肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用,具体的涉及的生物标志物为LILRB4。
背景技术
肾细胞癌简称肾癌,起源于肾脏实质小管上皮系统,是泌尿生殖系统最常见的恶性性肿瘤之一,发病率仅低于前列腺癌与膀胱癌,大约占所有成人恶性肿瘤的3%比例左右(DeSantis CE,Lin CC,Mariotto AB,et al.Cancer treatment and survivorshipstatistics 2014.CA Cancers J Clin.2014;64(4):252-271.)。肾癌在组织学上可分成多种不同的病理亚类,其中以透明细胞型最为常见,约占80~90%比例。日前对于早期或局限性的肾透明细胞癌,手术是首选治疗方式,包括肾部分切除术或根治性切除术,术后患者预后情况较好;然而对于罹患局部晚期或者伴发远处器官转移的肾透明细胞癌患者,由于肾癌对放疗与化疗并不十分敏感这一特性,导致其预后并不十分理想(Ljungberg B,Bensalah K,Canfield S,et al.EAU guidelines on renal cell carcinoma:2014update.Ehr Urol.2015;67(5):913-924.)。
近年来,随着分子生物学的发展,肾透明细胞癌发生发展过程中的潜在分子机制成为研究的热点,申请人在之前的研究中(CN 201710775699.2、CN201710775715.8、CN201710774433.6)发现了与肾透明细胞癌发生发展相关的基因,但是上述的基因的发现远远不能满足临床上肾透明细胞癌分子诊断和靶向治疗的需要,进一步探索肾透明细胞癌发生进展过程中的潜在分子机制,寻找新的生物标记物和预后相关因子对于肾透明细胞癌的临床诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种与肾透明细胞癌发生发展相关的生物标志物,应用于肾透明细胞癌的临床诊断和治疗,实现肾透明细胞癌的早期发现以及改善患者的生存生活质量。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种试剂,所述试剂能够检测LILRB4的水平。
进一步,第一方面所述的试剂包括:
特异性识别LILRB4基因的探针;或
特异性扩增LILRB4基因的引物;或
特异性结合LILRB4蛋白的抗体或配体。
进一步,特异性特异性扩增LILRB4基因的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第三方面提供了一种芯片,所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括LILRB4的抑制剂,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
进一步,所述抑制剂选自:核酸抑制物,蛋白抑制剂,蛋白水解酶,蛋白结合分子,其能够在蛋白或基因水平上下调LILRB4基因或其编码的蛋白的表达或活性。
进一步,所述抑制剂为核酸抑制物siRNA,优选的,所述siRNA的序列如SEQ IDNO.7~8所示。
本发明的第五方面提供了一种筛选肾透明细胞癌的候选化合物的方法,包括步骤:
测试组中,在细胞的培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组的细胞中LILRB4的表达量和/或活性;在对照组中,在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组的所述细胞中LILRB4的表达量和/或活性;
其中,如果测试组中细胞的LILRB4的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是对LILRB4的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。
在本发明中,所述的步骤还包括:对获得的候选化合物进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选化合物中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗肾透明细胞癌有用的物质。
在本发明中,筛选预防或治疗肾透明细胞癌的候选化合物的体系不限于细胞体系,还包括细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系等,所述体系不局限于上述形式,只要所述体系可以检测测试化合物可以降低LILRB4的表达和/活性即可。
所述候选化合物包括但不限于:针对LILRB4基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用:
1)本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肾透明细胞癌的产品中的应用;
2)本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断肾透明细胞癌的产品中的应用;
3)本发明第三方面所述的芯片在制备诊断肾透明细胞癌的产品中的应用;
4)本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗肾透明细胞癌的产品中的应用;
5)本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗肾透明细胞癌侵袭的产品中的应用;
6)本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗肾透明细胞癌转移的产品中的应用;
7)本发明第四方面所述的药物组合物在制备促进肾透明细胞癌细胞凋亡的产品中的应用;
8)本发明第五方面所述的方法在筛选治疗肾透明细胞癌的潜在物质中的应用。
本发明可以采用任何方法检测LILRB4的表达水平,检测LILRB4表达水平的方法不是本发明的发明点。
附图说明
图1是利用QPCR检测LILRB4基因在肾透明细胞癌组织中的表达情况图;
图2是利用western blot检测LILRB4蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达情况图;
图3是检测LILRB4mRNA及其编码的蛋白在肾透明细胞癌细胞中的表达情况图;其中,图A是LILRB4mRNA,图B是LILRB4蛋白;
图4是利用QPCR检测siRNA干扰肾透明细胞癌细胞中LILRB4mRNA及其蛋白表达情况图;其中,图A是LILRB4mRNA;图B是LILRB4蛋白;
图5是用MTT法检测LILRB4基因对肾透明细胞癌细胞增殖的影响图;
图6是用流式细胞仪检测LILRB4基因对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响图;
图7是利用细胞划痕实验检测LILRB4对肾透明细胞癌细胞迁移的影响图;
图8是利用Transwell小室检测LILRB4对肾透明细胞癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,首次发现了肾透明细胞癌中LILRB4显著性上调。实验证明,通过降低LILRB4的表达水平,能够有效地抑制肾透明细胞癌细胞的生长和侵袭以及转移,提示检测LILRB4基因的表达水平可成为肾透明细胞癌早期诊断的辅助诊断指标之一,干扰LILRB4基因表达可成为治疗肾透明细胞癌或肾透明细胞癌转移的新手段。
生物标志物
在本发明中,生物标志物等同于标志物或分子标志物,(单独使用或与其他定性术语组合例如肾透明细胞癌标志物、肾透明细胞癌特异性标志物、对照标志物、外源标志物、内源标志物),指可测量、可计算或可以其他方式获得的,与任何分子或分子组合相关,可用作生物和/或化学状态的指示物的参数。在本发明中,“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因,以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。
肾透明细胞癌标志物指可以用作(单独或与其他标志物组合)受试者中肾透明细胞癌指示物的特定类型的标志物,在本发明的具体实施方式中,肾透明细胞癌标志物可用于提供(单独或与其他标志物组合)受试者中肾透明细胞癌临床评估的标志物。
LILRB4基因
LILRB4是位于人19号染色体长臂1区3带上,本发明中的LILRB4包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的LILRB4基因具有数据库GeneBank中NC_000019.10所表示的核苷酸序列或其编码的氨基酸序列。
本发明的人LILRB4核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失),在至少大约60%的核苷酸碱基、通常至少大约70%、更通常至少大约80%、优选至少大约90%、及更优选至少大约95-98%核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性,则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
或者,当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时,则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时,存在杂交选择性。典型地,当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55%相同性、优选至少大约65%、更优选至少大约75%及最优选至少大约90%相同性时,发生选择性杂交。如本文所述,同源对比的长度可以是较长的序列节段,在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸,更通常为至少大约24个核苷酸,典型为至少大约28个核苷酸,更典型为至少大约32个核苷酸,及优选至少大约36或更多个核苷酸。
抑制剂和药物组合物
基于本发明人的发现,本发明提供了一种LILRB4的抑制剂的应用,用于制备治疗肾透明细胞癌的药物组合物。如本文所用,所述的LILRB4的抑制剂包括(但不限于)抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
所述的LILRB4基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低LILRB4蛋白的活性、降低LILRB4基因或蛋白的稳定性、下调LILRB4蛋白的表达、减少LILRB4蛋白有效作用时间、或抑制LILRB4基因的转录和翻译的物质,这些物质均可用于本发明,作为对于下调LILRB4有用的物质,从而可用于预防或治疗肾透明细胞癌。例如,所述的抑制剂是:核酸抑制物,蛋白抑制剂,抗体,配体,蛋白水解酶,蛋白结合分子,只要其能够在蛋白或基因水平上下调LILRB4蛋白或其编码基因的表达。
作为本发明的一种选择方式,所述的LILRB4的抑制剂是一种特异性与LILRB4结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用LILRB4蛋白免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等来生产多克隆抗体;多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的,表达LILRB4或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体,此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。抗体的“特异性”是指抗体能结合于LILRB4基因产物或片段。较佳地,指那些能与LILRB4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。抗LILRB4蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的LILRB4蛋白含量,还可以作为用于预防肝癌转移和侵袭的特异性治疗剂。血样或尿液中的LILRB4蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标,也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过ELISA、Western Blot印迹分析,或者与检测基团偶联,通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。
作为本发明的一种优选方式,所述LILRB4的抑制剂是一种LILRB4特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染肾透明细胞癌细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,它们分别具有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的序列,进一步地在细胞水平实验,结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。
作为本发明的一种可选方式,所述的LILRB4的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA,shRNA)”,其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述,shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体,例如质粒或病毒载体,然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下,可被切割成小干扰RNA分子,从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒,通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列,从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列,该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得,例如一些病毒载体。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成,也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物,可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内,或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有有效量的所述的LILRB4的抑制剂,以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肾透明细胞癌。任何前述的LILRB4的抑制剂均可用于组合物的制备。
如本文所用,所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的LILRB4基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、缓冲液。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。
本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
优选的,可采用基因治疗的手段进行。比如,可直接将LILRB4的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者;或者,可通过一定的途径将携带LILRB4的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等,或siRNA或shRNA)递送到靶点上,并使之表达活性的LILRB4抑制剂,具体情况需视所述的抑制剂的类型而定,这些均是本领域技术人员所熟知的。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明中的药物组合物包括LILRB4的抑制剂、和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肾透明细胞癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药,而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中,可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答,调整本发明药物组合物的剂量。
检测方法
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本领域普通技术人员可以使用已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中,PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR),TMA和NASBA直接扩增RNA。
蛋白免疫技术包括夹心免疫测定,例如夹心ELISA,其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
在本发明中,术语“上调”或“过表达”指在癌组织(例如在肾透明细胞癌组织)中以相对于其他相应的组织中的水平高的表达(例如RNA和/或蛋白表达)基因。在癌中上调的基因以比其他相应的组织(例如正常或非癌性肾组织)中的表达水平高至少10%,优选地至少25%,更优选地至少50%,更优选地至少100%,更优选地至少200%,最优选地至少300%的水平表达。
芯片、试剂盒
本发明的芯片包括基因芯片和/或蛋白芯片,所述基因芯片包括:固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LILRB4所示的部分或全部序列;所述蛋白芯片包括:固相载体;以及有序固定在固相载体上的抗体或配体,所述抗体或配体能够特异性的结合LILRB4蛋白。
具体地,可根据本发明所述的基因,设计出适合的探针,固定在固相载体上,形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的,可访问的地址为特征的位置)的阵列,每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要,可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
“探针”意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交,从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。“充分地互补”的序列允许探针序列与靶标序列稳定杂交,即使该两个序列不完全互补。探针可被标记或不标记。探针可通过具体DNA序列的分子克隆生产,也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。
“杂交”或“核酸杂交”或“杂交”通常指两个具有互补碱基序列,在适当条件下将形成热力学上稳定的双链结构的单链核酸分子的杂交。如本文所用的术语“杂交”可指在严格或非严格条件下的杂交。条件的设置在本领域技术人员的技术范围内,可根据本领域中说明的实验方案确定。术语“杂交序列”优选地指显示至少40%,优选地至少50%,更优选地至少60%,更优选地至少70%,特别优选地至少80%,更特别优选地至少90%,更特别优选地至少95%,和最优选地至少97%同一性的序列同一性的序列。。在杂交到硝化纤维素滤器(或其他此类支撑物例如尼龙)的情况下,例如众所周知的Southern印迹过程,硝化纤维素滤器可在代表所需严格度条件(高严格度60-65℃,中等严格度50-60℃,低严格度40-45℃)的温度下用溶于含高盐(6×SSC或5×SSPE)、5×Denhardt溶液、0.5%SDS和100μg/ml变性载体DNA(例如鲑鱼精子DNA)温育过夜的溶液中的经标记的探针。非特异性结合的探针可通过在0.2×SSC/0.1%SDS中在根据所需严格度选择的温度:室温(低严格度)、42℃(中严格度)或65℃(高严格度)下洗涤数次从滤器上洗脱。也可调整洗涤溶液的盐和SDS浓度以适应所需严格度。所选的温度和盐浓度基于DNA杂交物的熔化温度(Tm)。当然,RNA-DNA杂交物也可形成并被检测。在此类情况下,杂交和洗涤的条件可由本领域技术人员根据众所周知的方法改变。优选地使用严格条件。如本领域所熟知,也可使用利用了不同退火和洗涤溶液的其他实验方案或市售可得的杂交试剂盒(例如来自BD Biosciences Clonetech的ExpressHybTM)。众所周知,探针的长度和要确定的核酸的组成决定杂交条件的其他参数。值得注意的是,通过用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂的加入和/或取代可实现上述条件的变型。常见的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和市售可得的专有制剂。由于相容性问题,加入具体封闭试剂可能需要修改上述杂交条件。杂交核酸分子也包括上述分子的片段。此外,与上述核酸分子的任何一个杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外,杂交复合物指两个核酸序列之间依靠互补的G和C碱基之间和互补的A和T碱基之间形成氢键的复合物;这些氢键可通过碱基堆叠相互作用进一步稳定。两个互补核酸序列以反向平行的构型形成氢键。杂交复合物可在溶液(例如Cot或Rot分析)中,或在一个存在于溶液中的核酸序列和另一个固定于固体支撑物(例如,已经例如固定了细胞的膜、滤器、芯片、针脚或载玻片)上的核酸序列之间形成。
术语“互补的”或“互补”指多核苷酸在容许的盐和温度条件下通过碱基配对天然结合。例如,序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子之间的互补可以是“部分的”,其中只有某些核苷酸结合,或者如果两个单链分子之间存在完全互补,互补可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著的影响。这在依赖核酸链之间结合的扩增反应中特别重要。所谓“充分地互补”表示能与另一序列通过在一系列互补碱基之间形成氢键而杂交的连续的核酸序列。互补碱基序列可通过使用标准碱基配对(例如G:C、A:T或A:U配对)在序列中的每个位点互补,或可含一个或多个不使用标准碱基配对互补,但允许整个序列与另一碱基序列在适当杂交条件下特异性杂交的残基(包括非碱性残基)。寡聚体的连续碱基优选地与该寡聚体特异性杂交的序列至少约80%(81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%),更优选地至少约90%互补。
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合,最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板;所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒,其直径多为微米,由于带有能与蛋白质结合的功能团,易与抗体(抗原)形成化学偶联,结合容量大;所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
所述的LILRB4芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的基因芯片。
本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测LILRB4基因或蛋白的表达。优选的,所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物,以及与所述标记物相对应的底物。此外,所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂,包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外,所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器,其中可放置一种组分,并且优选地,可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时,试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器,其中分离地放置附加的组分。然而,不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器,密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器,其中可保留所需的小瓶。
本发明中,术语“样本”以其最广泛的含义使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的组织或材料,其可包括本发明的标志物。在本发明的具体实施例中,样品可以是肿瘤或肺肿瘤组织,并且可包括例如含有来自其的与肾组织相关的细胞或标志物的任何组织或材料。
数据统计
在本发明中,实验都是按照至少重复3次来完成的,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的,配对样本采用T检验,采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析,认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与肾透明细胞癌相关的基因标志物
1、样品收集
收集6例肾透明细胞癌组织和相对应的癌旁组织以及4例非肾透明细胞癌患者的肾组织,所有患者术前均未行放化疗,术后行病理切片检查明确诊断。组织样本的取得获得患者的知情同意,并且取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品,具体操作详见说明书。
3、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
4、构建cDNA文库
利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。
5、上机测序
使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。
6、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析,利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位,通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度,利用cuffdiff检测差异表达,当p值<0.001,|log2(Fold_change)normalized|>1时,认为mRNA显著差异表达。
7、结果
测序结果显示,基因LILRB4在肾透明细胞癌组织中的表达量显著高于癌旁组织以及正常肾组织中的表达量,而正常肾组织与癌旁组织之间的LILRB4的表达量无显著性差异。
实施例2QPCR测序验证LILRB4基因的差异表达
1、对LILRB4基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肾透明细胞癌患者癌旁组织和肾透明细胞癌组织各50例,收集非肾透明细胞癌患者的肾组织18例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品,具体操作详见说明书。
3、逆转录
采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR106)进行mRNA反转录。具体步骤如下:
(1)加入5×gDNA Buffer 2.0μl,总RNA 1μg,加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl,水浴锅中42℃加热3min;
(2)构建20μl反应体系,10×Fast RT Buffer 2.0μL,RT Enzyme Mix 1.0μl,FQ-RT Primer Mix 2.0μl,RNase Free ddH2O 5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混匀;
(3)水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min,-20℃储存备用。
4、PCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中LILRB4基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由博迈德公司合成。
LILRB4基因的引物序列:
正向引物为5’-CTGGATAAAGAGGAAAGC-3’(SEQ ID NO.1);
反向引物为5’-ATAGTAACAGCGGTATCT-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因:
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)PCR反应体系:正向引物和反向引物各0.6μl,2×SuperReal PreMix Plus 10μl,DNA模板2μl,ddH2O 7.4μl,50×ROX Reference Dye△2μl,灭菌蒸馏水4.8μl。
(3)PCR反应条件:95℃15min,(95℃10s,55℃30s,72℃32s)×40个循环,95℃15s,60℃60s,95℃15s。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
结果如图1所示,与肾透明细胞癌旁组织以及非肾透明细胞癌肾组织相比,LILRB4在肾透明细胞癌组织中表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同高通量测序结果一致。
实施例3蛋白免疫印记实验检测LILRB4蛋白的差异表达
1、组织总蛋白的提取
用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内,RIPA裂解液和PMSF以100:1的比例混匀,按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的RIPA裂解液,玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解,将裂解后的液体吸至EP管中,4℃下14000rpm离心5min,收集上清。
2、总蛋白浓度测定
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。
3、SDS-PAGE电泳
按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8%的分离胶和5%的浓缩胶并进行电泳。
4、western检测
1)电转移
将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min,放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中,切下相应的PAGE胶,按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干转膜仪中,恒压25V转膜1.5h;
2)免疫杂交
取出PVDF膜,PBS冲洗后置于5%BSA溶液中室温下摇动封闭2h,将PVDF膜放入杂交袋中,加入一抗过夜,用TBST缓冲液洗涤PVDF膜,再加入相应的二抗,室温下孵育2h,TBST缓冲液洗涤。
3)DAB显色
PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液,PVDF膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照,采用Quantity One凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析,实验重复3次,结果取平均灰度值;
5、结果
结果如图2所示,LILRB4蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织以及非肾透明细胞癌患者的肾组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4LILRB4基因在人肾透明细胞癌细胞中的差异表达
1、细胞培养
人肾透明细胞癌细胞株RLC-310、786-0、Caki-2、人胚肾细胞HEK293T,以含10%胎牛血清和1%P/S的DMEM培养基在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次,细胞生长良好,呈单层贴壁生长。使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、RNA的提取
取处于对数生长期细胞,根据细胞数量加入相应量的Trizol裂解细胞,吹打混匀并转移到无RNA酶的离心管中,充分匀浆,后续步骤同对组织标本的操作,提取细胞总RNA。
3、细胞总蛋白的提取
收集处于对数期的不同处理组的细胞,用预冷的PBS洗涤细胞。将RIPA细胞裂解液和PMSF以100:1的比例混匀,向细胞中加入上述裂解液150μl,冰上放置30min,使用细胞刮刀将裂解的细胞刮下来,使用移液器将裂解后的液体吸至EP管中,4℃下14000rpm离心5min,小心收集离心后的上清。
4、逆转录及QPCR扩增具体步骤同实施例2
5、Western检测具体步骤同实施例3
6、结果
结果如图3所示,LILRB4基因及其编码的蛋白在肾透明细胞癌细胞中的表达水平显著高于HEK293T细胞,在RLC-310细胞系中表达水平最高。
实施例5LILRB4基因的沉默
1、细胞培养步骤同实施例4
2、转染
1)转染前细胞的处理
转染前一天,6孔培养板上种3~5×105个细胞/孔,在无抗生素培养基中培养一天,转染时细胞密度为30~50%,于转染前换成无血清培养基。
2)siRNA的设计
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC):
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)
siRNA1:
正义链为5’-ACUCAUUGUGAAUUGAGAGGU-3’(SEQ ID NO.7)
反义链为5’-CUCUCAAUUCACAAUGAGUUA-3’(SEQ ID NO.8)
siRNA2:
正义链为5’-UAUCAGUUAACUCAUUGUGAA-3’(SEQ ID NO.9)
反义链为5’-CACAAUGAGUUAACUGAUAAA-3’(SEQ ID NO.10)
siRNA3:
正义链为5’-AUGUCAUUGGUUUGAUGUGUA-3’(SEQ ID NO.11)
反义链为5’-CACAUCAAACCAAUGACAUGG-3’(SEQ ID NO.12)
将实验分为三组:对照组(RLC-310)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3),其中阴性对照组siRNA与LILRB4基因的序列无同源性。
3)转染
采用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000进行转染,具体操作按照说明书进行,转染之后观察干扰RNA的沉默效应。
5、QPCR检测LILRB4基因的转录水平步骤同实施例4
6、Western blot检测LILRB4蛋白的表达水平步骤同实施例4
7、结果
结果如图4所示,与非转染组与转染siRNA-NC组相比,实验组中的LILRB4的mRNA表达量和蛋白表达量都显著降低,其中siRNA1的沉默效率最高,差异具有统计学意义(P<0.05),因此选择siRNA1进行后续的研究。
实施例6LILRB4基因对肾透明细胞癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测LILRB4基因对肾透明细胞癌细胞增殖能力影响。
1、取生长状况良好的细胞,常规消化成单细胞悬液后,计数细胞,将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液,接种到96孔培养板中,每孔接种2000个细胞,至少设3个平行孔,37℃、5%CO2培养24h;
2、于接种后1、2、3、4、5天每天取出3孔细胞以MTT法检测其570nm的OD值,进行计数,计算平均值;检测前弃去上清液,培养液洗3次,每孔加入MTT无血清培养基溶液(0.2mg/ml)100μl,37℃培养箱中继续培养4h;
3、终止培养,小心吸弃上清液,每孔加入150μl DMSO,震荡10min,使结晶物充分溶解,在酶标仪上用波长为570nm测定光密度(OD)值,以时间为横轴,光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。
4、结果
结果如图5所示,与对照相比,实验组在转染siRNA1后,细胞的增殖明显受到了抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),说明LILRB4的过表达具有促进细胞增殖的作用。
实施例7LILRB4基因对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测LILRB4基因对细胞凋亡的影响。
1、将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化后吹打成细胞悬液并计数。取106量的细胞悬液,1000rpm离心5min,弃上清,加入195μl AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞;
2、加入5μl的Annexin V-FITC,轻柔混匀,室温下避光孵育10min;
3、1000rpm离心5min,弃上清,加入190μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞;
4、加入10μl碘化丙啶(PI)染色液,轻柔混匀,冰浴避光放置,进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况,所有实验均重复3次,结果取平均值。
5、结果:
结果如图6所示,实验组与对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),该结果说明,LILRB4的过表达抑制肾透明细胞癌细胞的凋亡。
实施例8细胞划痕实验
1、向6孔板中每孔加入1ml 50μg/ml的纤连蛋白,并置于4℃冰箱中过夜;
2、弃去剩余的纤连蛋白溶液,用无血清培养基清洗,将处于对数生长期的不同处理组细胞经胰酶消化重悬后,接种于铺有纤连蛋白的6孔板中,每组细胞设2个复孔,每孔5×105个细胞,置入37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;
3、待细胞长至约90%融合时,用10μl的Tip头划出一条无细胞的细痕,PBS溶液洗去脱落的细胞,加入无血清培养基继续培养;
4、分别于划痕后0h、48h观察细胞划痕处的愈合情况并拍照。实验重复3次,结果取平均值。
5、结果
结果如图7所示,转染siRNA1组的细胞相对对照组而言,细胞体外划痕后的迁移距离明显降低,说明LILRB4过表达可以促进肾癌细胞的迁移。
实施例9细胞侵袭实验
1、Transwell小室制备
将50mg/L的Matrigel胶用4℃预冷的无血清培养基以1:8的比例稀释、混匀,包被Transwell小室的底部膜的上室面,4℃风干。取60μl~80μl稀释的Matrigel胶(3.9μg/μl)置于孔径为8μm的Transwell上室的聚碳酸脂膜上,使膜上的所有的微孔均被Matrigel覆盖,置于37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
2、配置细胞悬液
将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化,无血清培养基重悬后,调整细胞浓度为5×104个/ml。
3、细胞接种
在Transwell上室加入2ml的细胞悬液,下室加入1ml的含10%胎牛血清的完全培养基,放置于配套的6孔板上,37℃、5%CO2条件下培养20-24h;取出Transwell小室,棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞。
4、染色
细胞培养结束后,取出Transwell小室,棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞,下室面用95%酒精固定15min后,苏木素染色2min,倒置显微镜下随机取5个高倍镜视野观察、计数并拍照。计数小室下室面的细胞数即为穿透Matrigel胶的细胞数,取平均数作为实验结果,并以该细胞数代表肿瘤细胞的侵袭力,实验重复3次,每组细胞设3个复孔。
5、结果
结果如图8所示,与对照组相比,实验组的细胞穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数明显减少,而对照组之间无明显差异,结果说明LILRB4过表达可以促进肾透明细胞癌的侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggataaag aggaaagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagtaacag cggtatct 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acucauugug aauugagagg u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cucucaauuc acaaugaguu a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uaucaguuaa cucauuguga a 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacaaugagu uaacugauaa a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
augucauugg uuugaugugu a 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacaucaaac caaugacaug g 21