号：RR036A) 进行mRNA反转录。具体步骤如下：
1）取0.2ml PCR管，于冰上配置反应体系。取5×PrimeScriptTM Buffer 2µl，RNA500ng，用无核酶水将总体积补至10µl。充分混匀后用微型离心机短暂离心3-5秒，使用PCR仪进行逆转录。
2）反应条件设置为：37℃加热15min，85℃加热5s，降温至4℃后，-20℃储存备用。
3）逆转录结束后获得的cDNA用DEPC水1:10稀释备用。
2.3QPCR扩增
1）引物设计
根据PrimerBank中MUC21基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由生物工程公司合成。
MUC21基因的引物序列：
正向引物序列为5’-CCTGTCCCTGAGAAACACCT-3’（SFQ ID NO.1)；
反向引物序列为5’-GCTCCATGATTCCCTCCAGG-3’（SEQ ID NO.2)。
2）GAPDH基因的引物序列：
正向引物序列为5'-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3（SEQ ID NO.3);
反向引物序列为5'-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3（SEQ ID NO.4)。
3）于冰上配置反应体系，每孔加入0.5µl F端引物，0.5µl R端引物（引物初始浓度为20nM），2×SYBR Green qPCR Mix 5µl，稀释后的cDNA 4µl。
设置反应程序为：95℃ 5min，（95℃ 10s，60℃ 30s）× 40个循环，溶解曲线。
4）反应结束后，根据得到的ct值用公式计算基因表达情况：2–（ΔΔCt）。
3、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS17.0计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图3所示，与正常胰腺细胞相比，胰腺癌细胞中的MUC21表达上调，差异具有统计学意义（P<0.05）。
实施例4 MUC21基因的沉默
1、细胞培养
人胰腺癌细胞株PANC-1、ASPC1、HPAFII，以含10%胎牛血清和1%P/S的DMEM培养基在37oC、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、转染
1）转染前细胞的处理
转染前一天，6孔培养板上种3～5×105个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30~50%，于转染前换成无血清培养基。
2）siRNA的设计
阴性对照siRNA序列（siRNA-NC）购买于RiboBio公司。
siRNA1：
正义链为5’-AGCCUGUCCCUGAGAAACA-3’（SEQ ID NO.5）；
反义链为5'-UGUUUCUCAGGGACAGGCU-3'（SEQ ID No.6）。
siRNA2：
正义链为5’-UGGGAAAUCUUCCUCAUCA-3 （SEQ ID NO.7）；
反义链为5’-UGAUGAGGAAGAUUUCCCA-3’ （SEQ ID No.8）。
将实验分为三组：阴性对照组（siRNA-NC）和实验组 （siRNA1、siRNA2），其中阴性对照组siRNA与MUC21基因的序列无同源性。
3）转染
采用Invitrogen公司的脂质体Lipofectamine 2000进行转染，按说明书进行操作，具体步骤如下：
a.取浓度为50pmol的siRNA 3μl加入47μl的无血清培养基，轻轻混匀，室温孵育5min；
b.取1μl Lipofectamine 2000加入49μl无血清培养基。轻轻混匀，室温孵育5min；
c.将上述两种混合物混合（总体积100μl），轻轻混匀，室温下孵育25min，以使复合体形成；
d.在6孔板中每孔加入100μl的复合物及适量培养基，轻经混匀；
e.孵育48～96h后观察基因的沉默效应。
3、Qpcr检测MUC21基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取步骤同实施例3
3.2逆转录步骤同实施例3
3.3Qpcr扩增步骤同实施例3
4、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS17.0计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图4所示，与对照组相比，转染siRNA1和siRNA2组的细胞中的MUC21表达量都明显下调。
实施例5 MUC21基因对胰腺癌细胞迁移能力的影响
采用transwell迁移实验检测MUC21基因对胰腺癌细胞迁移能力的影响
1、将转染48h后的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液。
2、往小室下室添加750µl 含20%FBS的DMEM，取5×104细胞于200µl体积的DMEM中混匀，接种到上室，于37℃细胞培养箱培养48小时。
3、取出小室，用棉签吸去上室培养基并擦去上室面细胞，用4%多聚甲醛于室温固定下室面的细胞15分钟，再用双蒸水涮洗小室两次，于室温下干燥。
4、将迁移至膜下侧的细胞用0.1%结晶紫染色液染色30分钟，再用PBS轻轻冲洗。待晾干后在光学显微镜下以×40放大倍数成像和计数。
5、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS17.0计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图5所示，与对照相比，实验组在转染siRNA1和siRNA2后，细胞的迁移明显受到了抑制，差异具有统计学意义（P<0.05），说明MUC21具有促进细胞迁移的作用。
实施例6 MUC21基因对胰腺癌细胞侵袭能力的影响
采用transwell侵袭实验检测MUC21基因对胰腺癌细胞侵袭能力的影响
1、在transwell小室的上室铺100µl按1：10稀释的Matrigel胶，37℃放置 4小时，待胶凝固。
2、将转染48h后的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液。
3、往小室下室添加750µl 含20%FBS的DMEM，取5×104细胞于200µl体积的DMEM中混匀，接种到上室，于37℃细胞培养箱培养48小时。
4、取出小室，用棉签吸去上室培养基并擦去上室面细胞，用4%多聚甲醛于室温固定下室面的细胞15分钟，再用双蒸水涮洗小室两次，于室温下干燥。
5、将迁移至膜下侧的细胞用0.1%结晶紫染色液染色30分钟，再用PBS轻轻冲洗。待晾干后在光学显微镜下以×40放大倍数成像和计数。
6、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS17.0计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
7、结果
结果如图6所示，与对照相比，实验组在转染siRNA1和siRNA2后，细胞的迁移侵袭明显受到了抑制，差异具有统计学意义（P<0.05），说明MUC21具有促进细胞侵袭的作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一种MUC21功能性表达的抑制剂在制备预防或治疗胰腺癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述抑制剂为 siRNA，所述 siRNA 的序列如 SEQ ID NO.5-8所示。
2.一种特异性扩增MUC21的引物在制备诊断胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述引物的序列如 SEQ ID NO.1-2所示。
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Systematical Analysis of the Cancer Genome Atlas Database Reveals EMCN/MUC15 Combination as a Prognostic Signature for Gastric Cancer;Wentao Dai等;《Frontiers in Molecular Biosciences》;第7卷;第1-9页，尤其是第3页左栏最后1段，Supplementary Figure S1 *
Wentao Dai等.Systematical Analysis of the Cancer Genome Atlas Database Reveals EMCN/MUC15 Combination as a Prognostic Signature for Gastric Cancer.《Frontiers in Molecular Biosciences》.2020,第7卷第1-9页，尤其是第3页左栏最后1段，Supplementary Figure S1. *

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